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Un biosensor desechable para la determinación de alfa-amilasa

en saliva humana.
Resumen
Se presenta un biosensor tri-enzimático desechable para la determinación de la α-amilasa
en la saliva humana. Se basa en la cantidad de maltosa generada por hidrólisis de
maltopentosa en presencia de α-amilasa salival. El biosensor se fabrica por co-
inmovilización de las enzimas α-glucosidasa, glucosa oxidasa y mutarotasa en electrodos
serigrafiados modificados con azul de Prusia.
El ensayo se puede realizar con una "gota" de muestra, lo que permite facilidad y
simplicidad. Se encuentra una relación lineal para el rango de 5 a 250 unidades por ml,
con un LOD de 5 unidades por ml. El biosensor es estable durante al menos un mes y
durante este tiempo conserva el 80% de su actividad original. Luego se evaluó el sistema
para determinar los efectos matriciales de la saliva humana y se comparó con un método
espectrométrico utilizando un kit comercialmente disponible.
Introducción
El estrés, los trastornos relacionados con el estrés y la detección de biomarcadores
relacionados con el estrés en la saliva han ganado mucho interés durante la última
década en la investigación clínica, psicológica, biomédica y de medicina deportiva. Esto
se debe principalmente al hecho de que muchos biomarcadores importantes, que se
encuentran en la sangre y el suero, también están presentes en la composición de la
saliva. La ventaja y la preferencia de usar saliva como matriz de muestra es que es
relativamente no invasivo, menos estresante para la muestra y no requiere equipo o
personal especializado para el muestreo. Es bien sabido que las hormonas como el
cortisol y las catecolaminas (por ejemplo, norepinefrina) son buenos biomarcadores de
estrés que se encuentran en estado libre no unido en la saliva y su monitoreo se usa
ampliamente como índice para el estrés endocrinológico. Su liberación se debe a la
activación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) por un estímulo de estrés (por
ejemplo, actividad física) o por medio del sistema nervioso simpático (SNS). Sin embargo,
más recientemente se ha identificado que la alfa-amilasa salival (sAA) responde a los
estímulos de estrés a través del sistema simpático nervioso-adrenomedular (sistema
SAM) [1, 2] controlado por la noradrenalina en las glándulas salivales.
La secreción de sAA es muy reactiva a los estímulos de estrés y se ha demostrado que
responde mejor que la reacción hormonal inducida [3–7] ya que parece amplificar la baja
concentración de liberación de noradrenalina. Por lo tanto, se ha sugerido que la α-
amilasa se puede usar como un biomarcador sustituto del estrés a través del sistema
SAM que reemplaza a la noradrenalina, ya que es mucho más fácil de controlar. La alfa-
amilasa (EC 3.2.1.1) es uno de los principales componentes proteicos presentes en la
saliva. La principal función biológica de sAA es la digestión enzimática de los
carbohidratos, pero también es importante para la inmunidad de la mucosa en la cavidad
oral, ya que inhibe la adherencia y el crecimiento de bacterias [8, 9]. La reactividad de
sAA es muy importante para la digestión de los alimentos. Por lo tanto, al aplicar la
actividad sAA en relación con el deporte, el estado físico y la respuesta fisiológica, su
aumento durante los períodos de gasto de energía intenso y una concentración elevada
sostenida después de la actividad indica un camino donde las reservas de energía
podrían reponerse de manera efectiva. Por esta razón, existe un interés considerable en
la psicobiología del estrés como fuente de diferencias individuales en el rendimiento y el
comportamiento durante la competencia. En relación con el deporte competitivo y el
estado físico, la capacidad de estresar a un oponente es fundamental para lograr o
mantener una pole position. Por lo tanto, una resistencia individual al "estrés" en el
contexto de una competencia, aumenta las posibilidades de ganar y mantener el dominio.
Sin embargo, se requieren más estudios para avanzar nuestro conocimiento en la
interacción dinámica de biomarcadores relacionados con el estrés, nutrición y
recuperación física facilitada. Esta investigación a lo largo de los años se ha visto
obstaculizada por la falta de métodos de análisis adecuados y dispositivos portátiles que
puedan monitorear biomarcadores de estrés en el campo o "punto de atención".
Los biosensores electroquímicos pueden ofrecer un método comparativamente rápido y
simple para monitorear biomarcadores de estrés que puede ser relativamente fácil de usar
en un entorno competitivo o de entrenamiento, proporcionando mediciones cuantitativas y
cualitativas que serían útiles para la medicina deportiva para la determinación y la
investigación del estrés psicobiológico [7 ] Recientemente, Zou introdujo un biosensor
desechable sAA basado en ferroceno [10]. Este sistema utiliza almidón como sustrato y
dos enzimas, glucosa oxidasa y alfa-glucosidasa, inmovilizadas en un electrodo de trabajo
de grafito impreso. Yamaguchi [11] desarrolló un sensor de enzimas microanalíticas de
chip plano para la actividad de la amilasa salival que utilizaba una superficie de electrodo
de trabajo pre-columna y coimmovilizada modificada con glucosa oxidasa y peroxidasa.
Este sensor se utilizó en sistemas microelectromecánicos (MEMS) [12]. El mismo grupo
ha desarrollado un sistema portátil para el control de la alfa-amilasa [13]. Sin embargo, el
sistema analítico para la actividad sAA se basa en la química en seco y el análisis de
lectura óptica de flujo lateral y se ha utilizado para estudiar el estrés y la fatiga del buzo.
Zajoncovà ha propuesto un biosensor de inyección de flujo para la actividad de sAA en el
flujo utilizando enzimas inmovilizadas en una membrana de celofán y un electrodo de
peróxido de platino [14].
La maltosa es el componente principal de la reacción de amilasa (70% del producto). En
este trabajo se estudió un biosensor para la determinación de maltosa basado en tres
electrodos impresos serigrafiados modificados enzimáticamente (SPE). Este sistema
electroquímico se preparó por inmovilización directa de glucosa oxidasa (GOx), alfa-
glucosidasa (GD), enzima mutarotasa en un electrodo de trabajo modificado con azul de
Prusia (SPE-PB). Se propuso un nuevo sensor tri-enzimático desechable para la
detección de la actividad de la amilasa salival utilizando 30 µl de muestra utilizando la
“técnica de caída”. El sustrato elegido para la amilasa fue maltopentosa por su bajo peso
molecular. El biosensor trienzimático desechable se preparó y todas las condiciones
operativas se optimizaron primero en tampón y luego se aplicaron en muestras de saliva
real para la determinación de la amilasa salival.
Experimental
Reactivos
Monohidrato de maltosa, maltopentosa, amilosa, almidón hidrolizado parcial,
glutaraldehído al 25% (v / v), Nafion al 5% (v / v), albúmina de suero bovino (BSA),
glucosa oxidasa (GOx) de Aspergillus niger, tipo VII S (195 U / mg; EC 1.1.3.4), alfa-
glucosidasa (GD) de Saccharomyces sp., (133 U / mg; EC 3.2.1.20) y alfa-amilasa de
saliva humana (α1,4 – D-glucano 4-glucanohidrolasa ; EC 3.2.1.1; tipo IX – A) fueron
adquiridos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Schnelldorf, Alemania-
www.sigmaaldrich.com). La mutarotasa enzimática del riñón porcino (> 1,500 U / mg,
EC5.1.3.3) se adquirió de BBI Enzymes Ltd (Gwent, Reino Unido -
www.bbienzymes.com). Todos los productos químicos eran de grado analítico a menos
que se indique lo contrario.
Aparato
Las mediciones amperométricas se llevaron a cabo utilizando un potenciostato PalmSens
(Palm Instruments BV, Países Bajos www.plamsens.com) conectado a una computadora
portátil. Los electrodos serigrafiados (SPEs) se obtuvieron de EcoBioServices & Research
(Universidad de Florencia, Italia, www.ebsr.it). Estos electrodos consisten en una
configuración de tres electrodos que tiene un electrodo de trabajo y contraelectrodo de
grafito y un electrodo de pseudo-referencia plateado impreso en una película de soporte
de plástico. Se utilizó un kit de análisis espectrofotométrico para la amilasa salival (kit de
análisis de α-amilasa salival, Salimetrics LLC, Suffolk, Reino Unido—
www.salimetrics.com) con un lector de placas (Multiskan MS, Thermo Fisher Scientific,
Finlandia—www.thermo.com )
Preparación de electrodos serigrafiados
Los SPE se modificaron con azul de Prusia (PB) (hexacianoferrato de potasio hierro (III)
(II)) antes de la inmovilización de la enzima. El protocolo de modificación de la superficie
del electrodo de trabajo se basó en el procedimiento optimizado por Ricci [15]. En general,
se aplicaron 5 µl de cada solución precursora de PB, constituyendo 0,1 M de K3Fe (CN) 6
en HCl 10 mM y de FeCl6 0,1 M en HCl 10 mM, sobre el área de electrodo de trabajo. Los
electrodos se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad y luego se enjuagaron con
HCl 10 mM. Los electrodos se dejaron durante 1 h en el horno a 100 ° C para obtener una
capa activa de PB seca y estable. Los electrodos modificados con PB se almacenaron
secos a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.
Inmovilización de enzimas
Los electrodos modificados con enzimas se prepararon inmovilizando las enzimas
apropiadas sobre la superficie del electrodo de trabajo modificado con PB usando un
método de reticulación de glutaraldehído. Esto se llevó a cabo aplicando 2 μl de
glutaraldehído (1% v / v) sobre el electrodo de trabajo y permitiendo que la gota se seque
antes de aplicar 2 μl de una solución que contiene una mezcla de enzimas, Nafion (0.3%
en etanol, pH neutralizado con NaOH) y BSA (5% p / v) en una proporción de (1: 1: 1).
Para el biosensor de alfa-amilasa activo, las tres enzimas que contenían: 0.14 U de alfa-
glucosidasa (GD), 0.56U de enzima mutarotasa y 0.37 U de glucosa oxidasa (GOx) se
mezclaron con soluciones de Nafion y BSA para obtener una capa enzimática estable y
activa [15].
Saliva sintética
La saliva sintética se preparó utilizando el método Pratten [16]. En resumen, una
composición típica de la saliva: extracto de carne de res (1 g · L − 1), extracto de levadura
(2 g · L − 1), proteosa peptona 3 (5 g · L − 1), mucina (2 g · L − 1 ), cloruro de sodio (0.2
g· L − 1), cloruro de potasio (0.2 g · L − 1) y carbonato de calcio (0.3 g · L − 1) se
disolvieron en agua destilada; y se añadieron 1,25 ml de una solución esterilizada por
filtración de 0,2 µm de 40% de urea después de la esterilización en autoclave. La saliva
sintética se almacenó a -80 ° C.
Muestras y preparaciones de muestras enriquecidas para estudios de matriz
Se trataron cinco ml de saliva artificial y muestras de saliva real de la misma manera:
centrifugada (15 min a 5.000 rpm) para separar los compuestos de alto peso molecular
normalmente presentes en la saliva. Se añadió una alícuota de sobrenadante con el
estándar sAA a diferentes concentraciones (entre 10 y 100 U mL − 1). Las diluciones de
sAA se prepararon mezclando la solución tampón de “trabajo” (10 mmol L − 1 de tampón
fosfato pH 7.4 + 0.1 mol L − 1 KCl y que contiene 1 mg mL − 1 de maltopentosa) con
diferentes diluciones del analito estándar en el tampón. Antes de la medición, la solución
mezclada se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente.
La actividad de la amilasa se midió a -25 mV por el método de cronoamperometría y la
respuesta se registró después de 300 s. La concentración de sAA en la muestra se
determinó a partir de gráficos de calibración lineal y se usó para calcular la concentración
en la muestra inicial.
Preparación de muestra real
Se tomaron muestras completas de saliva utilizando el método de "baba pasiva" [17] de
una mujer y 2 hombres de prueba por la mañana para el análisis, al menos 1 hora
después de cepillarse los dientes y antes de consumir cualquier alimento o bebida. Las
muestras de saliva se centrifugaron a 6,000 rpm, se utilizó el sobrenadante y se descartó
el precipitado. Las muestras de saliva se diluyeron 1: 1 (v / v) con la solución tampón de
"trabajo" y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min.
Mediciones espectrofotométricas
La determinación de sAA usando el kit de espectrofotómetro comercial (kit de ensayo de
α-amilasa salival, Salimetrics) se realizó según las instrucciones de la guía proporcionada
con el kit.
Resultados y discusiones
Diseño del biosensor.
En este estudio, la medición de la alfa-amilasa se determinó utilizando un método basado
en la producción de maltosa durante la hidrólisis de maltopentosa en presencia de alfa-
amilasa [18]. Se investigaron varios sustratos de almidón en este estudio: almidón
hidrolizado parcial, amilosa y maltopentosa. Sin embargo, la maltopentosa se seleccionó
como el sustrato preferido para la alfa-amilasa debido a su alta solubilidad y bajo peso
molecular conocido que a su vez mejoró la especificidad de la enzima. En general, el
sustrato estándar utilizado para la actividad de alfa-amilasa es el almidón que es rico en
polisacáridos de alto peso molecular que pueden reaccionar y ser catalizados por otras
enzimas salivales que interfieren. Para convertir el azúcar en una forma
amperométricamente detectable, tres enzimas diferentes, alfa-glucosidasa (GD), enzima
mutarotasa y glucosa oxidasa (GOx) se co-inmovilizaron en la superficie del electrodo de
trabajo modificado con PB usando un método de reticulación ( vía glutaraldehído –BSA),
como se muestra en la parte experimental. Para obtener una respuesta más alta, se usó
una etapa de preincubación de la muestra y una solución tampón de "trabajo" de 5
minutos a temperatura ambiente. Se utilizó una concentración inicial de 1 mg mL-1 para
maltopentosa para producir una cantidad suficiente de productos finales (maltosa y
maltotriosa) que luego se hidrolizaron a alfa-glucosa por GD. La mutarotasa enzimática
cataliza enzimáticamente la mutarotación de α-D-glucosa en glucosa β-D, que es el
sustrato de GOx. La β-D-glucosa se hidroliza luego a ácido glucónico y peróxido de
hidrógeno por GOx. Esta reacción nos permite determinar toda la glucosa obtenida de la
hidrólisis de la maltopentosa y acelerar la reacción final para obtener una mejor linealidad
en un rango más amplio. La cantidad del producto final, peróxido de hidrógeno (H2O2), es
proporcional a la corriente detectada en el electrodo. Todas las reacciones enzimáticas
explotadas en la medición de la actividad alfaamilasa se muestran en el esquema 1 (ver
ecuaciones a continuación).

La actividad de la enzima se calculó utilizando la siguiente ecuación (1)

El comportamiento de cronoamperometría del biosensor se evaluó paso a paso, para


determinar las características enzimáticas, en términos de rango de linealidad y límite de
detección (LOD) de cada enzima inmovilizada en el electrodo de trabajo.

Estudio de los parámetros analíticos del biosensor.


Las curvas de calibración de glucosa y maltosa se obtuvieron con todos los parámetros
optimizados (es decir, el tiempo de reacción de cada enzima, tampón y unidades de
enzima inmovilizada en el electrodo de trabajo). Se realizó un estudio inicial utilizando una
cantidad fija de sustrato (glucosa y maltosa, 1 mg mL − 1 en ambos casos) e
inmovilizando diferentes cantidades de enzima (GOx y GD) para determinar la cantidad
óptima de unidades activas para los inmovilizados. enzimas
Las mediciones de glucosa y maltosa se llevaron a cabo por separado para caracterizar el
comportamiento de cada enzima, utilizando el biosensor en el que las enzimas, GOx, GD
y mutarotasa, estaban co-inmovilizadas. El estudio se llevó a cabo utilizando un
procedimiento de "gota" mediante la aplicación de 30 µL de la solución de sustrato en el
electrodo impreso, para cubrir los tres electrodos. El trabajo se realizó secuencialmente
inmovilizando inicialmente GOx y estudiando el tiempo de reacción y la curva de
calibración. El rango de linealidad fue entre 0.05–1 mM con LOD 0.05 mM (Tabla 1) que
fue comparable con los datos publicados previamente [19]. Para maltosa y maltotriosa, se
construyeron dos curvas de calibración diferentes para comprender el comportamiento
enzimático frente a cada sustrato. De hecho, se obtuvo una mezcla de maltosa y
maltotriosa 1: 1 (v / v) a partir de la hidrólisis de maltopentosa por alfa-amilasa. El GD
tiene una baja actividad enzimática [20] y también la tasa de mutarotación espontánea de
α-glucosa, formada a partir de maltosa y maltotriosa después de la reacción enzimática,
es muy lenta. Con el fin de mejorar el tiempo de análisis de la alfa-amilasa, la enzima
mutarotasa se agregó a la superficie del electrodo al mismo tiempo que GD y GOx [14].
La presencia de la enzima mutarotasa fue importante ya que cataliza la mutarotación de la
α-glucosa en la forma β, que es el sustrato ideal para GOx. Los resultados obtenidos
usando una cantidad fija de maltosa (1 mg mL − 1) mostraron una respuesta del biosensor
con mutarotasa 6 veces mayor que la que no contiene (datos no mostrados). Se estudió la
efectividad del sistema tri-enzimático inmovilizado utilizando glucosa, maltosa y
maltotriosa como sustrato en la "medición de gotas", después de una incubación de 5
minutos de cada sustrato en el electrodo. Las curvas de calibración obtenidas con el
mismo electrodo para cada sustrato mostraron buena linealidad en un amplio rango de
concentración (ver Tabla 1). Por lo tanto, para los biosensores de tres enzimas, las curvas
de calibración obtenidas para maltosa y maltotriosa mostraron un rango de linealidad
entre 1100 mM y 10–100 mM con límites de detección (LOD) iguales a 1 y 10 mM
respectivamente.

Medición de α-amilasa en tampón


Las respuestas de medición típicas de "caída" del biosensor descrito en presencia de
diferentes concentraciones de alfaamilasa se informan en la figura 1. Las mediciones se
llevaron a cabo utilizando una cantidad fija de maltopentosa (1 mg mL − 1, 5 mM) en el
tampón de “trabajo” (maltopentosa 5 mM en 10 mmolL − 1 de tampón fosfato, pH 7.4, +
0.1 molL − 1 KCl). Se registró la señal de corriente de fondo, causada por la maltopentosa
presente en la solución tampón de trabajo sin alfa-amilasa. Todos los resultados se han
normalizado con el fondo observado.
Se estudiaron diferentes tiempos de incubación (1, 5, 15, 30, 60 min), todos a temperatura
ambiente utilizando diferentes concentraciones (10–100 UmL − 1) de solución estándar de
alfa-amilasa y una cantidad fija de maltopentosa (1 mg mL − 1, 5 mM). Para la medición
de la alfa-amilasa, se eligió un paso de preincubación de 5 minutos a temperatura
ambiente para proporcionar un tiempo de análisis corto pero aún así obtener una buena
sensibilidad (14 nA U − 1) y reproducibilidad (RSD intradía 3%, entre días). 15%, n = 6
usando el mismo electrodo). Los resultados de la determinación de alfa-amilasa en el
tampón se muestran en la Fig. 1 con un rango de linealidad entre 5– 250 U mL − 1 y un
LOD igual a 5 U mL − 1.
Estudio de efecto matricial
El efecto de la matriz de los compuestos de saliva en las mediciones electroquímicas se
evaluó mediante la adición de saliva artificial con una cantidad conocida de amilasa
después de la centrifugación (este fue el único tratamiento de la matriz).
La saliva artificial, preparada de acuerdo con Pratten [16], se eligió para evitar la
presencia de enzimas endógenas. La comparación de las curvas de calibración obtenidas
en el tampón y en la saliva sintética mostró el mismo rango de linealidad y LOD, con solo
un ligero desplazamiento de la línea de base (Fig. 2). En particular, antes de comenzar la
medición de la alfa-amilasa en la saliva, se evaluó el efecto de los compuestos de saliva
mediante voltamperometría cíclica para detectar la presencia de cualquier compuesto
electroactivo interferente dentro de la matriz de la saliva. Los resultados obtenidos con el
electrodo no modificado para verificar la presencia de compuestos interferentes se
muestran en la Fig. 3. Los voltammogramas mostraron la comparación entre los
resultados obtenidos con tampón y en saliva diluida 1: 1 (v / v) en tampón con y sin
centrifugación Se puede observar que hay dos picos anódicos con potencial positivo
cuando la saliva no se centrifugó, lo que indica la presencia de compuestos con
capacidad reductora. El voltamograma cíclico de la saliva centrifugada mostró un pico
anódico de alrededor de 600 mV, pero no se observó respuesta electroquímica alrededor
del potencial elegido para las mediciones cronoamperométricas de alfa-amilasa.
Después de la evaluación del efecto de los diferentes compuestos presentes en la saliva
en la medición electroquímica usando saliva artificial, el experimento se realizó con saliva
humana real. La saliva humana, producida en las glándulas salivales, estaba compuesta
por 98% de agua y otras sustancias, incluidos electrolitos, moco, compuestos
antibacterianos y varias enzimas, incluida la alfa-amilasa. La glucosa endógena también
está presente en la saliva a una concentración entre 32–76 µM (14–33 µgmL − 1) [21, 22].
Estos valores se confirmaron mediante mediciones realizadas durante este estudio
utilizando el kit SALIMETRICS (kit de ensayo de α-amilasa salival). Como se observa en
la referencia [18], la corriente disminuyó ligeramente en proporción a medida que
disminuyó la concentración de maltopentosa. El efecto de la presencia de glucosa
endógena se observó cuando la cantidad de maltopentosa fue de 0.05 mg mL − 1 (datos
no mostrados).
Un compromiso entre una buena sensibilidad de la medición electroquímica de la α-
amilasa y un buen antecedente de la medición fue utilizar 5 mg mL − 1 de maltopentosa
añadida directamente a la muestra real diluida 1: 1 (v / v) con tampón fosfato después de
la centrifugación .
Las sustancias endógenas, en particular el ácido ascórbico y el lactato, presentes en la
saliva humana son candidatos para el efecto de interferencia electroquímica. Se eligieron
el ácido ascórbico y el lactato porque la presencia de estos dos compuestos, en particular
el ácido ascórbico, debería influir en la actividad simpática sobre la secreción de amilasa
humana en la saliva [23] y puede inhibir la actividad de la alfa-amilasa [24]. La
concentración salival típica de estos interferentes (<0.1 mM de lactato y <1 mM de ácido
ascórbico) se agregó a la solución de sustrato (maltosa 100 mM) que mostró poco o
ningún cambio significativo en la respuesta como se esperaba [25, 26].
Kit de α-amilasa salival y comparación de biosensores
Una comparación entre el biosensor y el kit comercial espectrofotométrico kit alfa-
amilasas, Salimatrics UK) se ha llevado a cabo midiendo las mismas soluciones estándar.
También se analizaron muestras de saliva real con ambos sistemas. Los resultados
obtenidos con las soluciones estándar estaban en buen acuerdo en términos de rango de
linealidad y LOD (Fig. 4), mientras que aquellos con muestras reales naturales mostraron
una muy buena correlación (Tabla 2).
Estabilidad del biosensor
Los electrodos enzimáticos se almacenaron secos a temperatura ambiente después de la
etapa de inmovilización enzimática. Las respuestas electroquímicas de la enzima co-
inmovilizada (GOx, enzima mutarotasa y GD) para maltosa 10 mM se evaluaron por
triplicado durante cuatro semanas con intervalos de una semana para controlar la
estabilidad de almacenamiento en seco de los biosensores de tres enzimas. Con el fin de
probar la estabilidad en términos de estabilidad de almacenamiento de GD inmovilizada,
la enzima con la actividad más baja [20], algunas mediciones de una solución de maltosa
y maltotriosa (presente en igual concentración 10 mM) se repitió cada día en el mismo
condiciones de funcionamiento por un total de 20 días. Después de 5 días de la
preparación, la actividad enzimática inmovilizada disminuyó al 15% en comparación con la
corriente del primer día.

Conclusiones
Se desarrolló un biosensor de alfa-amilasa serigrafiado desechable basado en un sistema
tri-enzimático. La sonda se basa en un sensor de peróxido que utiliza una pequeña gota
de muestra.
Al diseñar los sensores, se eligió el tiempo de reacción y análisis para que fuera realista y
en un formato que pudiera adaptarse fácilmente para usarse en el campo. La capa
reactiva del biosensor fue propuesta por la co-inmovilización de tres enzimas: GD, GOx y
enzima mutarotasa. El biosensor trienzimático fue lo suficientemente estable como para
permitir múltiples análisis (hasta 30 en el mismo día, RSD 4%) y durante tres días con una
reducción del 20% en la actividad del sensor. El sensor cuando se almacenó fue estable y
retuvo más del 80% de su actividad inicial después de 28 días. El sensor desechable
resultó ser muy rentable y funcionó en un formato muy simple que podría usarse
fácilmente.
El sistema de determinación electroquímica para la actividad de la alfa-amilasa salival en
la saliva humana que se describe aquí es el primero de su tipo basado en SPEs. Este
procedimiento resultó ser al menos tan sensible y preciso como los kits de análisis
espectrofotométricos ya disponibles en el mercado. Si bien estos kits generalmente
requieren personal de laboratorio calificado, así como equipos, incluyendo incubadora y
lector de placas, el sistema electroquímico es más adecuado para integrarse en un
instrumento portátil para mediciones de campo. Este biosensor enzimático es sensible a
otros azúcares, así como a la maltopentosa, y se debe prestar atención a la pureza del
sustrato. Sin embargo, se ha demostrado que el biosensor tri-enzimático proporciona un
procedimiento analítico simple y rápido que utiliza bajas cantidades de enzimas y
reactivos, instrumentación económica y que puede ser utilizado por operadores no
calificados.