IMPORTANCIA DE LAS DILUCIONES SERIADAS EN TEMAS DE

BIORREMEDIACIÓN BASÁNDOSE EN EL MEJORAMIENTO, USO Y

OBTENCIÓN DE UN MICROORGANISMO COMO LA PSEUDOMONA.
Chisco Fontecha Nicolas
Cely Soto Mauricio
Gaona Quiroga Luisa
Pascagaza Arévalo María
Biotecnología AK1A

INTRODUCCION
En los laboratorios de la Universidad Manuela Beltrán se pretende reconocer la utilidad y la
importancia de las diluciones seriadas en relación con la biorremediación, mediante el proceso
de mejoramiento, uso y obtención de un microorganismo como la Pseudomona. Para ello
inicialmente se realizaron diluciones serias de 10–1, 10–2 y 10–3 de un cultivo denso de
Pseudomonas, de cada una de las diluciones se tomó un volumen determinado y se trasfirió a
tres cajas de Petri que contenían mantequilla, gasolina y caldo nutritivo respectivamente,
además se determinó la densidad de poblacional de las diluciones y la cantidad de UFC
presentes en cada una de las cajas de Petri a las 24h y 48h de incubación a 37°C.
Posteriormente, se determinó que la Pseudomona sirve para la biorremediación ya que se
observó una degradación de aproximadamente 10% del hidrocarburo en tan solo 48 horas.
JUSTIFICACIÓN
Es de importancia la utilización de las diluciones ya que son utilizadas para saber cuál es la
concentración de soluto que actúa como medio óptimo para el crecimiento microbiano.
Asimismo, esta práctica tiene como objetivo evaluar el crecimiento de la Pseudomona en
diferentes diluciones de la misma, además la utilización de distintos agares para así analizar la
degradación de gasolina comparando con el agar de mantequilla y caldo nutritivo.
Por otro lado, es de vital importancia conocer la función de la Pseudomona ya que estás son
relevantes en el campo ambiental, gracias a su biodegradación de materia orgánica como los
hidrocarburos, pesticidas, entre otros. Posteriormente, tener en cuenta cuando se puede utilizar
el microorganismo y en qué caso utilizarlo como por ejemplo a la hora de remediar un cuerpo
hídrico o un suelo que tuvo un derrame de hidrocarburo.
De igual importancia a la hora de estabilizar un suelo que ha sido contaminado por pesticidas,
las pseudomonas son eficientes a la hora de la degradación de componentes tóxicos, como los
plaguicidas que son altamente utilizados a la hora de cosechar y por ende el suelo pierde
fertilidad (Martínez y García, 2012).
OBJETIVO
Este proyecto tiene como principal objetivo reconocer la utilidad e importancia de las
diluciones seriadas en temas de biorremediación basándose en el mejoramiento, uso y
obtención de un microorganismo como la Pseudomona, para ello se plantearon tres objetivos
específicos: Inicialmente, comprender qué son y cómo se realizan las diluciones seriadas; En
consecuencia, relacionar la densidad poblacional de las Pseudomonas con las diluciones de 10–
1
, 10–2 y 10–3, que parten de una solución densa de un cultivo de Pseudomona y finalmente,
comparar la eficiencia de las Pseudomonas en la degradación de grasas e hidrocarburos
variando la densidad poblacional de las cepas.
MARCO TEÓRICO
Las diluciones se caracterizan por tener una menor concentración que la disolución inicial ya
que con las diluciones se hace una reducción de la solución adicionando más solvente
(Ilustración 1)(Peña & Gómez, 2017). Las concentraciones varían según la cantidad en la que
se vaya a disolver la sustancia y el número de diluciones realizadas. Por ejemplo, se toma 1
ml de una solución y se disuelve en 9 ml de solvente se obtendrá una concentración 10−1
indicando que de cada 10 ml de esta dilución 1ml pertenece a la solución inicial (Barcina,
Orruño and Arana, et al.). Para realizar varias diluciones se pueden realizar los cálculos con
fórmulas como la (Ecuación 1).
1 𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 (1/10) = = 10 ml de dilución 1/10 ó 10−1
1 𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 9𝑚𝑙 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒
Ecuación 1. Preparación de diluciones

Ilustración 1. Diluciones Fuente: (SILVANA, 2006)

Las diluciones se pueden determinar como una mezcla homogénea por las cantidades usadas
ya que no son fijas y en la dilución que se quiera estudiar va a tener los mismos componentes
que la dilución inicial. Existen varios tipos de diluciones ya sea seriadas, no seriadas,
independientes y químicas (Muniz Lozano, 2012).
Las diluciones seriadas como su nombre lo indica son diluciones en serie que se relacionan
con los componentes usados y el factor de dilución ya sea al décimo (1:10) o al medio (1:2).
Este tipo de diluciones es usado para determinar el efecto de alguna sustancia en el ambiente,
conocer la cantidad de unidades formadoras de colonia en un medio, la cantidad de dosis de
un fármaco a usar para una enfermedad etc (Coto, n.d.). También puede ser usado para
determinar la presencia de organismos en el agua como lo indica (Navarro, 1994) donde para
determinar Coliformes totales y E. Coli en agua realizaron diluciones para la siembra de las
cepas tomando como control negativo la cepa Pseudomona aeruginosa por ser lactosa
negativa y control positivo la cepa E. coli que crece en el medio si hay presencia de lactosa
realizando diluciones 10−9 y posteriormente incubar cada muestra para realizar el respectivo
análisis y determinar la calidad del agua que se maneja ya que este tipo de cepas no deben
estar presentes en agua aún más si son para consumo humano. En otro caso se evaluó la
resistencia de la cepa Pseudomona sp frente al insecticida LORSBAN 4 EC identificando
factores que afectaban la efectividad del mismo en los cultivos de pastos, se manejaron
diluciones a partir de la concentración del insecticida obteniendo una degradación total del
insecticida por parte de la Pseudomona para cada una de las concentraciones usadas
(Quinchía, Gómez, Palencia Penagos, & Giraldo Lopera, 2006).Según lo anterior, se puede
identificar que las diluciones no solo se realizan para la reducción de una sustancia sino
sirven para determinar sustancias u organismos importantes en la remediación de suelos y
agua principalmente, analizando el metabolismo de los mismos y las condiciones para su
buen crecimiento.
En el caso de la biorremediación la implementación de diluciones seriadas permite conocer
las concentraciones optimas en el comportamiento de los organismos usados en este proceso,
la efectividad de degradación de los compuestos contaminantes, determinando así las cepas
más eficaces en el proceso y el medio o condiciones favorables para el crecimiento de la
mismas; permitiendo generar nuevas aplicaciones de organismos en pro de la recuperación
del suelo. Por ejemplo, en un estudio realizado por (Ramírez et al., 2012) se implementó las
diluciones seriadas a partir del suelo contaminado con combustible con una concentración
(10−9 ) y realizo la siembra (ultimas 3 diluciones) de cepas como Enterobacter sp, Bacillus
sp, Staphylococcus aureus, Sanguibacter soli, Arthrobacter sp y Flavobacterium sp en dos
medios diferentes y como resultado se identificaron los factores de crecimiento para las cepas
según los medios de cultivo usados, la efectividad de degradación de hidrocarburos de las
cepas donde todas fueron efectivas gracias a su metabolismo convirtiendo moléculas
peligrosas en componentes que pueden ser reincorporados a los ciclos biogeoquímicos
naturales.
Una de las cepas más usadas en este tipo de procesos como la biorremediación son las
Pseudomonas gracias a sus características de producción de biosurfactantes los cuales ayudan
con la remoción de aceites por medio de la solubilización y penetración de los hidrocarburos
a la pared celular hidrofílica (Benavides et al., 2006). Son bacterias gram negativas que por
su fácil adaptación al ambiente o medio de cultivo usando para su nutrición diversas fuentes
de carbono y nitrógeno, esto facilita realizar diversos tipos de experimentos como controles
de calidad de aguas, indicadores de contaminantes en el suelo y agua, entre otros (Estupiñán-
Torres et al., 2017).
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
Materiales y equipos Cantidad
Tubos de ensayo 3
Micropipeta 1
Puntas de micropipeta 4
Incubadora A 37°C 1
Espectrofotómetro 1
Celdas espectrofotómetro 3
Gradilla 1
Caja de Petri agar gasolina 1
Caja de Petri agar mantequilla 1
Caja de Petri agar nutritivo 1
Tabla 1. Materiales, equipos y reactivos.
METODOLOGÍA
El presente proyecto se llevó a cabo en tres partes: En primer lugar, se prepararon las
diluciones seriadas por lo que se necesitó de cuatro tubos de ensayo de los cuales tres
contenían 9 mL de agua peptonada al 0.1% y un tubo de ensayo contenía una solución de
caldo nutritivo y cultivo de Pseudomonas; siendo así, con una micropipeta se tomaron
1000μL de la solución y se trasfirieron a un tubo de ensayo que se rotulo como la dilución de
10–1, posteriormente de este tubo de ensayo se tomaron 500μL los cuales se pasaron a una
caja de Petri que contenía mantequilla y además se tomaron o1000μL que se pasaron a un
tubo de ensayo rotulado como 10–2 , donde se tomaron 1000μL que se pasaron a una caja de
Petri que contenía gasolina y para finalizar se preparó la última dilución donde se tomaron
1000μL de la dilución de 10–2 y se trasfirieron a un tubo de ensayo rotulado como 10–3 del
cuál se tomaron 500μL y se trasfirieron a otra caja de Petri que contenía caldo nutritivo, todas
las cajas de Petri fueron incubadas en posición invertida a 37°C durante 48 horas. En segundo
lugar, se determinó la densidad de la población que estaba presente en cada una de las
diluciones preparadas con ayuda del espectrofotómetro, partiendo de las absorbancias que
registraban las mismas. En último lugar, se realizó el recuento por placa, es decir se
determinó la cantidad de UFC/mL presentas en las cajas de Petri ya antes mencionadas, el
recuento se realizó a as 24h y a las 48h.
RESULTADOS
A continuación, se representan los resultados de la segunda y de la tercera parte de la
metodología ya presentada. En Tabla 2 y el Grafico 1 se presentan las absorbancias que se
registraron en el espectrofotómetro en cada una de las diluciones seriadas, mientras que en la
tabla 3 se muestran la cantidad de UFC/mL sé que evidenciaron en cada caja, como en todas
no fue posible el recuento se expresó en porcentaje.
Dilución Absorbancia (nm)
10–1 0,023
10–2 0,013
10–3 0,009
Tabla 2. Densidad poblacional presente en las diluciones.

Gráfico 1. Densidad de Pseudomonas presente en las diluciones

 Dilución Contenido caja de Petri Cantidad UFC/mL a 24h Cantidad UFC/mL a 48h
10–1 Mantequilla 70% 78%
10–2 Gasolina 0 4600
10–3 Caldo nutritivo 18000 22000
Tabla 3. Cantidad de Pseudomonas en UFC/mL presentes en los agares.
ANEXOS
En las siguientes fotos, se evidencia cada crecimiento en cada agar en las 24 y 48 horas de
incubación a 37°C.

Ilustración 2. Crecimiento microbiano agar mantequilla a las 24 horas de incubación.

Ilustración 3. Crecimiento microbiano agar nutritivo a las 24 horas de incubación.

 Ilustración 4. Crecimiento microbiano agar gasolina a las 24 horas de incubación.

Ilustración 5. Crecimiento microbiano agar mantequilla a las 48 horas de incubación.

Ilustración 6. Crecimiento microbiano agar nutritivo a las 48 horas de incubación.

 Ilustración 7. Crecimiento microbiano agar gasolina a las 48 horas de incubación.

DISCUSIÓN
En la tabla 2 y gráfico 1 se puede observar que la absorbancia de la Pseudomona iba
disminuyendo a medida que la concentración en las diluciones disminuía, lo que quiere decir
que hay una relación directamente proporcional. De acuerdo con los resultados obtenidos se
observó que donde hubo mayor crecimiento microbiano fue en el agar de mantequilla y esto es
debido a que la mantequilla es un ácido graso como el tributirin y es por esto que la
Pseudomona degrado más del 70% (microkit, 2018). No obstante, se esperaba que la
Pseudomona tuviera un crecimiento mayor en el caldo nutritivo ya que este tiene todos los
componentes para un crecimiento eficaz de un microorganismo. También se presentó un grado
de crecimiento en el agar de gasolina de aproximadamente del 10% gracias a esto se concluyó
que la Pseudomona sp. es degradadora de hidrocarburos y grasas, lo cual es funcional para la
biorremediación de suelos y cuerpos hídricos contaminados con hidrocarburos.
En este mismo estudio se expone la degradación de hidrocarburos por diferentes pseudomonas
como la Pseudomona putida, Pseudomona aeruginosa y una bacteria que es la Acinetobacter
sp. Posteriormente, hacer la comparación del crecimiento y la biodegradación de los
hidrocarburos.
 Ilustración 8. Crecimiento microbiano agar petróleo en 5 cepas bacterianas (Braibant,
2004).
Comparando con la Pseudomona utilizada en el laboratorio se evidenció que las cinco cepas
bacterianas y, sobre todo la bacteria Acinetobacter obtuvo un mayor crecimiento a diferencia
de las otras Pseudomonas putidas como se muestra en la Ilustración 8. Por el contrario, la
Pseudomona sp. utilizada en el laboratorio las primeras 24 horas no hubo crecimiento como se
puede observar en la Ilustración 4 y esto es debido a que la cepa se encontraba en la fase de
adaptación, pero luego de 48 horas de incubación ya se puede observar un crecimiento como
se evidencia en la Ilustración 7. En consecuencia, después de las 24 horas comienza a haber un
comportamiento estacionario y esto sucede porque la cantidad de nutriente (petróleo) se está
disminuyendo y por ende la disminución microbiana (Braibant, 2004).

Ilustración 9. Crecimiento microbiano agar petróleo por Pseudomona aeruginosa (Perez et.
al, 2007).
Finalmente, en la ilustración 9 donde se utilizó dos clases de Pseudomonas aeruginosa donde
se evidencia un buen crecimiento y debido a esto la eficacia de la biodegradación del petróleo
o hidrocarburo donde a las 48 horas de incubación ya se habría logrado aproximadamente el
60% de la degradación del hidrocarburo a diferencia de la Pseudomona sp. utilizada en el
laboratorio que tan solo degrado el 10% de la gasolina y esto es debido a que la Pseudomona
aeruginosa tenía mayor concentración ya que no estaba hecha a partir de diluciones. No
obstante, se determinó que a medida que aumenta el tiempo la velocidad de crecimiento
disminuye al igual que en la Ilustración 8 debido a que el hidrocarburo utilizado está
disminuyendo (Pérez et. al, 2007).
CUESTIONARIO
• ¿Se observa que las Pseudomonas consumen la gasolina o el pesticida?
Las Pseudomonas utilizadas en este estudio presentaron un crecimiento mínimo en el agar
con gasolina, es decir, llegaron a consumir parte de la gasolina en las 48h que estuvieron
en incubación, sin embargo, como la gasolina no es un compuesto puro y su degradación
es compleja, con más tiempo los resultados habrían sido mejores.
• Consulte las rutas metabólicas utilizadas por los microorganismos para la
degradación de hidrocarburos alifáticos y aromático
Biodegradación anaerobia de hidrocarburos aromáticos
La biodegradación por ruta anaerobia es un proceso alternativo de degradación de
compuestos orgánicos que se da principalmente por un consorcio o grupo de bacterias en
su mayoría fermentativas. La degradación anaerobia consiste en dos importantes pasos, el
primero, es la activación de los hidrocarburos mediante una serie de reacciones donde
intervendrán algunas enzimas y en segundo lugar se realizará la reducción de estos
hidrocarburos mediante dos vías; vía del fumarato y vía del Benzoil CoA. Ahora, en este
estudio, se evidencia que el grupo de bacterias Pseudomonas, tienen una eficiencia del
71,4% para la degradación del Benceno (Villareal, S., Balagurusamy, N., Rodríguez, R.,
Aguilar, C., Morlett, J. 2014)
Biodegradación del petróleo
Durante este proceso se pueden dar diferentes vías de degradación dependiendo de la
composición y la estructura molecular del compuesto. Por ejemplo, los alcanos lineales
cuando son asimilados por las bacterias pueden ser degradados por la Beta-oxidación
(García, U., Aguirre, L., 2014)
• Consulte las rutas metabólicas utilizadas por los microorganismos para la
degradación de pesticidas.
La degradación de pesticidas es sumamente compleja debido a que depende de muchos
factores, tanto como el degradante y el compuesto a degradar ya que estos compuestos
tienden a ser muy persistentes y ser difíciles de eliminar. Por ejemplo, en una investigación
se estudia la degradación de DDT (diclorodifeniltricloroetano), un plaguicida utilizado para
las cosechas, mediante microorganismos como Pseudomonas. Se evidenció que en
condiciones aerobias su degradación produce ácido clorobenzoico y en condiciones
anaerobias produce diclorodifenildicloroetano (DDD) mediante una reacción de
decloración reductiva. (Betancur, B., Peñuela, G., Cardona, S., sin año)
• Consulte otras técnicas para el conteo de poblaciones de microorganismos
Así como hay otras técnicas de conteo, éstas también tienen su propio procedimiento de
siembra, por ejemplo, el Microgoteo. Primero que todo para realizar la siembra se debe
dividir la caja de Petri que tenga agar nutritivo solidificado en cuatro cuadrantes, luego
realizar las respectivas diluciones y seguir con la siembra. Para el conteo solo se observa la
caja de Petri en el cuadrante deseado con su respectiva dilución y se sabrá la cantidad del
microorganismo. (Barrero, C., Gaitán, J., Orjuela, J., Pérez A, 2016)
CONCLUSIONES
En conclusión, se determinó que al realizar más diluciones a partir de extraer 1000 μL de la
disolución inicial a un tubo de ensayo con 9ml de agua peptonada al 0.1% los datos de
absorbancia también disminuían (Grafico 1) indicando la reducción de concentración de
Pseudomonas, generado al pasar de una dilución de 10−1 a 10−3 donde la dilución con
concentración (10−3) obtuvo menor absorbancia 0,009nm, esto también dio paso al bajo
crecimiento de colonias de Pseudomonas en el agar nutritivo ya que a pesar de tener
condiciones buenas para su crecimiento la concentración (10−3 ) es baja para su buen
desarrollo, por el contrario la dilución (10−1) cultivada en el medio de mantequilla su
crecimiento fue optimo debido a como lo indica la absorbancia (0.023nm) tiene la mayor
concentración de Pseudomonas y por otro lado el medio de cultivo con mantequilla mejoro el
crecimiento de la cepa confirmando que las Pseudomonas se desarrollan bien en medios con
aceites gracias a sus propiedades de degradación; También se observó que estas cepas son
capaces de degradar hidrocarburos como la gasolina ya que a las 48h de incubación se
observó crecimiento de colonias después de pasar por la fase de adaptación al medio.
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