Taller # 2 Metodologia SPA

Katherine Gisely Rozo Joya y Alegy Elizabeth Leon Acosta

Ensayo de proximidad de centelleo (SPA), caracterizado por su velocidad, sensibilidad, fiabilidad y el

hecho de que no se requiere un paso de separación, se ha convertido en una técnica importante en la
detección de alto rendimiento (HTS) para nuevos medicamentos, y para investigar sus interacciones
biológicas. Es un ensayo de unión a ligando, la técnica se basa en la observación de que una partícula
p emitido por un radioisótopo solo viajará una distancia limitada en un ambiente acuoso. El uso de
SPA en RIA ha sido facilitado por nuevos operadores, como las membranas que se pueden configurar
en varias formas y tamaños, lo que permite que el ensayo se realice en muestras de muchas fuentes,
incluidos tejidos,suero, plasma o células.[a][b]
EL Método se basa en que si el radioligando no se "captura" en el cordón SPA (figura 1a), la energía
de la desintegración radiactiva se disipa en el ambiente acuoso y no emite luz, dejando la
desintegración sin ser detectada. y si el radioligando se captura en la superficie de la perla de SPA
(figura 1b), el radioisótopo se acerca al centelleante y las partículas β transfieren efectivamente su
energía al centelleante, lo que produce una emisión de luz que puede ser detectada por contadores de
centelleo líquido Por lo tanto, el ligando radiomarcado unido y libre puede detectarse y no es
necesaria una separación física, como la centrifugación, el lavado y la filtración, lo que hace que la
operación sea más conveniente y fácil de automatizar que otras técnicas de ensayo de unión. [b]

[b]
Medición de la actividad enzimática: En los ensayos de enzimas SPA, la conversión del sustrato en
producto se controla mediante la eliminación o la adición de radioisótopos al componente, que se
captura en el cordón SPA. Se contemplan Tres formatos; remoción de señal básica, adición de señal y
captura de producto.

1. ¿Como haría un ensayo para descubrir inhibidores de proteasa?

para Enzimas que catalizan la hidrólisis de un enlace químico como las proteasa se usa un formato de
eliminación de señal, el sustrato radiomarcado se biotinilada a la perla SPA, lo que da como resultado
el centelleo de la perla. Cuando la catálisis de una enzima específica separa el resto radiactivo de la
porción biotinilada de la molécula del sustrato, la señal de luz disminuirá. [b]

Se tiene una molécula centelleante y un sustrato marcado con un aminoácido radioactivo (Para
detectar una transferencia de energía y la posterior emisión de luz al estar marcada radiactivamente).
El virus entraria normalmente a romper la unión entre el sustrato de la porción centelleante y se
perdería la señal, pero l​os cambios de la señal radiactiva pueden ser usados para detectar los
inhibidores de la proteasa pero la intensidad de la señal depende del radioisótopo.
En el diagrama podemos ver el principio del ensayo de proximidad por centelleo (SPA) usado para
detectar el inhibidor de proteasa del citomegalovirus humano (HCMV). El péptido sustrato (la línea
negra, gruesa horizontal) es unido a la pieza del ensayo de proximidad por centelleo a través del
sistema streptavidina-biotina (Av-Bio) el cual tiene un
sitio de rompimiento (rectángulo negro). El péptido es
fosforilado con una adenosina trifosfato (ATP) marcada
radiactivamente en el residuo cerca a la parte terminal
carboxílica. El centelleante dentro de la pieza del ensayo
de proximidad por centelleo es estimulado por el
decaimiento radiactivo y la alta señal radiactiva que
puede ser detectada. El rompimiento del péptido por el
citomegalovirus separa el fosfato marcado de la parte
relacionada a la pieza del ensayo de centelleo
disminuyendo a su vez los conteos por minuto. Sin
embargo, la presencia de los inhibidores de proteasa
pueden prevenir este rompimiento.

2. ¿Como haría un ensayo para descubrir inhibidores de transferasa?

En el formato de adición de señal, que es adecuado para actividades de transferencia molecular

actividad de las transferasas, el sustrato aceptor está biotinilado y el sustrato donador está
radiomarcado. El radiomarcador se transfiere del sustrato donante al sustrato receptor, que a su vez es
capturado por la perla SPA y da como resultado la generación de una señal. una enzima. Las
transferasas son enzimas que catalizan la transferencia de un grupo funcional, como las quinasas que
transferen un grupos fosfatos desde ATP a ua un sustrato específico o diana mediante la fosforilación.
[b]

[a]
En el ensayo del inhibidor de la quinasa, el sustrato peptídico se inmoviliza en la perla de SPA a
través de un sistema de captura de biotina-estreptavidina. La quinasa activa transferirá el fosfato [33P]
del cofactor [γ- 33P] -ATP a un residuo específico Tyr o Ser / Thr en el péptido. Cuando el fosfato
[33P] incorporado se acerca al centelleador de perlas de SPA, se genera una señal fuerte. La presencia
de concentraciones crecientes de inhibidor de quinasa disminuirá la velocidad de conversión de [γ-
33P] -ATP, lo que conducirá a una señal más débil. La fuerza de la señal será inversamente
proporcional a la cantidad de inhibidor presente.[a] Entonces podemos observar que cuando se
interrumpe la transferencia molecular, en este caso el grupo fosfato del ATP radiomarcado al ADP la
señal es menor que cuando hay menos cantidad del inhibidor esto nos corrobora su actividad negativa
sobre la acción enzimática.

Bibliografia
[a] ​Cook, N. D. (1996). ​Scintillation proximity assay: a versatile high-throughput screening
technology. Drug Discovery Today, 1(7), 287–294.​ doi:10.1016/1359-6446(96)10026-x
https://sci-hub.tw/10.1016/1359-6446(96)10026-x
[b] ​Wu, S., & Liu, B. (2005). ​Application of Scintillation Proximity Assay in Drug Discovery.
BioDrugs, 19(6), 383–392.​ doi:10.2165/00063030-200519060-00005
https://sci-hub.tw/10.2165/00063030-200519060-00005