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185-5095-IVD
184-5097-IVD
Si desea obtener información sobre las etiquetas de seguridad empleadas en este manual y en el sistema
CFX96, consulte “Seguridad y cumplimiento de normativas" en la página iii.
Recursos de Bio-Rad
En la Tabla 2 se enumeran los recursos de Bio-Rad y también se explica cómo encontrar lo que necesita.
Tabla 2. Recursos de Bio-Rad.
Recurso Contacto
Representantes locales Puede encontrar información y contactos locales en el sitio
de Bio-Rad Laboratories web de Bio-Rad. Para ello, seleccione su país en la página
de inicio (www.bio-rad.com). Además, puede encontrar
la oficina internacional más cercana en la contraportada
de este manual.
Notas técnicas y bibliografía Visite el sitio web de Bio-Rad (www.bio-rad.com). Escriba
un término de búsqueda en el cuadro Search (Buscar)
y seleccione Literature (Bibliografía) para encontrar
vínculos a notas técnicas, manuales y otra bibliografía.
Especialistas técnicos El departamento de asistencia técnica de Bio-Rad está
formado por científicos con experiencia que proporcionan
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Para encontrar su servicio de asistencia técnica local,
póngase en contacto con la oficina de Bio-Rad más cercana.
Si desea obtener asistencia técnica en Estados Unidos
y Canadá, llame al 1-800-424-6723 (teléfono gratuito)
y elija la opción de asistencia técnica.
ii
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
PRECAUCIÓN: ¡Peligro! Este símbolo identifica los componentes que suponen un riesgo
de lesiones personales o daños al instrumento en caso de manipulación incorrecta.
Siempre que aparezca este símbolo, consulte el manual para obtener más información
antes de continuar.
PRECAUCIÓN: ¡Superficie caliente! Este símbolo identifica los componentes
que suponen un riesgo de lesiones personales o daños al instrumento a causa
de un calentamiento excesivo en caso de que el sistema no se haya utilizado
correctamente.
iii
Advertencias de seguridad del instrumento
Las etiquetas de advertencia que se muestran en la Tabla 4 también están presentes en el instrumento
y hacen referencia al uso seguro del sistema CFX96.
Tabla 4. Etiquetas de advertencia de seguridad del instrumento.
Icono Significado
Advertencia acerca del riesgo de daños personales o materiales.
La utilización del sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real antes de haber
leído este manual puede suponer un peligro, pues existe el riesgo de que se produzcan
lesiones personales. Para un uso seguro, utilice este instrumento única y exclusivamente
como se indica en este manual. Este instrumento solamente lo debe manejar personal
de laboratorio cualificado con formación en el uso seguro de equipos eléctricos.
Manipule siempre los componentes del sistema con precaución y también con
las manos limpias y secas.
Advertencia sobre la manipulación de materiales de riesgo biológico.
Cuando manipule muestras de riesgo biológico, siga las precauciones y las directrices
recomendadas y, además, cumpla con la normativa local vigente específica para
su laboratorio y ámbito de actuación.
Advertencia acerca del riesgo de quemaduras.
Los termocicladores generan suficiente calor como para causar quemaduras graves.
Lleve siempre puestas gafas de seguridad u otra protección para los ojos cuando maneje
el instrumento. Permita siempre que el bloque de muestras vuelva a la temperatura
de inactividad antes de abrir la tapa y retirar las muestras. Mantenga siempre la máxima
distancia posible para impedir que se produzcan quemaduras accidentales.
Advertencia acerca del riesgo de explosión.
Los bloques de muestras se pueden calentar lo suficiente durante el funcionamiento
normal como para causar que los líquidos hiervan y exploten.
CUMPLIMIENTO DE NORMATIVAS
Tras haber sometido al instrumento a las pruebas pertinentes, ha demostrado que cumple
con todos los requisitos aplicables de las siguientes normas electromagnéticas y de seguridad:
• IEC 61010-1:2001 (2ª Ed.), EN61010-1:2001 (2ª Ed.). Requisitos de seguridad de equipos
eléctricos de medida, control y uso en laboratorio (Parte 1): Requisitos generales
• IEC 61010-2-010:2005, EN61010-2-010:2003. Requisitos de seguridad de equipos eléctricos
de medida, control y uso en laboratorio. Parte 2-010: Requisitos específicos para equipos
de laboratorio utilizados para el calentamiento de materiales
iv
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Peligros
El sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real está diseñado para funcionar de forma
segura cuando se utiliza de la manera descrita por el fabricante. Si el sistema CFX96 o cualquiera de
sus componentes asociados se utilizan de una forma no especificada por el fabricante, puede suponer
un perjuicio para la protección inherente proporcionada. Bio-Rad Laboratories, Inc. no será responsable
de cualquier daño causado por el uso de este equipo de una forma no especificada, o por las
modificaciones del instrumento que no haya realizado Bio-Rad o un agente autorizado. Las tareas
de mantenimiento y reparación del sistema CFX96 sólo las debe realizar personal de Bio-Rad.
Riesgos biológicos
El sistema CFX96 es un producto de laboratorio. No obstante, si hay muestras de riesgo biológico,
respete las siguientes precauciones y cumpla las directrices locales específicas para su laboratorio
y ámbito de actuación.
PRECAUCIONES GENERALES
• Siempre debe llevar guantes, batas de laboratorio y gafas de seguridad con protección lateral
• No se toque la boca, la nariz ni los ojos con las manos
• Proteja completamente cualquier corte o abrasión antes de trabajar con materiales
potencialmente infecciosos
• Lávese bien las manos con agua y jabón después de haber manipulado materiales
potencialmente infecciosos antes de salir del laboratorio
• Quítese el reloj y las joyas antes de trabajar en el banco
• Guarde todas los materiales infecciosos o potencialmente infecciosos en contenedores
irrompibles y a prueba de fugas
• Antes de salir del laboratorio, quítese las prendas de protección
• No utilice los guantes para escribir, responder al teléfono, encender la luz ni para tocar
cualquier cosa que otras personas pudieran tocar sin guantes
• Cámbiese los guantes con frecuencia. Quítese los guantes inmediatamente cuando observe
que están contaminados
v
• No exponga materiales que no se puedan descontaminar adecuadamente a materiales
potencialmente infecciosos
• Al finalizar una operación con materiales de riesgo biológico, descontamine la zona de trabajo
con un desinfectante adecuado (por ejemplo, una dilución de lejía doméstica al 1:10)
PRECAUCIONES ESPECÍFICAS
• Todas las muestras de pacientes tienen un riesgo biológico potencial y se deben manipular
de acuerdo con las precauciones universales
• Durante el funcionamiento normal de este instrumento, no se expulsan sustancias de riesgo
biológico
Peligros químicos
El sistema CFX96 no contiene materiales con riesgo químico potencial.
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Peligros eléctricos
El sistema CFX96 no supone un peligro eléctrico fuera de lo común para los usuarios cuando se instala
y utiliza correctamente sin realizar modificaciones físicas en él y si se conecta a una fuente
de alimentación con las especificaciones correctas.
Transporte
Antes de mover o transportar el termociclador C1000™ o el módulo de reacción óptica CFX96, se
deben llevar a cabo procedimientos de descontaminación. Mueva o transporte siempre el chasis
del termociclador C1000 y el módulo de reacción óptica CFX96 en contenedores separados con los
materiales de embalaje originales que protegerán el instrumento a fin de que no sufra ningún daño.
Si no puede encontrar contenedores adecuados, póngase en contacto con su oficina local de Bio-Rad.
Almacenamiento
El sistema CFX96 se puede almacenar en las siguientes condiciones:
• Rango de temperaturas comprendidas entre –20 y 60 °C
• Humedad relativa máxima del 80%
Eliminación
El sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real contiene materiales eléctricos, por lo
que no se debe desechar de la misma forma que los residuos generales y, por tanto, se debe recoger
por separado de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea 2002/96/CE sobre residuos de aparatos
eléctricos y electrónicos (RAEE). Antes de desechar el dispositivo, póngase en contacto con
un representante local de Bio-Rad para que le facilite instrucciones específicas aplicables a su país.
vii
viii
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Índice
Información sobre el manual de instrucciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii
Recursos de Bio-Rad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii
Seguridad y cumplimiento de normativas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii
Peligros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Capítulo 4. Protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Ventana del editor de protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Controles del editor de protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Modo de control de temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Escritor automático de protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Capítulo 5. Placas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Ventana del editor de placas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Ventana de selección de fluoróforos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Ventana para la configuración del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Ventana del Administrador de grupos de pocillos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Ventana de la vista de la hoja de cálculo de la placa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
ix
Capítulo 7. Descripción general del análisis de datos . . . . . . . . . . . . . . . 61
Ventana de análisis de datos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Pestaña cuantificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Configuración del análisis de datos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Selectores de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Gráficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Hojas de cálculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
1
Instalación del sistema
LED de indicación
Botón de apertura
Panel frontal
2
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Cuando se abre, el sistema CFX96 posee las características que se muestran en la Figura 2.
Bloque
Botón de cierre
3
Instalación del sistema
Entrada de alimentación
Interruptor Puerto
de potencia Ethernet Conexiones USB
¡ADVERTENCIA! Evite el contacto con la parte trasera del chasis C1000 cuando
esté en funcionamiento.
2. Levante el módulo de reacción óptica por los asideros que se encuentran encima
de las rejillas laterales de ventilación (Figura 4).
4
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
3. Coloque el módulo en el hueco para el módulo de reacción del chasis C1000, dejando
aproximadamente 2 cm de espacio en la parte delantera. Cuando se encuentre
en el hueco del chasis, el módulo óptico debería cubrir el logotipo de Bio-Rad
que se encuentra en la parte frontal del hueco del chasis C1000.
4. Localice la barra de bloqueo en el otro lado del termociclador C1000 y tire de ella hacia
arriba hasta que quede a ras de los laterales del hueco para el módulo. Esta acción
mueve el módulo hacia delante y lo ubica en el lugar adecuado (Figura 5).
7. Siga las instrucciones del panel frontal del termociclador C1000 para retirar el tornillo
rojo de transporte de la tapa interna calefactada (Figura 6). Gire el tornillo en sentido
contrario a las agujas del reloj para sacarlo del orificio.
5
Instalación del sistema
8. Retire la placa de transporte del bloque termociclador para que éste funcione.
3. La página de inicio del software debería aparecer automáticamente. Haga doble clic
en Install Software (Instalar software) en la página de inicio del software (Figura 7).
6
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
4. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla para completar la instalación. Cuando
haya finalizado, el icono del software CFX Manager de Bio-Rad aparecerá en el escritorio
del ordenador.
3. En la primera pantalla, seleccione Yes, this time only (Sí, sólo esta vez) para ordenar
al sistema operativo Windows que se conecte a Windows Update para buscar software.
Haga clic en Next (Siguiente).
5. Haga clic en Finish (Finalizar) en la última pantalla de instalación del software cuando
los controladores se hayan instalado.
7
Instalación del sistema
Archivos de software
El software CFX Manager guarda información sobre los experimentos en archivos específicos
(Tabla 7):
Tabla 7. Abra estos tipos de archivo con el software CFX Manager.
Tipo de archivo Extensión Cómo ver y editar el archivo
Protocolo .prcl Seleccionar en Experiment Setup (Configuración
del experimento) y editar en Protocol Editor (Editor
protocolos)
Placa .pltd Seleccionar en Experiment Setup (Configuración
del experimento) y editar en Plate Editor (Editor de placas)
Datos .pcrd Ver y analizar en la ventana Data Analysis (Análisis
de datos)
Estudio genético .mgxd Ver y analizar en la ventana Gene Study (Estudio genético)
Archivo .zpcr Contiene lecturas de fluorescencia de operaciones
independiente previo independientes que se convierten en un archivo de datos
a los datos
Ejecución de experimentos
8
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
9
Instalación del sistema
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
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Software CFX Manager™
Barra de menús
La barra de menús de la ventana principal del software contiene los elementos que figuran
en la Tabla 8.
Tabla 8. Elementos de la barra de menús de la ventana principal del software.
Elemento de
Comando Función
menú
File (Archivo) New (Nuevo) Crear un protocolo, una placa, un experimento
o un estudio genético nuevos
Open (Abrir) Abrir archivos existentes, entre otros, los relacionados
con protocolos (.prcl), placas (.pltd), datos (.pcrd)
y estudios genéticos (.mgxd), así como archivos
de ejecuciones independientes (.zpcr)
Recent Data Files Visualizar una lista con los diez últimos archivos
(Archivos de datos consultados en la que se puede seleccionar
de datos uno para que se abra en la ventana Data Analysis
recientes) (Análisis de datos)
Repeat an Abrir la ventana Experiment Setup (Configuración
Experiment del experimento) con el protocolo y la placa de una
(Repetir ejecución finalizada para repetir rápidamente
un experimento) la ejecución
Exit (Salir) Salir del programa de software
View (Ver) Application Log Mostrar el registro de la aplicación para el software
(Registro
de la aplicación)
Run Reports Seleccionar un informe de ejecución de la lista
(Informes para revisarlo
de ejecución)
Startup Wizard Abrir el Asistente de inicio
(Asistente
de inicio)
Experiment Setup Abrir la ventana de configuración del experimento
(Configuración
del experimento)
Instrument Abrir la ventana que contiene el resumen del instrumento
Summary
(Resumen
del instrumento)
Detected Mostrar u ocultar el panel de instrumentos detectados
Instruments
(Instrumentos
detectados)
Toolbar (Barra Mostrar u ocultar la barra de herramientas de la ventana
de herramientas) principal del software
Status Bar (Barra Mostrar u ocultar la barra de estado de la ventana
de estado) principal del software
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
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Software CFX Manager™
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
15
Software CFX Manager™
Asistente de inicio
La aplicación Startup Wizard (Asistente de inicio) aparece automáticamente cuando se abre
por primera vez el software CFX Manager (Figura 9). De no ser así, haga clic en el botón
del Asistente de inicio que se encuentra en la barra de herramientas de la ventana principal
del software.
El Asistente de inicio permite realizar las siguientes acciones:
• Create a new Experiment (Crear un experimento nuevo) (página 21). Permite
configurar el protocolo y la placa para iniciar un experimento nuevo
• Repeat an Experiment (Repetir un experimento). Permite configurar un experimento
con el protocolo y la placa de una ejecución que ya se haya realizado. En caso de que
sea necesario, puede modificar el experimento antes de ejecutarlo
• Open a Data File (Abrir un archivo de datos) (página 61). Permite abrir un archivo
de datos para analizar los resultados.
• Open a Gene Study (Abrir un estudio genético) (página 98). Permite abrir un estudio
de expresión genética de varios archivos para analizar los resultados de diversos
experimentos de expresión genética
• Open User Preferences (Abrir preferencias de usuario) (página 106). Permite abrir
la ventana de User Preferences (preferencias del usuario) para personalizar las opciones
del software
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
• Close Lid (Cerrar tapa). Permite cerrar una tapa motorizada en el bloque del
instrumento seleccionado
• Rename (Cambiar nombre). Permite cambiar el nombre del instrumento
• Properties (Propiedades). Permite abrir la ventana de Instrument Properties
(propiedades del instrumento)
• Collapse All (Contraer todo). Permite contraer la lista de instrumentos en el panel
de Detected Instruments (los instrumentos detectados)
• Expand All (Expandir todo). Permite expandir la lista de instrumentos en el panel
de Detected Instruments (los instrumentos detectados)
También es posible controlar un bloque. Para ello, haga clic en un icono de bloque
de instrumento del panel de instrumentos detectados y, a continuación, haga clic en algún
botón del panel Selected Instrument (Instrumento seleccionado) que se ilustra en la Figura 11.
Figura 11. Botones de la parte inferior del panel de los instrumentos detectados.
• Haga clic en View Status (Ver estado) para abrir la ventana Run Details (Detalles
de ejecución) a fin de comprobar el estado del bloque del instrumento seleccionado
• Haga clic en Open Lid (Abrir tapa) para abrir las tapas motorizadas del instrumento
seleccionado
• Haga clic en Close Lid (Cerrar tapa) para cerrar las tapas motorizadas del
instrumento seleccionado
• Haga clic en View Summary (Ver resumen) para abrir la ventana Instrument
Summary (Resumen del instrumento)
En caso de que se detecte un único instrumento, el botón View Summary (Ver resumen)
no aparece. Por tanto, si desea visualizar la ventana Instrument Summary (Resumen
del instrumento) para un único instrumento, seleccione View > Instrument Summary
(Ver > Resumen del instrumento).
Barra de estado
En el lateral izquierdo de la barra de estado de la parte inferior de la ventana principal
del software aparece el estado actual de los instrumentos. En el lateral derecho de ésta,
aparece el nombre de usuario, la fecha y la hora actuales.
Haga clic en la esquina derecha de la barra de estado y arrástrela para cambiar el tamaño
de la ventana principal.
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Software CFX Manager™
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
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Software CFX Manager™
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
3 Ejecución de experimentos
Lea este capítulo para obtener información sobre la ejecución de experimentos con
el software CFX Manager™:
• Ventana para la configuración del experimento (a continuación)
• Pestaña Protocolo (página 22)
• Pestaña Placa (página 23)
• Pestaña Iniciar ejecución (página 24)
• Ventana Detalles de ejecución (página 26)
21
Ejecución de experimentos
real, la pestaña Plate (Placa) estará oculta. Para que aparezca la pestaña Plate
(Placa), añada una “lectura de placa” (página 32) al menos en uno de los pasos
del protocolo.
NOTA: Inicie un experimento nuevo a partir de una ejecución anterior. Para ello,
seleccione File > Repeat an Experiment (Archivo > Repetir un experimento)
en la barra de menús de la ventana principal del software. A continuación,
seleccione el archivo de datos (.pcrd) del experimento que desee repetir.
La ventana de configuración del experimento se abre con la pestaña Protocol (Protocolo)
en un primer plano (Figura 15). Para abrir otra pestaña, haga clic en ella o en los botones
Prev (Anterior) y Next (Siguiente) de la parte inferior de la ventana.
Figura 15. Ventana de configuración del experimento con las pestañas Protocol
(Protocolo), Plate (Placa) y Start Run (Iniciar ejecución).
Pestaña Protocolo
La pestaña Protocol (Protocolo) muestra una vista previa del archivo de protocolo seleccionado
que está cargado en la configuración del experimento (Figura 15). Los archivos de protocolo
contienen las instrucciones para los pasos de temperatura del instrumento y opciones del
instrumento que controlan la inclinación de la rampa y la temperatura de la tapa.
Seleccione una de las siguientes opciones para elegir un protocolo existente, crear uno nuevo
o editar el protocolo que se encuentra seleccionado actualmente:
• Botón Create New (Crear nuevo). Abre la ventana del editor de protocolos para crear
un protocolo nuevo
• Botón Select Existing (Seleccionar existente). Abre una ventana del explorador
en la que puede seleccionar y cargar el archivo de un protocolo existente (extensión .prcl)
en la pestaña Protocol (Protocolo)
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
Pestaña Placa
La pestaña Plate (Placa) muestra una vista previa del archivo de placa seleccionado que
está cargado en la configuración del experimento (Figura 16). En un experimento de PCR
en tiempo real, el archivo de placa contiene una descripción del contenido de cada pocillo,
el modo de exploración y el tipo de placa. El software CFX Manager utiliza estas
descripciones para la recopilación de datos y los análisis.
Seleccione una de las siguientes opciones para elegir una placa existente, crear una nueva
o editar la placa que se encuentra seleccionada actualmente:
• Botón Create New (Crear nuevo). Abre la ventana del editor de placas para crear
una placa nueva
• Botón Select Existing (Seleccionar existente). Abre una ventana del explorador
en la que puede seleccionar y cargar el archivo de una placa existente (extensión .pltd)
en la pestaña de placa
• Menú desplegable Express Load (Carga exprés). Le permite seleccionar de forma
rápida una placa para cargarla en la pestaña de placa
CONSEJO: Para añadir o eliminar placas en el menú Express Load (Carga exprés),
añada archivos (extensión .pltd) a la carpeta Express Load (Carga exprés)
o elimínelos de la misma. Para encontrar esta carpeta, seleccione Tools > User
Data Folder (Herramientas > Carpeta de datos del usuario) en la barra de menús
de la ventana principal del software
• Botón Edit Selected (Editar selección). Abre la placa actualmente seleccionada
en el editor de protocolos
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Ejecución de experimentos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
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Ejecución de experimentos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
Detiene el protocolo
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Ejecución de experimentos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
4 Protocolos
Lea el siguiente capítulo para obtener información sobre cómo crear y editar archivos
de protocolo:
• Ventana del editor de protocolos (a continuación)
• Controles del editor de protocolos (página 32)
• Modo de control de temperatura (página 35)
• Escritor automático de protocolos (página 36)
29
Protocolos
Figura 20. Ventana del editor de protocolos con botones para editar protocolos.
30
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
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Protocolos
2. Haga clic en el botón Add Plate Read to Step (Añadir lectura de placa a un paso) para
añadir una lectura de placa al paso seleccionado. Si el paso ya contiene una lectura
de placa, el texto del botón cambia a Remove Plate Read (Eliminar lectura de placa).
Haga clic en este botón para eliminar una lectura de placa del paso seleccionado.
32
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
33
Protocolos
Opciones de paso
Para cambiar una opción de paso para el paso seleccionado:
1. Seleccione el paso haciendo clic en él en la vista de gráfico o de texto.
2. Haga clic en el botón Step Options (Opciones de paso) para abrir la ventana
Step Options (Opciones de paso).
34
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
La Figura 23 muestra el paso seleccionado con un gradiente de 10 °C. Observe que algunas
opciones no están disponibles en un paso de gradiente. En un paso de gradiente no se puede
modificar el incremento o la inclinación de la rampa.
2. Haga clic en el botón Delete Step (Eliminar paso) para eliminar el paso seleccionado.
¡ADVERTENCIA! Esta acción no se puede deshacer.
35
Protocolos
Figura 24. Ventana del escritor automático de protocolos con un protocolo nuevo.
36
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
3. Seleccione un tipo de enzima de la lista de opciones (iTaq, iProof u Other) (iTaq, iProof
u Otro).
5. Seleccione una velocidad del protocolo entre Standard, Fast o Ultrafast (Estándar,
Rápida o Ultrarrápida) mediante la barra deslizante del panel Type (Tipo). Cuando mueve
la barra deslizante, el software ajusta la duración total de la ejecución. Seleccione
Real-time PCR (PCR en tiempo real) para indicar al software que recopile datos
de fluorescencia.
7. Haga clic en OK (Aceptar) para guardar un protocolo nuevo o haga clic en Cancel
(Cancelar) para cerrar la ventana sin guardar el protocolo.
NOTA: Bio-Rad Laboratories no garantiza que la ejecución de un protocolo escrito
en la ventana del escritor automático de protocolos siempre resulte en un producto
de PCR.
37
Protocolos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
5 Placas
Lea el siguiente capítulo para obtener información sobre cómo crear y editar archivos
de placas:
• Ventana del editor de placas (a continuación)
• Ventana de selección de fluoróforos (página 42)
• Controles para la carga de pocillos (página 43)
• Ventana del Administrador de grupos de pocillos (página 48)
39
Placas
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Modo de exploración
El sistema CFX96 excita y detecta fluoróforos en seis canales y utiliza diversos modos
de exploración de adquisición de datos para recoger datos de fluorescencia durante
la ejecución de un experimento.
Seleccione uno de estos modos de exploración en la barra de herramientas de la ventana
Plate Editor (Editor de placas):
• All Channels (Todos los canales). Incluye los canales comprendidos entre
el 1 y el 5 del sistema CFX96
• SYBR/FAM only (Sólo SYBR/FAM). Incluye solamente el canal 1 y proporciona
una exploración rápida
• FRET. Incluye solamente el canal FRET y proporciona una exploración rápida
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Placas
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
• Haga clic en el cuadro Color junto al nombre del fluoróforo y seleccione un color
nuevo para representar a cada fluoróforo en la ventana del editor de placas y en
los gráficos de análisis de datos
NOTA: Antes de comenzar la ejecución, el software comprueba que los fluoróforos
que ha especificado en la placa estén calibrados en ese instrumento. No se puede
ejecutar un experimento con una placa que contenga fluoróforos que no estén
calibrados en ese instrumento.
43
Placas
Tabla 14. Opciones para cargar la placa y los pocillos en el editor de placas.
Opción Función
Para el análisis de expresión genética o para distinguir
entre diferentes muestras, elija un Sample Name
(Nombre de muestra) en el menú desplegable para cargar
el nombre de la muestra en los pocillos seleccionados.
Para añadir un nombre de muestra nuevo al menú
desplegable de la placa actual, escríbalo en el cuadro
desplegable y pulse la tecla Intro. Para eliminar
un nombre de muestra, selecciónelo en el menú,
pulse la tecla Suprimir del teclado y, a continuación,
la tecla Intro.
Para cargar números de replicados, los pocillos
seleccionados deben incluir el mismo contenido. En caso
contrario, el software desactiva este control de carga.
Haga clic en el cuadro Load (Cargar) para añadir
un Replicate # (N.º de replicado) a los pocillos
seleccionados.
En el panel Replicate Series (Serie de replicados) puede
aplicar una serie de replicados a un conjunto de pocillos
seleccionados. Introduzca el Replicate Group Size
(Tamaño del grupo de replicados) seleccionando un
número que represente el número de muestras (pocillos)
de caga grupo de replicados. Seleccione un Starting
Replicate # (N.º de replicado inicial) para añadir
replicados.
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Tabla 14. Opciones para cargar la placa y los pocillos en el editor de placas.
Opción Función
Haga clic en el botón Dilution Series (Serie de dilución)
para introducir una serie de dilución para la concentración
de muestras Standard (Estándar) y cargar una curva
estándar.
45
Placas
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
47
Placas
2. Haga clic en Add (Añadir) para crear un grupo nuevo. El menú desplegable muestra
el nombre del primer grupo como Group 1 (Grupo 1).
3. Seleccione los pocillos que compondrán el grupo en la vista de la placa. Para ello, haga
clic en los pocillos y arrástrelos al grupo. Los pocillos seleccionados se vuelven de color
azul (Figura 29).
48
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
7. Haga clic en OK (Aceptar) para terminar y cerrar la ventana, o bien haga clic
en Cancelar para cerrar la ventana sin hacer cambios.
Figura 29. Color de los pocillos en la ventana del administrador de grupos de pocillos.
49
Placas
50
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
6 Funcionamiento independiente
Lea este capítulo para obtener información sobre la ejecución del sistema de detección
CFX96™ mediante PCR en tiempo real en modo independiente:
• termociclador C1000™ (a continuación)
• Creación de un experimento nuevo (página 53)
• Exportación de datos para análisis (página 58)
• Creación de un archivo de datos (página 60)
Termociclador C1000
El sistema CFX96 puede ejecutar experimentos de PCR en tiempo real sin un ordenador.
Es posible exportar los datos de fluorescencia adquiridos durante una ejecución con
una memoria USB. También puede elegir que se le envíen los datos directamente por correo
electrónico si la base C1000 está conectada a Internet y se ha configurado la función
de correo electrónico (consulte el manual de instrucciones del termociclador C1000 si desea
obtener información sobre cómo configurar las opciones de correo electrónico). Para analizar
los datos, se necesita el software CFX™ Manager.
El panel de control del termociclador C1000™ proporciona acceso a todas las funciones
necesarias para ejecutar el instrumento. La Figura 31 muestra los componentes del panel
de control.
Tecla del escritor
Teclas
LCD automático de protocolos
alfanuméricas
Teclas
Teclas de nave-
de comando gación
Puerto USB
(más abajo)
Teclas de función
Figura 31. El panel de control del termociclador C1000.
51
Funcionamiento independiente
Tecla Función
TECLAS DE COMANDO
RUN (EJECUTAR) Seleccionar y ejecutar un protocolo
EDIT (EDITAR) Seleccionar y cambiar el protocolo
STATUS (ESTADO) Mostrar el estado de uno o varios protocolos en ejecución
VIEW (VER) Cambiar entre la vista de gráfico y de texto
de un protocolo
TECLAS DE FUNCIÓN
F1, F2, F3 o F4 Los nombres y las funciones de los botones de las teclas
de función son diferentes en cada pantalla
TECLAS ALFANUMÉRICAS
Del 1 al 9 Le permiten introducir números o letras del alfabeto.
Pulse una tecla varias veces para cambiar a la letras
asociadas
0, INCUBATE (INCUBAR) Introducir un cero (infinito) o iniciar una incubación
instantánea
coma decimal (,) Introducir una coma decimal
signo menos (-) Introducir un signo menos
Escritor automático de protocolos
Tecla del escritor automático Iniciar el escritor automático de protocolos
de protocolos
TECLAS DE NAVEGACIÓN
Flecha hacia la DERECHA Mover el cursor hacia la derecha
Flecha hacia la IZQUIERDA Mover el cursor hacia la izquierda
Flecha hacia ARRIBA Mover el cursor hacia arriba
Flecha hacia ABAJO Mover el cursor hacia abajo
ENTER (INTRO) Confirmar una opción
BACK (VOLVER) Cancelar una función o borrar una letra, un número
o una palabra
Menú principal
Cuando se inicia el sistema CFX96, éste ejecuta un autodiagnóstico para comprobar
que funciona correctamente y, a continuación, muestra el menú principal. El menú principal
proporciona acceso a todas las funciones del sistema, muestra la fecha y la hora, el nombre
del usuario que ha iniciado sesión, el estado del sistema, el tipo de módulo de reacción,
el nombre del termociclador y cualquier termociclador conectado S1000™.
NOTA: El termociclador C1000 guarda un máximo de 20 ejecuciones
de experimentos de PCR en tiempo real y marca la fecha/hora de las ejecuciones.
Cuando se han almacenado 20 ejecuciones en el C1000, los datos más antiguos
se eliminan al almacenar una ejecución nueva.
52
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
53
Funcionamiento independiente
3. (Opcional) Para introducir un paso nuevo, pulse el botón Insert (Introducir) (F1).
Para eliminar un paso, pulse el botón Delete (Eliminar) (F3) (Figura 33).
4. (Opcional) Para cambiar las opciones de un paso, pulse el botón Options (Opciones)
(F4) (Figura 33). En la ventana Step Options (Opciones de paso), seleccione un
parámetro que desee cambiar, incluida la temperatura y el tiempo del paso o añada/
elimine una lectura de placa al paso (Figura 34)
5. El paso GOTO (Ir a) ordena al termociclador que repita una serie de pasos de forma
continuada para crear los ciclos del experimento de PCR. Seleccione un paso GOTO
(Ir a), pulse las teclas de flecha para seleccionarlo y, a continuación, edite el número
pasos de un paso GOTO o cambie el número de repeticiones.
54
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
3. Haga clic en Edit Filename (Editar nombre de archivo) (F1). Escriba un nombre nuevo
en el cuadro y haga clic en Save (Guardar) (F2) (Figura 36).
55
Funcionamiento independiente
4. Haga clic en Run (Ejecutar) (F2) para continuar y ejecutar el protocolo (Figura 37).
56
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
57
Funcionamiento independiente
2. Vaya a la carpeta RT_DATA y pulse la tecla de flecha hacia la derecha para abrir
la carpeta.
58
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
4. Pulse el botón Export File (Exportar archivo) (F1) para exportar los datos de la ejecución
(.zpcr) a la memoria USB (Figura 42).
Figura 42. Exportación de datos de una ejecución independiente a una memoria USB.
4. Vaya hasta el cuadro Email Address (Dirección de correo) con las teclas de flecha
e introduzca la dirección de correo electrónico mediante las teclas alfanuméricas.
59
Funcionamiento independiente
60
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
61
Descripción general del análisis de datos
62
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Elemento
Comando Función
de menú
File (Archivo) Save (Guardar) Guardar el archivo
Save As (Guardar como) Guardar el archivo con un nombre nuevo
Repeat Experiment (Repetir Extraer el archivo del protocolo
experimento) y de la placa del experimento actual
para volver a ejecutarlo
Exit (Salir) Salir de la ventana Data Analysis
(Análisis de datos)
View (Ver) Run Log (Registro de ejecución) Abrir una ventana de registro de ejecución
para ver el registro de ejecución
de un archivo de datos
Settings Analysis Mode (Modo Seleccionar el método Baseline
(Configuración) de análisis) Subtraction (Sustracción de valores
basales) para los grupos de pocillos
seleccionados en los datos
C(t) Determination Mode Seleccionar el modo Regression
(Modo de determinación de C(t)) (Regresión) o Single-Threshold
(Umbral sencillo) para determinar
cómo se calculan los valores de C(t)
para cada trazo
Baseline Thresholds (Umbrales Abrir la ventana de umbrales basales para
basales) ajustar los valores basales o el umbral
Trace Styles (Estilos de trazo) Abrir la ventana Trace Styles (Estilos
de trazo)
View/Edit Plate (Ver/Editar Abrir el editor de placas para ver y editar
placa) la placa
Mouse Highlighting (Resaltado Activar o desactivar el resaltado
con ratón) simultáneo de datos con el puntero
del ratón
63
Descripción general del análisis de datos
Tabla 17. Elementos de la barra de menús en la ventana Data Analysis (Análisis de datos).
(cont.)
Elemento
Comando Función
de menú
Tools Reports (Informes) Abrir el informe de este archivo de datos
(Herramientas) Import Fluorophore Calibration Seleccionar un archivo de calibración
(Importar calibración de para aplicarlo al archivo de datos actual
fluoróforo)
Replace Plate (Reemplazar Reemplazar el archivo de datos actual
placa) en el análisis de datos
Export All Data Sheets Exportar todas las vistas de la hoja
to Excel (Exportar todas de cálculo de cada pestaña a un archivo
las hojas de datos a Excel) independiente de formato Excel
Help (Ayuda) Abrir la ayuda del software para obtener
información adicional sobre el análisis
de datos
64
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Pestaña cuantificación
Cada pestaña de la ventana Data Analysis (Análisis de datos) muestra los datos en gráficos
y hojas de cálculo para un método de análisis específico, con un selector de pocillos
en el que seleccionar los datos que desea ver. La ventana Data Analysis (Análisis de datos)
se abre con la pestaña Quantitation (Cuantificación) (Figura 46) en un primer plano. Los datos
del gráfico Amplification (Amplificación) de esta pestaña se deben emplear para determinar
la configuración correcta de análisis para el experimento.
NOTA: El gráfico Amplification (Amplificación) muestra la fluorescencia relativa
(RFU) de cada pocillo en cada ciclo. Cada trazo del gráfico representa datos
de un solo fluoróforo en un pocillo.
65
Descripción general del análisis de datos
Figura 47. Selección del número de paso en la ventana Data Analysis (Análisis de datos).
Figura 48. Ventana Data Analysis (Análisis de datos) con la opción Group 2 (Grupo 2)
seleccionada.
66
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
2. Ajuste el umbral de cruce (Figura 49) para el fluoróforo; para ello, haga clic en
User Defined (Definido por el usuario) e introduzca un número de umbral.
67
Descripción general del análisis de datos
2. Ajuste el ciclo Baseline Begin (Basal inicial) y el ciclo Baseline End (Basal final)
de todos los pocillos seleccionados o cambie el número de ciclo Begin (Inicial)
y End (Final) en la parte inferior de la hoja de cálculo (Figura 49).
Selectores de pocillos
Haga clic en los pocillos del selector de pocillos para mostrar u ocultar datos en los gráficos
o en las hojas de cálculo en toda la ventana Data Analysis (Análisis de datos):
• Para ocultar un pocillo, resáltelo y haga clic en el pocillo en cuestión. Para mostrar
el pocillo, resáltelo y vuelva a hacer clic en él
68
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
• Para ocultar varios pocillos, haga clic y arrastre un cuadro hasta que abarque
los pocillos que desee seleccionar. Para mostrar esos pocillos, haga clic y vuelva
a arrastrar un cuadro hasta que abarque los pocillos
• Haga clic en la esquina superior izquierda de la placa para ocultar todos los pocillos.
Vuelva a hacer clic en la esquina superior izquierda para mostrar todos los pocillos.
• Haga clic al inicio de alguna columna o alguna fila para ocultar dichos pocillos.
Vuelva a hacer clic en la columna o la fila para mostrar los pocillos
En el selector de pocillos solamente se pueden seleccionar los pocillos cargados
con contenido (introducidos en el Plate Editor (editor de placas)). El color de estos indica
si están seleccionados. Como se muestra en la Figura 50, en el selector aparecen estos
tres tipos de pocillos:
• Pocillos seleccionados y cargados (azul). Estos pocillos contienen un tipo de muestra
cargada Unk (desconocida). Los datos de estos pocillos aparecen en la ventana Data
Analysis (Análisis de datos)
• Pocillos no seleccionados y cargados (gris claro). Estos pocillos contienen tipos
de muestras cargadas Std (estándar) y Pos (positivo). Los datos de estos pocillos
no aparecen en la ventana Data Analysis (Análisis de datos)
• Pocillos vacíos (gris oscuro). Estos pocillos no están cargados en la ventana
Plate Editor (Editor de placas)
69
Descripción general del análisis de datos
3. Haga clic en Exclude Wells in Analysis (Excluir pocillos del análisis), tal como se ilustra
en la Figura 52, para excluir los pocillos seleccionados. Esta casilla de verificación
se encuentra en la parte inferior de los controles del editor de placas, en el lateral
derecho de la ventana.
Figura 52. Casilla de verificación Exclude Wells in Analysis (Excluir pocillos del análisis)
en la parte inferior del panel.
4. Los pocillos excluidos están marcados con un asterisco (*) en la ventana Plate Editor
(Editor de placas).
De forma alternativa, puede eliminar pocillos del análisis de forma permanente; para ello, borre
el contenido de los pocillos en el editor de placas haciendo clic en el botón Clear Wells
(Borrar pocillos).
¡ADVERTENCIA! Tendrá que volver a introducir el contenido de los pocillos
que se haya borrado.
70
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Gráficos
En cada uno de los gráficos de la ventana Data Analysis (Análisis de datos), se muestran
los datos en un gráfico diferente y, además, se incluyen opciones para ajustar los datos.
Si desea ampliar alguna parte del gráfico, haga clic con el ratón y arrástrelo para seleccionar
la parte en cuestión. El software cambia el tamaño del gráfico y lo centra en el área
seleccionada.
Hojas de cálculo
Las hojas de cálculo que se muestran en el análisis de datos incluyen opciones para ordenar
y transferir los datos. Ordene las columnas mediante alguno de estos métodos:
• Haga clic en alguna columna y arrástrela a una nueva ubicación de la tabla
seleccionada
• Haga clic en el encabezado de la columna para ordenar los datos de forma
ascendente o descendente
Para ordenar un máximo de tres columnas de datos en la ventana Sort (Ordenar), siga estos
pasos:
1. Haga clic con el botón derecho en la hoja de cálculo para abrir el menú y seleccione
Sort (Ordenar).
71
Descripción general del análisis de datos
4. Haga clic en OK (Aceptar) para ordenar los datos o en Cancel (Cancelar) para detener
la operación.
Resalte los datos en los gráficos asociados y el selector de pocillos manteniendo el puntero
del ratón sobre una celda. Si hace clic en la celda, puede copiar su contenido para pegarlo
en otro programa de software.
72
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
73
Ventanas de análisis de datos
Selector de fluoróforo
Para seleccionar los datos del fluoróforo para visualizarlos en los gráficos y en las hojas
de cálculo de la pestaña Quantitation (Cuantificación), haga clic en el selector de fluorófos
debajo del gráfico Amplification (Amplificación) (Figura 53). Haga clic en el recuadro que
se encuentra junto al nombre del fluoróforo para mostrar u ocultar los datos del fluoróforo
en toda la ventana del análisis de datos.
74
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
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Ventanas de análisis de datos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
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Ventanas de análisis de datos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
79
Ventanas de análisis de datos
Para analizar los datos de punto final, la placa debe contener controles negativos, ya que,
de lo contrario, el software no podrá realizar la llamada. Lleve a cabo uno de estos dos tipos
de protocolos:
• Ejecutar un protocolo de cuantificación. Configure un protocolo estándar. Tras haber
realizado el experimento, abra la ventana Data Analysis (Análisis de datos), ajuste las
opciones de análisis de datos en la pestaña Quantitation (Cuantificación) y,
a continuación, haga clic en la pestaña End Point (Punto final) para elegir un ciclo
de punto final
• Ejecutar un protocolo exclusivo de punto final. Cargue el protocolo End Point Only
(Sólo punto final) en la pestaña Plate (Placa) de la ventana Experiment Setup
(Configuración del experimento), seleccione o cree una placa y lleve a cabo
el experimento
La pestaña End Point (Punto final) muestra los valores de RFU promedio para determinar
si el objetivo se ha ampliado o no con el último ciclo (final). Utilice estos datos para determinar
si una secuencia concreta del objetivo está presente (positivo) en alguna muestra.
Los objetivos positivos tienen valores de RFU superiores al nivel de corte definido.
El software muestra los siguientes datos en la pestaña End Point (Punto final):
• Settings (Configuración). Permite ajustar la configuración del análisis de datos
• Results (Resultados). Muestra los resultados inmediatamente después de haber
ajustado la configuración
• Well Selector (Selector de pocillos). Permite seleccionar los pocillos con los datos
de punto final que desea ver
• Hoja de cálculo Well (Pocillo). Muestra una hoja de cálculo de los datos de RFU
recopilados en los pocillos seleccionados
80
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
81
Ventanas de análisis de datos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
• Seleccione un fluoróforo para cada eje del gráfico (X: e Y:) en las opciones
de configuración de la parte inferior de la ventana
• Cambie una llamada manualmente resaltando una fila en la hoja de cálculo y,
a continuación, seleccionando una opción en la lista Call Selected Alleles
(Llamar alelos seleccionados) en la que se incluyen Alelo 1, Alelo 2, Heterocigoto,
Desconocido, Control 1 o Control 2
• Haga clic en el botón Restore Default Thresholds (Restaurar umbrales
predeterminados) para restaurar las barras vertical y horizontal a sus posiciones
originales, cuya indicación queda reflejada en los números que se encuentran junto
a las barras
• Seleccione C(t) Display Mode (Modo de visualización de C(t)) para ver los datos
como niveles de umbral. Seleccione RFU Display Mode (Modo de visualización
de RFU) para ver los datos en unidades de fluorescencia relativa en el ciclo
seleccionado
• Seleccione Normalize Data (Normalizar datos) para normalizar los datos de RFU
que se muestran en el gráfico y en la hoja de cálculo
La normalización cambia los datos del gráfico a un rango de 0 a 1 en ambos ejes.
Para normalizar los datos, la placa debe contener pocillos con tipos de muestra sin control
de plantilla (NTC) para Alelo 1 y Alelo 2. Para este trazado, los datos de RFU están
normalizados para los valores de NTC como una combinación lineal de RFU específicas
de Alelo 1 y Alelo 2. Este trazado es una forma eficaz de presentar los datos de RFU.
Los cálculos para la RFU normalizada siguen las fórmulas presentadas en Livak et al. (1995).
A1
Normalizado A 1 = -------------------------------------------------------------
-
A 1 + A 2 + x NTC A1 + A2
Donde:
• A1 representa la RFU del Alelo 1
• A2 representa la RFU del Alelo 2
83
Ventanas de análisis de datos
El software muestra las reglas de control de calidad que están en vigor en ese momento
y la configuración que define cada regla (Figura 63). La descripción de la regla también
muestra los pocillos que no cumplen una regla seleccionada.
NOTA: Puede activar o desactivar las reglas haciendo clic en la casillas de
verificación que hay junto a las reglas en la columna Use Rule (Usar regla).
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
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Ventanas de análisis de datos
3. Cambie las opciones que desea incluir en el informe. El informe se abre con las opciones
predeterminadas seleccionadas. Haga clic en las casillas de verificación de la lista
de opciones del informe para cambiar categorías completas u opciones individuales
dentro de una categoría.
NOTA: Los datos que aparecen en el informe dependen de las opciones
seleccionadas actualmente en las pestañas de la ventana de análisis de datos.
Por ejemplo, un experimento de cuantificación podría no contener una curva
estándar, por lo que esos datos no aparecen en la ventana de análisis de datos
ni en el informe de datos.
4. Haga clic en el botón Update Report (Actualizar informe) para actualizar la vista
previa del informe con todos los cambios que se hayan realizado.
6. (Opcional) Cree una plantilla de informe con la información que desee. Para guardar
la configuración del informe actual en una plantilla, seleccione Template > Save
(Plantilla > Guardar) o Save As (Guardar como). La próxima vez que desee crear
un informe nuevo solamente necesita cargar la plantilla de informe.
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Ventanas de análisis de datos
88
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Expresión genética
Con el uso de controles altamente cualificados en sus reacciones, puede realizar
un experimento de expresión genética para normalizar las diferencias relativas
en una concentración objetivo entre muestras. Por norma general, se utilizan los niveles
de mensaje de uno o varios genes de referencia para normalizar los niveles de expresión
de un gen objeto de interés. Los genes de referencia tienen en cuenta las diferencias de carga
u otras variaciones representadas en cada muestra, y no se deben regular en el sistema
biológico que esté sujeto al estudio.
Abra la pestaña Gene Expression (Expresión genética) para evaluar las diferencias entre las
reacciones de PCR de dos o más pocillos. Puede evaluar, por ejemplo, los números relativos
de genomas virales o los números relativos de secuencias transfectadas en una reacción
de PCR. La aplicación más común de los estudios de expresión genética es la comparación
de la concentración de ADNc en más de una reacción para calcular los niveles de ARN
mensajero de estado estable.
El software calcula el nivel de expresión relativa de un objetivo con alguna de las siguientes
situaciones:
• Nivel de expresión relativa de una secuencia objetivo (Objetivo 1) en relación
con otro objetivo (Objetivo 2). Por ejemplo, la cantidad de un gen en relación
con otro gen bajo el mismo tratamiento de la muestra
• El nivel de expresión relativa de una secuencia objetivo de una muestra comparado
con el mismo objetivo bajo diferentes tratamientos de la muestra. Por ejemplo,
la cantidad relativa de un gen en relación a él mismo en diferentes condiciones
temporales, geográficas o de desarrollo
89
Análisis de la expresión genética
Figura 66. Ejemplo del contenido de los pocillos para un experimento de expresión
genética uniplex.
En la Figura 67 se ilustra un ejemplo del contenido mínimo de los pocillos para un experimento
de expresión genética multiplex.
Figura 67. Ejemplo del contenido de los pocillos para un experimento de expresión
genética multiplex.
90
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
• Hoja de cálculo. Muestra una hoja de cálculo de los datos de la expresión genética
CONSEJO: Haga clic con el botón derecho del ratón en cualquier gráfico u hoja
de cálculo para ver las opciones. Haga clic en el botón View/Edit Plate (Ver/Editar
placa) en el editor de placas y cambie el contenido de los pocillos de la placa.
.
91
Análisis de la expresión genética
Cantidad relativa
Seleccione Relative Quantity (C(t)) (Cantidad relativa) en el menú desplegable
de los controles del gráfico de la pestaña Gene Expression (Expresión genética) para realizar
un análisis de cantidad relativa (C(t)). Por definición, los datos del análisis de cantidad relativa
(C(t)) no están normalizados. Este método se utiliza para cuantificar muestras que no
incluyen ningún gen de referencia (objetivos). Por norma general, el investigador confía
en una de las siguientes consideraciones a la hora de configurar el experimento:
• Cada muestra representa la misma cantidad de la plantilla en cada muestra
biológica, posiblemente la misma masa de ARN o ADNc en cada pocillo
• Cualquier variación en la cantidad de muestra biológica cargada se normalizará
después de la ejecución mediante algún método de análisis de datos fuera del
software. Por ejemplo, un investigador podría elegir dividir el valor de cantidad
relativa por el factor normalizador, posiblemente la masa de ácido nucleico cargado
por cada muestra o el número de células a partir de las que se aisló
el ácido nucleico
DATOS DE GRÁFICO
Las opciones de datos del gráfico le permiten presentar los datos en el gráfico mediante
alguna de las dos opciones que se detallan a continuación:
• Relative to control (Relativos al control). Realiza un gráfico con el eje en una escala
de 0 a 1. Si asigna un control en el experimento, seleccione esta opción para visualizar
rápidamente la regulación hacia arriba y la regulación hacia abajo del objetivo
• Relative to zero (Relativos a cero). Realiza un gráfico de los datos con el origen
en cero
92
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
OPCIONES DE ESCALA
Seleccione Normalized Gene Expression (C(t)) (Expresión genética normalizada) para
activar las opciones de escala en el gráfico de expresión genética. Seleccione una de estas
opciones de escala para calcular y presentar los datos de la forma que mejor se adapte
a su diseño experimental:
• Unscaled expression (Expresión sin escala). Esta opción presenta la expresión
de gen normalizada sin escala
• Highest expression (Expresión más alta). Establece la escala de la expresión genética
normalizada en la más alta de cada objetivo, dividiendo el nivel de expresión de cada
muestra entre el nivel más alto de expresión de todas las muestras. Esta opción
de escala utiliza la fórmula de escala más alta
• Lowest expression (Expresión más baja). Recalcula la expresión genética
normalizada de cada objetivo dividiendo el nivel de expresión de cada muestra entre
el nivel más bajo de expresión de todas las muestras. Esta opción de escala utiliza
la fórmula de escala más baja
TIPO DE ERROR
Seleccione una opción para los cálculos de tipo de error (barras de error) en el gráfico
Gene Expression (Expresión genética):
• Standard Error of the Mean (Error típico de la media, SEM). Es el valor
predeterminado
• Standard Deviation (Desviación típica, Std Devs)
93
Análisis de la expresión genética
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
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Análisis de la expresión genética
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
97
Análisis de la expresión genética
Estudio genético
Cree un estudio genético para comparar datos de expresión genética de uno o varios
experimentos de PCR en tiempo real utilizando un calibrador entre ejecuciones para
normalizar los datos entre los experimentos. Cree un estudio genético añadiendo datos
de uno o varios archivos (extensión .pcrd) al estudio en cuestión; el software los agrupará
en un único archivo (extensión .mgxd).
NOTA: Para poder crear un estudio genético, lo datos para la expresión genética
deben incluir una muestra común en todos los archivos de datos. El software
utiliza la muestra común para normalizar los datos entre los experimentos.
Seleccione los nombres de las muestras seleccionadas en la ventana Experiment
Settings (Configuración del experimento) (página 46).
NOTA: El número máximo de muestras que puede analizar en un estudio genético
está limitado por el tamaño de la memoria RAM y la memoria virtual del ordenador.
3. Si hay varios objetivos con un rango idéntico de valores de C(t), se elige como
calibrador dominante el que tenga el objetivo con el menor valor absoluto de C(t) medio
de las muestras del calibrador entre ejecuciones elegibles.
4. Si hay varios objetivos con valores absolutos idénticos de C(t) medio, el calibrador
dominante será el grupo de replicados con el menor C(t).
NOTA: El primer archivo de datos que se importe al estudio genético servirá
siempre como archivo central en las comparaciones de parejas durante la
calibración entre ejecuciones.
98
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
99
Análisis de la expresión genética
• Añadir notas acerca del estudio genético. Escriba los comentarios que desee añadir
sobre los archivos y el análisis de este estudio genético en el cuadro Notes (Notas).
La pestaña de configuración del estudio muestra los archivos de datos del estudio genético,
como se describe en la Tabla 26.
Tabla 26. Pestaña de configuración del estudio en la ventana de estudio genético.
Título de la columna Descripción
File Name (Nombre Nombre del archivo de datos del experimento
de archivo) (extensión .pcrd)
File Folder (Carpeta Directorio en el que se guardan los archivos de datos
de archivos) de cada experimento del estudio genético
Date Created (Fecha Fecha en la que se obtuvieron los datos de la ejecución
de creación)
Well Group Name (Nombre Nombre del grupo de pocillos que se seleccionó cuando
de grupo de pocillos) se añadió el archivo al estudio genético
100
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
101
Análisis de la expresión genética
Tabla 27. Información de la hoja de cálculo en la pestaña de análisis del estudio. (cont.)
Información Descripción
Mean (C(t)) (Media de C(t)) Media del ciclo de umbral
C(t) SEM (o SD) (SEM o SD Error típico de la media o desviación típica del ciclo de umbral,
de C(t)) en función de la opción seleccionada
2. Seleccione Tools > Reports (Herramientas > Informes) para abrir la ventana Gene Study
Report (Informe del estudio genético).
3. Haga clic en las casillas de verificación de la lista de opciones del informe para
seleccionar y eliminar opciones de visualización de los datos.
102
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
4. Haga clic en el botón Update Report (Actualizar informe) para actualizar el panel
de vista previa del informe. Este panel muestra una vista del informe.
103
Análisis de la expresión genética
104
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
10 Usuarios y preferencias
Lea este capítulo para obtener más información sobre cómo administrar los usuarios
del software y sus preferencias:
• Inicio de sesión o selección de usuario (a continuación)
• Ventana de preferencias del usuario (página 106)
• Configuración de notificaciones por correo electrónico (página 107)
• Administración de usuarios (página 113)
105
Usuarios y preferencias
4. Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo de inicio de sesión y abrir
el software.
106
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
• Haga clic en una de las pestañas (Figura 75) para ver y cambiar las preferencias
107
Usuarios y preferencias
• Test email (Correo de prueba). Para probar la configuración del correo electrónico,
introduzca una o varias direcciones de correo en el cuadro de texto Test Email
Address (Direcciones para correo de prueba). Si escribe varias direcciones, sepárelas
con una coma. A continuación, haga clic en el botón Test Email (Correo de prueba)
Pestaña Archivos
Seleccione la pestaña Files (Archivos) para ver una lista de las ubicaciones predeterminadas
para abrir y guardar archivos. Haga clic en el botón “...” que se encuentra a la derecha
de cada cuadro para abrir una ventana del explorador y buscar una carpeta.
• Default folder for file creation (Carpeta predeterminada para la creación de
archivos). Seleccione una carpeta predeterminada en la que desea guardar los archivos
nuevos. Seleccione una ubicación para cada tipo de archivo: Protocol (Protocolo),
Plate (Placa), Data (Datos) o Gene Study (Estudio genético)
• File Selection for Experiment Setup (Selección de archivos para la
configuración del experimento). Seleccione los archivos de protocolo y placa
predeterminados que aparecen cuando abre la ventana Experiment Setup
(Configuración del experimento)
• Data File Prefix (Prefijo de los archivos de datos). Defina el texto inicial del nombre
de los archivos de datos
108
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Pestaña Protocolo
Seleccione la pestaña Protocol (Protocolo) en la ventana User Preferences (Preferencias
del usuario) para especificar la configuración predeterminada de un archivo nuevo de
protocolo en la ventana Protocol Editor (Editor de protocolos):
• Protocol Editor (Editor de protocolos). Establezca la configuración predeterminada
que aparece en el editor de protocolos. Seleccione un volumen de muestra
predeterminado para describir el volumen de las muestras de los pocillos y seleccione
una temperatura de apagado de la tapa
• Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos). Le permite seleccionar
la configuración predeterminada que aparece en el escritor automático de protocolos
Pestaña Placa
Seleccione la pestaña Plate (Placa) en la ventana User Preferences (Preferencias del usuario)
(Figura 77) para especificar la configuración predeterminada de un archivo nuevo de placa
en la ventana Plate Editor (Editor de placas):
• Plate Type (Tipo de placa). Seleccione el tipo de placa predeterminado
• Plate Size (Tamaño de placa). Seleccione el tamaño de placa predeterminado
• Units (Unidades). Seleccione las unidades utilizadas para describir la concentración
de la plantilla inicial de los pocillos que contienen estándares
• Scientific Notation (Notación científica). Seleccione la notación científica para
ver las unidades de concentración en dicha notación
• Scan Mode (Modo de exploración). Seleccione un modo de exploración
predeterminado
• Fluorophores (Fluoróforos). Haga clic en las casillas de verificación para seleccionar
los fluoróforos predeterminados que aparecen en los controles de carga de los pocillos
de la ventana Plate Editor (Editor de placas)
• Libraries (Bibliotecas). Introduzca el nombre de los objetivos y las muestras utilizados
en los experimentos. Estos nombres aparecen en las listas de la pestaña Targets
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Usuarios y preferencias
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
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Usuarios y preferencias
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
Administración de usuarios
Abra la ventana User Administration (Administración de usuarios) en la ventana principal
del software:
• Seleccione Users > User Administration (Usuarios > Administración de usuarios)
• Haga clic en el botón User Administration (Administración de usuarios) en la barra
de menús
Si inicia sesión como administrador, abra la ventana User Administration (Administración
de usuarios) para administrar los usuarios y sus derechos:
• Manage Users (Administrar usuarios). Añada o elimine usuarios y asigne a cada
uno una función (Role)
• Manage Rights (Administrar derechos). Cambie los derechos para las funciones
de los usuarios: Principal, Operator (Operador) o Guest (Invitado)
NOTA: Esta ventana sólo la pueden editar los usuarios que sean administradores.
Los demás usuarios únicamente la pueden ver.
Para asignar una función a cada usuario, selecciónela de la lista de funciones en la ventana
User Administration (Administración de usuarios) (Figura 80). En este ejemplo, el usuario
Guest (Invitado) está autorizado para guardar archivos.
2. Seleccione una función en el campo Role. Las funciones restringen los derechos
de cada usuario. La función predeterminada es Principal.
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Usuarios y preferencias
4. Haga clic en OK (Aceptar) para abrir un cuadro de diálogo y confirmar que desea cerrar
la ventana.
2. Haga clic en OK (Aceptar) para abrir un cuadro de diálogo y confirmar que desea cerrar
la ventana.
2. Haga clic en OK (Aceptar) para abrir un cuadro de diálogo y confirmar que desea cerrar
la ventana.
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real
11 Recursos
Lea este capítulo para obtener más información sobre los recursos para el sistema
de detección CFX96™ en tiempo real:
• Asistente de calibración (a continuación)
• Mantenimiento del instrumento (página 117)
• Registro de la aplicación (página 119)
• Resolución de problemas (página 120)
• Especificaciones técnicas (página 122)
• Referencias (página 124)
Asistente de calibración
El sistema CFX96 viene calibrado de fábrica para los fluoróforos utilizados con mayor
frecuencia en placas de pocillos transparentes y blancos (Tabla 29).
Tabla 29. Fluoróforos calibrados de fábrica y canales.
Fluoróforos Canal
FAM, SYBR® Green I 1
VIC, HEX, TET, CAL Gold Fluor 540 2
ROX, Texas Red, CAL Fluor Red 610 3
Cy5, Quasar 670 4
Quasar 705 5
El sistema CFX96 también incluye un canal dedicado a la química de FRET. Este canal
no necesita calibración de tinturas específicas.
Para abrir el asistente de calibración y calibrar el sistema CFX96 mediante PCR en tiempo real:
1. Seleccione un instrumento en el panel Detected Instruments (Instrumentos detectados).
2. Seleccione Tool > Calibration Wizard (Herramientas > Asistente de calibración) para
abrir la ventana y calibrar combinaciones de tinturas y placas nuevas (Figura 81).
115
Recursos
4. Haga clic en Add to Plate (Añadir a la placa) para agregar el fluoróforo. Para vaciar
la placa, haga clic en Clear Plate (Vaciar placa) y se eliminarán todos los fluoróforos.
5. (Opcional) Repita los pasos comprendidos entre el 1 y el 6 para añadir cada uno
de los fluoróforos que prevé calibrar para la placa.
6. Cuando termine de añadir fluoróforos, haga clic en View Plate (Ver placa) para abrir
la pantalla Dye Plate (Placa de tinturas). Utilice esta ventana como guía para cargar
tinturas en la placa.
7. Prepare una placa de 96 pocillos para la calibración de una tintura; para ello, pipetee
la solución de tintura en cada pocillo siguiendo el patrón que se muestra en la pantalla
Pure Dye Plate (Placa de tintura pura). Llene 4 pocillos con 50 μl (para una placa
de 96 pocillos) de solución de tintura de 300 nM por cada fluoróforo. Observe que
al menos la mitad de la placa contiene pocillos vacíos.
116
Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
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Recursos
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
• Limpie los pocillos del bloque. Limpie los derrames inmediatamente para impedir
que se sequen. Utilice pipetas de plástico desechables con agua (recomendado), etanol
al 95% o una dilución de 1:100 de lejía en agua. Utilice también un paño suave
y sin pelusas o una toallita de papel y agua para limpiar el bloque. Enjuague siempre
los pocillos con agua varias veces para eliminar todo rastro de productos de limpieza
¡ADVERTENCIA! Nunca limpie el bloque con soluciones alcalinas fuertes
(jabón fuerte, amoniaco o lejía concentrada). Nunca utilice soluciones de limpieza
corrosivas o abrasivas. Estos productos de limpieza pueden dañar el bloque
e impedir un control térmico preciso.
¡ADVERTENCIA! La lejía, el etanol o el jabón que quede en los bloques puede
corroerlos y destruir plásticos durante una ejecución. Después de la limpieza,
enjuague siempre los pocillos a fondo con agua para eliminar todo rastro
de productos de limpieza.
¡ADVERTENCIA! Nunca caliente el bloque después de haber añadido
una solución limpiadora. De lo contario, el bloque, el módulo de reacción y la base
del termociclador se dañarán.
• Limpie la tapa interna. Utilice agua y un paño suave y sin pelusas para limpiar los
restos y las soluciones de la superficie de la tapa interna. Nunca utilice detergentes
abrasivos ni materiales ásperos que arañen la superficie. La limpieza de la tapa interna
mejora el calentamiento y el enfriamiento precisos de las muestras.
Registro de la aplicación
Antes de una nueva ejecución, el instrumento inicia una prueba autodiagnóstica para
comprobar que está funcionando de acuerdo a las especificaciones. El software registra
los resultados de esta prueba en el archivo de Run log (Registro de ejecución) y Application
log (Registro de la aplicación). Si observa algún problema en uno o varios experimentos,
abra los registros de aplicación y de ejecución para averiguar dónde se originó el problema.
El software CFX Manager registra la información sobre el estado de un instrumento durante
una ejecución en el Application Log (Registro de la aplicación) (Figura 83). Utilice estos
registros para rastrear eventos que hayan tenido lugar en instrumentos y en el software
a fin de resolver problemas.
Para abrir el registro de la aplicación en la ventana principal del software, seleccione
View > Application Log (Ver > Registro de la aplicación).
119
Recursos
Resolución de problemas
Por lo general, los problemas de comunicación entre el software y el instrumento se pueden
resolver reiniciando el ordenador y el sistema. Asegúrese de guardar todo el trabajo en curso
antes de reiniciar.
NOTA: Compruebe que el ordenador tiene suficiente RAM y espacio libre
en el disco duro. El tamaño mínimo de RAM es 2 GB y el espacio libre mínimo
en el disco duro es de 20 GB.
2. Haga clic con el botón derecho del ratón en el icono del CD del software y seleccione
Explorar para abrir la ventana del CD.
3. Haga doble clic en la carpeta CFX_Manager para abrirla y, a continuación, haga doble
clic en setup.exe para abrir el asistente de instalación del software.
4. Siga las instrucciones del asistente para instalar el software y, a continuación, haga clic
en Finish (Finalizar).
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
Figura 85. Manipulación del módulo óptico para retirar la placa de bloqueo.
3. Retire con una llave Allen los dos tornillos grandes que se encuentran debajo del borde
delantero del módulo de reacción (debajo del botón para abrir la tapa). No retire
los dos tornillos pequeños que se encuentran en el borde frontal del módulo.
Debe oír como el pestillo se suelta en el interior del módulo. La Figura 86 muestra
los dos tornillos grandes.
121
Recursos
4. Presione la tapa del módulo de reacción para abrirla. Observe que el pestillo (de plástico
oscuro) ya no está sujeto. Retire las muestras del bloque.
5. Vuelva a montar el módulo de reacción con la tapa abierta. Coloque de nuevo el pestillo
y fíjelo con los tornillos grandes. La Figura 87 muestra el pestillo colocado.
Especificaciones técnicas
Dimensiones y peso
Tamaño (An. x Pr. x Al.) 33 x 46 x 36 cm (13 x 18 x 14")
Peso 21 kg (47 lb)
Electricidad
Tensión 100–240 V
Frecuencia 50-60 Hz
Tipo de fusible 10 A
Condiciones de funcionamiento
Grado de contaminación 2
Clase de instalación 2
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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™
Termociclador
Chasis Chasis C1000
Inclinación máx. de la rampa 5 °C/seg
Inclinación media de la rampa 3,3 °C/seg
Amplitud del gradiente 1-24 °C
programable
Rango de gradientes 0-100 °C
operativos
Método de calentamiento y Peltier
enfriamiento
Tapa Calienta hasta 105 °C
Temperatura
Rango 0-100 °C
Precisión ±0,2 °C de la temperatura programada
a 90 °C
Uniformidad ±0,4 °C a los 10 segundos de alcanzar
90 °C
Óptica
Excitación 6 LED filtrados
Detección 6 fotodiodos filtrados
Rango de longitudes de onda 450–730 nm
de excitación/emisión
Sensibilidad Detecta 1 copia de la secuencia
objetivo en el ADN de genoma humano
Rango dinámico 10 órdenes de magnitud
Software
Sistemas operativos Windows XP, Windows Vista o Windows 7
Análisis multiplex Hasta 5 objetivos por pocillo
Sistema
Con licencia para PCR en Sí
tiempo real
Capacidad para muestras 96 pocillos
Tamaño de las muestras 1–50 μl (se recomiendan 10–25 μl)
Comunicaciones USB 2.0
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Recursos
Referencias
Breslauer KJ et al. (1986). Predicting DNA duplex stability from the base sequence.
Proc Nat Acad Sci 83, 3746–50.
Livak JL et al. (1995). Towards fully automated genome-wide polymorphism screening.
Nature Genetics 9, 341–342.
Pfaffl MW (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time
RT-PCR. Nucleic Acids Research 29(9), 2002–2007.
Vandesompele J, et al. (2002). Accurate normalization of real-time quantitative
RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome
Biology 3(7), 1–12.
Aviso sobre derechos de autor de Minpack (1999), Universidad de Chicago.
Todos los derechos reservados
Se permite la redistribución y el uso en forma de código fuente y binaria,
con o sin modificaciones, siempre que se cumplan las siguientes condiciones:
1. Las redistribuciones del código fuente deben conservar el aviso anterior sobre
los derechos de autor, la lista de condiciones y la siguiente renuncia de responsabilidad.
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Canada 905 364 3435 China 86 20 8732 2339 Czech Republic 420 241 430 532 Denmark 44 52 10 00 Finland 09 804 22 00 France 01 47 95 69 65
Group Germany 089 31 884 0 Greece 30 210 777 4396 Hong Kong 852 2789 3300 Hungary 36 1 459 6100 India 91 124 4029300 Israel 03 963 6050
Italy 39 02 216091 Japan 03 6361 7000 Korea 82 2 3473 4460 Mexico 52 555 488 7670 The Netherlands 0318 540666 New Zealand 0508 805 500
Norway 23 38 41 30 Poland 48 22 331 99 99 Portugal 351 21 472 7700 Russia 7 495 721 14 04 Singapore 65 6415 3188 South Africa 27 861 246 723
Spain 34 91 590 5200 Sweden 08 555 12700 Switzerland 061 717 95 55 Taiwan 886 2 2578 7189 United Kingdom 020 8328 2000