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República De Panamá

Universidad Latina
Sede Santiago
Facultad Ciencias de la Salud
Escuela de Medicina

Asignatura De Bioquímica
Informe De Laboratorio
Experiencia De Laboratorio N°5
LAS ENZIMAS

Elaborado Por:
Markelda Flores
Torres Inelis
Marciaga Ana

Profesor De Cátedra:
José Amores

Fecha De Entrega:
18/3/2017
INTRODUCCIÓN
Las células llevan a cabo simultáneamente una gran cantidad de reacciones químicas necesarias para
la vida. Muchos de los productos de esas reacciones se necesitan inmediatamente, y si no fuera por
la participación de las enzimas, algunas reacciones no se producirían tan rápido. Las enzimas, en su
mayoría proteínas o RNA (riboenzimas), son catalizadores químicos que agilizan una reacción que
envuelve la formación o rompimiento de enlaces químicos.
Las enzimas no se consumen en las reacciones, ni tampoco se alteran, razón por lo cual no se necesitan
en grandes cantidades. Las enzimas actúan sobre los sustratos formando un complejo enzima-sustrato;
esto ocurre en un lugar en específico conocido como el sitio activo de la enzima. Las enzimas son
muy selectivas porque pocas moléculas pueden interactuar bien con este sitio. Las enzimas reducen
la energía de activación necesaria para llevar a cabo una reacción; es decir, reducen la barrera de
energía que hay que sobrepasar para que la reacción se lleve a cabo.
Las enzimas trabajan óptimamente bajo condiciones específicas y ciertos cambios pueden alterar el
funcionamiento de la enzima, desactivarla o hasta destruirla. Algunas enzimas necesitan activadores
para cambiar su conformación de modo que pueda formarse el complejo enzima–sustrato. Estos
activadores se conocen como cofactores y pueden ser tan simples como iones metálicos. Los
cofactores orgánicos se conocen como coenzimas.
Las enzimas pueden afectarse negativamente por inhibidores que impidan la actividad enzimática.
Estos inhibidores pueden afectar el sitio activo de dos maneras: competitivamente, al bloquear el sitio
activo, o no competitivamente, al pegarse en otro lugar de la enzima y alterar indirectamente la forma
del sitio activo.

En función de su acción catalítica específica, las enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o


clases:1: oxidorreductasas,2: transferasas,3: hidrolasas,4: liasas, 5: isomerasas,6: ligasas.

Las enzimas requieren de la presencia de sustancias de naturaleza no proteica para exhibir su actividad
catalítica. Si la sustancia es de naturaleza orgánica se le llama coenzima y si es un ion metálico, se le
denomina como ion metálico activador.

Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como catalizadores.
Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las demás conformaciones
posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad catalítica.
Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima son: pH,
temperatura, las concentraciones de sustrato y de la enzima y de muchos activadores e inhibidores.
La mayoría de las enzimas exhiben su máxima actividad a una temperatura y pH determinado, los
cuales se conocen como temperatura y pH óptimos.

La ureasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido de carbono y amoníaco. La
reacción ocurre de la siguiente manera: (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3.

Esta reacción enzimática se produce mediante el uso de indicadores adecuados, que muestran los
cambios que ocurren en el pH del medio donde se da la reacción, por la producción de amoniaco en
la reacción.
CÁLCULOS DE SOLUCIONES

1. 100 mL de urea 1.0 M

𝟏. 𝟎 𝒎𝒐𝒍 𝟔𝟎. 𝟎𝟔𝒈


𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 =𝟔𝒈
𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝒐𝒍

2. 100 mL acrilamida 1.0 M


𝟏. 𝟎 𝒎𝒐𝒍 𝟕𝟏. 𝟎𝟖𝒈
𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 = 𝟕. 𝟏𝒈
𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝒐𝒍

3. 100 mL HCl 0.1 M a partir de HCl 12 M

𝑴𝟏 𝑽𝟏 = 𝑴𝟐 𝑽𝟐
𝑴𝟐 𝑽𝟐 (𝟎. 𝟏 𝑴)(𝟏𝟎𝟎𝒎𝒍)
𝑽𝟏 = = = 𝟎. 𝟖𝟑𝒎𝒍
𝑴𝟏 𝟏𝟐𝑴

4. 100 mL NaOH 0.1 M


𝟎. 𝟏 𝒎𝒐𝒍 𝟒𝟎. 𝟎𝒈
𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 = 𝟎. 𝟒 𝒈
𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝒐𝒍

5. 150 mL KHC8H4O4 0.1 M


𝟎. 𝟏 𝒎𝒐𝒍 𝟐𝟎𝟒. 𝟐𝒈
𝟏𝟓𝟎𝒎𝑳 𝒙 = 𝟑. 𝟏𝒈
𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝒐𝒍
6. 150 mL KH2PO4 0.1M

𝟎. 𝟏 𝒎𝒐𝒍 𝟏𝟑𝟔. 𝟏𝒈
𝟏𝟓𝟎𝒎𝑳 𝒙 = 𝟐. 𝟎𝟒𝒈
𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝒐𝒍

7. 30 mL HgCl2 0.2 M
𝟎. 𝟐 𝒎𝒐𝒍 𝟐𝟕𝟏. 𝟓𝒈
𝟑𝟎𝒎𝑳 𝒙 = 𝟏. 𝟔𝒈
𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝒐𝒍

8. 50 ml Pb(NO3 ) 2 0.2 M

𝟎. 𝟐 𝒎𝒐𝒍 𝟑𝟑𝟏. 𝟐𝒈
𝟓𝟎𝒎𝑳 𝒙 = 𝟑. 𝟑𝒈
𝟏𝟎𝟎𝟎𝒎𝑳 𝟏 𝒎𝒐𝒍
PARTE EXPERIMENTAL
A. Preparación de un extracto crudo de ureasa.
Observaciones: al licuar las semillas de zapallo con agua destilada fría se procedió
a centrifugar con el objetivo de separar los sólidos de líquidos de diferente
densidad que se encuentran en la solución de semilla de zapallos. Luego se
procedió a retirar con un hisopo la capa de grasa que se encontraba en la parte
superior del tubo y por ultimo filtramos la solución, como resultado se obtuvo un
extracto de ureasa.

Al realizar la prueba de Biuret con la suspensión de ureasa esta se tornó de color


morado por la presencia de proteína en la enzima ureasa.

B. Especificidad de la ureasa
Observaciones:
Tubos Contenido de los tubos de Coloración
ensayo
TUBO A Urea+ureasa+rojo de fenol fucsia
TUBO B Acrilamida+ureasa+rojo de amarilla
fenol

En esta prueba se pudo observar que el tubo A (urea) se tornó de color fucsia
esto quiere decir que la ureasa reacciono positivamente con la urea y por ello
esta es más específica ya que la ureasa descompone a la urea, mientras que
la acrilamida se tornó de color amarilla esta es un sustrato análogo, por la
coloración la ureasa está actuando sobre la acrilamida pero en menor
proporción.
Cuestionario:
1. ¿En cuál de los tubos hubo evidencia de que ocurrió una reacción?
En el tubo A que contenía urea, ureasa y rojo de fenol hubo evidencia de
una reacción evidencia de esto es la coloración fucsia que tomo la solución.

2. ¿Cuál de las dos sustancias empleadas en la prueba (acrilamida y urea) es el


sustrato específico sobre el cual actúa la ureasa?
El sustrato específico sobre el cual actúa la ureasa es la urea.
C. Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción.
Observaciones:

Tubo Solución de Extracto de Agua Orden de coloración


urea 1 M ureasa destilada
1 2 ml 0.0 ml 3.0 ml 4-amarillo
2 2 ml 0.5 ml 2.5 ml 3-fucsia
3 2 ml 1.0 ml 2.0 ml 2-fucsia
4 2 ml 2.0 ml 1.0 ml 1-fucsia intenso

Luego de preparar todas la soluciones, dejamos reposar el contenido de los


tubos y el primero en adquirir una coloración fucsia intensa fue el tubo Nª4
ya que este contenía la mayor cantidad del extracto de la enzima ureasa con
respecto a los otros tubos el último en obtener esta coloración y con menor
intensidad en la coloración fue el tubo Nª1 ya que no contenía la enzima
ureasa.
Al aumentar la concentración de sustrato, la actividad enzimática aumenta,
hasta alcanzar la velocidad máxima, punto donde la enzima se satura, debido
a que las enzimas tienen todos sus sitios activos ocupados

Cuestionario:
1. ¿A qué se debe el cambio de color del indicador?
El cambio de color del indicador rojo fenol se debe a que las soluciones
están en un rango de pH 6.4 -8.2 básico.

2. ¿Qué producto de la reacción es responsable del cambio de pH en el medio


reaccionante?

Amoniaco. Este compuesto hace variar el color del indicador de amarillo


a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
3. ¿En qué tubo se llevó a cabo la reacción enzimática a mayor velocidad? ¿Por
qué?
En el tubo 4 se lleva a cabo la reacción enzimática a mayor velocidad
porque este contenía la mayor cantidad de la enzima ureasa con respecto
a los otros tubos.
La velocidad de reacción aumenta con la concentración, como está
descrito por la ley de velocidad y explicada por la teoría de colisiones. Al
incrementarse la concentración de los reactantes,
la frecuencia de colisión también se incrementa.
D. Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática
Observaciones:
Tubos Contenido de los tubos Coloración Orden
de
reacción
1 2 ml Urea+2 ml agua destilada+2 gotas Baño de agua Fucsia 3
de rojo de fenol+ 1ml ureasa con hielo
2 2 ml Urea+2 ml agua destilada+2 gotas Baño María a Fucsia 1
de rojo de fenol+ 1ml ureasa 40ºC
3 2 ml Urea +2 ml agua destilada+2 gotas - Fucsia 2
de rojo de fenol+ 1ml ureasa
4 2 ml Urea +2 ml agua destilada+2 1 ml de extracto Amarilla 4
gotas de rojo de fenol+ de ureasa
calentado

 El tubo 1 que la solución estaba formada por urea, agua destilada y rojo de
fenol se colocó en un baño de agua con hielo y luego se le añadió 1 ml de
extracto de ureasa, fue el tercer tubo en tomar una coloración fucsia definida
debido a que se encontraba a bajas temperaturas y la actividad enzimática
disminuyo
 En el tubo 2 que contenía urea, agua destilada, rojo de fenol se colocó en
baño maría luego de esto agregamos 1 ml de extracto de ureasa y fue el
primero en adquirir una coloración fucsia definida ya que se encontraba dentro
de su temperatura óptima 40ºC.
 el tercer tubo contenía urea, agua destilada, rojo de fenol, fue el segundo tubo
que se tornó fucsia ya que se encontraba a una temperatura ambiente.
 En el cuarto tubo la solución contenía urea, agua destilada y rojo de fenol
posteriormente se le añadió 1 ml de extracto de ureasa calentado y este se
tornó amarillo indicando que la enzima se ha desnaturalizado por la influencia
de la temperatura.

Cuestionario:
1. ¿Cuál es el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática?
En general, la velocidad de la reacción se incrementa con la temperatura
hasta que un punto máximo es alcanzado. Este incremento se debe a que
aumenta el número de moléculas ricas en energía que pueden pasar la
barrera energética de estado de transición, para formar a los productos.

2. ¿Cuál es el efecto de las temperaturas altas sobre las enzimas?


La elevación excesiva de la temperatura del medio que contiene a las
enzimas, resulta en un decremento de la velocidad como resultado de la
desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura tridimensional de
las enzimas.

E. Influencia del pH sobre la actividad de la ureasa.


Observaciones:
Tubos Soluciones coloración
1 Solución amortiguadora pH=4+urea+ureasa Amarilla
2 Solución amortiguadora pH=6+urea+ureasa Amarilla
3 Solución amortiguadora pH=8+urea+ureasa Azul

Al añadirle a las tres soluciones el indicador de pH azul de timol, el tubo 3 fue el que
adquirió una coloración azul que indica que el pH=8 es el óptimo para la actividad
enzimática
La ureasa actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N excepto en aquellos
que contiene puentes peptídicos.
Cuestionario:
1. De acuerdo con sus resultados, ¿Cuál es el pH óptimo para la actividad de la
ureasa?
Según los resultados de nuestra prueba el pH=8 es el óptimo para la actividad
enzimática de la ureasa

F. Influencia de los inhibidores sobre la actividad de la ureasa.


Observaciones:
Tubos Soluciones Indicador Coloración
1 Urea+Cloruro Formación de dos capas una
mercúrico+ureasa superior amarilla e inferior
Rojo de blanquecina
2 Urea+nitrato fenol Formación de dos capas una
plumboso+ureasa superior anaranjada e inferior
blanquecina
3 Urea+agua+ureasa Formación de dos capas una
superior fucsia e inferior
blanquecina

En el tubo Nº3 se observó evidencia marcada de actividad enzimática


determina por la coloración fucsia que se tornó la solución al añadir el
indicador de pH rojo de fenol.
Mientras que en los tubo Nº2 y Nº3 no se presentó actividad enzimática ya
que estos se tornaron entre colores amarillo y naranja. Esto se debe a que el
cloruro mercúrico y nitrato plumboso son inhibidores ya que se unieron al
extracto de la enzima ureasa y disminuyeron su actividad enzimática.
Cuestionario:
1. ¿En qué tubo hubo una gran actividad enzimática y en cuáles no? Explique por
qué.
En el tercer tubo hubo una gran evidencia de actividad enzimática mientras
que en el primer y segundo no. Esto se debe a que el tercero solo contenía
agua y esta no afectó en la actividad enzimática de la ureasa, mientras que
en el primer y segundo tubo contenía cloruro mercúrico y nitrato plumboso
compuestos que actuaron como inhibidores de la actividad de la ureasa.

b. ¿Cuál es el efecto del HgCl2 y del Pb (NO3)2 sobre la ureasa?


Ambos compuestos son inhibidores enzimáticos, estos se unen a la enzima
ureasa y disminuyen considerablemente la actividad enzimática
CONCLUSIONES

 Se preparó un extracto crudo de ureasa a base de semillas de zapallo


(descascarilladas) y se procedió a realizar la prueba de Biuret con la suspensión,
esta dio como resultado una coloración violeta que indica la presencia de
proteínas.
 En la prueba de especificidad de la ureasa se pudo observar que el tubo A (urea)
se tornó de color fucsia esto quiere decir que la ureasa reacciono positivamente
con la urea y por ello esta es más especia ya que la ureasa descompone a la urea,
mientras que en el tubo B (acrilamida) se tornó de color amarilla esta es un
sustrato análogo, por la coloración la ureasa está actuando sobre la acrilamida
pero en menor proporción.
 La prueba que estudiaba el efecto de la concentración de la enzima sobre la
velocidad de la reacción dio como resultado que el primero en adquirir una
coloración fucsia intensa fue el tubo Nº4 ya que este contenía la mayor cantidad
del extracto de la enzima ureasa con respecto a los otros tubos.
 En la influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática pudimos observar
que En general, la velocidad de la reacción se incrementa con la temperatura
hasta que llega a un punto óptimo. Este incremento se debe a que aumenta el
número de moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de
estado de transición, para formar a los productos. Mientras que la elevación
excesiva de la temperatura del medio que contiene a las enzimas ureasa, resulta
en un decremento de la velocidad como resultado de la desnaturalización, es
decir, la pérdida de la estructura tridimensional de las enzimas.
 La prueba de la influencia del pH sobre la actividad de la ureasa dio como
resultado que el pH óptimo de esta enzima es 8 ya que la solución amortiguadora
se tornó de color azul al añadirle el indicador azul de timol.
 En La prueba de la influencia de los inhibidores sobre la actividad de la enzima
ureasa, pudimos observar que en el tubo que contenía ureasa y agua hubo una
marcada actividad enzimática determinada por la coloración fucsia en que se tornó
la solución al añadir el indicador de pH rojo de fenol.
Mientras que en los tubos que contenía cloruro mercúrico y nitrato plumboso no
se presentó actividad enzimática ya que estos se tornaron entre colores amarillo
y naranja. Esto se debe a que estos compuestos son inhibidores y por ende se
unieron al extracto de la enzima ureasa y disminuyeron su actividad enzimática
ANEXOS
A. preparación de un extracto crudo de ureasa

Extracto de
ureasa en
Extracto
prueba de
de
Biuret
ureasa

B. Especificidad de la ureasa.
Acrilamida
Ureasa
C. Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción.

4 3 2 1 Tubo Solución Extracto Agua coloración


de urea de destilada
1M ureasa
1 2 ml 0.0 ml 3.0 ml amarillo
2 2 ml 0.5 ml 2.5 ml fucsia
3 2 ml 1.0 ml 2.0 ml fucsia
4 2 ml 2.0 ml 1.0 ml fucsia

D. Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática

Urea+agua
Reaccionaron No hubo
destilada+solucion de rojo reacción se
fenol desnaturalizo
Solución amortiguadora pH=4
Urea+HgCl2+ureasa+rojo de fenol

Urea+Pb(NO3) 2+ureasa+rojo de fenol Solución amortiguadora pH=6

Urea+agua+ureasa+rojo de fenol Solución amortiguadora pH=8


E. Influencia del pH sobre la actividad de la ureasa.

F. Influencia de los inhibidores sobre la actividad de la ureasa.