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Visualización de inmunoglobulinas mediante Western Blot

Cristian Benalcázar1, Andrea Pumisacho1, Stefania Llumiquinga1, Laura Vallejo1, Marbel Torres2
1
Departamento de Ciencias de la Vida y Agricultura, Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE,
Sangolqui, Ecuador
2
Laboratorio de Docencia de Ingeniería en Biotecnología

Correspondencia a: cabebenalcaza1@espe.edu.ec, adpumisacho@espe.edu.ec,

msllumiquinga@espe.edu.ec, levallejo1@espe.edu.ec, mmtorres@espe.edu.ec

Palabras clave: inmunoglobulinas electroforesis, SDS-PAGE, Western blot

Fecha de entrega: 03 Agosto de 2018

Resumen

La técnica de Western blot detecta proteínas a través del reconocimiento y unión del anticuerpo
al antígeno. Esta interacción es altamente específica y es empleada en investigaciones
fisiológicas. El ensayo tiene como objetivo determinar el peso molecular de las
inmunoglobulinas presentes en las muestras de suero. La elaboración del gel de poliacrilamida
permitió observar la migración y separación de las proteínas desnaturalizadas, determinando sus
pesos moleculares, asimismo, se lo comprobó empleando el colorante Azul de Coomasie.
Finalmente, se observaron proteínas con pesos moleculares desde 25 a 74 kDa.

Abstract

The Western blot technique detects proteins through the recognition and binding of the antibody
to the antigen. This interaction is highly specific and is used in physiological investigations. The
objective of the test is to determine the molecular weight of the immunoglobulins present in the
serum samples. The preparation of the polyacrylamide gel allowed to observe the migration and
separation of the denatured proteins, determining their molecular weights, also, it was proved
using the Coomasie Blue dye. Finally, proteins with molecular weights from 25 to 74 kDa were
observed.

Introducción
El Western blotting es una técnica que permite la inmunodetección y cuantificación de
proteínas dentro de una mezcla que puede contener más proteínas u otras moléculas
[ CITATION Las15 \l 3082 ]. Se comienza con la extracción de proteínas seguida de la
cuantificación de su concentración mediante métodos colorimétricos como los ensayos Lowry,
ácido bicinconínico (BCA) y orto-ftaladehído (OPA) [ CITATION Nob07 \l 3082 ].
Se separa a las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato
sódico (SDS-PAGE). Al ser tratadas las proteínas con SDS se desnaturalizan y se cargan
negativamente para posteriormente separarse en función de su peso molecular mediante PAGE [
CITATION Bas16 \l 3082 ]. Por medio de electroforesis se transfiere las proteínas desde el gel a
una membrana de soporte. Se incuba a la membrana con dos anticuerpos, el anticuerpo primario
se une al antígeno por lo que ayuda a detectarlo en la membrana. El anticuerpo secundario se
une al primario y debido a que está marcado por enzimas o fluoróforos se puede cuantificar a la
proteína [ CITATION Abb08 \l 3082 ].

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El objetivo del estudio fue determinar el peso molecular de las inmunoglobulinas obtenidas a
partir de una muestra de suero humano mediante SDS-PAGE que forma parte de la técnica de
Western blotting.

Protocolo

A. Ensamblaje del equipo

1. Lavar con agua y jabón las placas de vidrio y el marco (casting frame).
Limpiarlas con alcohol 95%.
2. Colocar y asegurar las placas de vidrio en el marco y ubicarlo en el soporte
(casting stand).
3. Verificar la ausencia de fugas en el sistema al ingresar agua entre las placas.
4. Eliminar el agua y secar con papel Whatman.

B. Preparación del gel de separación 8%

1. Mezclar en un tubo de 15ml, 2700µL de agua destilada, 1000μL de acrilamida

37,5:1 40% (LOBALChemie), 1250μL de Tris HCL 1.5M tampón 4X 0.4% de
SDS, 2.5 μL de APS y al final 5μL de TEMED (Invitrogen).
2. Homogenizar la mezcla.
3. Colocar la mezcla dentro de la placa de vidrio con la ayuda de una micropipeta
de 1000 μL.
4. Nivelar el gel con agua
5. Dejar polimerizar por 20 minutos y controlar este proceso por medio del tubo
que contiene una parte del gel.

Composición de las soluciones empleadas

10% de SDS

SDS (Promega) 10g

Agua destilada 90 ml
Calentar a 60°C

Tris HCL 1.5M tampón 4X 0.4% de SDS

Tris Base (Invitrogen) 18.17g

Agua destilada 66ml
SDS al 10% 4ml
Ajustar el pH a 8.8 con HCL 6N
Agua destilada A 100ml

C. Preparación del gel de concentración 4%

1. Mezclar en un tubo de 15ml, 3200 µL de agua destilada, 500μL de acrilamida
37,5:1 40% (LOBALChemie), 1250μL de Tris HCL 0.5M tampón 4X 0.4% de
SDS, 2.5 μL de APS y al final 5μL de TEMED (Invitrogen).
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2. Homogenizar la mezcla.
3. Cuando el gel de separación se haya polimerizado, verter la mezcla en la parte
superior de la placa pequeña con la ayuda de una micropipeta de 1000 μL.
4. Insertar el peine para formar los pocillos.
5. Dejar polimerizar por 20 minutos y controlar este proceso por medio del tubo
que contiene el resto del gel de apilamiento.

Composición de las soluciones empleadas

Considerando que Tris Base posee una pureza de 99.9% y su peso molecular
corresponden a 121.14 g/mol .

Tris HCL 0.5M tampón 4X 0.4% de SDS

Tris Base (Invitrogen) 6.06g

Agua destilada 66ml
SDS al 10% 4ml
Ajustar el pH a 6.8 con HCL 6N
Agua destilada A 100ml

D. Preparación de las muestras

1. Homogenizar en un tubo eppendorf con una micropipeta, 50μL de buffer de

carga 5X con 50μL de las muestras de sobrenadante y pellet, previamente
cuantificadas con el método BCA, que poseen 24.52 µg/ml y 34,64 µg/ml
respectivamente.
2. Incubar los tubos a 100°C por 10 minutos en el termobloque.
3. Colocar a 4°C por 10 minutos y homogenizar.

Composición de las soluciones empleadas

Buffer de carga

Agua destilada 3.55mL

0.5 M Tris-HCL, pH=6.8 1.25mL
Glicerol 87% 2.5mL
SDS 10% 2mL

E. Instalación de los geles y Migración en SDS-PAGE

1. Colocar en el tanque de electroforesis vertical el gel polimerizado.

2. Añadir buffer de corrida desde el centro de los geles y completar el volumen
hasta el límite marcado para los geles.
3. Retirar el peine sin dañar los pocillos.
4. Colocar el soporte de corrida con los geles en la cámara de electroforesis
verificando que los puertos eléctricos sean los correctos.
5. Colocar el buffer de electroforesis 1X
6. Cargar en el primer pocillo 2μL del marcador de peso molecular (Precision Plus
Color Dual BIORAD®, 161-0374 Ref) y en los demás pocillos 5 μL de las
muestras.
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7. Conectar los cables de la fuente de poder al tanque cargado de acuerdo a las

cargas positiva y negativa.
8. Migrar a 180mA por 40 minutos comprobando la producción de burbujas.
9. Al finalizar la migración, retirar el gel de las placas con cuidado de no romperlo
y empleando una paleta.
10. Teñir el gel mediante la tinción de Azul de Coomasie por 5 minutos.
11. Lavar el gel con la solución destiñidora.

Composición de las soluciones empleadas

Considerando que Tris Base y glicina poseen una pureza de 99.9% y sus pesos
moleculares corresponden a 121.14 g/mol y 75.07 g/mol respectivamente.

10X Buffer de electroforesis

Reactivo Cantidad Concentració

n Final
Tris Base 30.315g 0.25
(Invitrogen)
Glicina (Amp) 150.29g 2M
Agua destilada 1L
Verificar pH 8.27

Cantidad que se agrega de Tris base

0.25 moles
∗121.14 g∗100
Litro
∗1 L soluci ó n=30.315 g de Tris base
1mol∗99.9

2 moles
∗75.07 g∗100
Litro
∗1 L soluci ó n=150.29 g de Glicina
1 mol∗99.9

Se agrega en el buffer de electroforesis 30.3 g de Tris Base y 150.29 g de glicina

por litro de agua.

Buffer de electroforesis 1X

Solución madre 10X 100ml

Agua destilada 890ml
SDS 10% 10ml

Solución destiñidora

Metanol 50ml
Ácido acético glacial 50ml
Agua destilada 400ml

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Resultados

A continuación se presenta las concentraciones de proteínas en el pellet y sobrenadante de las

muestras de suero.
Tabla 1. Concentraciones de proteínas en pellet y sobrenadante

Sobrenadante Pellet
  (ug/mL) (ug/mL)
Electroforesis G1 168,4 98,8
Las muestras obtenidas G2 197,6 113 del suero humano se
cargaron en los pocillos G3 180,38 110,13 del gel de poliacrilamida
– SDS (SDS-PAGE). La G4 32,64 24,52 línea final de corrida no
es uniforme debido al G5 164,2 -----  alto voltaje aplicado para
la migración de proteínas. (Figura 1).
G6 102,54 75,718

Figura 1. Corrida del gel de poliacrilamida

Mediante la tinción con Azul de Coomasie y varios lavados con buffer PBS, se verificó la
migración de las proteínas (Figura 2).

Figura 2. Visualización de proteínas en gel mediante tinción de Azul de Coomasie

La figura 3 muestra bandas borrosas y una migración entrecruzada que se observa en los
pocillos 5,6, 9 y 10. Los pocillos 3, 4, 7 y 8 correspondientes a las proteínas del pellet como del
sobrenadante, revelan bandas distorsionadas por lo que dificulta la determinación de su peso
molecular. El pocillo 2 de la muestra problema no refleja ninguna banda.

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kDa

Figura 3. Migración de proteínas en gel SDS-PAGE al 8% con tinción Azul de Coomasie 1) Marcador de peso
molecular; 2) Muestra problema; 3) Pellet G3; 4) Sobrenadante G3; 7) Pellet G4; 8) Sobrenadante G4

Luego de la separación electroforética, las proteínas se deben transferirse a una membrana de

nitrocelulosa. Las proteínas transferidas corresponden a otra muestra, sin embargo, en la
membrana se logra observar bandas tenues de color rojo (Figura 4).

Figura 4. Transferencia de proteínas a membrana de nitrocelulosa. Comprobación mediante

el colorante Rojo Ponceau..

Discusión

Western blot es una técnica de laboratorio utilizada para detección de proteínas específicas en
una muestra determinada [ CITATION Sev11 \l 3082 ]. El método implica el uso de
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) que ayudaran
para la separación de las proteínas de la muestra según su tamaño y peso molecular, al teñir el
gel con azul de Coomassie (Figura 2) se puede ver las bandas de proteínas [ CITATION
Tay14 \l 12298 ]. En esta técnica las proteínas pasan por un tratamiento con agentes reductores
que causan la pérdida de las estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polipéptidos
desnaturalizados, impidiendo que la estructura tridimensional de las proteínas influya en la
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electroforesis y puedan separarse únicamente en función del tamaño [ CITATION UAZ18 \l

12298 ].
En el pocillo 1 del gel de poliacrilamida (Figura 3) se cargó el marcador de peso molecular, el
cual es una mezcla de proteínas de tamaño conocido que permite realizar un monitoreo
electroforético, diferenciar proteínas de interés por su peso molecular y brinda una idea de la
eficiencia de la transferencia (SelectScience, 2018). En el pocillo 2 se observa la muestra
problema que no refleja ninguna banda, esto se puede deber a que la cantidad o la concentración
de proteína en la muestra cargada al gel eran insuficientes y se encuentra por debajo de los
niveles detectables [ CITATION Mah12 \l 12298 ]. Alberts & Bray (2006) anuncia que se debe
tomar en cuenta la concentración del gel de separación, debido a que para obtener componentes
de un alto peso molecular se emplean concentraciones de entre 5 a 7,5%, mientras que si se
quiere separar proteínas de bajo peso molecular en necesario emplear geles de entre 15-20% y
para proteínas de tamaño intermedio se usan concentraciones de 10-12%. En nuestro caso en los
pocillos 3 y 4, se cargó con muestras tomadas del pellet y el sobrenadante del grupo tres, se
obtuvo una formación de bandas en los pesos de 48-74 kDa y 49-73 kDa, Por otro lado, en los
pocillos 7 y 8 tomadas del pellet y el sobrenadante del grupo cuatro, se obtuvo una formación de
bandas en los pesos de 50-75 kDa. Parham (2006) asevera que las inmunoglobulinas son
glucoproteínas las cuales están compuestas por cadenas idénticas tanto 2 ligeras como 2 pesadas
y que su peso es de aproximadamente 25 kDa y 50 kDa respectivamente, y que el peso de las
inmunoglobulinas es variado de acuerdo a su isotipo, pueden encontrarse en forma de dímeros,
tetrámeros o pentámeros, pero en general el peso molecular de un monómero de
inmunoglobulina se encuentra entre 150 a 180 kDa [ CITATION 9Be86 \l 3082 ].

Conclusiones

Recomendaciones

Referencias Bibliográficas

Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S. (2008). Celular y Molecular Inmunología. Philadelphia:
Elsevier.
Alberts, B., & Bray, D. (2006). Introducción a la biología celular. Buenos Aires: Médica
Panamericana.
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physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports.
Bernabeu, C. M.-M. (1986). Anticuerpos monoclonales específicos para antígenos de
histocompatibilidad y activación de leucocitos humanos. Rev Doy Immunol.
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Elearning, E. (2010). Las enfermedades autoinmunes y el laboratorio. Editorial Elearning, S.L.
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Parham, P. (2006). Inmunología . Buenos Aires: Médica Panamericana.
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