TINCIÓN DE GIEMSA FROTIS DE SANGRE MALARIA

1. PROPÓSITO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

Describir el procedimiento para la tinción adecuada de las muestras de sangre de malaria con
tinción de Giemsa.

Este procedimiento sólo se modificará con la aprobación del coordinador nacional para el
aseguramiento de la calidad de la microscopía de la malaria. Todos los procedimientos
especificados en este documento son obligatorios para todos los microscopistas de malaria que
trabajan en laboratorios nacionales de referencia, en laboratorios de hospitales o en laboratorios
básicos de salud en establecimientos de salud que realizan una microscopía de malaria.

2. ANTECEDENTES

Una película de sangre debidamente teñida es fundamental para el diagnóstico de la malaria,

especialmente para la identificación precisa de las especies de malaria. El uso de la tinción de
Giemsa es el procedimiento recomendado y más confiable para teñir las películas gruesas y finas
de sangre. La solución de Giemsa se compone de eosina y azul de metileno (azur). El componente
de eosina tiñe el núcleo del parásito rojo, mientras que el componente azul de metileno tiñe el
azul del citoplasma. La película fina se fija con metanol. La dehemoglobinización de la película
gruesa y la tinción tienen lugar al mismo tiempo.

El pH ideal para demostrar el punteado de los parásitos y para permitir la identificación apropiada
de la especie es 7.2.

Métodos de tinción

Los dos métodos para la tinción con tinción de Giemsa son el rápido (solución de trabajo de tinción
al 10%) y el lento(Solución de trabajo de tinción al 3%).

El método rápido (solución de trabajo de tinción al 10%) Este es el método más común para la
tinción 1-15 diapositivas a la vez. Se utiliza en clínicas ambulatorias y laboratorios ocupados donde
un diagnóstico rápido es esencial para el cuidado del paciente. El método es eficiente pero
requiere más manchar. La necesidad de velocidad justifica el costo adicional.

El método lento (solución de trabajo con tinción al 3%) El método lento se utiliza para teñir un
mayor número de diapositivas (≥ 20). Es ideal para teñir las películas de sangre recogidas durante
las encuestas transversales o epidemiológicas y la investigación de campo y para preparar lotes de
diapositivas para la enseñanza. Es menos apropiado cuando se necesita un resultado rápido. El
método lento es menos costoso que el método rápido porque requiere mucha menos mancha (3%
en vez de solución de tinción al 10%).
3. SUMINISTROS Y MATERIALES

PARA EL MÉTODO RÁPIDO (SOLUCIÓN DE TRABAJO CON TINCIÓN AL 10%)

• Colorante Giemsa (solución al 10%) (Véase MM-SOP-04 para el método de preparación);

• un pequeño contenedor o vaso para la mancha de trabajo Giemsa;

• metanol absoluto, libre de acetona;

• una pipeta Pasteur con un pezón de goma;

• un recipiente pequeño o un vaso de precipitados para metanol;

• una bandeja de tinción plástica curvada, una placa o una rejilla de tinción;

• un temporizador;

• una rejilla de secado de diapositivas;

• un pequeño secador de pelo eléctrico;

MM-SOP-07A: GIEMSA TEJIDO DE PELÍCULAS DE SANGRE DE MALARIA

• Guantes protectores de látex, sin polvo, desechables y

• Agua destilada o desionizada tamponada a pH 7,2.

PARA EL MÉTODO LENTO (SOLUCIÓN DE TRABAJO CON TINCIÓN AL 3%)

• Colorante Giemsa (solución al 3%) (Ver MM-SOP-04 para el método de preparación);

• un recipiente pequeño para la mancha de trabajo Giemsa;

• metanol absoluto, libre de acetona;

• una pipeta Pasteur con un pezón de goma;

• un recipiente pequeño o un vaso de precipitados para metanol;

• tinas de coloración que pueden contener 20 diapositivas colocadas una contra otra;

• un temporizador;

• una rejilla de secado de diapositivas;

• guantes protectores de látex, sin polvo, desechables y

• agua destilada o desionizada tamponada a pH 7,2.

4. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD

1. El metanol (alcohol metílico) es inflamable y altamente tóxico si se inhala o se ingiere; puede

causar Ceguera e incluso la muerte si se ingiere en cualquier cantidad. Evite el contacto y la
inhalación. Cuando no está en uso, se debe almacenar en un armario cerrado.
2. Precauciones universales - incluyendo el uso de equipo de protección personal relevante como
guantes,Gafas de seguridad y una bata o bata de laboratorio - debe ser practicado. Ver MM-SOP-
11: Seguridad general Procedimientos en el laboratorio de microscopía de malaria.
CUADRO DE FLUJO
1. Preparar el 10% de
Giemsa
trabajandoSolución
(MM-SOP-04), y
colóquela en Un
pequeño contenedor
2. Usando una pipeta Pasteur, fije la
película fina dejando caer
cuidadosamente metanol sobre la
película delgada
3. Deje que la película de sangre
se seque al aire en una rejilla o
bandeja de secado
4. Coloque las diapositivas
para teñir las láminas de
sangre con la cara hacia abajo
sobre una bandeja de tinción
curvada o boca arriba en una
rejilla de tinción.
DESCRIPCION DE ACTIVIDAD
1. Estimar la cantidad de solución de trabajo
Giemsa del 10%
Necesario para el número de diapositivas a
teñir. Cada diapositiva requiere
aproximadamente 3 ml de mancha para
cubrirlo.
Preparar la mancha inmediatamente antes de
usar de acuerdo a
MM-SOP-04: Preparación de la solución de
trabajo Giemsa.
2. Para fijar la película delgada,
preferiblemente utilice una pipeta Pasteur o
sumerja la película delgada durante 2 s en un
recipiente pequeño o un vaso de precipitados
que contenga metanol. Evitar el contacto
entre la película gruesa y el metanol, ya que el
metanol y sus vapores fijarán rápidamente la
película gruesa e interferirán con la hemólisis
de la película gruesa.
3. Coloque los portaobjetos en una bandeja o
estante de secado. Deje que el frotis fino
fijado en metanol se seque por completo en
aire (aproximadamente 2 min) colocando los
portaobjetos sobre una superficie plana.
Nunca deje el portaobjetos seco en posición
vertical con la película delgada hacia abajo, ya
que esto puede conducir a la fijación de la
película gruesa por vapor de metanol
4.Coloque las diapositivas para teñir las
láminas de sangre con la cara hacia abajo si
utiliza una bandeja de tinción curvada o hacia
arriba si está usando una rejilla de tinción

5. Vierta la mancha
lentamente sobre o debajo
de la diapositiva hasta que
las películas de sangre estén
cubiertas
6.Ajuste el temporizador a 8-10
minutos para la tinción
7. Limpie suavemente toda la
mancha de las diapositivas
dejando caer agua limpia
sobre ella.
8. Deje que las
diapositivas se sequen al
aire
9. Deseche la
solución restante de
Giemsa al 10%.
5. Vierta la mancha suavemente entre la
diapositiva y la bandeja de coloración si la
mancha hacia abajo, hasta que cada
diapositiva se cubre con mancha, o
suavemente verter la mancha en la parte
superior de los portaobjetos cara cara hacia
arriba en una rejilla de coloración
6. Ajuste el temporizador a 8-10 min (el
tiempo de exposición debe determinarse
previamente probando el lote de solución de
tinción de stock utilizado) y permita que las
láminas de sangre se manchen. La experiencia
con la mancha que está usando le ayudará a
indicar el tiempo requerido para una buena
tinción. Véase MMSOP 3c: Control de calidad
de la solución madre de Giemsa y agua
tamponada.
7. Al final del tiempo de tinción, retire cada
diapositiva individualmente. Enjuague
suavemente la mancha de la diapositiva
mediante la adición de gotas de agua
tamponada hasta que toda la mancha se ha
lavado. No vierta la mancha directamente de
las diapositivas, como la espuma de superficie
verde metálico se pegue a la película, lo
estropea para la microscopía.
8. Cuando la mancha se haya lavado, coloque
la diapositiva en la película de la secadora
hacia abajo o en posición vertical con la
película gruesa hacia abajo para drenar y
secar. Asegúrese de que las películas gruesas
no se rasquen contra el borde de la rejilla
9. Deseche la solución restante de Giemsa al
10%.
6. NOTAS DEL PROCEDIMIENTO

Secado de la película de sangre gruesa Las películas gruesas de sangre deben estar completamente secas antes
de ser manchadas. Se pueden secar rápidamente con aire caliente de un pequeño secador de pelo. Evitar el
sobrecalentamiento de diapositivas, ya que pueden "calentar" y así manchar mal.

Uso de agua tamponada para enjuagar las diapositivas El pH del agua utilizada para el enjuague es importante,
ya que el agua ácida puede decolorar las películas. Por lo tanto, se recomienda que los portaobjetos se enjuaguen
con el mismo agua tamponada que se utiliza para la tinción y por lo tanto tiene un pH de 7,2.

Cuidado de cristalería y equipo de mediciónLos cilindros de medición, las pipetas, las cubetas de tinción y los
vasos de precipitados deben estar limpios y secos antes de usarlos. La tinción de las películas de sangre con
utensilios sucios da resultados insatisfactorios.

El equipo utilizado para la tinción de Giemsa debe ser enjuagado inmediatamente después de su uso en agua
limpia para eliminar la mayor cantidad posible de la mancha. A continuación, debe ser empapado durante un
tiempo en una solución de detergente antes del lavado. Los utensilios se pueden lavar con un detergente suave,
siempre que se enjuagan bien en agua limpia antes de secar. Cualquier detergente que se deje en los envases de
vidrio y plástico puede alterar el pH del agua y la mancha, lo que resulta en una tinción pobre cuando se usa el
equipo.

Precaución Durante la tinción con tinción Giemsa (solución de trabajo de tinción al 3% o 10%), la superficie se
cubre con una escoria verde metálica. Evite colocarlo en las láminas de sangre durante el enjuague, ya que puede
perjudicar el examen.

Los frotis de sangre deben ser manchados tan pronto como sea posible después de que estén preparados. El
almacenamiento de diapositivas sin manchas durante unos días en condiciones calientes y húmedas antes de la
tinción resultará en auto-fijación, y la película gruesa se volverá inútil para la microscopía.

Método para la tinción de diapositivas individuales

1. Coloque los portaobjetos individualmente en la rejilla de tinción, asegurándose de que no se toquen entre sí.

2. Vierta la mancha suavemente en las diapositivas hasta que estén totalmente cubiertas. Cada diapositiva
requerirá aproximadamente 3 ml de mancha. Evite verter la mancha directamente sobre las películas gruesas.

3. Dejar la mancha sobre las placas durante 45-60 minutos con solución de Giemsa al 3% y 10-15 minutos con
solución de Giemsa al 10%. El control de calidad interno de su mancha indicará el tiempo de tinción óptimo.

4. Inundar las diapositivas suavemente con agua tamponada para flotar fuera de la "escoria" iridiscente en la
superficie de la mancha. El agua tamponada a 7,2 pH debe ser vertida sobre las diapositivas desde el extremo de
la película delgada para evitar disturbios indebidos y lavado de las películas gruesas.

5. Retire los portaobjetos uno a uno y colóquelos, con una película gruesa hacia abajo, en una rejilla de secado
para vaciar y secar, asegurándose de que la película gruesa no toque el borde de la rejilla.