Que es la luz?

: Radiación electromagnética visible

Teoría corpuscular
Dualidad onda-corpúsculo
Teoría ondulatoria

Fotón: Tiene propiedades corpusculares y ondulatorias

Partícula que porta las distintas formas de radiación electromagnética;
tiene masa cero y en el vacío tiene velocidad constante.
 - En fenómenos de reflexión y refracción, el fotón se comporta como una
onda.
- En fenómenos de transferencia de energía, el foton se comporta como
un corpúsculo, donde la energía esta dada por:
hc
E= λ

Espectro electromagnético
Propiedades de la luz desde un punto de vista ondulatorio

Parámetros utilizados para definir una onda:

Amplitud, A: intensidad de la energía. El ojo percibe la A como brillo.
Longitud de onda, λ: Distancia entre 2 máximos de una onda.
Este parámetro determina el color de las cosas.

Frecuencia, F: Número de vibraciones por segundo de una onda.

Velocidad, v: se calcula usando la longitud de onda la frecuencia.

 Fenómenos de la luz

Refracción: cambio de dirección de la luz cuando incide por un

cuerpo con densidad distinta, sufriendo un retraso en su
velocidad.

Velocidad de la luz en el aire

Índice de refracción:
Velocidad de la luz en el medio
 Fenómenos de la luz

Reflexión: cuando la luz incide en superficies como un espejo, el

rayo se refleja (no penetra)
 Fenómenos de la luz

Dispersión: cambio en la velocidad de un rayo incidente sobre

un medio en particular.

Todas las radiaciones tienen la misma velocidad en el vacío. Al

incidir en un medio diferente, sus velocidades cambian y esta
velocidad (en el nuevo medio) depende de la longitud de onda.
Uso de microscopia en biología celular
Problemas básicos en biología celular

- Donde se expresa la proteína?

- Cuando se expresa la proteína?
- Donde y cuando mi proteína interactua con otra proteína?
- Cuanto de mi molécula hay disponible?
- Que cantidad de mi molécula se encuentra en un lugar
determinado y en que momento?

Herramientas bioquímicas y de biología molecular (entre

otras) pueden ayudarnos a contestar estas preguntas pero
existen algunos detalles...
Cambios en la expresión de la proteína “X” al tratar células
con el compuesto “Y” a diferentes concentraciones.

Compuesto Y

ng/ml
Proteina X

Actina

a) todas las células aumentan la expresión de X?

b) algunas células aumentan la expresión de X?
c) todas las células incrementan la expresión de X pero en
diferentes niveles?
d) no hay cambios en la expresión de X?
Esquema de la expresión de proteína X (azul) analizada
por el inmunoblot anterior: se puede hablar de expresión
heterogénea mediante este método?
Bioquímica vs imagen
Las células se pueden ver mediante instrumentos que
manipulen la luz: microscopios

Jugando con las propiedades antes mencionadas se puede:

1.- modificar el recurso/enfoque de luz

2.- iluminar las células
3.- seleccionar la luz que se emita o transmita de la célula
4.- detectar la luz necesaria
Concepto de resolución: habilidad para distinguir dos
puntos

d: espacio entre dos partículas adyacentes, l: longitud de onda de iluminación, NA: apertura numérica
del objetivo
Apertura numérica (NA): uno de los
parámetros más importantes en
microscopía
medida que indica la capacidad del objetivo de
poder captar los rayos refractados por las
estructuras finas de las cuales está constituido
el objeto que se observa

-Cuanto mayor sea la AN, mayor será la resolución.

-Cuanto mayor sea el ángulo de la lente para recibir la
luz, mayor será su poder resolución. θ
-El poder de resolución: La capacidad de un objetivo
para resolver dos líneas o puntos que se encuentran Light cone
muy juntos
-Cuanto mayor sea la AN, la más corta es la distancia
de trabajo
NA=n(sin θ)
n= el índice de refracción más bajo entre el objeto y el
objetivo, generalmente 1.
θ es 1/2 de la apertura angular del objetivo
Magnificación: hacer que las cosas parezcan más grandes de lo
que son.

Magnificación =/ resolución
 Microscopia óptica: tipos de microscopios

Microscopia de campo claro: se utilizan tinciones

Células de cebolla

Rotífero
Microscopía de campo oscuro

Solo la luz refractada (desviada) o difractada (dispersa)

participa en la formación de la imagen.

Ventaja: se visualizan objetos pequeños

como bacterias que refractan la luz (ej.
Treponema pallidum), células vivas sin
colorantes.

Desventajas: la resolución no es muy

alta.
 Glóbulos rojos bajo microscopia de campo oscuro

A B

Rotíferos. A: campo oscuro, B: campo claro

 Microscopía de contraste de fase

Diferencias en el índice de refracción o en el grosor de partes de la

muestra, son convertidas en luz y oscuridad para formar la imagen final.

Uso: Muestras vivas sin teñir.

Detección de bacterias y algunos
organelos grandes (fagocitosis, mitosis,
movimientos ameboideos, etc) pero no
para distinguir la estructura interna de
bacterias.
Microscopía de contraste de fase
 Microscopio DIC (Differential Interference Contrast)

Se utiliza luz polarizada; para esto la luz pasa por un

polarizador y luego por un prisma de Wollaston.

La luz forma 2 haces separados que atraviesan la

muestra (rotando la polarización) y luego se juntan con
el segundo prisma de Wollaston.

Las diferencias en el índice de refracción o de grosor

en la muestra genera imágenes brillantes (rayos en
fase) u oscuras (rayos fuera de fase)
 Contraste de fases DIC

Células del epitelio bucal

Diferencia principal entre CF y DIC: bases ópticas por

las que las imágenes son formadas (contraste)
 Microscopía de fluorescencia

Concepto de fluorescencia

Un “cromóforo” absorbe luz pero no emite luz.

Esto implica que el objeto tiene “color”

Un “fluoróforo” absorbe luz a longitudes de onda cortas y emite luz a

longitudes de onda mayores.
Fluoróforos
Ventajas: uso de fluoróforos ha permitido la identificación de compuestos
sub-celulares con alta especificidad y sensibilidad (50 moléculas/
micrómetro cúbico).
Disponibilidad de muchos fluorocromos.

Usos: en material orgánico e inorgánico, material “vivo”, como sensor de

cambios fisiológicos (cambios en concentración de iones), etc.
Actina (Alexa Fluor® 488 ) α-Tubulin Antibody (green). Actin
filaments have been labeled with Alexa
Fluor® 555 phalloidin (red). Blue
pseudocolor = DRAQ5™ (fluorescent
DNA dye).
mouse anti-NPCP (nuclear pore complex protein) anti-Histone H2A.Z Polyclonal Antibody
and rabbit anti-giantin (Golgi complex) primary
antibodies. The antibody targets were visualized
with goat secondary antibodies conjugated to
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488, respectively
Microscopía confocal

Se utiliza un láser que ilumina la muestra en un solo plano.

Elimina la luz que viene de planos fuera de focos (toma solo un

plano focal y se eliminan los restantes)
(A). Imagen de microscopía óptica de fluorescencia de un alga (Spyrogira).
(B) Imagen del mismo tipo de muestra (Spyrogyra) obtenida con el microscopio
confocal.
Ángel Martínez Nistal, Microscopia confocal, U. de Oviedo
 Ventajas de la microscopía confocal

Reducción de imágenes “borrosas” producto de la dispersión de la luz

Incremento en la resolución efectiva
Mejora la relación señal / ruido
Examina de forma clara muestras gruesas
Escaneo en eje Z
Percepción de profundidad en las imágenes seccionadas en Z
Magnificación se puede ajustar electrónicamente
Reconstrucción 3D
Reconstrucción 3D
 Microscopia electrónica

Fuente de iluminación: electrones, los que inciden en la muestra

enfocados por campos electrostáticos.
Permite la observación en una escala de nanómetros a micrómetros.

-Los electrones se hacen pasar por un

vacío,
- posteriormente se aceleran hacia la
muestra con un potencial positivo,
- La muestra irradiada con electrones
de la misma energía, hace “variar” el
haz original y estas diferencias son
detectadas para formar la imagen.
Electrones sobre una muestra:

Dispersión elástica; solo cambios en trayectoria (energía cinética y

velocidad permanecen constantes)

e inelástica; algunos electrones pueden chocar y sacar a electrones

de sus órbitas en la muestra (estado excitado)

SEM

TEM
TEM
Las muestras se cortan en secciones delgadas (<100 nm) para permitir que los
electrones pasen a través de ella.
Se usan metales pesados para dar contraste adicional los que se unen a ciertas
estructuras. Los electrones solo pasan por las zonas donde no hay metales
asociados
Uso: para ver estructuras internas como organelos, para ver contornos intactos,
pequeñas estructuras como virus, etc.

SEM

La formación de la imagen se logra a partir de los electrones que han sido

desplazados al incidir en la muestra. Estos electrones emitidos se capturan con
un detector y la información se convierte en una señal eléctrica,
amplificada y digitalizada. El resultado es una imagen topográfica de la superficie
de la muestra. También otras señales son emitidas que se pueden utilizar usando
detectores específicos.
Uso: Medicina Forense (Análisis morfológico de pruebas), Botánica, Biomedicina
y Medicina (Estudio morfológico), geología, estudio materiales, etc.
 Mitocondria en sección de tejido pulmonar
Polen

Organelos en polen de tabaco, AF: filamentos de

actina; G: aparato de Golgi; Mi: Mitocondria; Mt: Sangre humana
Microtúbulos
 Microscopia de efecto túnel

Se usa punta conductora aguda donde se aplica un voltaje entre la punta y

la muestra (aprox. unos 10 Å). Los electrones fluyen a la muestra o
viceversa.
Se necesita que la muestra y la punta sean conductores o semiconductores.
A partir de la densidad electrónica de la superficie se obtendrá la imagen.
Se pueden obtener imágenes con resoluciones muy altas (sub-angstrom).

Corral de átomos de Fe (48), radio: 71.3 Å

Milímetro: 1 mm = 1 000 000 nm
Micrómetro: 1 µm = 1000 nm
Angstrom: 1 Å = 1/10 nm
Picómetro: 1 pm = 1/1000 nm
Metro: 1 m = 1.000.000.000 nm
kilómetro: 1 km = 1.000.000.000.000 nm