TECNOLÓGICO NACIONAL

DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC

Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

TRANSFORMACIÓN DE RESIDUOS DE PESCADO Y POLLO EN PÉPTIDOS CON

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.

POR

XXXXXXXXXX

Estudiante de Ingeniería Química

No. de control xxxx

Tepic, Nayarit Mayo del 2019

 CAPÍTULO 3Y 4.- PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA/JUSTIFICACION:

CAPÍTULO 6. METODOLOGÍA (MATERIALES Y MÉTODOS)____________ 47

ETAPA 1.-Extracción y purificación parcial de proteasas a partir de B. Karatas y B. 49
Pinguin, así como su aplicación para la obtención de hidrolizados proteicos de
subproductos de pescado y pollo, y aplicación de Bromelina en subproductos de
pescado:____________________________________________________________
6.1.- Extracción y purificación parcial de proteasas de frutas B. Karatas :_________ 49
6.2.- Extracción y purificación parcial de proteasas de frutas B. Pinguin:_________ 49
6.3.- Concentración de proteína:_________________________________________ 50
6.4.- Actividad proteolítica:_____________________________________________ 51
6.5.- Hidrólisis de subproductos de pescado y pollo por efecto de extractos 52
enzimáticos de B. Karatas, B. Pinguin y Bromelina:_________________________
ETAPA 2. Análisis de los hidrolizados obtenidos separados por membranas, 53
determinación de grupos aminos libres y capacidad antioxidante por los métodos
FRAP y ABTS:______________________________________________________
6.6.- Fraccionamiento de los hidrolizados en base a sus pesos moleculares, por 53
membranas:_________________________________________________________
6.7.- Determinación de grupos aminos libres (NH2):__________________________ 54
6.8.- Determinación de la capacidad antioxidante in vitro de los hidrolizados por los 56
métodos FRAP y ABTS:_______________________________________________
6.8.1.- FRAP:_______________________________________________________ 56
6.8.2.- ABTS:_______________________________________________________ 57
6.9.- Análisis estadístico:_______________________________________________ 58
CAPÍTULO 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN :____________________________ 59
Etapa 1.-Extracción y purificación parcial de proteasas a partir de extractos de B. 71
Karatas y B. Pinguin, así como su aplicación para la obtención de hidrolizados
proteicos en subproductos de pescado y pollo, y aplicación de Bromelina en
subproductos de pescado:_______________________________________________
 CAPÍTULO 3Y 4.- PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA/JUSTIFICACION:

7.1.- Extracción y purificación parcial de proteasas de frutas B. Karatas y B. 88

Pinguin:____________________________________________________________
7.2.- Concentración de proteína y actividad proteolítica:______________________ 88
7.3.- Hidrólisis de subproductos de pescado y pollo por efecto de extractos
enzimáticos de B. Karatas, B. Pinguin y Bromelina:_________________________
Etapa 2. Análisis de los hidrolizados obtenidos, separados por membranas,
determinación de grupos aminos libres y capacidad antioxidante por los métodos
FRAP y ABTS:______________________________________________________
7.4.- Fraccionamiento de los hidrolizados en base a sus pesos moleculares, por
membranas:_________________________________________________________
7.5.- Determinación de grupos aminos libres (NH2):__________________________
7.6.- Determinación de la capacidad antioxidante in vitro de los hidrolizados por el
método FRAP y ABTS:________________________________________________
7.6.1.- FRAP:_______________________________________________________
7.6.2.- ABTS:_______________________________________________________
 CAPÍTULO 5.- OBJETIVOS:

CAPÍTULO 5. OBJETIVOS:

4.1.- Objetivo general:

Transformar subproductos de pescado y pollo en péptidos para su revaloración y

contribución al medio ambiente.

4.2.- Objetivos específicos:

 Obtener proteasas de Bromelia karatas L. y Bromelia pinguin L. parcialmente

purificadas.

 Obtener hidrolizados proteicos de subproductos de pescado y pollo con los

extractos enzimáticos de B. Karatas y B. Pinguin.

 Fraccionar los hidrolizados de subproductos de pescado y pollo obtenidos

separando por microfiltración con membranas.

 Determinar el contenido de grupos amino (TNBS) y capacidad antioxidante

(FRAP y ABTS) de los hidrolizados fraccionados de los subproductos de
pescado y pollo.
 CAPÍTULO 9.-ANEXOS:

CAPÍTULO 6. METODOLOGÍA. MATERIALES Y MÉTODOS:

6. 1Tipo de investigación. Investigación fue aplicada, ya se utilizaron subproductos de pescado y

pollo en péptidos para su revaloración y contribución al medio ambiente, para ello se
obtuvieron datos experimentales en un periodo determinado.

6.2 Diagrama de bloques. En la figura 6.1 se muestra el diagrama general de la metodología

empleada.
 CAPÍTULO 9.-ANEXOS:

Extracción y purificación
parcial de proteasas de
frutas B. Karatas y B.
Pinguin.

Hidrólisis de subproductos
de pescado y pollo por
Concentración de proteína. efecto de extractos Actividad proteolítica.
enzimáticos de B. Karatas,
B. Pinguin y Bromelina.

Fraccionamiento de los
hidrolizados en base a sus
pesos moleculares, por
membranas.

Análisis
espectrofotométrico

UV-VIS.

Determinación de la
capacidad antioxidante in
Determinación de grupos vitro de los hidrolizados
aminos libres (NH2). por el método FRAP y
ABTS.

Figura 6.1.- Diagrama general de la metodología.

 CAPÍTULO 9.-ANEXOS:

En el desarrollo de este proyecto las muestras fueron preparadas como se describe a

continuación.

Los frutos de B. Karatas y B. Pinguin se consiguieron del mercado de la zona, fueron

limpiados y desinfectados, posteriormente se separo la pulpa, la cual fue liofilizada y
triturada. Conservándose a -20°C hasta su uso.

Los subproductos de robalo (piel y escamas) se consiguieron del mercado de la zona, fueron
cortados en pedazos pequeños, se liofilizaron y trituraron (3 veces). Conservándose a -20°C
hasta su uso.

Los subproductos de pollo (corazón, sangre y viseras) se consiguieron del mercado de la

zona, fueron licuados, liofilizados y triturados. Conservándose a -20°C hasta su uso.

El desarrollo se dividió en dos etapas que serán descriptas a continuación, con la finalidad de
cumplir con los objetivos. Además, en la Figura 5.1 se muestra la metodología de forma
general.

Etapa 1.-Extracción y purificación parcial de proteasas a partir de extractos de B. Karatas y

B. Pinguin, así como su aplicación para la obtención de hidrolizados proteicos de
subproductos de pescado y pollo, y aplicación de Bromelina en subproductos de pescado.

Etapa 2. Análisis de los hidrolizados obtenidos separados por membranas, determinación de

grupos aminos libres y capacidad antioxidante por los métodos FRAP y ABTS.

Etapa 1.-Extracción y purificación parcial de proteasas a partir de extractos de B.

Karatas y B. Pinguin, así como su aplicación para la obtención de hidrolizados proteicos
de subproductos de pescado y pollo, y aplicación de Bromelina en subproductos de
pescado:

6.1.- Extracción y purificación parcial de proteasas de frutas B. Karatas:

 CAPÍTULO 9.-ANEXOS:

Se homogenizó en un mezclador 20 g de pulpa verde liofilizada con 250 ml de buffer de

fosfato de sodio (0.1 M, 4 °C, pH 6.5, 5 mM de L-cisteína). La suspensión se filtró para
eliminar los restos insolubles de la pulpa y se centrifugó (6,000 rcf, 30 min, 4 °C) (Hermle,
Z32HK Labortechnik GmbH, Wehingen, Germany) (López y cols., 2000).

El sobrenadante de B. Karatas L. se precipitó con sulfato de amonio (NH4)2SO4 a una

concentración de 20% con respecto al volumen del sobrenadante durante 5 horas a 4°C, se
filtró, y el retenido se dializó con membrana (Dialysis tubing cellulose membrane, 14x100
CRL, Sigma-Aldrich, 1.3 in) por 20 hrs a 4°C haciendo cambio de agua cada 5 hrs en las
primeras 10 hrs. Se recuperó el dializado, se centrifugó (10,000 rcf, 30 min, 4°C) y se pesó
(González-Borrayo, 2015). El dializado se liofilizó y se mantuvo en refrigeración a -20°C
hasta su posterior uso.

6.2.- Extracción y purificación parcial de proteasas de frutas B. Pinguin:

Se homogenizó en un mezclador 20 g de pulpa verde liofilizada con 250 ml de buffer de

fosfato de sodio (0.1 M, 4 °C, pH 6.5, 5 mM de L-cisteína). La suspensión se filtró para
eliminar los restos insolubles de la pulpa y se centrifugó (6000 rcf, 30 min, 4 °C) (Hermle,
Z32HK Labortechnik GmbH, Wehingen, Germany) (López y cols., 2000).

El sobrenadante de B. Pinguin L. se precipitó con sulfato de amonio (NH4)2SO4 pero a una

concentración de 30% con respecto al volumen del sobrenadante durante 4 horas a 4°C, se
filtró, y el retenido se dializó con membrana (Dialysis tubing cellulose membrane, 14x100
CRL, Sigma-Aldrich, 1.3 in) por 20 hrs a 4°C haciendo cambio de agua cada 5 hrs en las
primeras 10 hrs. Se recuperó el dializado, se centrifugó (10,000 rcf, 30 min, 4°C) y se pesó
(González-Borrayo, 2015). El dializado se liofilizó y se mantuvo en refrigeración a-20°C
hasta su posterior uso.
 CAPÍTULO 9.-ANEXOS:

6.3.- Concentración de proteína:

La concentración de proteína se determinó por el método propuesto por Bradford (1976), el

cual se basa en el cambio de color del compuesto Azul Brillante de Coomassie G-250 de roja
a azul al formar un complejo colorante-proteína, el cual tiene un coeficiente de extinción alto
que implica una gran sensibilidad en la determinación. La formación complejo colorante-
proteína es rápida (aproximadamente 2 min) y este permanece en solución 1 hr.

Se colocó 0.05 ml de extractos y subproductos liofilizados diluidos en buffer de fosfato de

sodio (0.1 M, 4 °C, pH 6.5, 5 mM de L-cisteína) e hidrolizados (soluciones proteicas), con
1.05 ml de reactivo de Bradford y se mezcló por agitación, se midió la absorbancia en un
espectrofotómetro UV-VIS (Cintra Doublé Beam UV- Visible Espectrometer) a 595 nm
después 10 min de la reacción.

El blanco se preparó con 0.05 ml de buffer de fosfato de sodio (0.1 M, pH 6.0, 12.5 mM de
L-cisteína) con 1.05 ml de reactivo de Bradford. Se elaboró una curva de calibración
(ANEXO A1) con soluciones estándar de albúmina de suero de bovino (BSA, por sus siglas
en inglés) a concentraciones de 10, 50, 100, 250 y 1000 µg/ml, las absorbancias medidas se
representaron en una gráfica Absorbancia Vs Concentración. De los subproductos se
realizaron 8 réplicas y 3 de los extractos enzimáticos.

6.4. Actividad proteolítica:

La actividad proteolítica se midió siguiendo el método empleado por López y cols. (2000)
modificando el sustrato por albúmina de huevo grado reactivo. Se hizo reaccionar 1.1 ml de
solución de albúmina al 1% en buffer de fosfato de sodio (0.1 M, pH 6.0, 12.5 mM de L-
cisteína) con 0.1 ml de solución de extractos enzimáticos (de B. Karatas, B. Pinguin y
Bromelina) por 5 min a 37°C. La reacción finalizó agregando 1.8 ml de ácido tricloroacético
(TCA, por sus siglas en inglés) al 5% en la muestra y se hizo reaccionar a 37°C con 0.1 ml
de solución de extractos enzimáticos (de B. Karatas, B. Pinguin y Bromelina) liofilizados
diluidos en buffer de fosfato de sodio (0.1 M, 4 °C, pH 6.5, 5 mM de L-cisteína). La reacción
 CAPÍTULO 9.-ANEXOS:

finalizó agregando 1.1 ml de solución de albúmina al 1% en buffer de fosfato de sodio (0.1

M, pH 6.0, 12.5 mM de L-cisteína) en la muestra.

Se centrifugó la solución (10,000 rcf, 10 min a 27°C) (Hettich, MIKRO 200R, Andreas
Hettich GmbH y Co., Tuttlingen, Germany) y se midió la absorbancia del sobrenadante a 280
nm en un espectrofotómetro UV-VIS (Cintra Doublé Beam UV- Visible Espectrometer). Se
realizó la medición de la absorbancia a 280 nm por ser la longitud de onda a la cual los
aminoácidos tirosina y triptófano se absorben por la presencia de sus grupos cromóforos
(Pace y cols., 1995).

Se realizó una curva de calibración de Tirosina (ANEXO A2) con soluciones de 75, 375,
750, 1,500 y 3,000 μmol/ml en buffer de fosfato (0.1 M, pH 6.0, 12.5 mM de L-cisteína) y
se midió la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (Cintra Doublé Beam
UV- Visible Espectrometer). Los resultados se representaron en una gráfica Absorbancia vs
Concentración de tirosina. Posteriormente se transformaron las absorbancias leídas en la
actividad proteolítica en equivalentes de tirosina con la ecuación obtenida de la curva de
calibración.

6.5.- Hidrólisis de subproductos de pescado y pollo por efecto de extractos

enzimáticos de B. Karatas, B. Pinguin y Bromelina:

Se pesaron 1.5 g de subproductos de pescado róbalo (piel con escamas) 12 veces y 8 veces
de pollo (sangre, corazón y viseras) liofilizados, se mezclaron cada uno con 30 ml de buffer
fosfatos de sodio 0.2 M a pH 6.5, se colocaron durante 15 minutos en baño a ebullición,
posteriormente se enfriaron por inmersión en agua fría a 4°C por 10 min para poner en
equilibrio la muestra para la hidrólisis (González-Borrayo, 2015).

Se agregó 1 ml de la solución de extractos enzimáticos (de B. Pinguin, B. Karatas y

Bromelina) que corresponda a 100 μg de proteasa/ml. Se colocaron los tubos de hidrólisis en
baño de agua para la hidrólisis a la temperatura de 25 °C por 4 hrs para extractos de B.
Karatas, como se muestra en la Figura 5.2-A, a 40 °C por 30 minutos para extractos de B.
 CAPÍTULO 9.-ANEXOS:

Pinguin, como se muestra en la Figura 5.2-C, y a 37 °C por 4 horas en un pH de 7 en

Bromelina (solo en pescado), como se muestra en la Figura 5.2-B, como control (González-
Borrayo, 2015). Los hidrolizados se filtraron y se colocaron en baño de agua a ebullición por
15 min. Posteriormente se centrifugaron (14,000 rcf, 10 min a 25°C) (Hermle, Z32HK
Labortechnik GmbH, Wehingen, Germany).

Se microfiltró el sobrenadante con una membrana de 0.45 μM (Millipore, MF. Membrane

Filtres HAWP, Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) y se microfiltró el permeado con una
membrana de 0.22 μM (Millipore, Membrane Filtres GSWP, Merck Millipore, Darmstadt,
Alemania). El sobrenadante se almacenó a 4 °C hasta el fraccionamiento.

A B C

Figura 6.2.- Proceso de hidrólisis en subproductos de pescado y pollo con extractos

enzimáticos A: B. Karatas, B: Bromelina y C: B. Pinguin.