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    CAPITULO 5S REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES DURANTE EL DESARROLLO DE LAS PLANTAS| Hace unos 35 atios se demostré que células extraidas de una planta dife- renciada y cultivadas en condiciones adecuadas eran, en al menos algunos casos, capaces de dividirse y regenerarse para producir un nuevo individuo completo, Actualmente esto se puede conseguir con células y protoplastos aislados de diferentes especies de plantas, aunque muchas plantas dicotiledé- neas todavia presentan problemas. La regeneracion de plantas a partir de élulas aisladas demuestra claramente que muchas eélulas permanecen toti- Potentes, ¢s decir que contienen toda la informaciGn genética necesaria para Ja especificacién del organismo, aunque normalmente sdlo se expresa parte de ella. De esto se desprende que el desarrollo y la diferenciacién implican el Control selectivo de la expresin génica. Recientes estudios con sondas mole- culares confirman este enfoque. Si deseamos comprender el desarrollo debe- mos desvelar las bases moleculares de esta expresin diferencial de los genes. La regeneracisn de plantas a partir de cultivo de tejidos y su conversién en luna planta entera estén regulados, al menos en parte, por una o varias de las ‘cinco hormonas o grupos de hormonas més importantes: auxinas, giberelinas, citoquininas, dcido abscidico y etileno, Estos procesos estén también influen- ciados por factores ambientaies tales como el tipo de lz, Iongitud del dia, gravedad, temperatura, cic. Actualmente existen pruebas claras de que las, respucstas a estas sefiales también suponen cambios en la expresién génica. Por consiguiente, si quéremos resolver los problemas asociados con el desa- rrollo de las plantas tenemos que considerar los mecanismos de recepeién de {estas sefiales y 1os pasos intermedios en los mecanismos de su traduccién, ast ‘como también los efectos wltimos sobre la expresién génica. En la primera parte de este Capitulo expondremos algunos principios sgencrales de la regulacién génica en plantas, antes de entrar a discutir algunos ‘ejemplos en fases concretas del ciclo de vida. Més informacién sobre Ia regulacién del desarrollo y regulacién ambiental se puede encontrar en las referencias citadas en ol epigrafe «lecturas adicionales» S.L Regulacién diferencial de la expresién génica La expresin génica se puede regular en vatios pasos entre los que se 103 104 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS incluyen la disponibitidad de ADN para la transcripcién, el propio proceso de transcripcién, la maduracién, transporte y estabilidad del ARNm, la traduc- cin y ol transporte post-traduccional 0 modificaciGn de la proteina producto. ‘También se sabe que la expresi6n génica esté influenciada por la disponibili dad de cofactores y metabolites y por la vida media de los ARNm especificos y de las protefnas. Hasta hace poco era dificil medir con precision cualquiera de estos procesos; asf, durante mucho tiempo se discutié vehementemente la importancia que los procesos de expresién génica tenfan en los cambios en el desarrollo. La llegada de nuevas técnicas ha hecho posible demostrar que los, modelos de expresién génica pueden cambiar en cuestién de minutos en respuesta a estfmulos especificos, Mas importante atin, la disponibilidad de clones ADNe para ARNm especiticos permite aislar los correspondientes ‘genes a partir de genotecas y desvelar su estructura. Un aspecto muy positivo que al menos parte de ia informacién implicada en la regulacién de la expresién génica se encuentra, en general, dentro 0 cerca de los mismos genes. Esto se ha confirmado por medio de experimentos en los que se han transferido, por técnicas de ingenierfa genética (Capftulo 9), genes enteros de plantas, incluyendo las secuencias flanqueantes en los extremos 3'y 5', a otras plantas, observéndose que mantienen una regulacidn normal durante el desa- rollo (Goldberg, 1986), Por medio de estudios que implican la expresién de genes con secuencias, especificas delecionadas in vitro, se ha visto que las cajas TATA, y a veces las caja’ CAAT, son necesarias para la transcripcin (Capitulo 2). Tales sefales estin presentes en todos los genes, tanto si se expresan constitutiva- mente como si muestran regulaciGn diferencial. Sin embargo, existen otras sefiales que controlan el nivel 0 el momento de la expresién de genes concre- 10s. Por ejemplo, los elementos de secuencias ADN llamados «activadores» pueden inducir altos niveles de expresisn génica. En el gen de la octopina sintetasa (o¢s) de Agrobacterium tumefaciens (ver Capitulo 7), que normal- ‘mente ¢s de expresién constitutiva en células de plantas, existe una secuencia de 14 pares de bases responsable del incremento de la transcripcién (Ellis e¢ al, 1987), La secuencia activadora de oes es ACGTAAGCGCTTACGT y se encuentra entre los nuclestidos -193 y -178 a partir del comienzo de ia transcripci6n de los. genes ocs, El activador ocs es una secuencia palindromi- ‘ca y esto parece ser importante para su funcién, ya que la inscrcién de una se- ‘cuencia de cuatro pares de bases en el centro suprime la capacidad activado- ra, Ademiés, la mitad de la secuencia palindrémica es inefectiva en la estimu- lacién de la transcripcién, Otro aspecto importante de este activador es que su cfectividad es marcadamente reducida cuando se inerementa la distancia entre él y el comienzo de la transcripcién, determinado por la caja TATA. Para los genes regulados durante el desarrollo hay otros tipos de sefiales en el ADN que actiian en cis y que estimulan 0 reprimen la expresién en REQULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 105 situaciones especificas del desarrollo, Como otras secuencias control del ADN, funcionan por interaccién con factores proteicos que actian en trans y stn codificados por genes localizados en el genoma. Estos factores recono- cen y enlazan secuencias control que actiian en cis y que bien directa 0 indirectamente regulan la transcripcin de los genes adyacentes. Laevidencia disponible de estudios realizados sobre un niimero de genes de plantas relativamente pequefio indica que los elementos reguladores que actian en cis pueden encontrarse en la mayor parte de los sitios posibles en un ‘gen, incluyendo el lado 5" de la caja CAAT, entre o en los alrededores de las cajas CAAT y TATA, dentro de intrones o de las regiones codificantes, o en el extremo 3' de los genes (Figura 5.1). Estas sefales incluyen activadores, silenciadores y otros elementos regulatorios especificos para unia fase con. creta en el desarrollo. Muchos genes parecen tener miltiples sefiales de co ‘ol que regulan su expresién, Existen dos estrategias principales para ident ficar tales regiones de control. Una consistiria en la bisqueda de secuencias Potencialmente regulatorias por comparacién con secuencias situadas dentro o cerca de diferentes genes que se sabe que estén regulados de forma similar. Esta estrategia presupone que las secuencias de regiones regulatorias impor- {antes se han conservado durante la evoluci6n. Otra supone el andlisis de las funciones de los supuestos elementos de control mediante el estudio de sus efectos sobre la expresién génica en células de plantas. Esto se realiza a menudo construyendo genes quiméricos que leven un gen chivato (Capitulo 9) unido al supuesto cfemento control de ADN. La expresién de tales genes 4quiméricos se pueden probar bien introduciéndolos en protoplastos mediante €1 uso de polietiléngticol o por electroporacisn (Capitulo 9), 0 bien por genera- ci6n de plantas transgénicas en las que los genes estén incorporados de forma estable en los cromosomas (Capitulo 9). CoAT Taran ah 2 Figura 8.1 Localizacin de seales de note gion que actian en cig. Bn negro se representa un hipotéico gen que contiene un initén, conjantemente con las senales de inicio de fa trnscripsion (CAAT, TATAA) y Ia sefial de poliadenilacién (AATAA). El tcomicnzo de la transcripein tient lugar poco despues de la caja TATAA. Los recusdos fn blanco representan sitios para secuencias de control en el ADN que actian en cis. Estas incluyen activadores que funcionan en una u ora orientacién (Ia, 1b), slenciado- Fes que producen disminucién de laregulacién en algunos tipos de céluls (2), secuencias cajas CAAT G) 0 TATAA (4), dentro do la regién codificante (5), dentro de n (6), Oen el exttemo 3" del gen (3). 106 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS Se pueden seguir diversos métodos para el aistamiento de factores protei- Cos que actiian en trans y que se creen estan implicados en la activacién de la transcripci6n, Estos métodos, que dependen todos de la deteccién de la union de protefnas a secuencias especificas de ADN, incluyen (i) reardamiento del ‘movimiento de los fragmentos de ADN durante la electroforésis en geles de ‘garosa, (ii) retenci6n de los complejos ADN-proteinas en filtros de membra. ‘as, (i) proteccién de las secuencias especificas de ADN frente al ataque de hucleasas después de su unién a proteinas, (iv) cromatografia de protefnas utilizando secuencias de ADN inmovilizado como una matriz de afinidad. El mejor procedimiento para caracterizarios es estudiar sus efectos sobre Ia ‘wanscripcin in vitro, aunque la metodologia para este estudio, utilizande ‘extractos de plantas, esta todavia en vias de desarrollo, 5.2 Desarrollo y germinacién de las semillas Las semillas cultivadas por su valor alimenticio contienen generalmente grandes camtidades de hidratos de carbono de reserva, proteinas y otras clases de productos de reserva, Las protefnas son particularmente importan- {es dado su papel en nutrici6n humana y animal (Capitulo 9) yen la medida en dive pueden afectar a elaboraciGa de alimentos, por ejemplo en panaderia y en cerveceria. En legumninosas, que fijan nitrégeno atmosférico (Capitulo 6), cl 20-40% del peso seco de Ia semilla es proteina, mientras que en cereales este componente slo representa del 7-16%. En semillas de guisantes, aproxi- madamente el 80% de esta proteina es el resultado de In acumulacign de los Productos de cerca de 20 genes. Las protefnas de reserva de las semillas se sintetizan como protetnas Precursoras con un péptido seital N-terminal que les permite entrar en el reticulo endoplasmico, Dentro del sistema membranoso son procesadas (Capitulo 2) antes de ser depositadas en los cuerpos protcicos unidos a ‘membranas procedentes del reticulo endoplésmico o de Ia vacuola, En semi las de leguminosas, las protefnas de reserva se acumulan predominantemen. te en los abultados cotiledones del embri6n, micntras que en los cereales se acumulan principalmente en el endospermo. Los genes de las principales roteinas de reserva, tales como las vicilinas y leguminas de guisantes, las hordefnas de cebada, gliadinas del trigo y ze(nas de matz (Capitulo 2) se sintetizan nicamente durante el desarrollo de las semillas. Estas protefnas ‘os suministran, por tanto, buenos ejemplos de genes regulados estrictamente durante el desarrollo, En Ia Figura 5.2 se ilustran las fases del desarrollo de los cotiledones del Suisante, El periodo de mayor acumulaci6n de proteina tiene lugar entre los 10 ¥ 20 dias después de la floracién, durante una fase de ripido crecimiento celular. En este momento las elulas delos cotledones leganaserpoliploides REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 107 Y por tanto se incrementa el mimero de genes de protetnas de reserva por élula. No existe sin embargo amplificacidn selectiva de genes especificos. Durante el periodo de maxima velocidad de deposicién, hasta el 50% del ARNm celular puede estar implicado en la sfntesis ce proteinas de reserva. La vicilina empieza a acumularse antes que la legumina y hay varios tipos de genes para cada protefna. La determinacién de las cantidades relativas de ARNms de vicilina y legumina demuestra que existe una buena correlacién entre la concentracién de ARNm y la sintesis de protefnas especificas duran- te Ja fase principal de deposicién de protefna. Los experimentos de transcrip- in continua con mcieos aislados, que miden el nimero de moléculas de ARNm primario que se transcriben, indican que el principal factor determi- nante de la concentracién de ARNms para las proteinas de reserva es la velocidad de transcripcién de los genes correspondientes (Gatehouse et al, 1986). Sin embargo, la relacién entre el contenido de ARNm y la sintesis de protefna disminuye durante la desecacién de las semillas, momento en el que se para la sintesis de protefnas, aunque él ARNm de legumina se mantiene a un alto nivel (Figura 5.2). Estimaciones similares realizadas para granos de ‘cereales indican que la produccién de sus proteinas de reserva también implica la tegulacidn de la transcripcin de los genes correspondientes. ‘Sc han identificado varias sccuencias de ADN conservado en las regio- ‘nes anteriores a los genes que codifican las proteinas de reserva de las cour Dread —} Frown wera od 6rd WY ‘wroanes sod Bu) N= YSN Ce1ce of Bu) eee cons rr Dias despues oe a feractn Figura 52 Cambios en Ia cantidad de ADN, ARN, proteina, y ARNm de vicilina y Jegumina durante el desarrollo de los cotledones de semillas de guisantes, Modificado de Spencer y Higgins (1982), y Gatehouse etal. (1986). 108 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS semillas (Kreis et al, 1985; Casey y Domoney, 1987), incluyendo una caja «icllina» y una caja «legumina» (ver Gatehouse etal, 1986), En laregulacion de Ia expresion de estos genes pueden estar implicadas una o mas de esas secuencias. Por ejemplo, a 300 pares de bases antes del codén ATG de los genes de la c-gliadina del trigo y B-hordeina de la cebada existe una secuencia ATGTAAAGTGAATAAG. Una secuencia similar a ésta se repite en una egin anterior. Ademés, antes de la caja TATA de todos los genes de zefna del maiz también se encuentra una secuencia conscrvada de 15 pares de bases, CACATGTGTAAAGGT, que tiene caracteristicas parecidas. Estas seflales se parecen a la regién central de la secuencia activadora TGTGG 6 de virus y de animales. Aunque no se ha comprobado todavi dlrectamente su funcién en plantas, experimentos recientes sugieren que pueden tener importancia regulatoria. Se ha identificado un factor proteico del Imicleo del endospermo del maiz que se une espectticameate a una regién de 22 pares de bases de un gen zeina del maiz, localizada entre 339 y 318 nucle6tidos antes del punto de iniciacién de la transcripciGn, Esta secuencia estd conservada en otros genes de zeinas y contiene 14 de los 15 nucledtidos de la secuencia de! gen de zefna del maiz. mencionada anteriormente. En all menos un caso la Secuencia esté asociada con una region de ADN que potencialmente pudiera formar una estructura tipo horquilla (Maier et al, 1087). Obviamente, es necesario tcalizar investigacién adicional para aclarar ¢l Papel de esta secuencia y del factor proteico en la regulacién de la expre- sin de los genes de las zefnas. Endospa Sestanas oe resava Figura $3 Movlizncion de as susancias de reserva en gas de cha. La snes 9 sectecin del Sido ibercco por el exces scl eaten te set ata ee és dea cape de urna a snccr 7 Sepoar casinos Hach een is susancia le resre acm ene entree, iy ah REQULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 109 La principal sustancia de reserva en los cereales es el almidén, que se ‘acuta en os amiloplasios de ls o€tulas del endosperm durante el llenado del grano. La calidad y cantidad del almidén producido son factores importan- tes para determinar el rendimiento y la bondad de los cereales para ciertos tipos de elaboracién de alimentos. El almidén, las proteinas y otras reservas acumuladas en el endospermo son utilizadas por el embrién en crecimiento durante la germinacién, El proceso de movilizacién de las reservas se ha ‘studiado en varios eereales, concretamente en cebada donde es importante para el malteado, Cuando el grano de cebada se embebe en agua (Figura 5.3) se desarrolla ripidamente una actividad metabslica en las células del embrién y en la capa de aleurona (pero no en el endospermo, ue en esta fase esté en rep0s0). A los ocos dias es bastante notoria la movilizacion de las reservas acumuladas y el endospermo llega a licuarse parcialmente. Por cortes transversales del en- dospermo a diferentes tiempos después de la imbibicién se demuestra que los procesos de solubilizacién comienzan en el exterior, en asociacién con les élules de la capa de aleurona, y van progresando hacia el interior. No se produce solubilizacién si se extrac el embridn en una fase inicial dela imbibi- cin, Estas observaciones llevaron ala conclusién de que un factor estimulan- te dfusible se desplaza desde el embrién a la capa de aleurona, Este factor seha idemificado quimicamente como scido giberélica (GA,). GA, una de Jas aproximadamente 80 giberelinas (GAs) que se encuentran en la naturale- a, muchas de Tas cuales tienen importantes efectos sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas. Actualmente se piensa que GA, y GA, pueden estar activas en la capa de aleurona. GA, es sintetizada por el escutelo poco después de la imbibicién, y se ha estudiado su papel en la movilizacidn de las reservas del grano de cebada utilizando capas de alcurona aisladas. Las células de la aleurona son pequefias, tienen paredes gruesas y un citoplasma densamente empaquetado. En cebada, la capa de aleurona tiene tun grosor oquivalente a tres células y se puede aislar del resto del grano. Las GAs tienen dos efectos separados sobre la capas de aleurona aisladas: ‘riginan la produccidn de nuevos enzimas hidroliicos y también contribuyen al establecimiento de mecanismos para la secrecién y liberacién de enzimas preexistentes y nuevas al exterior de las células. La incubacidn en agua de las capas de aleurona conduce a la produccién de diferentes enzimas hidroliticas entre las que se incluyen la fosfatasa dcida, B-1,3 glucanasa y ribonucleasa. La adicién de GA da lugar a la liberaciGn de estas enzimas de las células y también ala produccién y liberacién de c-amilasas y proteasas. Todas estas ‘enzimas son sintetizados de novo durante la germinacién, pero tinicamente la «-amilasa y la proteasa necesitan la presencia del dcido giberclico Un aspecto de la accisn de GA en relacién con la secrecién de enzimas es la considerable sintesis de reticulo endoplésmico inducida por la hormona, Symi UNIVERSITARIO. WV piiidteion 10 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS Esto se asocia con el incremento en la sintesis de membranas, formacién de ‘uerpos de Golgi y estimulacién de Ia formacion de polirribosomas. Las GAs también promueve la sintesis de ARNms que contienen poli(A), entre ellos los ‘que codifican para c-amilasa. Higgins et al.(1976) estudiaron la aparicién de ARNm traducible para c-amilasa en respuesta a GA, por inmunoprecipita- i6n de las protefnas sintetizadas in vitro, wilizando wn anticuerpo especifico de c-amilasa (Figura 5.4). Recientemente se han medido los niveles de ARNm de a-amilasa por hibridaci6n de sondas de ADNe con ARN de capas de aleurona resuelto en geles de agarosa por el método de transferencia de Norther. La mayor sensibilidad de esta técnica demuestra que el ARN de la -amilasa aparece una hora después de aplicar GA, a las capas de aleurona Y continda incrementandose con el tiempo. También se ha demostrado que Ia aparicién de ARNm es debida a regulacidn transcripcional. Si se afade ciclo- hheximida al tiempo que GAs se evita la aparicién de ARNm, lo que sugiere {que hay un requerimiento de sintesis proteica para poder fabricar el mensaje- ro de c-amilasa. Curiosamente, se puede inducir por desecacién la respuesta 8 GAs en las capas de alcurona de granos inmaduros, pero solamente alrede~ dor de 20 dias después de la antesis. Esto indica que la capacidad de respuesta allas giberelinas se desarrolla en este momento. Eltamafio del producto de traduccién in vitro del ARNm de la c-amilasa de cebada sugiere que ésta enzima es sintetizada como una proteina precursora, 4 a ft : Is # a8 Ae Tempo (hte) do tetas en 620 hereto Figura 54 Efecto del écido giberélico en a acumulacién de ARNm de c-amilassy en la velocidad de sintesis de c-amilasa en capas aisladas de aleuconas de cebada, Reprodiucido de Higgins et al. (1976). REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DEGENES 11 Jo que también se ha sugerido para el trigo (Boston er al, 1982). Aunque la enzima se encuentra asociada in vivo con el reticulo endoplésmico, los deta- Hes de su transporte no estén claros. Una de ls dilicultades es que la enzima os secretada de las células de Ia aleurona y probablemente después atraviesa Jas membranas del amiloplasto en el endespermo, Se conocen diversas isoenzimas de c-amilasa y pueden dividirse en dos srupos en base a su punto isoeléetrico y a su reaceisn con anticuerpos. En trgo, existen tres familias de_ genes de c-amilasas en los cromosomas del grupo 5 (Amy 3), del grupo 6 (Amy 1) y del grupo 7 (Amy 2), respectivamen- te, Slo existe un tipo de gen Amy 3, que tnicamente se expresa en grancs en desarrollo, mientras que los miembros de las familias Amy 1 y 2se expresan preferencialmente en respuesta a GA. Las comparaciones entre las secucn- cas no han aportado ninguna luz sobre Ia existencia de secuencias conserva- das en las regiones de los genes anteriores al extremo 5° que pudieran ser regiones de control actvas en cis (Baulcombe et al, 1986). 5.3 Efecto de la luz sobre la sintesis de proteinas de los cloroplastos Durante la germinacin de las semillas y el crecimiento de las hojas en la oscuridad, los protoplestidios incrementan marcadamente su tamaiio y se transforman en etioplastos que tienen varios micrometros de longitud y que contienen gran cantidad de membranas internas, incluyendo un caracteriti- co cuerpo prolametar formado por un sistema paracristalino de tibulos. Los etioplastos conticnen frecuentemente enzimas implicadas en la fijacién y metabolismo del CO, y algunas de las protefnas normalmente encontradas en Jos filacoides de los cloroplastos. Con una o dos excepciones, carecen de clorofila y de algunos otros componentes necesarios para la fotosintesis, y {inicamente adquicren la capacidad fotosintética después de una exposicién a Ja luz. Las respuestas de los etioplastos a la luz son complejas y parece que estén involucrados ch ellas varios fotorreceptores, entre los que se incluyen la protoclorofilaa, que es un precursor de laclorofila un receptor de luzazul y el Pigmento fotoconvertible fitocromo, que responde a la irradiacion con luz roja, xp, 660mm). Esta respuesta puede ser suprimida sila irradiacién va seguida poco después por un pulso de luz de la zona roja lejana del especttO Ou, 730nm).. Laestructura del fitocromo de pléntulas ctioladas de avena se ha inferido apartirde la secuencia de aminodcidos deducida de los correspondientes clo- ‘nes ADNe (ver Quail et al, 1986). Se piensa que es un dimero de forma alargada constituido por dos polipéptidos de peso molecular 124,000, cada uno de los cuales consta de una regién N-terminal globular de peso molecular 74,000 que lleva un croméforo tetrapirrol lineal en la cisteina 321. Se cree que los dos monémeros interaccionan por los extremos C-terminales de los poli- 12 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS Péptidos. La irradiacién con luz roja o rojalejana provoca un cambio confor- ‘macional que convierte Ia molécula de la forma Pr (absorbe luz a 660nm) ala forma Pir (absorbe luz a 730nm). Se cree que el Pfr producido por irradiacién 2.660nm ¢s la forma activa del fitocromo. Datos recientes indican que existen ‘al menos dos tipos de fitocromos. Una forma, que se encuentra predominante- mente en tejido ctiolado, se degrada répidamente después de lailuminacin y una nueva forma, eodificada por un gen distinto, se acumula en Ia luz. No se ‘conocen los mecanismos de transmisién de las sefales de la transduccién que permiten ligar a Pircon la expresisn génica. Sin embargo, se ha sugerido, que los fitocromos tienen una actividad protefna quinasa y es posible que la accién de los fitocromos conlleve la fosforilacion de las proteinas reguladoras, El cambio estructural més claro que tiene lugar tras la iluminacién es la dispersién del cuerpo prolamclar de los etioplastos y un incremento en la cantidad de membranas tilacoidales. Se forman répidamente pequeiias canti- dades de clorofila a por la fotorreduccisn estimulada de la protoclorofilidaa a lorofflida « catalizada por la enzima del tilacoide NADPH-protoclorofilida oxidorreductasa, que en la mayoria de las plantas requiere luz para reducir sus sustratos. La clorofilida a producida se esterfica antes de su reduccién con geranil geraniol para producir 1a cadena lateral fitol de la clorofila a. La fotoactivacién del fitocromo produce la estimulacién de la via fotosintética de Ja clorofila y también la acumulacién de proteinas que se unen a la clorofila (Cab) Tras un periodo de varias horas, durante el que se sintetiza més material de membrana, los tilacoides forman grana y se desarrolla Ia ultraes- ‘ructura tipica del cloroplasto y la actividad bioguimica. Durante este proceso, al menos dos protefnas de los tilacoides disminuyen en cantidad y aparecen ‘muchas otras. La sintesis de la rubisco, de otras enzimas del ciclo de Calvin y de ciertas proteinas de los tilacoides son también estimuladas por la luz, aunque algunas de ellas estén presentes en pequeias cantidades en la oscuridad, La Iuz afécta a la expresién de los genes tanto en el nicleo como en los Plastidios. A este respecto ha sido particularmente bien estudiado el gen psb A ue codifica para la proteina Q,, que se une a Ja atrazina, de peso molecular 32.000 (Capitulo 3), Inicialmente, se encontrd que existia un gran ineremento cn la cantidad de transcritos psb A cuando se transferfan a la luz plantas tioladas de especies tales como mafz, espinaca, mostaza y guisantes, El efecto estimulatorio de ta luz, que parece ser debido principalmente a la ‘aetivacién del sistema citocromo aunque en algunas plantas también intervie Reel receptor azul, fue tan dramético que psb A fue inicialmente denomina- do «fotogen» (Bogorad, 1983). La proteina se sintetiza a altas velocidades en 4a luz pero no se acumula en grandes cantidades debido a que tiene una alta velocidad de reciclaje, Se cree que esto es originado por dafios praducidos en l polipéptidoipar fojniphibigién. Otros genes cuyos transcritos se acumulan ape tree REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 113 en la luz son rbc L, atp A, B,E, H, psa A,, A, y psb B, D (Link, 1988). Sin embargo, muchos de estos ARNm se sintetizan también en la oscuridad, y el alcance de Ia activacién por la luz depende de la fase del desarrollo de las, plantas en el momento de la iluminacién y puede estar influenciada por facto- res tales como el niimero de plastidios por células, el ntimero de copias del plastoma por plastidio y la velocidad de divisidn y expansin de las eélulas de Jas hojas. El consenso general es que aunque puedan ocurrir cambios consi- derables en la concentracién de algunos ARNm en respuesta a la luz, estos son transitorios. Normalmente, la velocidad de transcripcién de los genes de los cloroplastos solamente se incrementa de dos a tres veces después de la iluminaciGn, lo que és insuficiente para explicar la diferencias observadas en Ja acumulacidn de proteinas especiticas de los cloroplastos en ia luz y en la oscuridad. Por ello, se cree que tanto las velocidades de degradacién de los ARNm como el control de la traduccién del ARNm y la velocidad de reciclaje de protefnas espectficas (Capftulo 3) juegan un importante papel en el desa- rrollo de los cloroplastos en la luz. Laluz, que acta principalmente mediante el sistema fitocromo pero que a veces también lo hace a través del fotorreceptor azul, tiene en algunas plantas, una influencia decisiva en la expresin de genes nucleares para las proteinas del cloroplasto, Se han estudiado particularmente bien las proteinas del com- plejo I, las clorofilas a/b (Cab) y la subunidad pequeita de la rubisco (rbcS), y Se sabe que ambos polipéptidos estén codificados por pequefias familias rultigénicas. ‘Aunque la rubisco es sintetizada frecuentemente por plantas que crecen en la oscuridad y se acumula en los etioplastos, su sintesis es estimulada por la luz. En algunas plantas, principalmente en guisantes, la luz estimula drastica- ‘mente la sintesis de la rubisco, Se han usado sondas de ADN para estimar la actividad transcripcional de genes rbc $ en nicleos de guisantes aisiados de plantas etioladas, antes y después de la iluminacién. Los resultados indican que la velocidad de transcripcisn de los genes rbc $ es de 18 veces més alta después de la exposicién ala luz, mientras que tinicamente es de dos veces en Jos genes ARNr (Gallagher y Ellis, 1982). Esto demuestra la existencia de un fuerte efecto selectivo de la luz sobre la estimulacién de los genes de trans- cripcién de rbc S, Recientemente se han estudiado con més detalle los cinco ‘miembros de la familia génica rbc S de guisantes. Aunque los genes tienen secuencias codificantes muy similares, sus transcritos muestran divergencias suficientes en las regiones 3' no traducidas como para ser distinguidos por hibridacién usando sondas especificas de cada gen, Los genes rbc S-3A y rbe S-3C son expresadlos a altos niveles en hojas verdes y representan el 40% y el 34% del ARNm total de rbc S, respectivamente. Un destello de luz roja stimula la acumulacién de transcritos de los genes 3A y 3C en hojas etioladas, ye mucho menos efecto sobre los genes rbc S-E9 y rbc S-8,0.En hojas wstiTuTo UntvERSITARIO OE LA PAL BIBLIOTECA 114 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS or 1559p + 5309 1 ane Contd rettva de ARM ep x 10°) Sino leno Temso ors) desputs de tetamiono Figura 5.5 Efectos de Ia luz en la acumulaci6n de ARNm para las proteins (Cab) que se unen a clorofila a/b en el complejo antena Il de hojas de plintulas de echada crecidas en a oscuridad. La traccion de ARNm fue porificada, traducida in vitro, y los productos dde Ia traduccidn de ARNm de Cab se precipitaron con un anticverpo especifico, La acumulacién de los ARNm es activa por la luz roja y e efecto es parcalmente revertido por la luz de la zona lejana de especiro. Reproducido de Ape! (1973), madurés, el receptor de luz azul también parece ser importante en la regula- i6n de los gones de transcripcién de rbe S (Nagy et al, 1986). En hojas ctioladas de plantas, ef nivet de ARNm para las protetias Cab recolectoras de luz del complejo IT es muy bajo. Este ARNm se acumula répidamente en respuesta ala fotoactivacion del sistema fitocromo por la luz roja Figura 5.5 y Apel, 1979), Curiosamente, los genes Cab son mucho més sensiblesa la luz que los genes rbc S, necesitindose una intensidad de luz. oja 1.000 veces mas baja para estimular la acumulacién de ARNm (ver Nagy et al, 1986). Se ha demostrado por experimentos de traduccién continua que el incremento en la concentracién se debe, en parte, a un incremento en la transcripciGn, Mas recientemente se ha visto que la transeripcién de los genes Cab en el trigo sigue un ritmo diumo, con picos de actividad en la luz y muy ppoca sintesis de ARNms en la oscuridad. El hecho de que la actividad cfclica de los genes Cab persista tanto en oscuridad total como con luz continua indica que la transeripci6n esta influenciada por un ritmo endégeno. Los productos de la traduecién in vitro de los Cab tienen pesos molecul 1es comprendidos entre 29.000 y 32.000, mas grandes que Ins protefnas ‘maduras en 4.000 a 6.000 daltons. Igual que en la subunidad pequefia de Ia tubisco, Los aminodcidos adicionales funcionan como un péptido guia para el REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 115, transporte de la proteinaa través de la envoltura del plastidio. También existe uuna Secuencia polipeptidica adicional para el transporte selectivo a os tlacoi- des. Aunque los ARNm aparecen después de la exposiciOn a la luz, las prote(nas de la antena no se acumulan a menos que tenga lugar la sfntesis de clorofila; en ausencia de clorofila estas protefnas son inestables y se degra- dan, Siempre que la clorofila esté presente, las protefnas se insertan en los tilacoides, donde se combinan con laclorofila a yb. Las regiones N-terminales de las protefnas Cab estén expuestas en la superficie exterior de la membrana del tilacoide, de cara al estroma, Los residuos treonina de esta regién de las. prote(nas Cab se pueden fostorilar por una proteina quinasa activada por laluz y desfosforilar por una fosfatasa. Ambas enzimas estén presentes en los loroplastos y su actividad esté modulada por el estado redox de la plastoqui- noma, Se cree que la fotofasforilacién reversible de las diferentes protefnas Cab controla la distribucién de energéa luminica entre los fotosistemas I y I, optimizando asi el rendimiento cuéntico fotosintético (Bennett, 1983), Tam- bign se cree que la carga de las proteinas Cab fosforiladas disminuyen el ‘empaquetamiento de 10s tilacoides y la asociacién del complejo antena I con 1 fotosistema II (ver Anderson, 1986). Mediante experimentos que implican el uso de plantas transgénicas se han identificado secuencias ADN activas en cis que controlan la expresién specifica de los genes rbc Sy Cab en la luz 0 en determinados érganos. Morelli e¢ al,(1985) utilizaron et gen rbc E9 de guisante, que contiene una secuencia ADN de 1.052 pares de bases anterior a la regiGn eodificante, y 10 transfirieron a células de petunia mediante el plasmido Ti de Agrobacterium ‘tumefaciens (Capitulo 9). Los genes transferidos mostraron expresién induci- da por la luz en cultivo de callos de petunia. Examinando la expresién de diversos mutantes por delecién en el extremo Si, se demostré que una secuen- cia de 33 pares de bases, situada entre la caja TATA y el sitio de inicio de la ‘raducci6n, era importante para la expresidn regulada por la luz. Ademés, la transcripeién fue estimulada por una secuencia de ADN localizada entre las Posiciones -1.052y -352a partir del inicio dela ranscripcién, Los estudios con plantas transgénicas regeneradas de tabaco pusieron de manifiesto la exis- tencia de diferentes secuencias activas en cis. Se encontré por ejemplo que luna secuencia de 410 pares de bases de rbc S-3A, anterior al extremo 5', era suficiente para obtener expresién inducida por luz roja y azul en hojas de plantas regeneradas. Para el gen rbc S-E9, hast6 una regién de 352 pares de bases precediiendo al extremo 5' (Nagy et al., 1986). En una serie posterior de experimentos se analiz6 la eapacidad de diversos fragmentos de estas regio- nes para dirigir la expresiGn fotorregulada de la enzima cloranfenicol acetil transferasa de bacterias en plantas transgénicas de tabaco, y se encontré que una regin comprendida entre -410 y +15 en el gen rbc S-3A estaba implicada en el proceso, Se demostré que las secuencias de -327 a ~48 conferian sensi- bilidad a los fitocromos y expresién especttica en BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS ma seqooqy SET] SSENAY Uo: 298 seo] Uoo sepeustsap ST 189 uaoid as anb sepeas09 5 [pp § owanxe qe opadsor ‘paoaid anb wot: REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 117 secuencias ADN en esta regién tienen dos caracteristicas importantes; (I) se parecen a los activadores en que pueden funcionar en cualquier orientacion; i) contienen secuencias internas silenciadoras que reprimen la expresion ‘génica en rafces. La comparacién de las secuencias ADN de estas regiones en los genes rbc S-3A y E9 condujo a la identificaciGn de cuatro secuencias, conservadas 0 cajas (ademés de la caja TATA) que se piensa contienen clementos sensibles a la luz (LREs), necesarios para la correcta expresidn de los genes rbc S (Nagy et al, 1986). En trabajos posteriores, Green et al, (2987) identificaron en néduios de guisantes, mediante ensayos de retarda- miento de geles y experimentos de proteccidn frente @ nucleasas, un factor proteico, Hamado GT-1, que se une a supuestas secuencias regulatorias que preceden al gen rbc S-3A (Figura 5.6). Las dos secuencias que se unen a GT- Lestén también repetidas en una regién més anterior y contienen residuos G ‘cuya importancia para la interacci6n con la protefna ha sido establecida. La protefna GT-1 esta presente en hojas de guisantes crecidas en la oscuridad y cen la luz. Por ello, para que pueda regular la expresiGn génica tiene que ser modificada después de la traduecisn o inactivada estéricamente por medio de su unin a otro factor. Estos resultados no dehen interpretarse en el sentido de que todas las secuencias regulatorias se encuentran en el extremo 5’ en genes rbc S. En un estudio sobre los genes rbc $ de la familia de las petunias se ha demostrado que dos de los ocho genes implicados muestran diferentes niveles de expre- si6n, exhibiendo unos niveles de ARNm 100 veces mas grandes que otros. Ea petunia, los experimentos con plantas transgénicas que contienen genes qui- éricos indican que ciertas secuencias posteriores al codén de terminacién de la sintesis de proteina son responsables de esa expresién diferencial. No std claro todavia si esto se debe a un efecto sobre la transcripeién 0 a diferencias en la estabilidad del ARNm. Por meclio de experimentos que implican la expresién de construcciones quiméricas de genes Cab en plantas transgénicas se han delimitado también ciontas regiones que contienen clementos supuestamente reguladores que actian en cis. Utilizando un gen Cab-1 de trigo, Nagy et al. (1987) idemtifica- ron una secuencia activadora de 268 pares de bases, localizada entre las posiciones -357 y -89 a partir del comienzo de la transcripeiGn, que conferta regulaci6n fitocrSmica. Se obtuvo expresion a intensidades muy bajas de luz, y el efecto fue reversible con luz de la zona roja lejana del espectro. Los andlisis de delecién en el extremo S' demostraron que se puede prescindir de la sccuoncia CAAT para la expresién regulada por fitocromo. Curiosament, no existe una homologia clara entre los LREs de los genes rc $ y Cab, Esto sugiere que los dos genes pueden estar regulados por distintos factores acti- vos en trans, 1o cual concuerda con el hecho de que sean necesarias diferen- tes intensidades de luz roja para estimular la acumulacién de ARNm. 118 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS 5.4 Etileno, senescencia y maduracién del fruto El eileno juega un iniportante papel en la activacién de procesos tales como la senescencia de la hojas y pétalos de las flores, caida de hojas y lores cen zonas de abscisién y en la maduracién de algunos frutos. Una primera interpretacion de la senescencia y maduraci6n es que se trataba de un proce- 0 degradativo ocasionado por una ruptura del sistema de organizaciGn celu- lar, Se ereia que este proceso conduefa ala liberacién de enzimas hidroliticas que destrufan la célula catalizando su autolisis. Sin embargo, la existencia de ‘mutaciones que interfieren con el proceso de maduracién pone claramente de ‘manifiesto que en el proceso esta implicada la expresidn de genes espectficos. ‘Sin lugar a dudas, hoy en dia es obvio que durante la maduracién y senescen- cia de los érganos se sintetizan ARNms que codifican para enzimas respon sables de cambios en el desarrollo. La maduracién de los frutos climatéricos « probablemente el proceso mejor entendido a nivel molecular. Los frutos se clasifican como «climatéricos» 0 no «climat 10s», depen- diendo de su comportamiento respiratorio durante la maduraci6n. En frutos (exer oe role) lorotte Poigatctrensse ° ' 1° 5 2 Figura 5.7 Algunos de los cambios que tienen lugar durante la maduraeién del frto del romate REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 119 r len metioninn —adencxil—tvicido I-aminoci-be oy, hi malonin g coprpane teat | ‘alice pei aminotivi i cea sce tiga roricmacen,Aghab RECEPTOR | 1 Sess fe ARN Figura §.8 Papel del etileno en la estimulacin de la maduracisn. El etileno es sinttizado a pani de la S-adenosil metionina por la ACC sinttasa (que es inhibida por Ja amino ctoxivnilglicna) y a «enzima que formal etileno» (ACC oxidasa), El etleno stimula su propia sintesis y tambien promueve la maduracin mediante la seumulacign {de ARNm especificos. El norbornadieno y la Ag*inhiben la madiuraciéa, inerfirienco bien on el mecanismo de deteeciéa del etleno o con el mecanismo de respuesta al mismo. limatéricos tales como manzanas, pers, pitenos y tomates, el primer indicio de la maduracién esun incremento en la produccisn de didxido de carbono y en lasintesis de etileno (Figura 5.7). Por otro lado los frutos no climatéricos, tales como naranjas, limones, uvas y fresas, no muestran un ineremento significativo de la respiracién durante la maduraci6n, Existe todavia cierto ‘desacucrdo acerca desi la respiracin ola produccisn de eleno se ineremen- ta en primer lugar en los frutos climatéricos. Esta discrepancia se explica posiblemente por las dificultades en medir pequefios cambios en la produe- cin de gas en drganos voluminosos. Sin embargo, experimentos recientes on tomates demuestran que se_ produce un incremento en la sintesis natural de etileno antes de larespiracin climatética. Ademés, la aplicacién de etleno 8 diversos teidos de plantas puede originar un incremento en la respitacién, mientras que los compucstos quimicos que inhiben la sintesis de etileno (p.. aminoetoxivinil glicina) 0 su deteccisn por las planta (p.c. Ag’, norbornadie- no) retrasan o limitan la maduracién, En la Figura 5.8 se representa un esque- made la viade sintesis de elileno y un bosquejo de su papel en la estimulacion de la expresién génica. La iniciacién de la sintesis de etileno durante la aduracién y senescencia puede ser debida a la sintesis de ARNms y de polipéptidos para las dos enzimas de la ruta, ACC sintetasa y ACC oxidasa, aunque esto no es todavia seguro. Una vez iniciada, la sintesis de etileno es autocatalitca. Sin embargo, no ha sido purificado el receptor propuesto, y el ‘mecanismo que une la deteccién y la expresién génica no se ha investigado 120 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS ‘con detenimiento. El papel crucial que juega el etileno en la activaci6n de los, Proceso de maduracién y senescencia se pone de manifiesto por la importan- cca que tiene el control de su sintesis y acumuulacién durante el almacenaje de los frutos y hortalizas, y en flores cortadas. El etileno es utilizado comercial- ‘mente para madurar platanos, que son recolectados y transportados inmadu- 10s, y la Ag*, que es un inhibidor del proceso de deteccién de etileno por las plantas, es utilizado para prolongar la vida del clavel y de otras flores en jarrones, Durante Ia maduracién del fruto del tomate se ha estudiado la expresién de varios genes que implican alteraciones importantes en la bioquimica y en la , i i. i 1 od : il i it : i Sonnet tans : il wee i ae a ee pues Te as Figura 5.9 Produccién anormal de ARNm de poligalacturonasa en frutos mtantes rin y frutas normales después del tratamiento con Ag’. En (A), se muestra la acamulaciGn de ARNm de poligalacturonasa y de enzima en frutos normales yen frutos mutantes rin La scala de tiempos para los cambios de ls estados de maduracion 2 a 6 fue apcoximada- ‘mente dos semanas para los frutos normales y cuatro meses para los frat rin. (Repro ducido de Grierson er al. 1987a). En (B), los fratos normales correspondientes 2 los ‘stados 3-4 de (A) se trataron bien con triosulfato de Agr o de Na‘, 7 los ARNm de Poligalacturonasa se midievon a lo largo de un periodo de cinco dias. Datos de los experimentos realizados por K.M. Davies. REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 121. fisiologiaen ausencia de division o expansién celular. Los cambios que tienen lugar afectan a todos los compartimentos celulares ¢ incluyen un incremento de la respiracién, un reblandecimiento de las paredes celulares, la sintesis de ‘compuestos que contribuyen al sabor yal aroma y la conversién de cloroplas- {os en cromoplastos (Figura 5.7). La produccién de cromoplastos implica la degradacién de clorofila y almidén y el desmantetamiento de los tilacoides, y ‘sta asociada con un descenso en la expresin de los genes que codifican cenzimas fotosintéticas. Se han aislado clones de ADNe para 19 ARNms que ‘aparecen por primera vez o aumentan considerablemente en cantidad duran- tela maduracién. Por secuenciacin de la protefna producto y del ADN se ha ‘demostrado que uno de estos genes codifica para la poligalacturonasa, princi- pal enzima responsable del reblandecimiento de la pared (Grierson er al, 1986), Se presume que los otros ARNm codifican enzimas importantes para otros aspectos del proceso de maduracién. La poligacturonasa (PG) existe en tres formas isoenvimaticas inmunolbg a y estructuralmente relacionadas. PG esta ausente en frutas verdes y es sintetizada de novo durante la maduracidn, El mutante «Neverripe» (Nr) que se ablanda lentamente, produce mucho menos PG de lo normal y el mutante rin (debido a una mutacién en el cromosoma 5) solamente produce trazas de la enzima (Figura 5.9) y muestra escaso reblandecimiento. Se ha demostrado que las isoenzimas PG purificadas degradan las paredes celulares de la fruta verde madurada in vitro y 1a enzima parece jugar un papel en la degradacién de a fraccién de pectina de la pared celular durante el reblandecimiento. Durante la meduracién normal, a sfntesis de PG es prevedida por la produc- ciGn de etileno, y el tratamiento de fruta no madura con etileno induce cambios en la maduracién, incluyendo la sintesis de PG. Hasta ahora solamente se ha encontrado un gen para PG. (Figura 2.6), lo que sugiere que puedan producir- se diversos isoenzimas por diferentes modificaciones post-traduccionales del mismo polipéptido. Un mapeo preliminar basado en estudios de polimorfismo de longitudes de tragmentos de restriccién sugiere que el gen PG esta locali- zado en el cromosoma 10. La secuenciacién de ADNe y de clones genémicos indica que PGse sintetizainicialmente como un polipéptido precursor, con una presecuencia de 71 aminodcidos que puede estar implicada en su transporte y secrecién a través de 1a membrana plasmitica al interior de la pared celular (Grierson et ai, 1986). El etileno produce incrementos masivos de varios ARNm relacionados con la maduracién. Esta acumulacidn de mensajeros tiene lugar antes de que los cambios de la maduracién se hagan visibles y es consistente con la idea de que los ARNm producen la maduracién (Grierson et al, 1987a). Se ha estima- do que el incremento en la concentracién de ARNm de PG durante la madu- raciGn es del orden de 1.000 veces (Della Penna et al, 1986). Sin embargo, la cantidad de ARNm de PG encontrada en el mutante rin es aproximadamente 122 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS 100 veces menor que el nivel normal (Figura 5.9), loque explicala ausencia de ablandamiento. La hibridacin de filtros con ADN gendmico con ADNc de PG indica que el mutante rin contiene el gen PG pero no lo expresa a niveles altos. Esto es consistente con la sugerencia de que rin es una mutacién en el aparato regulatorio que normalmente activa el gen PG (Della Penna et al, 1987); Grierson et al,, 1987b). La localizacién de PGen el cromosoma 10y de Ja mutacién rin en el cromosoma 5 es consistente con la idea de que la lesion implica un factor que actia en trans, pero no se sabe si la mutacién afecta a una proteina que se une a ADN. Aunque el ARNm de PG se acumala en frutas verdes maduradas tratadas con etileno, la respuesta no es tan répida ‘como os lade otros ARNm (Lincoln eral., 1987). Scha sugerido que ARNm de PG no responde directamente a etileno sino que se necesitan otros pasos intermedios para provocar la respuesta. Otra posibilidad es que tenga lugar la produceiéa de algunos ARNm a concentraciones muy bajas de etileno, mien- tras que se necesiten niveles altos para estimular la aparicién de otros. Una explicacién basada en diferencias én la sensibilidad al etileno recuerda el control de la expresién génica por fitocromo, donde se necesitan intensidades de luz roja_mucho més bajas para estimular la transcripciGn de Cab que las, que son necesarias para la transcripcién los genes rbc S (Seccién 5.3), Sin embargo parece que la deteccién de etileno por la planta es necesaria para la produccién continuada de ARNm de PG puesto que la aplicacién de Ag” después de que haya comenzado la maduracién origina la desaparicién de este mensajero (Figura 5.9). Recientemente se ha demostrado en el fruto de plantas transgénicas de tomate (Bird et al, 1988) que un fragmento de 1.450 pares de bases de la regidn S' del gen que codificaa PG puede dirigirlasintesis, de un gen informador CAT (Capitulo 9). Esto significa que las sefiales de control activas en cis para la expresién especifica de la maduracién estén localizadas dentro de esta regién ADN. 5.5 Respuesta al estrés Estrés anaerdbico Cuando se inundan, las rafees de las plantas sufren una disminucién en la concentracién de oxfgeno que puede conducir ala anaerobiésis. Esta situa cién se puede reproducir en el laboratorio transfiriendo las plantas @ una almésfera de N, que contenga poco o nada de oxfgeno. En estas condiciones se induce una respuesta caracteristica de estrés, dando lugar a larepresién de Ja sintesis normal de protefnas y a la acumulacién de unas 20 «protefnas anaerSbicas». Durante la fase iniial de la respuesta se acumulan provisional ‘mente cuatro polipéptidos con peso molecular aproximado de 33.000, y luego dismiauyen su concentracin entre las tes y las cinco horas después del comienzo de la anacrobissis. En esta fase, se empiezan a acumular otros 20 polipéptidos que pueden dividirse en dos grupos: un grupo mayoritatio, de REGULACION DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE GENES 123 ‘unos 10 polipéptidos, que representa mas del 70% de la sintesis de protefna ‘otal, y oto grupo constituido por un mimero similar de peque‘ios polipéptidos ‘minoritarios, que represcnta el resto. Muchos de estos polipéptidos anaer6bi- os estin presentes en pequefias cantidades en les rafces durante ¢} creci iento aerébico pero su sintesis es estimulada por bajas concentraciones de oxigeno. Se ha demostrado que varios de ellos son enzimas implicadas en la slicolisis anaerébica, tales como alcohol deshidrogenasa, piruvato decarboxi- lasa, glucosa fosfato isomerasa 1 y fructosa 1,6 bifosfato aldolasa, Su acumu- lacién durante periodos de baja tensién de oxigeno es probablemente una Tespuesta adaptativa para permitira las raices sobrevivir en periods de inun- dacién. Recientemente se ha propuesto que la hemoglobina de las plantas juega un cierto papel en la respuesta anaerSbica detectando las bajas con- centraciones de oxigeno (ver Capitulo 6). Durante las primeras 24 horas de la respuesta anacrdbica se produce un incremento en la concentracién de ARNms que codifican para algunas de las Droteinas anaerébicas. El andlisis de los transcritos sintetizados por nticleos aislados indica que esto implica un incremento de la transcripci6n génica. En maiz, se ha demostrado que la activacién de la transcripcin de dos genes (Adi 1 y Adh 2) es responsable de los altos niveles de sintesis de la alcohol deshidrogenasa. El gon Adi 1 del matz comtiene 10 exones y 9 intrones. Puesto que no es {acl la produccisn de plantas monocotiledéneas transgénicas, Ellis et al. (1987) estudiaron la funcién de las supuestas regiones control en el extremo 5' del gen Adi 1 en tabaco transgénico. Fusionaron un fragmento ADN comprendido entre las posiciones -1.094 a +106 (desde el comienzo de la transcripcién) de este gen con el gen informador de la cloranfenicoltransa- cetilasa (CAT) y, utilizando vectores Ti de Agrobacterium, obtuvieron plan- tas transformadas de tabaco (Capitulo 9). En condiciones anaerSbicas se ob- serv una escasa 0 nula actividad de la enzima CAT en plantas de tabaco lo ‘que sugiere que no se reconocié ninguna secuencia de control anaer6bica. Sin embargo cuando se colocaron secuencias activadoras del gen octopina sinte- {asa (secci6n 5.1), 0 del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, delante del segmento de ADN mencionado se obtuvieron altos niveles de expresion de la proteina CAT en plantas transgénicas de tabaco expuestas a Condiciones anaersbicas. Esto permitié Ia identificacién de una secuencia de unas 247 pares de bases, locatizada justo antes del codén de iniciaci6n de la ttaduccién, que era responsable de la expresién a bajas concentraciones de ox{geno (Ellis etal, 1987), En otros experimentos sc ha estudiado la funcién e las secuencias control del gen Adit 1 mediante la introduccién de genes ‘quiméricos por electroporacién en protoplastos de matz. Utilizando CAT ‘como gen informador también se ha demostrado que el primer intrén del gen Adh 1 del maiz, cuando esta localizado cerca del extremo 5' del transcripto, Puede estimular marcadamente la cantidad de enzima sintetizada en proto Plastos que expresan normalmente el gen Adh 1 Callis et al, 1987), 124 BIOLOGIA MOLECULAR DE LAS PLANTAS Choque térmico La mayoria de los organismos manifiestan una respuesta de estrés térmi- co cuando la temperatura sube 10°C por encima de la temperatura Optima de crecimiento. La respuesta al choque térmico (hs, de

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