Manual Primavera 2020 Lab Bacter II

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Vicerrectoría de Docencia
Dirección General de Educación Superior
Facultad de Ciencias Químicas
PLAN DE ESTUDIOS (PE): Licenciatura en Químico Farmacobiólogo
ÁREA: Ciencias Microbiológicas
ASIGNATURA: Laboratorio de Bacteriología II
CÓDIGO: 48
CRÉDITOS: 8
FECHA: Octubre 2019
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1. DATOS GENERALES
Nivel Educativo: Licenciatura
Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura de Químico Farmacobiólogo
Modalidad Académica: Presencial
Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Bacteriología II
Ubicación: Formativo
Correlación:
Se recomienda tener conocimientos de Bacteriología
Asignaturas Precedentes:
I, Microbiología general y Bioquímica
Microbiología médica diagnóstica., Diagnóstico
Asignaturas Consecuentes:
microbiológico molecular
2. CARGA HORARIA DEL ESTUDIANTE
Total
Concep Horas por semana de
to horas
por
period
o
Horas práctica 3 54
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3. REVISIONES Y ACTUALIZACIONES
M.E.C Ana Bertha Escobedo López
M.C. María Susana Pérez Fernández
M.C. Patricia Guadalupe Suárez Albores
M.S.P. Claudy Lorena Villagrán Padilla
Autores:
M.C. Reyna del Consuelo Almiray Pinzón de Dios
M.C. Edith Díaz Cabrera
M.C. Gloria León Tello
M.S.P. María de la Cruz Meneses Sánchez
Fecha de diseño: Noviembre 2009
Fecha de la última actualización: Febrero 2017
Fecha de aprobación por parte de
la academia de área, departamento Febrero 2017
u otro.
M.E.C Ana Bertha Escobedo López
M.C. María Susana Pérez Fernández
M.C. Patricia Guadalupe Suárez Albores
M.S.P. Claudy Lorena Villagrán Padilla
Revisores:
M.C. Reyna del Consuelo Almiray Pinzón de Dios
M.C. Edith Díaz Cabrera
M.C. Gloria León Tello
M.S.P. María de la Cruz Meneses Sánchez
Se estableció el propósito y las competencias de la
asignatura.
Sinopsis de la revisión y/o Se revisaron y modificaron los contenidos de
actualización: algunas prácticas
Revisión y actualización de bibliografía.
Se unificaron criterios de evaluación.
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4. PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:

Disciplina profesional: Quimico Farmacobiólogo
Nivel académico: Licenciatura, Maestría o Doctorado
Experiencia docente: 3 años en el área de Ciencias Microbiológicas
Experiencia profesional: 2 años en el área
 5. PROPÓSITO: Aplica métodos y técnicas para el análisis químico-biológico de

especímenes obtenidos de pacientes conforme a protocolos establecidos para contribuir
a la prevención, diagnóstico, seguimiento y control de enfermedades para proponer
soluciones que contribuyan a su desarrollo profesional que le permitan abordar la
problemática social de su entorno y le permitan integrarse a los Comités de Salud
6. COMPETENCIAS PROFESIONALES:
 Obtiene, procesa y almacena de forma adecuada muestras biológicas conforme a

protocolos establecidos, siguiendo normas de garantía y seguridad con la finalidad de
garantizar resultados confiables para la prevención , diagnóstico y seguimiento de
pacientes
 Utiliza controles de calidad en equipos y su operación conforme a protocolos y normas
vigentes para garantizar la confiabilidad y validez de los resultados de los análisis a
utilizar para el diagnóstico, pronóstico, control y evaluación del estado de salud de
pacientes
 Interpreta resultados, los correlaciona clínicamente y elabora informes apegado a
principios éticos y normas vigentes para contribuir mediante el uso del laboratorio
clínico al oportuno y certero diagnóstico, pronóstico, seguimiento y control de
pacientes.
 Aplica principios éticos y legales en las acciones asistenciales y de investigación
relacionadas con su actividad profesional para garantizar la certeza y confianza de
aquellos a los que presta sus servicios
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7. CONTENIDOS TEMÁTICOS
Unidad de
Contenido temático Referencias
Aprendizaje
Práctica No. 1 Infecciones gastrointestinales Forbes, Betty A., Daniel F.
(Coprocultivo) Sahm, Alice S.Weissfeld. .
(2013) Bailey and Scott.
Diagnóstico Microbiológico.
Argentina. Panamericana.
Práctica No. 2 Infecciones de las vías urinarias Winn (h.) W. C., Allen S D.,
(Urocultivo) Janda W. M., Koneman E.
W., Procop G. W.,
Schleckenberger P C.,
Woods G. L. (2006).
Koneman. Diagnóstico
Microbiológico. Texto y Atlas
en color. 6ª. ed Madrid
España. Editorial Médica
Panamericana
Práctica No. 3 Sensibilidad a los antimicrobianos método Clinical Laboratory Standars

de Kirby-Bauer Institute (CLSI) 2012
(antibiograma) Métodos de estandarización
para los laboratorios
Práctica No. 4 Infecciones de vías respiratorias altas Winn (h.) W. C., Allen S D.,
(Exudado faríngeo y nasofaríngeo) Janda W. M., Koneman E.
W., Procop G. W.,
Woods G. L. (2006).
Panamericana
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Unidad de
Aprendizaje
Práctica No. 5 Infecciones de vias respiratorias bajas Murray R. (2009).
(Cultivo de esputo) Microbiología
Médica.Ed.Elsevier Mosby.
Barcelona España.
Práctica No. 6 Búsqueda e identificación de Winn (h.) W. C., Allen S D.,

Mycobacterium tuberculosis Janda W. M., Koneman E.
W., Procop G. W.,
Woods G. L. (2006).
Panamericana
Práctica No. 7 Infecciones oculares Forbes, Betty A., Daniel F.

Sahm, Alice S.Weissfeld. .
Argentina. Panamericana
Práctica No. 8 Infecciones óticas Forbes, Betty A., Daniel F.

Práctica No. 9 Infecciones del aparato genital (Exudado Winn (h.) W. C., Allen S D.,
cervico vaginal y exudado uretral) Janda W. M., Koneman E.
W., Procop G. W.,
Woods G. L. (2006).
Panamericana
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Unidad de
Aprendizaje
Práctica No. 10 Cultivo de heridas Forbes, Betty A., Daniel F.
Práctica No. 11 Diagnóstico de enfermedades meníngeas Murray R. (2009).

(Cultivo de LCR) Microbiología
Médica.Ed.Elsevier Mosby.
Barcelona España
Práctica No. 12 Hemocultivo Forbes, Betty A., Daniel F.

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PRÁCTICA No. 1
INFECCIONES GASTROINTESTINALES
COPROCULTIVO
Introducción
El estudio de las bacterias responsables de cuadros clínicos gastrointestinales se
realiza fundamentalmente mediante el cultivo de la materia fecal (coprocultivo). Las
enfermedades diarreicas agudas representan una de las principales causa de defunción
en nuestro país.
Las vías gastrointestinales son el hábitat natural de una extensa variedad de
microorganismos, la mayoría de las bacterias de la flora entérica residente
corresponden a miembros de la familia Enterobacteriaceae (E.coli, Proteus etc.)
aunque también son abundantes Enterococcus faecalis, diversas especies de
Staphylococcus, Mycobacterium y especies anaerobias. Siendo de mayor relevancia
diagnóstica las enterobacterias patógenas como: Shigella, Salmonella, Yersinia,
Escherichia coli, esta última aunque se considera parte de la flora algunos serotipos
denominados enteropatógenos son capaces de producir gastroenteritis, principalmente
en lactantes en forma de brotes epidémicos. Además de otros géneros de importancia
médica como Vibrio, Campylobacter y Helicobacter que pertenecen a otras familias.
El objetivo principal de realizar el coprocultivo es que éste sirva como apoyo al
diagnóstico clínico en caso de gastroenteritis.
Objetivo
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El alumno aprenderá la técnica para la realización del coprocultivo así como conocerá
las diferentes pruebas bioquímicas que se utilizan para la identificaciòn de los
patógenos intestinales.
Material
Placas de Petri con Agar Mac Simmons para pruebas
Conkey bioquímicas
Placas de Petri con Agar S.S. Solución de Iodo
Placas de Petri con Agar, XLD Juego de colorantes de Gram.
Placas de Petri con Agar Sulfito Portaobjetos
de Bismuto Cubreobjetos
Placas de Petri con Agar Entérico
de Hektoen.
Placas de Petri con Agar EMB
Placas de Petri con Agar Campy-
BAP
Placas de Petri con Agar TCBS.
Placas de Petri con Agar Gelosa
sangre de Carnero.
Caldo selenito o tetrationato en
tubos de 13x100 con 2 mL.
Agua Peptonada Alcalina (APA) a
pH 9.
Solución salina isotónica en tubos
de 13x100 con 2mL.
Tubos con medio: TSI, LIA, MIO,
urea de Christensen, citrato de
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Colorante de Azul de Metileno

Gradillas
Aceite de inmersión.
Frasco con benzal
Algodón
Taxos de oxidasa
Tubos con caldo soya tripticasa
Baño maría
Marcador de vidrio.
Buffer de PBS
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Desarrollo
Toma y transporte de muestra para coprocultivo
Las muestras se deberán obtener al inicio del cuadro clínico antes de iniciar el
tratamiento antimicrobiano.
1. La muestra de heces se puede tomar directamente en un frasco limpio de
boca ancha y con tapa hermética de preferencia debe usarse estéril y
desechable, cuando se trata de lactantes la muestra se toma directamente del
recto usando sonda K31 conectada a una jeringa estéril, e introduciéndole
solución salina isotónica. Si la muestra se toma en el mismo laboratorio donde
se va a procesar el aislamiento, no es necesario usar medio de transporte hay
que sembrar de inmediato.
1. En estudios de campo o cuando el laboratorio no está cercano, la muestra se
toma con un hisopo que debe quedar bien impregnado de materia fecal. El
hisopo se coloca en un medio de transporte como el de Cary-Blair o el de
Stuart-Amies.
1. Sólo en ocasiones extremas se puede refrigerar la muestra.
Procesamiento de la muestra
1.- Hacer la observación directa de las heces, si presenta moco, sangre o si son
líquidas, pastosas o de diferente color.
2.- La tinción de Gram en frotes de materia fecal es importante para corroborar la
presencia de Campylobacter en sus formas vibriónicas y helicoidales, la presencia de
células indicativas de inflamación, eritrocitos, etc.
3.- Para muestras sólidas se coloca un inóculo de la materia fecal en solución salina
isotónica y se siembra en los medios de cultivo seleccionados. El método usado es por
la técnica de estría cruzada esterilizándola en cada sección de la placa y separando la
estría.
4.- Las placas se incuban a 37° C durante 18 a 24 horas
5.- Al mismo tiempo de sembrar las placas, sembrar un tubo de enriquecimiento con
muestra fecal usando una cantidad pesada de inóculo, como caldo tetrationato o caldo
selenito. Si se sospecha de Vibrio sembrar un tubo con agua peptonada alcalina (APA),
incubar a 37°C de 12 a 18 horas y posteriormente sembrar en un medio selectivo.
7.- Del tubo de enriquecimiento después de incubado se siembran medios selectivos y
diferenciales y se identifican las colonias de interés.
DIAGRAMA DE TRABAJO
Heces
Enriquecimiento
SSI al 0.5%
Caldo tetrationato
o
Caldo selenito
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Azul de metileno Agar SS
Agar ENDO Agar verde Brillante
Agar XLD Agar sulfito de bismuto
Agar tergitol 7 Agar XLD
Identificación
bioquímica
IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae
Reporte del coprocultivo

Realizar un informe del estudio para el médico incluyendo los siguientes datos:
1. Nombre completo del Paciente.
1. Edad y sexo del mismo.
1. Tipo de cultivo.
1. Si la muestra contenía microorganismos de la flora normal, o las bacterias patógenas

a nivel intestinal.
1. Las características principales de la muestra.
1. Sus observaciones con las diferentes tinciones.
1. Si existe algún comentario se le realiza al médico con sus respectivas sugerencias.
1. Firma del responsable.
Cuestionario
1. Menciona la flora que podemos encontrar normalmente en una muestra de
heces.
2. Cuáles son los principales patógenos que podemos encontrar en este tipo de
muestra.
3. En una muestra sólida, ¿qué bacteria buscamos principalmente?
4. ¿Qué factores intervienen para que un microorganismo pueda causar una
infección gastrointestinal?
5. ¿Qué bacterias producen enterotoxinas?
PRÁCTICA No. 2
INFECCIONES DE VÍAS URINARIAS
UROCULTIVO
Introducción
Las infecciones de las vías urinarias son muy frecuentes y presentan una marcada
resistencia al tratamiento y muchas de ellas con tendencia a redicivar especialmente en
las personas del sexo femenino, considerándose riesgosas porque pueden evolucionar
a enfermedades renales graves, como pielonefritis, presentándose en algunos casos de
manera asintomática, o como enfermedad aguda o crónica.
Las infecciones agudas son causadas generalmente por un solo microorganismo,
mientras que las crónicas por varios microorganismos. Las bacterias que con mayor
frecuencia se aislan de la orina de pacientes son E. coli, Staphylococcus, Proteus,
Enterococcus faecalis, Salmonella, Pseudomonas, Mycobacterium, ocasionalmente
Neisseria gonorroheae o Candida albicans.
Objetivo
El alumno aprenderá las diferentes tomas de muestra de la orina, así como la técnica
para su cultivo.
Material
Placas de Petri con Agar Mac Conkey.
Placas de Petri con Agar Sal y Manitol.
Placas de Petri con Agar sangre de carnero
Placas de Petri con Agar Thayer Martin.
Placas de Petri con Agar de DNAsa.
Tubos con medio de Biggy
Tubos con medios: TSI, LIA, MIO, Urea y Citrato para pruebas bioquímicas
Asa calibrada.
Juego de colorantes de Gram
Taxos de catalasa, oxidasa, PN, ESD. Bacitracina 0.04 U
Portaobjetos y cubreobjetos.
Placas estériles.
Pipetas estériles.
Tubos estériles.
Solución Salina Isotónica.
Matraz con Agar Nutritivo estéril.
Cuenta coloniasTaxos de catalasa, oxidasa, PN, ESD. Bacitracina 0.04 U
Desarrollo
Toma de muestra
La muestra idónea es la primera micción de la mañana, ya que permite la multiplicación
de bacterias durante la noche.
Técnicas para mujeres
1.- La paciente debe quitarse la ropa interior.
2.- Se lavará las manos cuidadosamente con agua y jabón, las enjuagará con agua y
las secará con una toalla limpia.
3.- Se separarán los labios mayores y menores, y los mantendrá separados en todo
momento hasta que se haya recogido la orina.
4.- Con una gasa enjabonada se lava bien la vulva pasándola de delante hacia atrás, se
repetirá el proceso un total de 4 veces.
5.- Enjuagar cuidadosamente con agua hervida para eliminar los restos de jabón.
6.- Se indicará a la paciente que orine desechando los 20-25 primeros mililitros, tras lo
cual y sin interrumpir la micción, se recogerá el resto de la orina en el recipiente.
7.- El frasco de boca ancha y estéril debe sujetarse para que no tenga contacto con
pierna, vulva o ropa de la paciente. Los dedos no deben tocar el borde del frasco o su
superficie interior.
Técnica para hombres

1.- Lavado de las manos con agua y jabón.
2.- Retraer completamente el prepucio, que se mantendrá así en todo momento, hasta
que se haya recogido la orina.
3.- Limpiar el glande con jabón neutro.
4.- Eliminar los restos de jabón enjuagándolo con agua hervida.
5.- Se pedirá al paciente que orine desechando los primeros 20-25 mililitros y sin
interrumpir la micción, recoger el resto de la orina en el recipiente estéril.
Técnica para niños

1.- En niños y niñas mayores la orina se recoge de forma similar a los adultos.
2.-En niños y niñas más pequeños, la orina se recogerá en colectores o bolsas estériles
especialmente diseñadas para ellos de la siguiente forma:
a) Lavado cuidadoso de los genitales y área perineal igual que en los adultos.
b) Colocar la bolsa de plástico o el colector.
c) Vigilar la bolsa cada 30 minutos y tan pronto como el niño haya orinado, deben
retirarse y enviarse al laboratorio para su procesamiento.
d) Si la micción no se ha realizado en una hora, se repite la operación colocando una
nueva bolsa.
Otros pacientes
1.- En pacientes ingresados con imposibilidad de recoger la muestra por sí mismos, se
realizará sondaje vesical por personal sanitario experto con las medidas asépticas
oportunas.
2.- Orina de pacientes con catéter permanente.
a) Se limpiará el catéter con una gasa humedecida en alcohol o solución yodada. Dejar
secar unos minutos.
b) Pinchar directamente con la aguja el catéter, por la zona desinfectada, aspirando
entre 3-5 mL.
c) Para su transporte puede enviarse en la jeringa o pasar la orina a un recipiente
estéril. Si no puede llevarse al laboratorio, se debe refrigerar a 4ºC.
d) Como regla general se considera que la muestra de sonda vesical no es una muestra
adecuada y que está justificado rechazar su procesamiento.
Aspiración suprapúbica
1. Este tipo de procedimiento solo puede ser realizado por personal médico. Se usa
para obtener el diagnóstico exacto en los recién nacidos y en los niños pequeños, es
una forma de demostrar el origen de la infección de la vejiga y la bacteriuria con
microorganismos que se originan más allá de la vejiga, así como la búsqueda de

bacterias anaerobias.
1. Hacer una punción directa en la vejiga a través de la pared abdominal con aguja y
jeringa.
1. Este tipo de métodos se considera muy agresivo.
Transporte de la muestra
La orina debe llegar al laboratorio en el plazo de una hora. Cuando esto no sea posible
debe refrigerarse a 4ºC durante un tiempo máximo de 24 horas. El laboratorio debe
controlar el transporte, garantizándose que las muestras han sido refrigeradas desde el
momento de su toma, siendo admisible, si no puede garantizarse el transporte correcto,
la utilización de algún conservante (ácido bórico al 2% o el sistema comercial con
bórico-formiato).
Volumen mínimo de la muestra.
Es suficiente un volumen de orina de 5-10 mL, ver tabla
Recomendaciones sobre el volumen de orina

VOLUMEN
DETERMINACION COMENTARIOS
(mL)
Bacteria 0,5-1 Primera orina de la mañana.
Hongos >20 Primera orina de la mañana.
Mycobacterias >20 Primera orina de la mañana tres días consecutivos.
Aspirado suprapúbico, enviar en un sistema de
Anaerobios 1
transporte para anaerobios
Primera orina de la mañana, enviar con hielo y
Virus 10-15
transportar al laboratorio inmediatamente.
Parásitos. Orina de 24 horas.

Método del asa calibrada 10-3
1. Se basa en el uso del asa calibrada para inocular un volumen conocido de orina en la
placa.
1. Agitar la orina, y tomar una asada de orina con el asa calibrada procurando que solo
entre la rueda y se descarga en línea rectas en el centro de la placa y se estría .
1. Se incuban las placas a 37ºC por 24 h.
1. Contar el número de colonias que se desarrollan en las placas y se calcula las
unidades formadoras de colonias por ml. UFC/mL.
1. Se identifica el microorganismo según sus características.
Método de dilución con pipeta
1. Se coloca 0.1 mL de orina en 9.9 mL de solución salina isotónica (dilución 10 2) se

homogeneiza el tubo perfectamente.
2. Con una pipeta estéril se toman 0.1 mL de esta dilución y se transfiere a un segundo
tubo conteniendo 9.9 mL de solución salina isotónica (dilución 10 4).
1. Se toman 0.1 mL de cada uno de los tubos y se depositan en placas de medios de
cultivo seleccionados.
1. La suspensión bacteriana se extiende rotando las placas suavemente, se incuba a
37ºC de 18-24 h.
1. Se cuenta el número de colonias de acuerdo al factor de dilución correspondiente.
Método de vaciado en placa

1. Se coloca 1 mL de cada una de las diluciones arriba mencionadas dentro de cajas de
Petri estériles.
2. Se agrega el medio de cultivo fundido y enfriado a 45ºC se rota suavemente la placa
para que se homogeneice perfectamente y se deja solidificar el medio.
3. Se incuban las placas a 37ºC de 18-24 h.
4. Se cuenta el número de colonias.

5. De acuerdo al factor de dilución se calcula las UFC/mL.
DIAGRAMA DE TRABAJO
Primera micción
matutina
chorro medio
Agar Mac Conkey

Agar sangre de carnero
asa calibrada 10-3
Cent. 2000g/10 min
Sedimento Identificación
Cuantificación bioquímica
No. de colonias X 1000
No. de UFC/mL
Thayer Martin
(N. gonorrhoeae)
Agar biggy
(Candida albicans)
Reporte
Una parte importante del urocultivo es la interpretación del resultado. El criterio de
100,000 o más microorganismos por mL de orina para el diagnóstico de la bacteriuria
significativa es primariamente de índole operacional, cuando se emplea el método del
vaciado aséptico para recoger las muestras. Actualmente se utiliza el criterio de Kass
para detectar una bacteriuria verdadera.
La bacteriuria verdadera se caracteriza usualmente por cuentas que exceden
sobradamente el 1,000,000 de colonias por mL. menos de 10,000 UFC/ mL se
considera negativo. Sin embargo, es muy importante el criterio del médico de acuerdo
al estado clínico de su paciente.
El reporte deberá contener los siguientes datos:

Nombre del Paciente
Edad
Sexo
Fecha
Hora de la toma de muestra
Nombre del médico
Tipo de estudio:
Resultado:
P/e: Se aíslo E. coli 650,000 UFC/mL.
Negativo a las 48 h de incubación
Firma del Responsable.
Cuestionario
1. Menciona a partir de qué área del aparato urinario es estéril.
2. Escribe los microorganismos que podemos encontrar como microflora residente
en la uretra.
3. ¿Qué es la bacteriuria?
4. ¿Por qué es importante realizar cultivos cuantitativos en una muestra de orina?
5. ¿Por qué la orina debe procesarse lo más pronto posible?
PRACTICA No. 3
SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS METODO DE KIRBY-BAUER
ANTIBIOGRAMA
Introducción
En los últimos años, las bacterias resistentes a los antimicrobianos, han causado varios
brotes de infecciones que produjeron muchas muertes. Por ello es necesario establecer
programas nacionales e internacionales de vigilancia de la resistencia de las bacterias a
los antibióticos, utilizando pruebas de sensibilidad fidedignas que proporcionen datos
comparables. La información microbiológica y epidemiológica disponible ayudará a los
clínicos a seleccionar el agente microbiano más apropiado para tratar cada infección.
Plantear la necesidad de saber cuál es el antimicrobiano que se debe utilizar

para eliminar el microorganismo que está provocando la infección, es de suma
importancia en pacientes cuyas terapias antimicrobianas han tenido poco éxito,
principalmente en pacientes hospitalizados.
Para esto es necesario conocer:
1. La susceptibilidad del microorganismo “in vitro”
1. La relación de susceptibilidad entre el microorganismo y las bacterias de la misma
especie.
1. Las propiedades farmacológicas de los antimicrobianos, incluyendo su toxicidad,
distribución, absorción y excreción.
1. Experiencia clínica en el tratamiento
1. Historia natural del proceso patológico.
1. El estado inmune del huésped
El papel que juega el laboratorio es de suma importancia, ya que al determinar la
susceptibilidad de los microorganismos “in vitro”, dará una pauta a seguir sobre cuál
debe ser el antimicrobiano que se debe usar, sin dejar de considerar las diferencias en
su actividad in vitro.
Para este tipo de estudios existen varios métodos como son:

1. Dilución seriada en tubo
1. Dilución seriada en placa.
1. Difusión en discos de papel filtro
1. Sistemas automatizados
La selección del método, va a depender de:
1. Número de pruebas que se procesen diariamente.
1. Tipo de microorganismo que se trata, del sitio que se aislé, tipo de
patogenicidad, etc.
1. Equipo automatizado que se cuente.
Objetivo
Que el alumno realice la técnica de difusión en disco de Kirby-Bauer para determinar la
susceptibilidad del patógeno “in vitro” ante determinados antimicrobianos
DIFUSIÓN EN DISCOS DE PAPEL FILTRO (Modificado de la FDA y la NCCLS del

método original de Bauer, Kirby. Sherris y Turck 1966).
Utilizando discos de papel filtro con diferentes concentraciones del antimicrobiano, sé
obtiene diámetros en la zona de inhibición proporcionales a la concentración. Para
seguir este método es indispensable:
1. Efectuar el antibiograma a microorganismos de crecimiento rápido, por lo que
no se deberá emplear en organismos de crecimiento lento, anaerobios
obligados.
1. Siempre se realizará con cultivos puros y con cepas control.
1. El medio empleado es el de Mueller-Hinton cuyo pH final deberá ser 7.2 a 7.4.
1. Los microorganismos control utilizados para realizar esta técnica son:
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853)
2. Verificar la calidad de los discos así como su fecha de caducidad.
3. Para probar la susceptibilidad de Haemophylus y Streptococcus se utiliza el

medio suplementado con sangre de carnero.
Material
1. Placas con medio de Mueller Hinton
de 15 cm de diámetro
1. Placas con medio de Mueller Hinton
con sangre de carnero
1. Tubos con 4 ml de caldo Mueller
Hinton
1. Hisopos estériles
1. Pinzas
1. Sensidiscos para grampositivos y
gramnegativos
1. Cepas control
1. Regla transparente
1. Alcohol
1. Tubo del Nefelómetro de McFarland
al 0.5%
1. Solución salina isotónica estéril.
(SSI).
Desarrollo
1. Con un asa en punta se tocan 4 ó 5 colonias morfológicamente iguales y se inoculan
en un tubo con SSI
1. Ajustar la turbidez tomando como referencia el tubo 0.5 del Nefelómetro de
McFarland.
1. Se introduce el hisopo en la suspensión bacteriana, se quita el exceso de solución
en las paredes del tubo.
1. Sembrar el microorganismo en la placa de Mueller Hinton en tres direcciones para
sembrar uniformemente. Al final se pasa el hisopo en el borde de la placa.
1. Colocar los sensidiscos distribuidos en forma uniforme o en su defecto usando un
dispensador automático, con una presión ligera.
1. Incubar la placa de Petri en forma invertida durante 18 h a 35ºC.
2. Se mide los halos de inhibición con la regla.
1. La interpretación de los diámetros de las zonas de inhibición de las cepas se hace en
base a las tablas entregadas por el fabricante.
Diagrama de procedimientos
Reporte
1. Se informa la actividad de los antibióticos contra los microorganismos empleados.
1. Si la cepa es de microorganismos resistentes a la penicilina se debe probar su
comportamiento a otros antibióticos.
1. Sí el paciente es sensible a la penicilina se debe usar eritromicina y la tetraciclinas
como otra alternativa.
1. Se reporta el nombre de la bacteria con su género y especie así como su
comportamiento al antibiograma.
Cuestionario
1. Describe las diferentes técnicas que se utilizan para la realización de los
antibiogramas.
2. ¿A qué microorganismo le realizas el antibiograma?
3. ¿Cuál es la técnica que utilizaste en la práctica y qué nombre recibe?
4. ¿Qué medio de cultivo utilizaste para esta técnica?
5. ¿Por qué se calibra la muestra a una turbidez de 0.5 y a cuántas bacterias
equivale?
PRÁCTICA No. 4
TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR
EXUDADO FARÍNGEO Y NASOFARÍNGEO
Introducción
El estudio del exudado faríngeo y nasofaríngeo es importante para el diagnóstico de
ciertas infecciones consideradas dentro de las principales causas de morbilidad y
mortalidad en todo el mundo. Dentro de las principales bacterias patógenas causantes
de infección están los estreptococos.
También es muy importante conocer la flora normal en las vías respiratorias altas
y bajas para un buen reporte, ya que la orofaringe es un sitio expuesto y se debe
distinguir a los patógenos de los comensales con ayuda del cultivo.
El exudado faríngeo y nasofaríngeo son las muestras más empleadas para el

estudio bacteriológico de una infección de vías respiratorias superiores y es requisito
importante que sean tomadas en forma adecuada para garantizar resultados confiables
y correctos.
Objetivo
Que el alumno aprenda a tomar la muestra para el aislamiento de bacterias de
importancia médica de vías respiratorias altas
Toma y transporte de la muestra

Es muy importante la toma de la muestra al inicio del cuadro clínico antes de empezar
cualquier tratamiento.
1. Es importante indicarle al paciente que debe venir al laboratorio sin aseo bucal.
1. Sin haber ingerido ningún tipo de alimento.
1. No debe haber ingerido ningún antimicrobiano.
1. Se inclina la cabeza del paciente hacia atrás y se revisa con una lámpara la zona
afectada
1. Se empuja la lenguas hacia abajo con un abatelenguas estéril que permita mejor
visión.
1. Se introduce un hisopo hacia las amígdalas, se frota suavemente la zona afectada.
1. Hay que evitar tocar la lengua, los dientes o la mucosa.
EXUDADO NASOFARINGEO
En la muestra indicada para la investigación de Bordetella pertussis se puede

tomar por exudado o aspirado
1. Utilizar solamente hisopos de Dacrón o rayón con base de plástico o alambre
flexible. NO utilizar hisopos de alginato de calcio o con palillo de madera.
1. Introducir el hisopo por una de las narinas, aproximadamente 10 cm cuidando

tocar solo el extremo posterior del mango del hisopo y evitar tocar solo los
cornetes.
1. Una vez tocado el fondo de la nasofaringe se frota suavemente y con movimiento
rápido.
Aspirado:
1.- Desinfectar el lugar de la punción con povidona.
2.- Introducir una aguja en el antrum maxilar por debajo del cornete inferior, o en el
seno frontal por debajo del marco supraorbital del ojo.
3.- Aspirar el líquido del seno. Cuando no se obtenga líquido, aplicar 1 mL de suero
salino estéril y aspirarlo nuevamente.
4.-Inyectar una parte de la muestra en un medio de transporte para anaerobios y enviar
el resto en un contenedor estéril o en la propia jeringa.
Transporte de la muestra
1. En caso que la muestra no se vaya a procesar de inmediato se deberá depositar en
medio de transporte.
1. Es importante que el médico nos indique en base al cuadro clínico de que proceso
infecciosos se sospecha, para conocer los requerimientos de cada una de las
bacterias y sembrar las muestras inmediatamente.
Material
1. Placas de Petri con. Gelosa sangre de carnero al 5%
1. Placas de Petri con medio de Sal y Manitol
1. Placas de Petri con Mac Conkey
1. Placas de Petri con medio de Thayer-Martin.
1. Placas de Petri con medio de Agar hemina bacitracina extracto de levadura (GHBL).
1. Placas de Petri con medio de Biggy
1. Tubos con medios TSI, LIA, MIO.CS. y Urea para pruebas bioquímicas
1. Tubos con caldo Soya Tripticasa
1. Matraz con 15 ml de agar de Soya tripticasa
1. Hisopos estériles
2. Abatelenguas estériles
3. Colorantes de Gram
4. Frasco con cloro
5. Sensidiscos de Bacitracina de 0.04 U
6. Sensidiscos de Optoquina
7. Sensidiscos de Novobiocina
8. Tubos con agar bilis esculina
9. Tubos de Caldo soya tripticasa con 6.5 % NaCl
Desarrollo
Es importante seguir el diagrama de trabajo que se indica en esta práctica.
Aunque el uso de agar sangre de carnero es obligado para la búsqueda de
Streptococcus hemolítico.
1. Se toma la muestra como ya se indicó anteriormente, se siembra en los medios: agar
sangre de carnero, Thayer Martin, Sal y Manitol etc.
1. Se incuban 24 h a 37ºC
1. Hacer frotes y teñir por técnica de Gram, Ziehl Neelsen, Giemsa para investigar
asociación con fusoespirilar.
2. Hacer frotes y teñir por técnica de Gram, Ziehl Neelsen, Giemsa para investigar
asociación con fusoespirilar.
1. Sí en las tinciones se sospecha de Corynebacterium diphteriae se debe seguir un

diagrama de trabajo específico para su identificación así como el aviso inmediato a
las autoridades de la S.S.A.
1. Se debe leer todas las placas y se identifica a los microorganismos patógenos.
Es importante en niños menores de cinco años la investigación de Haemophilus
influenzae.
Es de gran trascendencia epidemiológica determinar la presencia de portadores de
Neisseria meningitidis.
Otro problema importante son los casos de Bordetella pertussis es importante
sembrar las muestras en medio de Bordet-Gengou y seguir un diagrama específico
para su identificación así como la notificación de los casos a la S.S.A.
Reporte
El reporte al médico es de acuerdo a nuestros resultados, es importante tomar en
cuenta la edad y sexo del paciente.
1. Se aisló Flora Normal
2. Se identificó el siguiente microorganismo, se pone género y especie
1. Es posible encontrar más de un microorganismo patógeno en un cultivo
1. De preferencia a estas muestras se les realiza antibiograma, si tiene más de una
bacteria patógena a cada una se les realiza su antibiograma
DIAGRAMA DE TRABAJO
Medio de
transporte Stuart
Caldo estreptosel
Agar Biggy
Agar sangre de
carnero Agar sangre de
Candida albicans (CGP, BGN) carnero
GHBEL
(H. influenzae)
Colonias β-hemolíticas
Pruebas de identificación
Cuestionario
1.- ¿Cuál es la importancia de realizar un cultivo faríngeo?

2.- ¿Qué indicaciones le das al paciente para una correcta toma de muestra?
3.- Menciona la flora normal de faringe.
4.- Menciona a los principales patógenos que podemos encontrar como posibles
productores de una faringitis.
5.- ¿Cuál es la importancia de buscar a Streptococcus pyogenes?
PRÁCTICA No. 5
INFECCIONES DE VÍAS RESPIRATORIAS BAJAS
(CULTIVO DE EXPECTORACIÓN)
Introducción
Las infecciones de las vías respiratorias inferiores son causa importante de enfermedad
y muerte a nivel nacional. Siendo la tuberculosis en sus diferentes cuadros agudos, una
de las más frecuentes, se presentan tanto en gente joven y anciana, así como en
pacientes inmunodeficientes y a consecuencia principalmente del uso del tabaco.
De los principales agentes bacterianos asociados a neumonías sobresalen en

primer término Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus
influenzae; bacterias del tipo anaerobio tienen un papel importante en algunas
muestras, por lo que se recomienda la búsqueda de Chlamydia pneumoniae y
Mycoplasma pneumoniae que se asocia con neumonías atípicas, Francisella tularensis,
E.coli, Ps aeruginosa, levaduras del tipo de Candida albicans.
En las condiciones habituales de la clínica diaria, la expectoración no es una

muestra representativa de la situación existente en el tracto respiratorio inferior por su
mezcla con secreciones procedentes de todo el árbol traqueo-bronquial y con la flora
saprófita de la orofaringe. No obstante es un método fácil y rápido cuya utilidad o
relación entre resultado obtenido y verdadera etiología depende en gran medida de su
correcta obtención, control de calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de agente
que se pretenda detectar y valoración adecuada del resultado.
Objetivo
Que el alumno conozca la metodología para el manejo e identificación de los agentes
etiológicos de las vías respiratorias bajas a partir de esputo y otros productos .
Toma de muestra
1.- Enjuagar la boca con agua destilada estéril o solución salina.
2.- Obtener el esputo tras una expectoración profunda, preferentemente matinal.
3.- De no producirse expectoración espontánea, puede inducirse el esputo con
nebulizaciones de suero fisiológico estéril (15 mL durante 10 minutos), siendo útil
además realizar un drenaje postural o fisioterapia respiratoria.
LAVADO O CEPILLADO BRONQUIAL
1. Este tipo de muestras solo son tomadas por un médico en condiciones asépticas.
1. Evitar la contaminación con la flora de la cavidad oral.
1. Se recomienda solo en pacientes hospitalizados con SIDA, Cáncer o enfermedad
obstructiva crónica (EPOC).
1. La muestra se debe procesar de inmediato una vez llegada al laboratorio.
Volumen mínimo
De 2 a 10 mL, si es posible.
Transporte y conservacion
Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si no es posible, conservar
en refrigeración 4ºC.
Observaciones
1.- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibiótico.

2.- No es útil para anaerobios.
3.- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia.
4. - La expectoración debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente
(mas de 25 leucocitos polimorfonucleares por campo 100x, y de 10 células epiteliales
por campo 100x).
Material
1. Placas de Agar sangre de carnero. 1. Placas de Agar de Sal y Manitol.
2. Placas de Agar de Mac Conkey. 1. Placas de Agar de Thayer Martin.
1. Placas de Agar Cetrimida. 1. Placas de Agar Levinthal.
1. Placas de gelosa sangre en base

Columbia con ácido nalidíxico y
colistina.
1. Tubos con medio de Biggy
1. Tubos con medios TSI, UREA, CS,
LIA y MIO para pruebas bioquímicas
10. Portaobjetos
1. Cubreobjetos
2. Microscopio
3. Juego de colorantes de Gram.
4. Tinta China
5. Aceite de inmersión
6. Taxos de optoquina y bacitracina de
0.04 U y 10 U
7. Tubos estériles de plástico
desechable.
8. Pipetas Pasteur estériles
9. Centrífuga.
Desarrollo
Todas las muestras de cepillado bronquial o de esputo se deben trabajar con las
siguientes medidas de seguridad: Uso de campana de seguridad, guantes desechables,
cubrebocas y lentes protectores o en su defecto mascarillas.
Selección de la muestra
1. La muestra se examina microscópicamente para identificar la presencia de sangre y
material purulento así como el color de la misma.
1. Se toma de la porción más purulenta o con restos de sangre y a partir de esta
porción se hace una tinción de Ziehl-Neelsen (Z-N) ,tinción de Gram y el examen en
fresco el cual una vez puesto el cubreobjetos se presiona de tal forma que la
muestra se distribuya.
1. Observar todo el porta-objetos para determinar la distribución de las células tipo.
1. Se examina por la óptica de Normarsky. Hay que seleccionar 10 campos
representativos y en ellos se cuentan el número y proporción de leucocitos y de
células epiteliales de descamación. Según los resultados se clasifican de acuerdo a
Welch y Kelly
CLASIFICACIÓN DEL ESPUTO SEGÚN WELCH Y KELLY
Clase de Grupo Células Leucocitos

Welch-Kelly Normansky Epiteliales
I 0 <25 <25
1 >25 <10
2 >25 10-25
II 3 >25 >25
III 4 10-25 >25

5 <10 >25
6 <25 >25
Tomado de:Welch DF.kellMT.J.Clin.Microbiol 1979, 9 :520-524
2. Las muestras que sean de clase III serán cultivadas.

3. Las muestras que sean de clase I y II se rechazan, no se deben cultivar.
Nota. Es muy importante indicar el porqué del rechazo de la muestra al médico y
solicitar una nueva muestra y se envía con la siguiente leyenda. “La muestra no fue
aceptada para el cultivo debido a la presencia de más de 25 células epiteliales por
campo microscópico (100x).
4. Inocular la porción sobrante del material purulento en los medios de cultivo
adecuados por estría cruzada, no olvidar hacer picadura en las placas de gelosa
sangre de carnero para certificar la hemólisis.
5. Incubar las placas con sangre a 35-37 ºC en atmósfera parcial de CO 2.
6. Se identifican las bacterias de acuerdo a su género y especie.
Reporte
1. Proporcionar un informe preliminar después de la observación de los cultivos.
1. La flora normal presente en el cultivo no debe ser identificada ni reportada.
1. Si no se observan microorganismos al término de la incubación y la identificación de
los microorganismos patógenos ya se realizó .se debe enviar el informe final con
fecha y firma del responsable. Se debe informar el cultivo p/e Negativo a búsqueda
de Streptoccoccus pneumoniae
1. Si no hay crecimiento después de dos días el informe final es el siguiente: No hubo
crecimiento bacteriano a las 48 h de incubación.
En el laboratorio se debe contar con pruebas rápidas para la identificación de

antígenos que ayudan al médico para establecer una terapia antimicrobiana adecuada
y en el menor tiempo posible.
En paciente con fibrosis quística o en huéspedes comprometidos es semejante; sin
embargo, es importante reportar todos los microorganismos independientemente la
cantidad en que se encuentra, y es muy importante realizarles el antibiograma aunque
el médico no lo solicite.
DIAGRAMA DE TRABAJO
Muestra
(Esputo)
Examen en fresco BAAR

Tinción de Gram
Agar Gelosa Sangre

Agar Gelosa Chocolate
Agar Mac Conkey
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy
37 °C /CO2 24 – 48 Hrs
Cuestionario
1.- ¿Qué características debe tener una muestra de expectoración para poderla
procesar?
2.- ¿Qué microorganismos pueden afectar las vías respiratorias bajas?
3.- ¿Cuál es el principal microorganismo que buscamos en una expectoración?
4.- ¿Mencione otras técnicas que se pueden utilizar para identificar a Streptococcus
pneumoniae?
5.- ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Ziehl-Neelsen?
PRÁCTICA No. 6
BÚSQUEDA E IDENTIFICACIÓN DE
Mycobacterium tuberculosis
Introducción
La tuberculosis en nuestro país, es actualmente uno de los problemas más importantes
de salud en los últimos 5 años y su resurgimiento se da a partir de la epidemia de VIH
que ataca a todo el mundo.
El diagnóstico de las micobacterias se puede realizar en diferentes productos
biológicos como son: esputo, orina, lavado gástrico, raspado laríngeo, lavado o
cepillado bronquial, materia fecal, sangre menstrual, heridas.
Objetivo:
Que el alumno conozca el manejo de las diferentes muestras para el aislamiento de
Mycobacterium tuberculosis
Toma de muestra
Una parte muy importante para un buen resultado es la toma de muestra la cual deben
cubrir algunos requisitos indispensables como son:
1. Calidad de la muestra.
1. Cantidad.
1. Envase estéril y desechable.
EXPECTORACIÓN
1. La muestra debe ser de preferencia la primera de la mañana.
1. La muestra que son enviadas al laboratorio de preferencia se le agrega carbonato
de sodio que tiene la finalidad de disminuir el crecimiento de la flora asociada, y
disminuir el mal olor.
1. En caso de niños se puede usar el hisopo laríngeo o nasofaríngeo.

1. No olvidar usar frasco estéril biodegradable de boca ancha.
ORINA
1. Se debe obtener en un frasco estéril y de boca ancha, después de lavado estricto de
genitales.
1. Se puede usar orina de 24 h o la primera de la mañana.
1. En este tipo de muestras es posible que el médico lo solicite en forma seriada.
LAVADO GASTRICO
1. Este tipo de muestras solo las efectúa un médico
1. Se utiliza una sonda gástrica estéril y desechable
1. El contenido del lavado gástrico se pone en un frasco estéril
1. Se trabaja el sedimento.
1. Este tipo de muestras se deben trabajar el mismo día que se toman
LAVADO O CEPILLADO BRONQUIAL y PLEURAL.

1. Este tipo de muestras es tomado por el médico en sala de operaciones bajo
condiciones de asepsia.
1. Este tipo de muestras se reciben en un frasco estéril con un volumen de acuerdo al
aseo que le realizaron al paciente.
1. Se deben procesar el mismo día que se reciben.
1. Se trabaja con el sedimento de la misma.
Material que se utiliza para el lavado o cepillado bronquial
HECES
1. Se recibe la muestra en un frasco estéril y desechable.
1. Se prepara una suspensión gruesa de materia fecal y solución salina.
1. Se agrega un volumen igual de éter. Se agita y se centrifuga a 3000 r.p.m. durante

un período de 5 min.
1. Se elimina el sobrenadante.
1. Se utiliza la capa gelatinosa
1. Se realiza la tinción de BAAR.
1. El resto de la materia fecal se trata con NaOH al 4% se siguen los pasos igual que el
esputo.
LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO.
1. Este tipo de muestras las obtiene el médico en forma aséptica
1. Se reciben en tubos estériles.
1. Se centrifuga la muestra
1. Del sedimento se realizan las tinciones y se siembra
2. La muestra se debe trabajar en forma inmediata el día que se recibe
TEJIDOS
1. Se recibe en un frasco estéril de boca ancha.
1. Se toman fragmentos de tejidos y se trituran en un mortero estéril
1. Se hacen frotes delgados
1. Las demás muestra se siembra en forma directa.
Material
1. Tubos estériles de tapón de rosca de plástico biodegradable con capacidad de 40 ml

guantes desechables
1. Cubrebocas o en su defecto mascarilla
1. Frascos estériles
1. Agitador vortex
1. Equipo de Ziehl-Neelsen
1. Equipo de Auramina Rodamina
1. NaOH al 4%
1. Pipetas Pasteur estériles
1. Frasco con fenol al 10%
1. Pinzas
1. Tubos con medio de Lowenstein - Jensen
1. Microscopio
1. Aceite de inmersión
1. Portaobjetos.
Desarrollo
BACILOSCOPIA DIRECTA DEL ESPUTO
1. Hacer un frote de la porción purulenta, se puede usar un aplicador de madera.
1. Extender la muestra en forma uniforme.
1. El aplicador se desecha dentro del frasco de la muestra.
1. Se deja secar el frote al aire.
1. Se fija al calor.
1. Se tiñe por la técnica que se tenga para la búsqueda de BAAR.
INTERPRETACION.
El número de bacilos es de suma importancia ya que se relacionan con el grado de
infectividad del paciente. La lectura se realiza como lo muestra el esquema de tal forma
que se observa toda la preparación
Informe de las baciloscopias para BAAR
. No. de bacilos encontrados Reporte de Resultados

Negativo No se observan BAAR en 100 campos
De 1 a 9 BAAR Informar el número de bacilos en 100
campos
Positivo + Menos de un bacilo x campo observados
en 100 campos
Positivo ++ De 1 a 10 bacilos por campo en promedio
en 50 campos observados
Positivo +++ Más de 10 bacilos por campo en 20
campos observados
Tomado de International 4 Union Againts Tuberculosis 1977
CONCENTRACION Y CULTIVO DEL ESPUTO

Dado las características de las muestras es importante seguir estas indicaciones para
prepararlas y poder así sembrarlas en el medio selectivo.
Método de Petroff modificado
1. Se toman 2 mL del esputo y se transfieren a un tubo de tapón de rosca de plástico
desechable y se mezclan con un volumen igual de NaOH al 4% con rojo de fenol.
1. El tubo se agita en un vortex durante 20 seg. Se incuba a 37º C por 15 min.

1. Se centrifuga a 3,000 r.p.m. durante 15 min. (Por ningún motivo se debe abrir la
centrifuga si no se ha detenido completamente).
1. Se decanta cuidadosamente el sobrenadante.
1. El sedimento se neutraliza con HCl 1N o con H 2SO4 al 8%. El procedimiento de
neutralización debe ser muy cuidadoso de tal forma que el pH final no sea inferior a
6.5 , ni superior a 7.2.
1. Se siembra 7 o 8 gotas del sedimento con pipeta Pasteur estéril en dos tubos con
medio de Lowenstein-Jensen.
1. El sedimento se toma con pipeta Pasteur y se hacen dos frotes que se tiñen con los
métodos existentes en el laboratorio para la búsqueda de BAAR puede ser la tinción
de Ziehl - Neelsen o de auramina rodamina.
1. Los tubos se deben incubar a 37ºC ,dejándolos en posición horizontal con la tapa
floja durante 24 a 48 hasta que se evapore el inóculo .Posteriormente se ajusta la
tapa con fuerza para evitar que la muestra se evapore , se incuba durante 60 días.
1. Semanalmente se revisan los tubos hasta la octava semana. Sí no hay desarrollo se
informa como negativo. Un cultivo se da como negativo después de 60 días de
incubación.
1. Si hay crecimiento, se identifica a M. tuberculosis las características del crecimiento
son masas pequeñas, de superficie mate y consistencia cérea. Tiñe diferentes tonos
desde amarillo muy pálido hasta anaranjado rojizo.
1. Los resultados se informan ya que se haya identificado con las pruebas especiales
para el género y la especie.
TRATAMIENTO DE LA ORINA
1. Se recibe la muestra en un frasco estéril de boca ancha de preferencia la primera
orina de la mañana.
1. Se centrifuga la muestra a 3000 r.p.m. por 30 min.
1. Decantar el sobrenadante y depositarlo en el frasco original, cuidar de limpiar la boca

del tubo con fenol al 10%. Se hace el frote del sedimento.
1. El resto del sedimento se trata con NaOH al 4%, Agregando una cantidad semejante
al sedimento.
1. Se deja 15 min a 37ºC
1. Se siguen los mismos pasos que para la técnica del esputo para sembrar el
sedimento con pipeta Pasteur estéril.
1. Se realiza del sedimento la baciloscopia.
Reporte
En caso de tener BAAR se reportan como se indicó en la tabla, es importante
correlacionarlo con el cultivo.
Cuestionario
1.- ¿Importancia médica de Mycobacterium tuberculosis?
2- En la búsqueda de Mycobacterium tuberculosis para su cultivo ¿qué tratamiento
debes darle a la muestra?
3.- ¿En qué condiciones debes trabajar a Mycobacterium tuberculosis y por qué?
4.- Menciona algún medio selectivo para Mycobacterium tuberculosis, cuánto tiempo
necesita incubarse y qué pruebas necesitas hacer para su identificación.
5.- Menciona un método diferente al cultivo convencional para diagnosticar tuberculosis
PRÁCTICA No. 7
INFECCIONES OCULARES
Introducción
Las infecciones oculares se manifiestan comúnmente por el constante lagrimeo. Los
microorganismos aislados con mayor frecuencia dependen de la edad del paciente y su
localidad. Considerándose dentro de los pacientes de mayor riesgo a los recién nacidos
por las posibles secuelas irreversibles que pueden originarse en ellos.
Objetivo
Que el alumno conozca la metodología para el manejo de este tipo de muestra e
identifique las bacterias que atacan principalmente este sitio
Toma de muestra cultivo ocular

1.- Indicar al paciente que debe abstenerse de aplicar soluciones antisépticas en ambos
ojos.
2.- Con un hisopo mojado en suero fisiológico frotar sobre la conjuntiva.
3.- Identificar de que ojo procede la muestra.
4.- El transporte deberá ser inmediato. Cuando no sea posible, se colocarán los hisopos
en medio de transporte tipo Stuart-Amies, que se mantendrá a temperatura ambiente.
Para Chlamydia se utilizará un medio de transporte específico ("2-SP").
Material
1. Hisopos estériles de alginato de calcio o de dacron.
1. Guantes estériles y desechables,
1. Placas de Gelosa sangre de carnero.
1. Placas de sal y manitol.
1. Placas de agar Mac Conkey.
1. Placas de Thayer -Martin.
1. Placas con medio de Levinthal ó Agar chocolate
1. Placas con Agar DNAsa
1. Tubos con Biggy.
1. Tubos con medios:TSI, LIA, MIO, Citrato y Urea para pruebas bioquímicas
1. . Reactivo de oxidasa.
1. Taxos de optoquina y bacitracina.
1. Equipo para búsqueda de Chlamydia.
Desarrollo
1. La muestra se toma del sito de daño y se siembra en los medios de cultivo indicados.
1. Es importante incubar las placas en las condiciones que requieran.
1. Cualquier crecimiento se le debe efectuar la tinción de Gram.
1. Se identifica el crecimiento según el diagrama.
1. Para búsqueda de Chlamydia se realiza por medio de tinciones o en su defecto por

métodos de inmunofluorescencia..
Reporte
Debido al tipo de muestra es importante reportar cualquier bacteria identificada para su
tratamiento inmediato.
1. Se reporta el resultado teniendo cuidado de indicar de que ojo procede la
identificación.
1. Es importante realizar el antibiograma en este tipo de muestra
DIAGRAMA DE TRABAJO
Muestra
Tinción de Gram
Medio de
transporte Stuart
Inocular :
Agar sangre
Agar chocolate
Agar sal y manitol
Agar Mac Conkey
Agar Dextrosa Sabouraud
Cuestionario
1.-Esquematiza la anatomía del ojo.
2.-Menciona las diferentes técnicas que se utilizan para la toma de muestra según el
problema que se presenta en el ojo.
3.- ¿Qué flora podemos encontrar en el ojo?
4.- ¿Cuáles son los principales patógenos que podemos aislar?
5.- ¿Qué indicaciones le das al paciente para la toma de muestra?
Práctica No. 8
INFECCIONES ÓTICAS
Introducción
Dentro de las infecciones que pueden generar complicaciones más frecuentes están la
de los oídos ya sean por su forma crónica o aguda. El cuadro inicial puede asociarse a
infecciones respiratorias mal cuidadas, en niños por la introducción de objetos extraños
p/e botones, frijoles etc.
Objetivo
Que el alumno conozca la metodología para el manejo de este tipo de muestra, e
identifique las bacterias que pueden causar daño en oido
Toma de muestra.
1. Se le indica al paciente que se abstenga de aplicarse gotas de antimicrobianos.
1. Se introduce el hisopo teniendo cuidado de no lastimar, indicando el paciente hasta
donde soporta el hisopo.
1. Se diferencia los tubos del oído derecho e izquierdo.
1. En las infecciones crónicas se limpia el oído con solución de cloruro de benzalconio

1 :1000 para eliminar la flora contaminante.
1. Cuando se trata de perforaciones del tímpano debe ser tomada por el
otorrinolaringólogo
Material
1. Guantes estériles desechables.
1. Hisopos delgados de alginato de calcio o de dacron.
1. Gasas estériles.
1. Placas de gelosa sangre de carnero.
1. Placas de Sal y Manitol.
1. Placas de Mac Conkey
1. Placas de agar de Levinthal
1. Placas con agar DNAsa
1. Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CS y Urea. Para pruebas bioquímicas
1. Taxos de optoquina
1. Taxos con bacitracina.
1. Tubos con Biggy
1. Colorantes de Gram
1. Tubos con O/F con glucosa al 1%
1. Reactivo para catalasa
1. Reactivo para oxidasa.
Desarrollo
Después de la toma de muestra es importante sembrarla en los medios de cultivos
indicados y en forma inmediata.
Cualquier crecimiento se le debe efectuar la tinción de Gram y reportarla. La
identificación se realiza en base a el diagrama.
Reporte
En el reporte al médico se debe indicar:
1. El resultado por separado de cada oído
1. Como se encontraba este cuando se le tomo la muestra.
1. Si se encontró algún objeto extraño.
1. Es importante realizarle el antibiograma en caso de que el cultivo se encuentre
positivo.
1. Sí no se aísla ningún microorganismo se reporta como negativo a las 72 h de
incubación.
DIAGRAMA DE TRABAJO
Muestra
Medio de
transporte Stuart
Inocular :
Agar sangre
Agar chocolate
Agar sal y manitol
Agar Mac Conkey
Agar Dextrosa
Sabouraud/Biggy
Cuestionario
1.- Esquematiza la anatomía del oído.

2.- De las diferentes partes del oído, menciona que flora podemos encontrar en cada
una de ellas.
3.- ¿Cuáles son los principales patógenos que puedes encontrar en el oído?
4.- Menciona las diferentes técnicas que utilizas para la toma de muestra .
5.- ¿Qué indicaciones le das al paciente para la toma de muestra de oído?
PRÁCTICA No.9
INFECCIONES DEL APARATO GENITAL
(EXUDADO CERVICO VAGINAL, VULVAR Y URETRAL)
Introducción
Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) son un problema importante en Salud
Pública. Los principales agentes asociados a las ETS incluyen virus, bacterias, hongos,
protozoarios y ectoparásitos, los cuales están involucrados en varios síndromes, por lo
que la participación del laboratorio en el diagnóstico es relevante. Sin embargo los
microrganismos también pueden introducirse en el aparato genital ya sea
instrumentación, es decir, presencia de aparatos extraños al cuerpo los cuales pueden
causar inflamación o irritación y favorecer la infección. Además la madre puede
contagiar al niño durante el embarazo o durante el parto.
En general, la identificación de las bacterias productoras de ETS no siempre es a

través de cultivos, en algunos casos se requiere de técnicas inmunológicas. Como el
caso de Treponema pallidum ya que no existe ningún medio sintético para su
aislamiento; o Chlamydia trachomatis que por ser una bacteria intracelular obligada
requiere de células vivas para su multiplicación, de tinciones especiales o bien técnicas
de hibridación para su identificación.
Las infecciones agudas pueden extenderse por continuidad en el aparato genital

y originar secuelas graves en tanto que la infección puede tener características
metastásicas y transmitirse por vía sanguínea a otros órganos y tejidos.
Objetivo
Aprenderá a tomar una muestra de aparato genital y a procesarla en el laboratorio
Desarrollo
Este tipo de muestras requiere de condiciones especiales en cada caso y se deben
tomar en cuenta, las siguientes recomendaciones:
1.- Es importante tomarlas cuando la sintomatología existe y obligatoriamente en los
contactos de la pareja sexual.
2.- El paciente no debe estar en tratamiento antimicrobiano.
3.- Es importante que se cuente con el material adecuado como son. hisopos de
alginato de calcio, de dacrón o tratados con soluciones amortiguadoras.
4.- Este tipo de muestras se deben sembrar en los medios de cultivo adecuados y en
forma inmediata.
5.- En caso de no tener los medios se debe utilizar medios de transporte y crecimiento.
6.- Existen casos de mujeres y en hombres donde es necesario muestrear otros sitios
anatómicos, sobre todo en los pacientes que refieren contacto oro-genital, ano-genital y
oro-anal.
Exudado vaginal
1.- Con la paciente en posición ginecológica se introducirá un espéculo "sin lubricante"
(si es necesario para lubricar utilizar agua templada).
2.- Recoger la muestra bajo visión directa, con un hisopo, de la zona con mayor
exudado, o en su defecto, del fondo del saco vaginal posterior e introducirlo a un medio
de transporte Stuart-Amies (figura xx).
3.- Repetir la operación con un segundo hisopo, hacer un extendido sobre un
portaobjetos y colocar el hisopo en un tubo con SSI, para la posterior observación en
fresco.
4.- Retirar el espejo y de la secreción que quedó en el espéculo medir pH y hacer la
reacción de aminas con KOH al 10%, se reporta positiva si desprende un olor
característico a “pescado” el cual se debe a aminas volátiles.
5.- Cuando se sospeche la infección por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis
Mycoplasma hominis o Ureaplasma urealtycum, deberá enviarse muestra endocervical.
6.- Mantener la muestra a temperatura ambiente, o preferentemente, en estufa 35-37ºC
hasta su procesamiento, que deberá ser antes de 3-6 horas.
Figura .Toma de muestra vaginal
Observación en fresco
Las observaciones en fresco son de gran utilidad sobre todo en mujeres en las cuales
existe secreción vaginal y en el caso de tricomoniasis, vaginosis bacteriana y
candidiasis, así como en la trichomoniasis en pacientes masculinos.
1.- La muestra es recolectada en un tubo con solución salina isotónica.

2.- Se toma una gota de esta muestra y se coloca en un portaobjetos y se cubre con un
cubreobjetos.
3.- Se observa al microscopio en objetivo de 40 x y con poca iluminación.
4.- Se reporta si se observan Trichomonas vaginalis, levaduras, células clave,
leucocitos y lactobacilos.
Desarrollo
Exudado uretral
1.- Limpiar cuidadosamente la mucosa circundante con gasas estériles.
2.- Introducir un hisopo uretral fino suavemente con un movimiento de rotación hasta
penetrar unos 2 cm dentro de la uretra (3-5 cm para la investigación de Chlamydia
trachomatis). (figura) 3.- Repetir operación con un segundo hisopo.
4.- Un hisopo será destinado al examen microscópico y el otro para al cultivo
5.- La muestra deberá procesarse como máximo en un plazo de 6-12 horas.
6.- Cuando no haya suficiente exudado, puede estimularse mediante un masaje suave
prostático-vesicular.
Aislamiento
Las muestras se deben sembrar directamente en el medio de cultivo en forma

adecuada. En el caso de Thayer - Martin se debe sembrar en forma de Z con el hisopo
proveniente de la toma de muestra de cérvix y posteriormente se estría con el asa en el
laboratorio.
Las placas de agar sangre carnero, de Thayer Martin y de agar chocolate se incuban
en atmósfera parcial de CO2 a 37ºC. Después del tiempo de incubación se deben
revisar las placas y es importante realizarles la tinción de Gram a los crecimientos. De
acuerdo al crecimiento se efectúan las pruebas de identificación como se muestra en el

diagrama.
Figura .Toma de muestra uretral
DIAGRAMA DE TRABAJO
Tinción de Gram
Medio de
transporte Stuart
Thayer-Martin
V
Agar Mac Conkey
Agar Sangre de
Carnero Biggy
Neisseria
gonorrhoeae
Agar Chocolate
Enterobacterias
Agar Sangre Candida albicans
Humana
Streptococcus
Gardnerella vaginalis Staphylococcus Identificación
bioquímica
Solución salina
isotónica
Observación en
fresco
Trichomonas
vaginalis
Reporte
En el reporte se deberá informarle al médico lo siguiente:
1.- Edad del paciente.
2.- Sexo.
3.- Tipo de muestra.
4.- Fecha en el que se realizó el estudio
5.- Características del endocervix: si hay úlceras, cantidad de flujo, olor, etc.
6.- pH Vaginal
7.- Tinción de Gram.
8.- Examen en fresco
9.- Resultado del cultivo
10.- Antibiograma (en caso de haberlo realizado)
Búsqueda de Chlamydia trachomatis.
Búsqueda de Treponema pallidum.
Firma del responsable.
Cuestionario
1. ¿Qué indicaciones debes darle al paciente para la toma de muestra cérvico vaginal?
2. ¿Para qué utilizas el tubo con solución salina y otro con medio Stuart?
3. ¿Cuál es la importancia de determinar el pH vaginal?
4. ¿En qué consiste la prueba del KOH y para qué es útil?
5. Menciona cuáles son los microorganismos que podemos encontrar como flora
normal en vagina.
PRÁCTICA No. 10
CULTIVO DE HERIDAS
Introducción
Uno de los fenómenos que se observan con más frecuencia en las enfermedades
infecciosas es la formación de un exudado purulento a raíz de la invasión bacteriana de
una cavidad, tejido u órgano del cuerpo. Clínicamente puede ir desde un sencillo o
inocuo “grano” hasta uno o varios abscesos con múltiples bolsas de pus. El exudado
está constituido por microorganismos invasores, leucocitos, principalmente
polimorfonucleares y una mezcla de humores orgánicos y fibrina. En algunos casos, el
exudado puede recubrir la superficie del órgano, en otros, el exudado puede estar
tabicado por capas de fibrina y una red de células tisulares (ántrax). Incluso hay casos
en que el exudado proviene de una herida abierta, que por ello suelta líquido espeso o
pus.
Uno de los principales problemas de pacientes fracturados, quemados u

operados que se encuentran en unidades hospitalarias son las infecciones que pueden
adquirir en estos nosocomios. En este tipo de infecciones pueden estar involucrados
muchas bacterias, hongos y virus diferentes, además estas infecciones pueden estar
involucrados uno o más agentes causales. Dada la diversidad de agentes etiológicos y
la complejidad de estas infecciones, el médico a menudo describe al microbiólogo el
aspecto de la lesión para ayudar en el diagnóstico.
Objetivo
Aprenderá a tomar una muestra de herida y a procesarla en el laboratorio
Desarrollo
Toma de muestra de lesiones en la piel
1.- Lavar cuidadosamente la superficie de la herida.
2.- Recoger el pus mediante jeringa y aguja, aspirando preferentemente de zonas

profundas.
3.- Cuando la muestra sea insuficiente, instilar suero o solución de Ringer lactato y
aspirarlo nuevamente en la jeringa. Para muestras líquidas se recomienda intentar
obtener de 1-10 cm³.
4.- Cuando los procedimientos anteriores no sean factibles podrá efectuarse un frotis de
las partes profundas de la herida con un hisopo.
5.- La muestra se puede enviar en la misma jeringa de la extracción, debidamente
identificada si puede procesarse antes de 2 horas y si no usar medio de transporte.
Toma de muestra de exantemas

1.- Aspirar directamente con jeringa y aguja el contenido de las lesiones. Cuando no
sea suficiente, colocar una pequeña cantidad de suero salino estéril y aspirarlo.
Toma de muestra de abscesos cerrados

1.- Desinfectar la piel. Limpiar la zona con alcohol, de forma concéntrica comenzando
por el centro. Abarcar una zona de unos 10 cm.
2.- Repetir la operación con povidona. En pacientes con hipersensibilidad al iodo, en
lugar de povidona se utilizará alcohol dos veces consecutivas.
3.- Dejar secar al menos 1 minuto para que la povidona ejerza su acción antiséptica.
4.- Realizar una punción-aspiración del absceso con jeringa y aguja.
5.- Introducir una pequeña parte de la muestra en el medio de transporte para
anaerobios.
6.- Desinfectar la superficie de goma del tapón con povidona e inyectar con la misma
jeringa, parte de la muestra. No deberán utilizarse nunca los medios que hayan
adquirido una coloración azul.
7.- Dejar el resto de la muestra en la jeringa y remitirla así, o bien, traspasarla a un
contenedor estéril.
Toma de muestra de fistulas

1.- Limpiar cuidadosamente la superficie cutánea con alcohol y luego con povidona.
Aspirar el exudado de la parte profunda de la fístula con jeringa y aguja
aproximadamente de 1 a 5 mL.
Procesamiento de la muestra
1.- Realizar tinciones de Gram y Ziehl -Neelsen .
2.- A partir de la muestra sembrar diferentes medios de cultivo de acuerdo al diagrama
3.- En el medio de tioglicolato se eliminará el oxígeno, hirviendo durante 10 min. .
4.- Todo el material se incuba a 37ºC durante 24 a 48 h
5.- Las placas se deben revisar y a cualquier crecimiento se efectúa la tinción de Gram,
se procede a identificar de acuerdo al género y especie
6.- Es importante que en este tipo de muestras se realice el antibiograma.
REPORTE
En este tipo de muestras se debe reportar la tinción de Gram directa lo más pronto
posible para iniciar tratamiento.
Se reporta el crecimiento como positivo en caso de cualquier crecimiento y negativo

cuando no existe crecimiento.
DIAGRAMA DE TRABAJO
Muestra
Hisopo Jeringa
Tinción de
Gram
Tioglicolato
Agar Mac Conkey
Agar Sangre de Carnero
Agar Chocolate
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy
Anaerobios
Cuestionario
1. ¿De qué microorganismos se encuentra constituida la flora normal de piel?
2. Menciona las diversas maneras en que podemos causarnos una herida y qué
probables microorganismos podríamos aislar.
3. Escribe los pasos a seguir para la toma de una muestra de una herida infectada.
4. ¿En qué casos es recomendable el cultivo de un tejido y cuál es el método
utilizado?
5. En la búsqueda de anaerobios ¿qué microorganismos buscarías y que medios
utilizarías para su cultivo?
PRÁCTICA No. 11
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES MENÍNGEAS
CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)
Introducción
Aunque desde hace mucho tiempo se daba por hecho que la función primordial del
líquido cefalorraquídeo (LCR) era la de protección del sistema nervioso central (SNC) y
la regulación de su volumen, en 1926 Cushing propuso la idea de que el LCR
representaba la “tercera circulación”. Desde entonces se ha confirmado y ampliado su
proposición.
Cushing plantea que el LCR constituye por si mismo el medio interno del SNC,
ya que lo provee de la matriz acuosa de los componentes exactamente necesarios para
su adecuado funcionamiento, por otro lado, actúa como linfa cerebral ya que su
continua circulación permite la remoción permanente de materiales nocivos y de
desecho.
Aún mas recientemente, se ha comprobado el papel que juega el LCR en el
transporte a través del encéfalo mediante diversas moléculas activas como hormonas y
aminas de acción neutral.
Dentro de las patologías que mas comúnmente se presentan a este nivel está la
meningitis, que es la inflamación de las membranas que recubren el SNC, es decir, las
delgadas membranas que cubren totalmente al cerebro y la médula espinal y una de
sus causas puede ser por infección, básicamente debido a que los microorganismos
responsables de esta forma clínica pueden alcanzar al SNC a través de la vía
hematógena (bacteriemia o septicemia) o invadir directamente el cerebro (otitis,
fracturas de cráneo, etc.).
El diagnóstico del SNC se apoya en el examen integral del LCR en esta tarea,
tanto el médico como el químico son responsables de la utilidad del examen. El médico
desde la toma de la muestra, la medición de la presión intracerebral, entre otras y el

químico como realizador directo de los análisis citoquímicos y microbiológicos del LCR.
Objetivo
El alumno conocerá la metodología a seguir para la realización del cultivo del LCR.
Material
1. Placas con gelosa sangre de carnero.
1. Placas con agar de Mac Conkey ,
1. Placas con Agar de Sal y Manitol
1. Placas con Medio de Thayer- Martin
(sin inhibidor).
1. Tubos con medio de Lowenstein-
Jensen
1. Tubos con TSI, LIA, MIO, Citrato.
Urea para pruebas bioquímicas
1. Tubos con base de CTA conteniendo
glucosa, sacarosa, maltosa, fructuosa
al 1%.
1. Portaobjetos.
1. Cubreobjetos.
1. Aceite de Inmersión.
1. Tinta china (Marca Pelikan)
1. Equipo de tinción de Gram
1. Taxos de bacitracina y optoquina.
1. Reactivo de Kovacs.
1. Pipetas Pasteur estéril.
1. Centrífuga.
Metodología
Toma de muestra
El LCR se obtendrá antes de instaurar cualquier terapéutica antibiótica.
LCR obtenido por punción lumbar:
1.- Se localiza la zona elegida para la punción lumbar mediante palpación de los
espacios intervertebrales una vez colocado el paciente en la posición adecuada.
2.- Se desinfecta con alcohol al 70% una zona de 10 cm de diámetro en el área elegida,
la aplicación del desinfectante se hace de forma concéntrica del centro a la periferia. Se
repite la operación con povidona yodada que se deja secar durante un minuto.
3.- Realizar la punción entre los espacios intervertebrales L3-L4, LA-L5 o L5-S1,
siguiendo las normas de la más estricta asepsia (ver fig.9).
4.- Al llegar al espacio subaracnoideo retirar el estilete y dejar salir libremente el líquido
cefalorraquídeo que se recogerá en tres tubos sin conservantes con tapón de rosca.
Generalmente el primer tubo para el estudio bioquímico, el segundo para el
estudio microbiológico y el tercero para investigación de células (este suele ser el más
transparente aunque la punción haya sido traumática). No obstante, el tubo más turbio
se enviará a Microbiología.
Fig 9. Toma de muestra de LCR
Volumen mínimo
1.- Para el estudio bacteriológico rutinario es suficiente 1 mL, aunque es preferible
disponer de volúmenes superiores.
2.- Para hongos o micobacterias se necesitan al menos 2 mL adicionales más por cada
uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 mL.
3.- Para estudio de virus se necesita al menos 1 ó 2 mL más.
Transporte
El producto debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues alguno de los agentes
etiológicos como S. pneumoniae, pueden lisarse rápidamente a partir de una hora tras
su recogida. Si no es posible se mantendrá en estufa a 35-37ºC y una parte se incubará
en un frasco de hemocultivo que se mantendrá en idénticas condiciones hasta su
procesamiento en el laboratorio. Si no se dispone de estufas se mantendrá a
temperatura ambiente. Nunca deberá refrigerarse pues se puede afectar la viabilidad de
N. meningitidis y H. influenzae.
En el LCR no se estudian rutinariamente anaerobios. En caso de solicitar una
investigación se enviará en un medio de transporte de líquidos para estudio de
anaerobios o en hemocultivo de anaerobios.
Las muestras para el estudio de virus se enviarán en hielo, si el envío se retrasa
más de 24 horas, se deberá de conservar a -70ºC.
Observaciones
Como la meningitis suele surgir por un proceso bacterémico se solicitarán
simultáneamente hemocultivos, pudiendo ser así mismo estudiadas las posibles
lesiones metastásicas cutáneas.
Es necesario que el médico señale claramente las investigaciones solicitadas
(bacterias habituales, micobacterias, anaerobios, hongos o virus).
DIAGRAMA DE TRABAJO
LCR
Centrifugar 10-20 min.

1000-1500 r.p.m.
Sedimento Tinciones
Agar Mac Conkey

Agar Gelosa Sangre
Agar Gelosa Chocolate
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy
Agar Lowestein-Jensen
Cuestionario
1.-Describe las características físicas y químicas de un LCR normal.
2.- ¿Cuáles son los valores del LCR en caso de existir alguna alteración dependiendo
del microorganismo presente?
3.-Indica las tinciones que se le pueden realizar al LCR para su pronto diagnóstico.
4.- ¿Qué técnicas se utilizan para el cultivo del LCR?
5.- ¿Cuáles son los principales patógenos que puedes encontrar en el LCR?
PRÁCTICA No. 12
HEMOCULTIVO
Introducción
El cultivo de sangre o hemocultivo es uno de los estudios más solicitados en el
laboratorio clínico ya que de alguna manera apoya el diagnóstico de las infecciones
sistémicas que presentan en su evolución una etapa de bacteriemia o septicemia.
La presencia de microorganismos en la sangre refleja una infección activa y

diseminada en los tejidos. Esta situación puede originarse por:
BACTERIEMIA: Es un término que denota la presencia de bacterias en sangre, este

puede ser transitorio como un resultado de un fenómeno común como por ejemplo el
cepillarse los dientes, en la evolución de algunas enfermedades, en infecciones de vías
urinarias o en infecciones de heridas. La bacteriemia persistente o recurrente, es la
presencia continua de una bacteria en la sangre e implica un fenómeno, que en algunas
enfermedades da manifestaciones clínicas.
SEPTICEMIA: Se caracteriza por la presencia de bacterias en sangre y tejidos

acompañado por ataque al estado general, las bacterias se están multiplicando en
forma activa y liberando toxinas, originando manifestaciones clínicas de diversa
magnitud (local o sistémica).
PIEMIA: Formación de diversos abscesos de tipo purulento de origen bacteriano.
En pacientes inmunocomprometidos como son recién nacidos, personas de la

tercera edad, así como inmunosuprimidos se pueden presentar focos sépticos y poner
en peligro su vida.
Una de las características de este tipo de infecciones es la aparición de un

cuadro febril en el huésped acompañado como consecuencia de la liberación del
pirógeno endógeno por los fagocitos, posterior a la ingestión de material tóxico,
endotoxinas, productos de degradación tisular, pirógeno exógeno.
Objetivos
1. El alumno aprenderá los pasos a seguir para realizar la toma de muestra de la
sangre.
2. El alumno conocerá los diferentes medios de cultivo utilizados para realizar un
hemocultivo.
3. El alumno desarrollará el procedimiento para llevar a cabo un hemocultivo, así
como el aislamiento e identificación del patógeno.
Material
1. Medio bifásico Ruiz Castañeda 1. Pruebas bioquímicas: TSI , MIO , LIA,
(frasco para hemocultivo) o medios citrato y urea
especiales que actualmente se 1. Microscopio.
pueden conseguir en el mercado. 1. Sensidiscos de Bacitracina y
1. Jeringas estériles y desechables de 5 Optoquina.
o 10 mL 1. Taxos de oxidasa
1. Agujas estériles calibre 21.
1. Torniquete y torundas con alcohol
1. Frasco con tintura de Iodo
1. Equipo de tinción de Gram
1. Placas de gelosa sangre de carnero
1. Placas de agar de Mac Conkey
1. Placas de Sal y Manitol.
1. Placas de Thayer- Martin.
Metodología
Toma de muestra y transporte
Este tipo de muestra está indicado en casos de fiebre, hipotermia, sensación de enfriamiento,
escalosfríos, postración, hipotensión, fiebre prolongada e intermitente con soplo cardiaco
perceptible. Es importante la toma de muestra cuando el paciente se encuentra al inicio del
periodo febril, antes de llegar al pico. El número e intervalos de los cultivos dependen del
cuadro clínico del paciente así como de su gravedad.
Es importante saber el tipo de frasco para Hemocultivo que se puede actualmente
usar ya que muchas de ellas contienen sustancia que anulan la acción de los
antimicrobianos así como el complemento y la fagocitosis.
Puede usarse médula ósea lo que aumentaría las posibilidades de obtener un buen
diagnóstico.
1. Se selecciona el sitio de toma de muestra, debe evitarse tomar muestras de catéter
intraarteriales o intravenosos permanentes a menos que la sangre no pueda obtenerse por
venopunción.
1. El sitio de venopunción debe limpiarse vigorosamente con torundas impregnadas de
etanol al 70% o con tintura de iodo en alcohol.
1. Hay que esperar que seque sin soplar.
1. Por ningún motivo se debe tocar el sitio después de que fue desinfectado.
1. Los frascos para hemocultivo o tubos de cultivo se deben limpiar del tapón con alcohol-
iodo.
1. Se inserta la aguja en la vena y se extrae la sangre, el volumen depende de la edad y
marca de la botella usada. El volumen recomendado es: Niños de 1 a 3 mL, adultos de 5
ml en adelante.
1. Una vez tomada la sangre, se inyecta a la botella con una aguja nueva. Se debe mezclar
bien en forma homogénea para evitar que se coagule.
1. La botella inoculada se mantiene horizontalmente con la parte sólida hacia abajo durante 27
20 minutos.
1. Se incuba la botella a 37ºC durante 6 semanas. En forma vertical.
Laboratorio de Bacteriología II
Fig. Toma de muestra sanguínea
Actualmente existen diversas opciones para

cultivar la sangre estas pueden ser:
Hemocultivo líquido
1. Se toma la muestra como se indicó
anteriormente, se le añade suficiente volumen de tal manera que alcance una proporción
de 1:10 de sangre a medio.
1. Se incuba a 37ºC en condiciones aerobias.
1. Se hace una inspección de las botellas cuando menos una vez al día durante 3 días y
luego 2 a 3 veces por semana hasta completar 21 días.
Botella de Cultivo Bifásico.

Se emplea la botella de Ruíz Castañeda modificada o medios bifásicos comerciales. (Ver Fig.
10)
1. Se toma la muestra de sangre como se indicó anteriormente.
1. Se inocula la sangre en la botella e incubar a 37ºC durante 7 días o dejar hasta 45 días
en caso que se sospeche de Brucella.
1. Incubar en atmósfera de CO2 al 5 - 10%.
1. Se inspeccionan los frascos a diario y se buscan colonias en la superficie del medio como
señal de un cultivo positivo.
1. En caso de cultivo positivo hay que realizar la tinción de Gram.
1. Se realizan las resiembras en los medios indicados.
1. En ausencia de crecimiento visible se efectúan resiembras a las 48 h, y luego cada 27
semana hasta completar los 21 días, aunque puede continuar por 45 días, y sólo después
de este tiempo se puede descartar y considerar negativo.
Botellas Bactec Botellas BacT/Alert

Fig. 10
Método de Lisis
1. Se toman los tubos que contienen sustancias hemolizantes.
2. Se concentran los microorganismos por centrifugación a 3000 rpm durante 30 min.
1. Se inocula el sedimento en las diferentes placas de cultivo.
Método de Fluorescencia
1. Se toma la muestra como se indicó anteriormente.
2. Se inoculan las botellas de acuerdo al tipo de paciente, este tipo de botellas tiene medios
de cultivo para bacterias aerobias, anaerobias y hongos., están adicionados de resina
cuyo objetivo principal es capturar él o los antimicrobianos que pueden estar presentes en
la muestra.
1. Se incuban en un aparato especial (Bactec 9050) que se mantiene a 37ºC y rotando
suavemente.
1. En cuanto se presenta desarrollo bacteriano, el equipo cuenta con un sensor de
fluorescencia la que se va aumentando por el incremento de CO 2 producido por el propio
metabolismo bacteriano; esto lo realiza cada 10 min. Una alarma avisa al químico, la
posición de la botella con producción de CO2.
1. Se realizan las resiembras en los medios ya descritos.
Reporte
27
Es poco frecuente encontrarse dos o más especies bacterianas diferentes en un cultivo de

sangre, en la mayoría de los casos se trata de alguna contaminación y esto sucede
principalmente por una mala toma de muestra.
Sí no hay crecimiento a los 45 días, hay que dar como negativo el cultivo y se desecha la
botella.
En el caso de haber crecimiento se identifica al agente etiológico con las pruebas requeridas
por el mismo.
Es importante mantener informado al médico cómo va el Hemocultivo de sus pacientes,
principalmente si se encuentran en salas de terapia intensiva.
27
DIAGRAMA DE TRABAJO
Sangre
Botella para hemocultivo
Incubar 37°C/ 15-20 días o más
Tinción de
Gram
Agar Mac Conkey

Agar Sangre
Agar Chocolate
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy
Agar Lowestein-Jensen
Cuestionario
1.-Menciona otra técnica para la toma de muestra de sangre para su cultivo.
2.-¿Por qué es importante tomar la muestra de sangre en el pico febril?
3.- ¿Sería normal encontrar dos o más bacterias en un hemocultivo?
4.- ¿Por qué se recomienda cultivar la sangre en un medio bifásico y en qué consiste éste?
5.- El aislamiento de Staphylococcus epidermidis en un hemocultivo, ¿sería clínicamente
27
importante?
8. ESTRATEGIAS, TÉCNICAS Y RECURSOS DIDÁCTICOS
Estrategias y técnicas didácticas Recursos didácticos
* Lluvia de ideas
* Observación de imágenes
* Exposiciones
* Integración de equipos de trabajo
* Resolución de dudas con el profesor Impresos (textos): libros, fotocopias, periódicos,
* Trabajo colaborativo documentos...
* Prácticas de laboratorio relacionadas con la * Materiales de laboratorio
teoría * Materiales audiovisuales:
* Discusión de artículos * Imágenes fijas proyectables (fotos)-
* ABP diapositivas, fotografías
* Discusión de artículos
9. EJES TRANSVERSALES
Eje (s) transversales Contribución con la asignatura

Formación Humana y Social Desarrollará acciones que promuevan la
convivencia democrática, plural y responsable y
de pensamiento crítico. El respeto a los
derechos de los otros y al medio ambiente.
Participará en actividades académicas
extracurriculares como conferencias, visitas
guiadas a organismos culturales y exposiciones.
Desarrollará aptitudes personales para enfrentar
y resolver retos, manejo del estrés, prevención
de accidentes y primeros auxilios, higiene y
cuidado personal, así como la presentación
para el trabajo.
Desarrollo de Habilidades en el uso de las Los alumnos en esta asignatura se valen de las
Tecnologías de la Información y la herramientas electrónicas para desarrollar sus
Comunicación objetivos de aprendizaje a través de las TIC’s
utilizando los laboratorios de cómputo a través
de software de simulación, bibliotecas y
plataformas virtuales; auditorios y Radio BUAP.
Desarrollo de Habilidades del Pensamiento Se promoverá un proceso educativo a través del
Complejo análisis, reflexión, comprensión, discusión e 27
integración de conocimientos para la resolución
de problemas.
Lengua Extranjera Aplicará sus habilidades para leer y comprender
artículos en una segunda lengua reforzando lo

aprendido en la asignatura; además
complementará sus conocimientos, mediante la
movilidad estudiantil en otros países,
participación en comunidades virtuales y
videoconferencias.
Innovación y Talento Universitario Desarrollará su sentido emprendedor y
propositivo así como su talento creativo a través
de la innovación.
Educación para la Investigación Impulsar y motivar al alumno a identificar una
problemática y proponer una solución a través
de la investigación, para la generación de
conocimientos que se puedan aplicar en
beneficio de su comunidad.
10. CRITERIOS DE EVALUACIÓN

Criterios Porcentaje
 Exámenes 40 %
 Manual de prácticas de laboratorio 20 %
 Reporte de actividades 10 %
 Tareas 10 %
 Presentaciones en equipo 10 %
Resumen de artículos 10 %
Total 100%
11. REQUISITOS DE ACREDITACIÓN

Estar inscrito como alumno en la Unidad Académica en la BUAP
Asistir como mínimo al 90% de las sesiones para tener derecho a presentar el examen final
Cumplir con las actividades académicas y cargas de estudio asignadas que señale el PE
27
27

Manual Primavera 2020 Lab Bacter II

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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

PLAN DE ESTUDIOS (PE): Licenciatura en Químico Farmacobiólogo

ÁREA: Ciencias Microbiológicas

ASIGNATURA: Laboratorio de Bacteriología II

FECHA: Octubre 2019

Nivel Educativo: Licenciatura

Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura de Químico Farmacobiólogo

Modalidad Académica: Presencial

Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Bacteriología II

2. CARGA HORARIA DEL ESTUDIANTE

4. PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:

 5. PROPÓSITO: Aplica métodos y técnicas para el análisis químico-biológico de

 Obtiene, procesa y almacena de forma adecuada muestras biológicas conforme a

Práctica No. 3 Sensibilidad a los antimicrobianos método Clinical Laboratory Standars

Práctica No. 6 Búsqueda e identificación de Winn (h.) W. C., Allen S D.,

Práctica No. 7 Infecciones oculares Forbes, Betty A., Daniel F.

Práctica No. 8 Infecciones óticas Forbes, Betty A., Daniel F.

Práctica No. 11 Diagnóstico de enfermedades meníngeas Murray R. (2009).

Práctica No. 12 Hemocultivo Forbes, Betty A., Daniel F.

Colorante de Azul de Metileno

IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae

Reporte del coprocultivo

1. Si la muestra contenía microorganismos de la flora normal, o las bacterias patógenas

Técnica para hombres

Técnica para niños

microorganismos que se originan más allá de la vejiga, así como la búsqueda de

1. Este tipo de métodos se considera muy agresivo.

Recomendaciones sobre el volumen de orina

Parásitos. Orina de 24 horas.

Método de dilución con pipeta

1. Se coloca 0.1 mL de orina en 9.9 mL de solución salina isotónica (dilución 10 2) se

Método de vaciado en placa

4. Se cuenta el número de colonias.

Agar Mac Conkey

El reporte deberá contener los siguientes datos:

Plantear la necesidad de saber cuál es el antimicrobiano que se debe utilizar

Para este tipo de estudios existen varios métodos como son:

DIFUSIÓN EN DISCOS DE PAPEL FILTRO (Modificado de la FDA y la NCCLS del

3. Para probar la susceptibilidad de Haemophylus y Streptococcus se utiliza el

El exudado faríngeo y nasofaríngeo son las muestras más empleadas para el

Toma y transporte de la muestra

En la muestra indicada para la investigación de Bordetella pertussis se puede

1. Introducir el hisopo por una de las narinas, aproximadamente 10 cm cuidando

1. Sí en las tinciones se sospecha de Corynebacterium diphteriae se debe seguir un

1.- ¿Cuál es la importancia de realizar un cultivo faríngeo?

De los principales agentes bacterianos asociados a neumonías sobresalen en

En las condiciones habituales de la clínica diaria, la expectoración no es una

LAVADO O CEPILLADO BRONQUIAL

1.- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibiótico.

1. Placas de gelosa sangre en base

CLASIFICACIÓN DEL ESPUTO SEGÚN WELCH Y KELLY

Clase de Grupo Células Leucocitos

III 4 10-25 >25

Tomado de:Welch DF.kellMT.J.Clin.Microbiol 1979, 9 :520-524

2. Las muestras que sean de clase III serán cultivadas.

En el laboratorio se debe contar con pruebas rápidas para la identificación de

Examen en fresco BAAR

Agar Gelosa Sangre

1. En caso de niños se puede usar el hisopo laríngeo o nasofaríngeo.

LAVADO O CEPILLADO BRONQUIAL y PLEURAL.

Material que se utiliza para el lavado o cepillado bronquial

1. Se agrega un volumen igual de éter. Se agita y se centrifuga a 3000 r.p.m. durante

1. Tubos estériles de tapón de rosca de plástico biodegradable con capacidad de 40 ml