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ERIKA VIVIANA MORENO RIVERA
DANIEL FERNANDO VANEGAS GUTIERREZ
LICENCIADO EN QUÍMICA
DIRECTORES:
2
TABLA DE CONTENIDO
3
5.2.5 Desarrollo del método de mezclado ............................................................................... 31
5.2.6 Desarrollo de una bomba peristáltica para la reposición de agua evaporada.
31
5.3 Optimización de los métodos de cultivo ......................................................................... 32
5.3.1 Crecimiento y comprobación de la esterilidad de la bacteria E. coliMC4100 en
medio LB ..................................................................................................................................................... 32
5.4 Ajustes finales al biorreactor para el crecimiento de E. coliMC4100. ................. 32
5.5 Prueba de esterilidad en el biorreactor........................................................................... 33
5.6 Seguimiento y estudio del crecimiento deE. coliMC4100, en el biorreactor ya
conformado. ............................................................................................................................................... 33
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS........................................................................................................... 35
6.1 Diseño de biorreactor air-lift. .............................................................................................. 35
6.2 Variables de control y medida ............................................................................................ 35
6.3 Materiales para el diseño del biorreactor............................................................................. 38
6.4Prueba de esterilidad ....................................................................................................................... 40
6.5 Elección de E. coliMC4100 como microorganismo modelo ..................................... 42
6.6 Crecimiento de E. coliMC4100 ............................................................................................ 42
6.7 Análisis de costos ..................................................................................................................... 47
7. CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 49
8. RECOMENDACIONES .................................................................................................................... 50
9. AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................................... 52
10. RECURSOS DISPONIBLES ........................................................................................................... 53
11. CRONOGRAMA ................................................................................................................................ 54
12. BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………………………………………..56
4
LISTA DE TABLAS
5
LISTA DE FIGURAS
6
LISTA DE ABREVIATURAS
BR: Biorreactor
FBR: Fotobiorreactor
PVC: Policloruro de vinilo
GRESIA: Grupo de Investigación en Recursos, Ecología, Desarrollo Sostenible e
Ingeniería Ambiental
UAN: Universidad Antonio Nariño
LDR: light dependent resistor
PSI:PhotonSystems Instruments
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RESUMEN
Así, este estudio se dio debido a la necesidad de hacer posible estos estudios con
inversiones considerablemente menores para la adquisición de biorreactores,
encaminado a aumentar las investigaciones relacionadas que contribuyan en los
avances biotecnológicos que están involucrados.
8
1. INTRODUCCIÓN
9
principio y funcionamiento. Aquellos que se encuentran comercialmente a la venta
permiten controlar condiciones de temperatura, pH, flujos de entrada y salida,
esterilidad, además de medición de variables como concentración de dióxido de
carbono y oxígeno, sin embargo estos son muy costosos (desde miles hasta
decenas de miles de dólares), restringiendo las posibilidades de su uso para
estudios.
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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
11
3. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
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4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA
4.1 Biorreactor
4.1.1¿Qué es un biorreactor?
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- Biorreactores discontinuos:
- Biorreactores continuos
Son ideales para fines industriales cuando han de tratarse grandes cantidades de
sustancia y permiten obtener un buen control de la calidad del producto. Tienen un
flujo uniforme de entrada ysalida de nutrientes, donde la alimentación debe ser
consistente con la cantidad de nutrientes que son usados y a la vez extraídos del
biorreactor. Estos sistemas no tienen sedimentación.
- Biorreactores semicontinuos
Son sistemas más flexibles pero de más difícil análisis y operación que los
anteriores; estos consisten en remover al “final” de la operación un 80 o 90% de la
producción de biomasa y es restituida con una cantidad equivalente de medio de
cultivo. Este proceso permite un “reinicio” con un inoculo de gran tamaño y elimina
la fase de adaptación del microorganismo al medio, lo que favorece la velocidad
de crecimiento, la cual puede controlarse con estrategias de suministro de
nutrientes.
4.1.3 Clasificación
- Biorreactor tubular
Están fabricados con plástico o cristal, en forma tubular ya sea horizontal, vertical,
serpentín o cónico; normalmente estos operan al aire libre debido a la escala de
trabajo y por tanto requerimiento de espacio. La transferencia de O2o CO2 se suele
hacer a partir de la inyección de aire, la cual también permite su agitación.
Tienen una gran relación superficie: volumen, esto favorece el área superficial y
así la captación de luz, por esta razón este tipo de sistema es especialmente
utilizado para organismos fotoautótrofos.
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- Fotobiorreactor (FBR)
Es un biorreactor que incorpora algún tipo de fuente de luz. Los FBRs son por lo
tanto sistemas especializados para el cultivo de microorganismos fotoautótrofos.
Son principalmente empleados en el cultivo de microalgas, los FBRs introducen
CO2 para mejorar el crecimiento en presencia de luz, agua y nutrientes (5).
- Biorreactor air-lift
Por su clasificación los BRs air-lift se pueden dividir en dos clases según su tipo
de estructura: reactores de bucle externos, en el cual la circulación toma lugar por
conductos separados y distintos; y reactores de bucle interno, en los cuales los
conductos se colocan de una manera estratégica dentro de un mismo recipiente
para crear los flujos que permitan la circulación, sin embargo, estos diseños se
pueden modificar, permitiendo variaciones en la dinámica de los fluidos (8).
15
Figura 2. Tipos de bioreactores air-lift. Figura adaptada de (8).
4.1.4Sistemas de acople
4.1.4.1Sistemas de control
- Temperatura:
- Nutrientes:
16
Algunosnutrientes se necesitan en una mayor cantidad que otros, a estos se les
denomina macronutrientes y los usados en menor proporción, micronutrientes (9).
- Iluminación:
- pH:
4.1.4.2Sistemas de medida
- Densidad celular:
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así, como es importante hacer un seguimiento de éste. Para tal seguimiento
existen técnicas directas de medición, como el conteo celular que permite hacer
una relación entre una muestra y la totalidad del cultivo, a pesar de ser un método
relativamente preciso, presenta limitaciones instrumentales y rapidez de medición.
- Volumen:
4.1.5 Agitación
4.1.6 Mezclado
18
4.1.7 Materiales para la construcción de Biorreactores
19
importancia los microorganismos para ser fuentes de extracción de
compuestos de interés nutricional y farmacológico, además de otras ramas.
- Producción de biocombustibles
La producción de biocombustibles a escala industrial en gran medida está dirigida
hacia la industria azucarera, siendo un recurso cada vez más limitado. Por tal
motivo surgió la necesidad de buscar fuentes alternativas de los biocombustibles,
se ha encontrado que algunos microorganismos tienen considerables niveles de
producción de biodiesel, bioetanol, biohidrógeno y biometano (16), (17), (18), (19),
obtenidos directamente como producto de su metabolismo o elaborados a partir de
su alto contenido lipídico.
4.2 Bacterias
4.2.1Generalidades
Las bacterias son microorganismos que presentan tamaños entre 0,5 y 5m.
Básicamente se diferencian según su forma, en cocos (esféricas u ovaladas),
bacilos (cilíndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral) (19). Estos
organismos son los más abundantes en el planeta siendo ubicuos, es decir,
pueden crecer en el suelo, en la profundidad del mar, en lugares calientes y ácidos
incluso en residuos radioactivos (20).
20
- Microarófilos: Crecen mejor con tensiones de oxígeno bajas (3%-5%), las
concentraciones elevadas (21%) tienen un efecto inhibidor para estas
bacterias.
4.2.2 Crecimiento
4.2.2.1Fases de crecimiento
Por lo general una bacteria requiere 24 horas para su crecimiento a partir de unas
pocas células en las condiciones adecuadas para su desarrollo, este presenta
cuatro fases características(20), como se evidencia en la Figura 3.
21
Figura 3. Fases de crecimiento bacteriano. Adaptado de (4).
22
5. METODOLOGÍA
5.1 Generalidades
Para este diseño se tuvo como fin, elaborar métodos de control y medida de las
variables de interés. Conjunto a esto se seleccionaron materiales que resistieran
las condiciones a las cuales fueron sometidos.
- Temperatura:
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Figura 4. Sistemas electrónicos: temperatura, intensidad lumínica y
reposición de agua.
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El sistema mide la temperatura del cultivo a través de una sonda(Figura 6) que
está dentro de un tubo de ensayo acoplado a la tapa del BR, que al cerrarqueda
dentro del recipientede tal manera que la base de este tubo está sumergida en el
cultivo y así permite un equilibrio térmicoentre el tubo, el medio y la sonda.
- Densidad Celular:
25
Figura 7. Sistema de muestreo.
Estos fueron elaborados a partir de silicona poliéster, que solidifica con ayuda de
un catalizador, para la obtención de los empaques fueron usados moldes a la
medida elaborados en una impresora 3D (Figura 8).
26
- Sistema de intensidad lumínica:
- Suministro de luz:
- Fuente de Oxígeno:
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Con el fin de mejorar la disolución de oxígeno en el cultivo, se implemento el
método de la manguera perforada para disminuir el tamaño de las burbujas y por
ende aumentar el área superficial. Acontinuación, se describe el método
implementado:
- Fuente de nutrientes:
Medio LB: como nutrientes para el cultivo de las bacterias fue usado medio LB que
está compuesto por 1.0g de triptona, 5.0g NaCl y 5.0g de extracto de levadura por
litro de agua destilada; este medio principalmente se usa para el desarrollo óptimo
del microorganismo.
Esta selección fue determinada a partir de los requisitos necesarios para los
objetivos de la investigación.
La esterilización se llevó a cabo por medio de una autoclave (All american model
No 50X), donde los materiales se sometieron a una temperatura máxima de 122C
y a una presión de 20 psi, siendo así, los materiales que conforman el BR son
resistentes a dicho proceso, éstos son, el recipiente que contiene el cultivo, salida
de aire, los sistemas de inyección de airey muestreo.
- Transparencia:
El recipiente debe permitir el seguimiento del cultivo a simple vista, esto facilita su
estudio.Siendo así el recipiente usado es translucido para dicho requerimiento.
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Recipiente: se utilizó un recipiente de polipropileno PP (Figura 10),
comercialmente utilizado como contenedor de alimentos. Tiene una capacidad
de 1600mL, es translucido y cuenta con una tapa del mismo material con sello
hermético.
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Tabla 1. Materiales y especificaciones de los sistemas sometidos a
esterilización.
Muestreo Cuerpo de la T.
(Ver figura 7) PVC
Forma de U invertida que conduce el
Tubo de acero inoxidable cultivo hasta el colector.
Permiten la entrada de el tubo de
Empaques de caucho siliconado acero inoxidable por un lado y por el
otro el de la manguera conectada a la
jeringa, sin perder el sello hermético
de la T.
Manguera siliconada Una pieza de 2cm permite el ajuste del
tubo en la tapa del BR.
Aireación Tubo de acero inoxidable A través de éste pasa el aire
Manguera siliconada -Es usada para crear un sello
hermético en la tapa.
-La manguera perforada está
conectada a la parte inferior del tubo.
Recipiente Resistencia a alta temperatura y
(Ver figura 10) PP transparencia.
La tapa ofrece resistencia para la
inclusión de los sistemas a través de
ésta.
Riser Su cuerpo está hecho a partir de un
(Ver figura 11) PP recipiente de PP de 500mL.
Se usaron cortes de 1 cm a los
Tubo de acero inoxidable costados dentro de perforaciones,
para ajustarlo en el centro del BR
Ajusta los cortes de tubo a las
Manguera siliconada perforaciones en los costados.
Salida de aire Es doblado en forma de L, la parte
(Ver figura 13) Tubo de acero inoxidable inferior de la L no esta sumergida en el
medio.
-Es usada para crear un sello
Manguera siliconada hermético en la tapa.
-Es acoplada a la parte superior del
tubo, doblada constantemente hacia
abajo.
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5.2.5 Desarrollo del método de mezclado
Figura 11. Riser: pieza que facilita el flujo uniforme del cultivo. Tiene
soportes en las paredes para centrarlo.
31
Figura 12. Diseño de la bomba peristáltica.
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fueranóptimos y estables, el sistema de muestreo funcionara de manera adecuada
y que su uso no afectara la esterilidad del BR, el sistema de reposición de agua
fuera eficiente, en cuanto a velocidad de flujo y facilidad de uso, además, al igual
que el anterior conserve la esterilidad del medio.
Además se tomó una muestra del cultivo a las 48h y esta se sembró en medio LB
con agar sólido, se incubo a 37°C por 24h.
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crecimiento celular por medio de la densidad óptica, con ayuda del sistema de
muestreo y un espectrofotómetro (THERMO SCIENTIFIC GENESYS 20),
realizado de la siguiente manera:
Mediante el sistema de muestreo se tomaron las muestras del cultivo, con una
frecuencia de 30 minutos, iniciando en el minuto cero, esta muestra se llevó al
espectrofotómetro con el método de muestreo usado en la prueba de esterilidad
(600nm y medio LB estéril como blanco). El blanco utilizado fue desechado y
renovado en cada medición.
34
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS
- Densidad celular
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momento de su uso se encontraba a una menor temperatura que la del entorno,
este aspecto no afecta directamente en la medición. Sin embargo, es de
considerar que la conservación del blanco fue perturbada debido a esta diferencia
de temperaturas entre el blanco y el entorno, yaque al entrar en equilibrio térmico
con el medio generaba pequeñas burbujas en la pared de la celda en la que
estaba contenido, teniendo como resultado un error considerable; dichofenómeno
condujo a la necesidad de desechar y renovar el blanco en cada medición.
- Intensidad lumínica
Este sistema se basó en el uso de una resistencia tipo LDR como fuente de
medición, donde, al poner en marcha el BR la medición representaría la mayor
absorción de luz, por el contrario, la menor al finalizar, debido al aumento de la
densidad celular impidiendo el paso de luz.
En este proceso es importante la fuente de luz (natural o artificial), es por esto que
fue necesario establecer una fuente de luz constante, para lo cual fueron utilizadas
las luces LED, estas fueron dispuestas en las paredes de una caja cerrada,
destinadas para el uso con microorganismos fotoautótrofos. Con esto se aseguró
que la entrada incidente de luz fuese constante y que cualquier variación sería
debido al crecimiento celular.
La intensión de este sistema era hacer una correlación de los resultados obtenidos
entre éste (resistencia LDR)y la densidad celular(espectrofotómetro), si existía una
proporción en los resultados, sería posible relacionar una medida con la otra, lo
que eliminaría la fase de muestreo para proporcionar la medición de la densidad
óptica. A pesar de las consideraciones tenidas en cuenta, el sistema no presentó
estabilidad y por tanto fiabilidad, por esta razón no fue tenido en cuenta en el
estudio del BR.
- Fuente de luz
Inicialmente la cinta de luces LED fue puesta en contacto alrededor del recipiente,
lo cual presentó un inconveniente, debido a que su funcionamiento tenía como
resultado un aporte energético, esto evitaba mantener la temperatura deseada.
Por esto fue necesario el uso de una caja de madera que en las paredes de su
interior tuviese las luces. Posteriormente esta caja fue reemplazada por una de
poliestireno expandido, con el fin de obtener una menor perdida de energía
térmica y así cumplir los requerimientos de E. coliMC4100 (hablados más
adelante).
El suministro de luz cumplió dos funciones, la primera fue para llevar a cabo el
proceso de la fotosíntesis, el segundo fue destinado en hacer que la luz incidente
en la resistencia LDR (del sistema de intensidad lumínica) fuese constante, por
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esta razón, aun para el cultivo de microorganismos no autótrofos esta fuente de
luz permaneció activa.
- Temperatura
- Suministro de oxígeno
- Volumen de cultivo
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sistema de muestreo, que toma directamente el cultivo, manteniendo un equilibrio
entre la relación de la cantidad de células y el volumen del medio de cultivo
(densidad celular). Este aspecto es importante, ya que a pesar de disminuir el
volumen del medio por la toma de muestras, este decrecimiento no afectaría las
futuras mediciones.
𝑉𝑜𝑙.𝑑𝑒𝑒𝑣𝑎p𝑜𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 25𝑚𝐿
Debido a que el riser permite el flujo del sistema, es importante que el nivel del
medio de cultivo esté por encima del riser cubriéndolo completamente. Es así
como esto condiciona el volumen de operación, siendo estimado con un mínimo
de 900mL y un máximo de 1500mL.
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condiciona el comportamiento del material y le brinda unas características físicas
particulares; por su transparencia, rigidez y resistencia comercialmente se usa el
PP isotáctico (25).
- PVC:soportó las condiciones a las que fue sometido para su esterilización (121°C
y 20psi), pese a que tiene una temperatura de trabajo entre 50 a 80°C.Esto es
debido a que no estuvo en contacto con un buen conductor térmico, como el
medio de cultivo o el tubo de acero inoxidable que está en su interior, este último,
se encuentra aislado del PVC gracias a los empaques de caucho siliconado.Es de
señalar que la T de PVC tuvo una leve deformación, sin embargo, esto no alteró
su desempeño.A lo largo de la investigación se sometió el BR (con medio de
cultivo en su interior) a esterilización cerca de 20 ciclos, presentando cada uno de
sus materiales resistencia al proceso y sin desgaste aparente, exceptuando ligeras
deformaciones en la T de PVC del muestreador.
39
En la figura 14 se muestra el diseño del BR con los diferentes sistemas acoplados.
6.4Prueba de esterilidad
Esta prueba fue planteada con el fin de comprobar la capacidad para mantener la
esterilidad del medio del BR en completo funcionamiento de sus sistemas de
calentamiento, aireación y muestreo.Se esperaba que los valores de absorbancia
obtenidos en las tres mediciones fuesen cero, comprobando que no hay
crecimiento bacteriano en el BR. Sin embargo, estos no fueron los resultados
encontrados, los cuales se describen en la Tabla 2.
40
Las posibles causas de la variación en los valores de densidad celular se discuten
a continuación:
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muestras en tiempo real sin afectar las condiciones del ensayo, además de ser un
método sencillo, económico y eficaz.
Por otra parte al hacer un rayado del cultivo que se encontraba en el BR,en una
caja de Petricon medio LB solido(Figura 15)luego de 48h, se evidenció que no
existía presencia de crecimiento bacteriano, asegurando así, junto con las
medidas espectrofotométricas que la prueba de esterilidad para el BR y sus
sistemas es positiva, es decir, el BR cumple con los requisitos de esterilidad.
Como microorganismo modelo fue elegida una bacteria por su rápido crecimiento,
teniendo asíla posibilidad deobtener resultados en poco tiempo. La cepa de
bacteria usada fue E. coliMC4100, básicamente debido a su disponibilidad y
conocimiento de su especie. Además al ser la E. coli tan estudiada se tiene
conocimiento de su comportamiento y necesidades.
42
- Curva de crecimiento:
En la figura 16se pueden observar los tres ensayos realizados de la evolución del
crecimiento de E. coliMC4100, dondela variación del desarrollo de su crecimiento
es dado dependiendo la velocidad en que se lleva a cabo la fase de latencia,
logrando ver que los ensayos alcanzan dicha fase en tiempos distintos. Es de
resaltar que a partir de que los cultivos superan la fase de latencia tienden a
comportarse de forma paralela, demostrando una velocidad de crecimiento similar
en los diferentes ensayos, este hecho da mayor importancia a la fase de latencia
como parte crucial de la evolución del cultivo.
De igual manera se puede notar que las tres curvas consiguen tener las dos
primeras fases de crecimiento y su desarrollo tiende hacia la tercera
fase(estacionaria).
Cabe mencionar que en uno de los ensayos (representado con rombos) no fue
posible la medición espectrofotométrica de dos muestras (360 y 390 min), debido
a fallas con el equipo, las cuales fueron solucionadas para la última medición (420
1,000
Ensayos de crecimiento de E. coli
0,900 MC4100
Absorbancia (600nm)
0,800
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450
Tiempo (min)
43
solose evidenciaron hasta esta etapa del crecimiento por disponibilidadhoraria de
los espacios.
Luego de esto,según las referencias,se esperaríallegar a un momento en el que
no hay división celular, debido a la menor disponibilidad de nutrientes en el medio
de cultivo. De esta manerano se presentan cambios en la curva de crecimiento, a
esta fase se le asigna el nombre de estacionaria.
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450
Tiempo (min)
44
A lo largo del proceso se genera espuma que se acumula en la superficie del
medio, ésta es producto del metabolismo y excreción de E. coliMC4100, que
cambia la viscosidad del cultivoy con ayuda de la agitación se favorece esta
producción.
45
Figura 18. Seguimiento del cultivo de E. coliMC4100 en el BR puesto en
marcha.
- Prueba tinción de Gram
La Figura 19, muestra el cultivo con una alta presencia de bacterias en forma de
bastones rosados, aparentemente el cultivo es uniforme en cuanto a estas
características, sin manifestarse otro tipo de presencia celular.Si bien este método
no es del todo confiable para determinar con seguridad la presencia de
contaminantes, si da cierto nivel de confianza.
Figura 19. Tinción de Gram de muestra tomada del BR luego del periodo de
operación. Vista en un microscopio óptico. Foto tomada y ampliada.
46
6.7 Análisis de costos
47
Así, un BR elaborado a partir de la presente investigación tiene un costo de
$224.984 (COP),convertido a dólares (tasa de cambio 1 de diciembre del 2017)
sería:$74,84(US) para servir de parámetro de comparación se utilizaron dos FBR
(con la posibilidad al igual que el presente, de ser usado como BR)
comercializados y distribuidos por industrias que desarrollan equipos de
laboratorio.
Como se puede apreciar, sus precios son mucho más elevados en comparación
con los costos obtenidos en el presente proyecto, representando cerca del 0.5%
del valor del más económico (US$14.900).
48
7. CONCLUSIONES
El crecimiento deE. coli MC4100 fue satisfactorio, presentando las primeras dos
fases, latencia y exponencial al final de siete horas de operación,con tendencia a
iniciar la fase estacionaria.
49
8. RECOMENDACIONES
Para el uso del biorreactor con microalgas fue implementada la fuente de energía
lumínica con ayuda de luces LED, en este caso la aireación suministraría al cultivo
dióxido de carbono como fuente de carbono para el proceso de fotosíntesis,
otorgando el nombre de FBR. De esta manera el sistema está listo para su
implementación en el cultivo de microorganismos fotoautótrofos.
50
La tubería galvanizada, es un material económico y con mayor resistencia,
alternativo al PVC que conforma el sistema de muestreo, que luego de ser
sometido a la esterilización varias veces presentó pequeñas deformaciones.
51
9. AGRADECIMIENTOS
A nuestras familias por ser parte esencial a lo largo del camino demostrando su
apoyo y acompañamiento.
52
10. RECURSOS DISPONIBLES
Recursos humanos
Recursos físicos
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11. CRONOGRAMA
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Optimización de los métodos
de cultivo.
Crecimiento y comprobación
de la esterilidad de la bacteria
E. coli MC4100en medio LB.
Ajustes finales al biorreactor
para el crecimiento de E. coli
MC4100.
Prueba de esterilidad en el
biorreactor.
Seguimiento y estudio del
crecimiento de E. coli
MC4100, en el biorreactor ya
conformado.
Redacción informe final para
sustentación.
Entrega informe final requisito
de grado.
55
12. BIBLIOGRAFIA
11. Park JBK, Craggs RJ, Shilton AN. Wastewater treatment high rate algal
ponds for biofuel production. Bioresour Technol [Internet]. 2011;102(1):35–
42. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2010.06.158
13. Gupta PL, Lee SM, Choi HJ. A mini review: photobioreactors for large scale
algal cultivation. World J Microbiol Biotechnol. 2015;31(9):1409–17.
56
2010;183–98.
23. Rubio Fernández D, Sierra Herrera JA, Ruiz Fonseca S, Sandoval Herrera
JA. Diseño de un fotobioreactor Airlift a escala de banco. Elementos.
2014;4:21.
57
58