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PREPARACIÓN

DE DOSIS
SEMINALES
PREPARACIÓN

DE DOSIS
SEMINALES
Preparación de Dosis Seminales

Colección
Seminal
Antes de realizar la colecta seminal se debe
preparar el termo poniendo un vaso o una funda
con filtro desechable dentro del mismo con el
fin de colectar en este y no directamente en el
termo, al recipiente se le puede adicionar unos
50 ml de diluyente previamente preparado en
agua destilada a una temperatura de 37°C según
las indicaciones del producto.

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La colección se realiza mediante la técnica del Limpie la zona ventral del macho con toallas
doble guante, uno interno de nitrilo o vinil y uno de de cocina secas, de atrás hacia adelante, saque
protección externo que permite manipular al todo el contenido del prepucio escurriéndolo
macho y realizar la limpieza de la zona prepucial, el bien y tratando de evacuar completamente la
objetivo es que el guante interno únicamente entre zona, seque adecuadamente.
en contacto con el pene del macho y no se
contamine previamente, debe ser en los materiales
mencionados porque los guantes de látex o con
talco pueden afectar la calidad seminal.

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Preparación de Dosis Seminales

Tenga en cuenta:

a) Regular la altura del maniquí de colecta (potro), el verraco tiene que


poder apoyar su cabeza y tronco descansando todo el esternón sobre el
potro, de tal manera que no empinen los miembros posteriores sino que
queden ligeramente agachados.
b) La sala de colecta debe permanecer limpia, el piso, el tapete y toda la
instalación debe ser debidamente lavada y desinfectada después de
cada colecta y se debe verificar su limpieza siempre antes de cada
colecta o entrenamiento.
c) Los machos solo deben ser
colectados cada 3 o 4 días
cuando son adultos (mayores
de 1 año) y máximo una vez a la
semana cuando tienen entre 7
meses y un año de edad.

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Cuando el verraco monte el potro, hay que
esperar hasta que desenfunde el pene, y en este
momento el operario debe quitarse el guante
externo y tomar el pene por la punta dejando
libre el extremo para la salida del semen.

Habitualmente durante la eyaculación puede


haber tres tipos de fracciones: Fracción
pre-espermática, es la primera emisión del
eyaculado y su función principal es la de lubricar
la uretra, normalmente es transparente y suele
tener una carga contaminante, por lo cual no es
conveniente colectarlo.

La fracción rica en espermatozoides es de color


lechoso, y es la que debe ser recogida. La
fracción post-espermática llamada también
fracción pobre o acuosa es transparente y con
muy bajo número de espermatozoides. Esta
fracción habitualmente no se recoge para
mantener una muy buena calidad del semen.

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Preparación de Dosis Seminales

Siempre se debe permitir que el macho Recuerde


finalice completamente su eyaculación,
de lo contrario esto puede afectar la No se debe soltar el pene del verraco
conducta reproductiva del mismo, no para no perder el estímulo.
se deben colectar los machos cuando
estos presenten signos de enfermedad La colecta termina cuando sale la última fracción
o problemas locomotores. pobre y el pene comienza a retraerse.
Tapar el termo y llevar inmediatamente al
Generalmente el volumen de un laboratorio para su evaluación.
eyaculado es en promedio de unos 300
ml de los cuales entre 80 y 150 ml
suelen ser de fracción espermática.

El semen debe ser evaluado y clasificado en el


Evaluación menor tiempo posible inmediatamente después
de ser colectado, con el fin de disminuir el riesgo

Seminal de que se presenten cambios bruscos en su


temperatura y contaminación seminal. En todo
momento se buscará mantener una temperatura
de 37°C en todos los implementos que entran en
contacto con el eyaculado.

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COLOR Valoración
Tan pronto la fracción espermática
macroscópica
llega al laboratorio de procesamiento
se verifica si el color del semen es
normal (blanquecino nítido sin la
presencia de otros tonos como rojizo, marrón,
o amarillento). La presencia de colores atípicos
puede deberse a alteraciones patológicas del
verraco o a la contaminación del eyaculado, en
estos casos el semen colectado se desecha de
inmediato y no puede continuar con el proceso
de evaluación.

VOLUMEN
OLOR
se determina el volumen total en
El eyaculado debe presentar un olor mililitros del eyaculado, una alternativa
neutro muy sui generis, alteraciones es pesarlo y tomar un gramo como
en el olor del eyaculado como olor equivalente a un mililitro, en este caso
fétido, a sangre o a orina pueden es importante recordar que previamente se
indicar algún tipo de contaminación del mismo debe pesar el recipiente de colecta vacío para
y por lo tanto también debe ser desechado. descontar el peso.

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Preparación de Dosis Seminales

Valoración
microscópica

Motilidad

Se pone una pequeña gota de semen en una


lámina debidamente atemperada a unos
38-39ºC, y se cubre con la laminilla, se lleva
al microscopio a mínimo 40 aumentos, la
evaluación debe hacerse por duplicado,
estandarizando en lo posible el tamaño de la
muestra y la laminilla (laminilla de 20x20 mm
o 24x24 mm).

Encuentre material
audiovisual en
8 el aula virtual
Para la calificación de la motilidad en masa se toma una escala de
presente o ausente, asignando la calificación de motilidad en masa
ausente a la muestra que no presente ondas y motilidad en masa
presente cuando las ondas se mueven rápidamente formado
remolinos. La observación de la muestra se puede hacer tomando
como calificación una escala de 0 a 5 de la siguiente manera:

Motilidad tipo 0: Espermatozoides inmóviles

Motilidad tipo 1: Espermatozoides con motilidad no


progresiva (giran sobre sí mismos o se mueven pero
no avanzan).

Motilidad tipo 2: Espermatozoides con movimientos


sinuosos y lentos.

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Motilidad tipo 3: Espermatozoides con motilidad


progresiva lenta, con una velocidad de progresión
equivalente a la mitad de una cola de distancia por
segundo.
Tipo 3
Motilidad tipo 4: Espermatozoides con motilidad
progresiva rápida, equivalente a una cola por segundo.

Motilidad tipo 5: Espermatozoides con motilidad


progresiva muy rápida equivalente a más de una cola
por segundo.

Tipo 4

Se recomienda no utilizar eyaculados


que no tengan por lo menos una
motilidad tipo 4

Tipo 5
Segundos
1 2 3 4 5 6

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Morfología

Espermatozoide normal

Pieza media Cabeza

Acromosoma

Cola

La evaluación de las formas anormales debe En la cola incluso se considera anormal la presencia
incluir una observación precisa de todo el de gotas citoplasmáticas, más aun si estas se
espermatozoide evaluando la cabeza, la pieza encuentran muy cercanas a la cabeza en cuyo caso
media y la cola. Se considera anormal un podrían estar indicando un alto grado de inmadurez
espermatozoide que muestre algún tipo de espermática. El porcentaje de espermatozoides
alteración en cualquiera de estos tres segmentos. normales debe estar por encima del 75%.

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Morfoanomalías

Es necesario realizar la evaluación por


duplicado, el primer paso es hacer la
extensión de la muestra sobre porta 45°
objetos debidamente limpio con papel
secante, se extiende una gota pequeña de
semen en un ángulo de 45º con otro porta
objetos y arrastrando por un segundo en el
sentido que muestra la gráfica.

1 segundo

Las muestras extendidas se dejan secar a temperatura


ambiente, teniendo en cuenta que de esta manera se puede
producir la expansión de las cabezas de los espermatozoides
inmaduros y la pérdida de la gota citoplasmática
osmóticamente sensible.
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Proceder a alguno de los siguientes métodos de tinción:

Tinta China: poner una gota pequeña de semen con una


gota de tinta china en un portaobjetos, mezclar y hacer la Sin embargo, la manera más sencilla
extensión tal como se explicó anteriormente, dejar secar y de evaluar la morfología seminal es
examinar. Este es un método útil para la observación de realizando la observación al mismo
morfología del acrosoma. tiempo que se realiza el conteo en la
cámara de Burker, en todo caso, lo
Solución de eosina-nigrosina: sobre el portaobjetos se más indicado realizarlo en muestras
pone una gota de semen y una gota de la solución de pareadas (2 muestras por eyaculado).
eosina-nigrosina y se hace la extensión. Luego de 1-2 min se
observan los espermatozoides sobre el fondo oscuro. Es
necesario observar al menos 100 espermatozoides para
determinar así el porcentaje de células espermáticas
morfológicamente normales.

Ejemplo:

cabeza desintegrada
Anormalidades
cabeza piriforme

cabeza achatada

cabeza alargada
de cabeza
cabeza afilada

cabeza suelta
macrocéfalo
microcéfalo

bicéfalo
normal

Se pueden presentar otras anormalidades.

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Preparación de Dosis Seminales

Aglutinación

La evaluación de la aglutinación se realiza


sobre la misma muestra de motilidad. Se
determina el grado de acúmulos o de
aglomeración de los espermatozoides en
escala de 0 a +++ (siendo el + para las

inserción abaxial
filiforme
normal

engrosado

flexionado

gotita proximal
muestras con poca aglutinación y el +++
Ejemplo: para las muestras muy aglutinadas).
Anormalidades
de cuello o
pieza media

Muestra

doble
normal

corta

angulada

enrollada

retorcida

en látigo
gotita distal
de semen
Ejemplo:
Anormalidades
de cola La aglutinación generalmente se
relaciona con contaminación seminal,
en estos casos es conveniente evaluar
el estado de limpieza del laboratorio y
de los elementos usados en el
Se pueden presentar otras anormalidades. procesamiento seminal.
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Aglutinación + Aglutinación ++ Aglutinación +++

Tabla N. 1 Calificación de la aglutinación en muestras seminales

AGLUTINACIONES CARACTERÍSTICAS CALIFICACIÓN

Poca Menos de 2 aglutinaciones por campo +

Media Entre 3 y 5 aglutinaciones por campo ++

Alta Más de 5 aglutinaciones por campo +++

Tomado de: El libro de la inseminación artificial en el cerdo, 1994

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Preparación de Dosis Seminales

Test de Eosina Nigrosina

Vitalidad Mezclar 10 g de Nigrosina en 100 ml de solución


Eosina, a continuación se poner a hervir, se filtra,
Las pruebas de vitalidad se fundamentan sobre el se dejar enfriar y se guarda en recipiente de vidrio.
principio que los espermatozoides vivos cuentan
con una membrana plasmática funcional y en
buen estado la cual no permite el paso de
colorantes no permeables, estos solo pueden
ingresar al interior de la célula espermática si esta
no se encuentra íntegra. En este sentido, cuando
se realiza la coloración con algún tipo de tinción
aquellos espermatozoides que se observan sin
teñir son tomados como espermatozoides vivos.

En contraste, en el caso de los test


hipoosmóticos las membranas en
funcionamiento permiten el paso de la
sustancia captando agua del medio e
hinchándose lo que como consecuencia
ocasiona un enrollamiento o rizamiento
de la cola.

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Se mezclan 0,5 ml de semen con 0,5 ml de la solución preparada,
se esperan 30 segundos y se hace una extensión en dos
portaobjetos para analizar por duplicado, se dejan secar las
muestras y se observan a 100X y se evalúan al menos 100
espermatozoides en cada lámina para obtener el porcentaje de Eosina +
espermatozoides vivos. Nigrosina

Ejemplo:
100 espermatozoides en total
15 espermatozoides muertos

Por regla de tres simple:


(15 x 100)/100

Semen + 15% de espermatozoides muertos


Solución
preparada

Muertos
Vivos
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Preparación de Dosis Seminales

Test hipoosmótico

Mezclar 9 gr de fructosa anhidra y 4,9 gr de


citrato de sodio en un litro de agua destilada,
acto seguido se mezcla 1 ml de la solución
hipoosmótica y 0,1 ml de semen. Se mezclan y
se dejan 30 minutos en baño maría a 37ºC, se
deposita una gota de la preparación entre porta y
cubreobjetos y se observa al microscopio a 100x,
se cuentan al menos 100 espermatozoides, estos
se consideran muertos cuando no hay
hinchamiento de la membrana y el flagelo o cola
queda sin entorchar, se consideran vivos cuando
hay hinchamiento de la membrana y en
consecuencia el flagelo se enrolla sobre sí mismo y
se observa doblado, entorchado o rizado.

El rizamiento de la cola indica que


el espermatozoide está vivo
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Muertos

Vivos
37°C
30 minutos

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Preparación de Dosis Seminales

Método de recuento espermático


con cámara de Burker
Concentración
1

Después de realizar los pasos Para preparar la solución de conteo se puede


anteriormente descritos se procede a seguir la siguiente fórmula:
verificar la concentración de
espermatozoides en el eyaculado total Cloruro de sodio (sal común) 9gr
con el fin de obtener la cantidad de Formol (40% de pureza) 3gr
dosis posibles a preparar. Es necesario Agua destilada 1000ml
aclarar que este paso solo se lleva a
cabo si el eyaculado cumplió con los
estándares mínimos establecidos en las Se mezclan 99 mililitros de
evaluaciones de motilidad, morfología, solución de conteo y se le
aglutinación y vitalidad. adiciona 1ml del eyaculado
previamente homogenizado
Uno de los métodos más sencillos y para realizar una solución total
exactos para la evaluación de la de 100 ml. (Dilución 1/100).
concentración de espermatozoides es 1 ml
su determinación mediante cámara de eyaculado

recuento.

99 ml
solución
de conteo
20
Tanto la muestra como la solución idealmente
deben ser tomadas con micropipeta, en este paso
es fundamental que tanto la medición de la
muestra como la de solución sea exacta para
disminuir el riesgo de error. Se realiza una dilución
con dos muestras por separado para realizar
conteos pareados (2 conteos), si los conteos
muestran error se debe preparar una solución
nueva para realizar otro conteo pareado.

Se homogeniza muy bien


mezclando perfectamente la
preparación y se deposita una
pequeña gota entre la cámara
y el cubre objetos dejando
que el retículo de la cámara
sea llenado por capilaridad. Se
montan ambos retículos de la
cámara cada uno con una de
las diluciones preparadas
anteriormente.

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Preparación de Dosis Seminales

0,05 mm
3

0,2 mm
Se ubica la cuadrícula de la cámara con
el microscopio en campo claro a 10X y

0,2 mm
enseguida a 40X, se localizan los

1 mm
cuadrados pequeños.

0,05 mm
0,2 mm
Técnica

1
Contar los espermatozoides que hay en 40
cuadrados pequeños de izquierda a derecha y
luego de derecha a izquierda según la técnica
presentada en la gráfica, se deben contar
únicamente los espermatozoides cuya cabeza se
encuentra completamente dentro del cuadrado y
aquellos ubicados en el borde superior y la línea
Retícula de conteo,
derecha, no se cuentan los ubicados en la línea
vista de cuadrados inferior o en el borde izquierdo.
pequeños
22
1.
01 02 03 04 05 06 07 08 09
02 Espermatozoides a contar.

1 mm
01 Espermatozoides fuera
18 17 16 15 14 13 12 11 10
de conteo.

19 20

2.

0,05 mm
02 Espermatozoides a contar.

1 mm
01 Espermatozoides fuera
de conteo. 40

3.

0,2 mm
01 Espermatozoides a contar.

1 mm
02 Espermatozoides fuera
de conteo.

2
Una vez contados los espermatozoides en 40
cuadros de cada una de las dos retículas de la cámara Estos cuadros

se debe evaluar la validez del resultado: Se calcula la


40 no se deben
suma y diferencia de los dos contajes y se compara
contar
con la tabla N. 2 que recoge el intervalo de confianza
del 95% para diferencias entre dos contajes.
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Preparación de Dosis Seminales
DIFERENCIA DIFERENCIA
SUMA SUMA
ACEPTABLE ACEPTABLE

Tabla N. 2 Tabla de diferencia 35-40 12 227-242 30


aceptable entre dos conteos con 41-47 13 243-258 31
un intervalo de confianza del 95%
48-54 14 259-274 32

Mayores diferencias sugieren: error de dilución, 55-62 15 275-292 33


error de contaje, o mala homogenización de los
63-70 16 293-309 34
espermatozoides en la dilución y por lo tanto el
conteo no será válido debiendo repetir el 71-79 17 310-328 35
proceso desde el punto número 1.
80-89 18 329-346 36
90-98 19 347-366 37
Dilución 1 Dilución 2 99-109 20 367-385 38
1ª 2ª 1ª 2ª
Conteo Retícula Retícula Retícula Retícula 110-120 21 386-406 39
37 19 34 36
121-131 22 407-426 40
Sumatoria
conteo 56 70
132-143 23 427-448 41
Diferencia 15 16
aceptable
144-156 24 449-470 42
Diferencia
encontrada 18 2
157-169 25 471-492 43
Concepto No valido Valido
170-182 26 493-515 44
183-196 27 516-538 45
197-211 28 539-562 46
Tomado de: Manual de laboratorio
para el análisis de semen, 2012 212-226 29 563-587 47
24
3
Tan pronto como se realiza un conteo pareado valido
se procede a realizar el cálculo de la concentración
espermática, para el conteo se toma el promedio de Como se cuentan 40 cuadrados pequeños
ambas retículas. Para el ejemplo serían validos los dos con un área de 0,0025 mm2 cada uno, y se
últimos conteos, entonces se promedian. hace una dilución de 1/100 entonces será:

34 + 36/2 = 35
spz x 1000
Espermatozoides ml =
De manera general la formula usada para determinar (0,0025 x 40) × 0,1 × (1 / 100)
el número de espermatozoides en cualquier cámara
de conteo es la siguiente:
spz x 1000
Espermatozoides ml =
spz x D 0,1 × 0,1 × 0,01
Celulas por cm3 =
SxAxF
De manera abreviada se puede realizar de la
siguiente manera siempre y cuando no se
altere ninguna de las variables de la formula,
Dónde: deberá ser realizada la dilución y el conteo
de los cuadros exactamente como se
spz= Número de espermatozoides contados en
explicó anteriormente:
promedio de ambas retículas.
D = Para pasar a ml spz x V
S = Superficie empleada en mm2 Cantidad de pajillas =
A = Profundidad de la cámara C
F = Factor de dilución
V = Volumen de eyaculado incluyendo el
diluyente usado para el recipiente de colecta.
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Preparación de Dosis Seminales

Tabla N. 3 Ejemplo de ajuste por anomalías espermáticas

EJEMPLO: PORCENTAJE
ESPERMATOZOIDES POR DOSIS
Concentración abreviada DE ANOMALÍAS ESPERMÁTICAS
Por ejemplo para sacar dosis de 3.000
millones de espermatozoides se usara el
Hasta 10% 3000 millones (106) por dosis
número 300:

35 × 200 Hasta 20% 3500 millones (106) por dosis


Cantidad de pajillas =
300
Tomado de: El cálculo del número de dosis y volumen de diluyente, (N.D).

Lo que significa que de este eyaculado se pueden


obtener 23 pajillas con un contenido aproximado a Calentar a 37ºC un litro de agua destilada
de 3000 millones de espermatozoides cada una, en un recipiente estéril.
para obtener pajillas de 100 ml se multiplica 23 x b Disolver el diluyente en el agua y
100, lo que e igual a 2300 ml. Por lo tanto, homogenizar la mezcla.
teniendo en cuenta que ya se tienen 200 ml del
c Mantener en el baño María a 37º C.
eyaculado se completa con 2.100 ml de diluyente.

Para la preparación del diluyente se debe hacer Es aconsejable contar con mínimo un litro de
según las recomendaciones del fabricante, en diluyente preparado al menos una hora antes
términos generales se siguen los siguientes pasos: de la preparación de las pajillas.

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Preparación
de pajillas

Después de determinar el número de Lo más adecuado es tomar el semen


pajillas a obtener se diluye el semen en necesario para las diferentes pruebas y
la cantidad de diluyente necesaria, mezclar el eyaculado rápidamente en un
siempre se debe verificar y ajustar la litro de diluyente o hacer una dilución 1:1,
temperatura del diluyente a la (100ml de eyaculado: 100 ml de diluyente),
temperatura del semen, por ejemplo si tan pronto se tengan los resultados de
la temperatura del semen es de 36°C en concentración y pajillas a obtener se agrega
ese momento a esa temperatura debe el diluyente restante teniendo especial
encontrarse el diluyente. Se adiciona el cuidado que ambas preparaciones se
semen al diluyente en forma suave por encuentren a temperaturas iguales.
las paredes de la bolsa y se homogeniza.

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Preparación de Dosis Seminales

El resultado final de la dilución A continuación se empaca en bolsas o


debe estar idealmente entre 1/10 botellas sin dejar cámaras de aire y se tapa
y 1/15 refiriéndose a la relación perfectamente, por último se marcan las
entre eyaculado y diluyente: 1 dosis y se introducen inmediatamente a la
parte de eyaculado por 10 a 15 nevera de conservación.
partes de diluyente.

Conservación
seminal
Para asegurar la viabilidad de las dosis seminales
estas deben permanecer almacenadas en nevera
especializada a una temperatura de 16ºC sin
permitir variaciones superiores a 1ºC, por lo tanto,
se debe medir la temperatura con un termómetro
de altas y bajas por lo menos dos veces al día
(mañana y tarde).

28
Tenga en cuenta

Lleve registro de la colecta del macho así


como de su desempeño, esto le puede ser útil
para correlacionar con los resultados
reproductivos de su granja.

Adicionalmente, es conveniente homogenizar el


contenido de las dosis seminales al menos una vez al
día, con el objetivo de disminuir el riesgo de
aglutinación seminal por precipitación de los
espermatozoides.

Antes utilizar las pajillas esta indicado evaluar su


motilidad para verificar la viabilidad del contenido al
momento de ser utilizadas.

No se deben utilizar pajillas que no tengan buena


motilidad al momento de la evalución o aquellas que
excedan el tiempo de duración según el diluyente
utilizado, tampoco se deben utilizar pajillas que no
han mantenido la temperatura de conservación
adecuadas o que no han sido homogenizadas
periódicamente como ya se mencionó.
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BIBLIOGRAFÍA

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Díez Monforte. Carmen. (n.d.). Análisis del semen bovino. dosis y volumen de diluyente.
Información Ganadera, 2.
CRÉDITOS
AUTORES

ASOCIACIÓN PORKCOLOMBIA - Adriana Peña Sanabria


FONDO NACIONAL DE LA PORCICULTURA Coordinadora Fortalecimiento Empresarial

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Presidente Ejecutivo

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