UNIVERSIDAD DE VALLE- DEPARTAMENTO DE QUÍMICA- CAGV

TALLER 1 DE BIOQUÍMICA 2015-II PROFESOR: CÉSAR A. GODOY V.

AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS.

1. ¿Por qué se dice que las reacciones bioquímicas suceden en esencia en
un medio acuoso? ¿qué propiedades fisicoquímicas hacen del agua el medio
ideal para la vida?

2. Demuestre que para una L-alfa aminoácido como la glicina (con cadena
lateral neutra) el punto isoeléctrico, pI, es la semisuma de los pK a del alfa
carboxilo y el alfa amino. Recuerde la ecuación de Henderson- Hasselbach para
esto.

3. Se tienen los siguientes tres péptidos: EEE, KAEK y AAA. Escriba las
ecuaciones de equilibrio para las diferentes especies presentes (señale su carga
neta) comenzando a pH=1 y hasta el pH igual al pK x mayor. Trate de predecir el
valor pI de c/u de ellos realizando la curva de distribución de especies a
diferentes pHs.. ¿Cuál sería su orden de elución en una columna de intercambio
catiónico si se hace un gradiente de elución de pH ácido a pH básico?

4. Usted es el encargado de determinar la calidad de un péptido que se

produce en una empresa dada, ¿Qué prueba cualitativa emplearía usted para
determinar si el péptido está parcialmente hidrolizado? Explique su respuesta.

5. El método de Biuret y el método de Bradford permiten cuantificar la

concentración de proteína en una muestra dada.

Qué método elegiría usted si:

a) La proteína presenta una cantidad especialmente baja de cadena
laterales con grupos aromáticos. Explique.
b) La proteína precipita en medio básico. Explique.

6. ¿Como se explica que una proteína pueda plegarse y adquirir una estructura
tridimensional relativamente estable si a primera vista las uniones entre sus
aminoácidos, son enlaces sencillos que permiten una libertad de rotación muy
elevada? En otras palabras, ¿Qué razones (hay varias) hacen que la proteína no
sea un simple polímero lineal sino que tenga una elevada complejidad
estructural?
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7. Explique brevemente (como siempre, dé razones estructurales) los siguientes

mecanismos de desnaturalización de proteínas.

a. Por ácidos o bases Fuertes (pHs extremos).

b. Por calor.

c. Por urea (caótropo).

d. Efecto de cosmótropos (no denaturan sino por el contrario estabilizan)
8. Se ha aislado un inhibidor tipo peptídico a partir de la harina de soya. Este
inhibidor sigue presentado su actividad biológica a pesar de ser sometido a altas
temperaturas y pHs moderados, y solo logra perderla cuando es sometido ante
compuestos tiolados como por ejemplo DTT (Ditiotreitol). ¿Qué información le
da esta evidencia sobre la estructura del inhibidor? Explique.

9. ¿Como se explica que dos proteínas o dos péptidos tengan exactamente la

misma composición de aminoácidos pero presenten, sin embargo diferente
actividad biológica?

10. En clase logramos deducir la expresión de Michaelis-Menten

Demuestre que [S] = Km cuando la velocidad “V” es la mitad de “Vmax”.

11. A usted le han solicitado que diseñe un biorreactor para descomponer urea
concentrada en agua (1000mM) y que diseñe un biosensor para detectar la
cantidad traza de urea que permanece en aguas tratadas.

km frente a kcat (1/s) k1 (s-1M-1) Kd( ) k2( ) Eficiencia,

punto 11e
Urea
( )
-2 6
Ureasa 1 6,0x 10 M 150000 5,0 x 10
Ureasa 2 6,0 x 10-5M 5000 2,0 x 108
a) Complete la anterior tabla.

b) De acuerdo con lo anterior ¿Cuál de estas enzimas usaría para descomponer

la urea y cual para diseñar un biosensor? Realice una gráfica de Michaelis-
Menten para comprobar su elección en el rango de concentraciones de urea de
1x10-20mM y 1000 mM.
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c) ¿Cuál de estas enzimas ha evolucionado para estabilizar más al sustrato

adsorbido (E-S) y cual para estabilizar más al complejo activado (E-Sǂ)? Explique
brevemente empleando una gráfica de energía vs. Coordenada de reacción.

d) Calcule el “turnover number” o número de recambio sabiendo que las

enzimas mostradas son homodiméricas. Analice de modo estricto cuáles son las
unidades de kcat de acuerdo a la ecuación de M&M, a partir de esto indique cuál
es el significado a nivel molecular de esa constante.

e) Un parámetro muy importante a nivel enzimológico y biotecnológico es la

“Eficiencia catalítica”; esta es igual a la razón de cambio de la velocidad de
reacción enzimática (con [E]0=constante) respecto a concentraciones de
sustrato inicial mucho menores a km; averigüe y/o deduzca el valor de esa
pendiente y exprese cuál es el significado a nivel molecular de la misma.

12. La tirosina hidroxilasa cataliza la producción de L-DOPA (un precursor de

neurotransmisores conocidos como catecolaminas) a partir de tirosina.

Se evaluó el efecto de inhibidores en la actividad de la enzima y se realizó la

siguiente tabla:
[Tirosina] V (μM/s) V(μM/s) V(μM/s)
en mM sin inhibir con ácido benzoico con KCN
0,500 1,75 1,12 1,35
1,00 3,14 2,08 2,42
2,00 5,19 3,65 4,00
4,00 7,71 5,88 5,94
8,00 10,2 8,44 7,84
Determine mediante linealización (Tipo Eadie-Hosftee y también de
Lineweaver-Burk) los valores de Km y Vmax con y sin los inhibidores (hagan las
tres rectas en la misma gráfica) e indique qué tipo de inhibición presentan el
ácido benzóico y el KCN; de acuerdo a las estructuras de estos ¿Los resultados
son acordes a lo que se esperaba?
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13 ¿Qué pasaría con los componentes matemáticos de km (KD y kcat/k1) en cada

uno de los tipos de inhibición reversible descritas?

14. Explique por qué una gráfica de Velocidad vs. [S]o que tenga un
comportamiento sigmoideo le podría indicar que una enzima estaría siendo
regulada alostéricamente por el sustrato.

15. En muchas ocasiones cuando se prepara un extracto crudo, suele agregarse

agentes quelantes como EDTA para evitar la degradación de la enzima de
interés por acción de ciertas proteasas. ¿Por qué esto es así?... Pista: averigüe
que tipo de catálisis efectúan proteasas como la termolisina.

16. Suponga que tiene una muestra de una proteína monomérica de 40 kDa
(pI=5), una muestra de una proteína homodimérica de 80kDa (pI=8) y una
proteína heterodimérica de 100 kDa (pI= 4) donde una de sus subunidades
tiene un peso de 35 kDa. Haga un estimado de cómo sería el electroforegrama
de c/u de esas 3 proteínas en: a) condiciones desnaturalizantes (no olvide incluir
en el electroforegrama los patrones de peso molecular); b) condiciones NO
desnaturalizantes asumiendo que al pH del experimento todas tienen la misma
carga neta; c) indique en orden ascendente, cuál de esas proteínas tiene más
grupos básicos en su superficie y por qué.

17. En la siguiente tabla se relacionan los valores de actividad total (en unidades
internacionales, UI), actividad específica (en UI/mg), cantidad de proteína (mg),
y grado de purificación (adimensional) en la secuencia de 4 pasos de
purificación de una lipasa termorresistente.

a) complete los espacios según sea el caso:

Paso de Proteín Actividad Actividad Rend Grado de
purificación a total total específica imien purificación
(mg) (UI) (UI/mg) to
(%)
Extracto crudo 800 100000 125 100% 1
Calentamiento a 60ºC 186 93000 500 93% 4
Cromatografía de 60 75000 1250
interacción hidrofóbica
Cromatografía de 60000 60% 25
intercambio aniónico
b) Si la actividad específica de la enzima termorresistente pura es de 12000
UI/mg, indique qué grado de purificación se hubiera requerido para obtener
la proteína pura.