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AVANCE PROYECTO SEMETRAL DE INGENIERIA DE LAS REACCIONES

BIOLOGICAS
“DISEÑO DE UN BIOPROCESO”

Laura Marcela Mira Uribe, Mariana Sepúlveda Pérez


lmmirau@unal.edu.co msepulvedap@unal.edu.co

Profesor: Rigorberto Rios Estepa

23 de julio de 2019

Planteamiento del problema

Las vacunas son el mecanismo más eficaz para tratar enfermedades virales, ya que muchas de las
enfermedades que estos provocan no pueden ser tratadas con medicamentos convencionales.
Debido a la creciente demanda de vacunas y a la necesidad de disminuir los tiempos de reacción
en caso de pandemias, se hace necesario llevar el proceso de producción a escala industrial. Para
ello hay que tener inicialmente un proceso de producción en modelo de laboratorio que sea eficaz
y que el resultado obtenido se haya probado en animales y tenga potencial para poder ser probado
en humanos. Luego el reto más grande es proponer un tipo de reactor y de operación que cumpla
con los costos de producción, demanda y calidad del producto.

El Enterovirus 71 causante de las enfermedades de manos, pies y boca (HFMD por sus siglas en
inglés) que afecta comúnmente a niños y que a veces se asocia con enfermedades neuronales
graves como parálisis parecida a la poliomielitis, meningitis, encefalitis de tronco encefálico e
incluso la muerte(C. Y. Wu et al., 2015). En la última década, más de 7 millones de casos de
HFMD y 2713 muertes asociadas se han notificado a nivel mundial, sin embargo para el caso de
la costa asiática pacífica se ha convertido en un problema de salud pública(C. Y. Wu et al., 2015)
.Por este motivo ya se cuenta una nutrida investigación en cuanto a los procesos de laboratorio
para la producción de esta vacuna, es decir ya se han desarrollado y probado vacunas en modelos
animales y en estudios clínicos. Actualmente se están proponiendo las metodologías para llevar
la producción de estas vacunas a nivel industrial y cumplir con la demanda principalmente de la
costa asiática. En este caso se plantea el diseño de un bioproceso para la producción industrial de
dicha vacuna.

Estado del arte

El Enterovirus 71 (EV71) fue descrito por primera vez en 1974 después de ser aislado de pacientes
en California(USA) y se ha asociado con casos esporádicos o brotes de un amplio espectro de
enfermedades, enfermedad de manos, pies y boca (HFMD), herpangina, aséptica meningitis,
encefalitis, ataxia cerebelosa que es un síndrome similar a la poliomielitis y puede ser fatal. Este
virus hace parte de la familia Picornaviridae una familia de virus de ARN de cadena simple de
sentido positivo, a esta misma familia pertenecen el Poliovirus, Coxsackievirus entre otros . El
genoma EV71 codifica una poliproteína larga con un solo marco de lectura abierto seguido de
una cola de PoliA. Los estudios muestran que el virus se ha encontrado en muestras de pacientes
provenientes de garganta en un 93% y en muestras de heces en un 30 % lo que significa que el
contagio se puede dar de forma oral-oral y oral-fecal(Lee & Chang, 2017)(Liu et al., 2011).
Los brotes relacionados con EV71 ocurrieron en Malasia en 1997, Taiwán en 1998 y China en
2008, lo que dio lugar a altas tasas de mortalidad y generó serios problemas de salud pública. En
los últimos años, la mayoría de los brotes en la región del Pacífico occidental son causados por
varios subgenotipos de EV71 (virus B3, B4, B5, C1, C2 y C4)(C. Y. Wu et al., 2015).

El éxito de las vacunas antipoliomielíticas atenuadas e inactivadas en la prevención de la


poliomielitis y la erradicación de los poliovirus indica el potencial de prevención de EV71
mediante la vacunación. El ensayo clínico de la vacuna EV71 inactivada con formalina adyuvada
con hidróxido de aluminio se realizó en respuesta a la epidemia búlgara en 1975, pero los
resultados no se publicaron en revistas internacionales(Lee & Chang, 2017).

Anteriormente se han evaluado varios candidatos para la vacuna de EV71. En 2004 Suh-Chin Wu
en su artículo “Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus
type 71 vaccine development” evalúa el cultivo en un reactor de tanque agitado, de tres líneas
celulares animales en microportadores (microcarrier) con o sin suplementación del medio de
cultivo con suero fetal bovino y su capacidad de producción de partículas virales; estas líneas
celulares fueron Vero, WI-38, y MRC-5. Posteriormente se realizaron pruebas en ratones de las
vacunas usando los virus inactivados producidos por cada línea celular; este estudio concluyó que
la línea celular Vero tienen un cultivo celular estable en los microportadores con o sin suero fetal
bovino en el medio y fue la línea que mejor rendimiento tuvo a la hora de producir partículas
virales y se obtuvo una buena respuesta inmunológica en los ratones(S. C. Wu, Liu, & Lian,
2004).

En 2007 Chia-Chyi Liu propuso la producción de una cepa de EV71 con una alta
inmunogenética usando células Vero en microtransportadores (microcarrier) con y sin
suplementación del medio con suero fetal bovino. Para esto evaluó tres cepas del EV 71 (EV71-
075, EV71-117, y EV71- 1207) y evaluó su inmunogenicidad en ratones. Su estudio concluyó
que la cepa EV71-075 y EV71-117 tienen alta inmunogenicidad mientras que la cepa EV71-
1207 tiene una baja inmunogenicidad, además se afirma que el suero puede ser fácilmente
eliminado del medio de cultivo y así se eliminaría la posibilidad de contaminación con
priones (Liu, Lian, Butler, & Wu, 2007).

Se ha avanzado satisfactoriamente en el desarrollo de dicha vacuna por lo que en 2015 cuando se


publicó “Inactivated Enterovirus 71 Vaccine Produced by 200-L Scale Serum-Free Microcarrier
Bioreactor System Provides Cross-Protective Efficacy in Human SCARB2 Transgenic Mouse”
ya contaba con estudios clínicos de dicha vacuna, por lo que este artículo buscaba principalmente
enfocarse en la posibilidad de producir la vacuna en un reactor de un solo uso de 200 L. Este
estudio concluye que efectivamente es posible producir la vacuna con el EV71 indicativo
cultivando células Vero en microtransportadores y sin suplementar el medio con suero fetal
bovino en un reactor de 200 L y sugieren que se intente en un reactor de 1000 L(C. Y. Wu et al.,
2015).

En 2018 se publicó “Enhancing enterovirus A71 vaccine production yield by microcarrier


profusion bioreactor culture” que propone que el hecho de usar un biorreactor operando en
continuo con perfusión puede reducir el tiempo de producción y dar mejores rendimientos ,sin
embargo no se menciona el volumen del reactor ni se enfoca en su diseño(Liu et al., 2018).

Análisis económico
La demanda de vacunas, varía dependiendo de la velocidad de esparcimiento y la tasa de mutación
del virus, al igual que el tiempo que tarda su producción comparado con el tiempo en el que se
necesitaría la vacuna en caso de una epidemia. Para el caso de las vacunas contra enterovirus 71,
al igual que para el polio, son requeridas de una forma constante, ya que su tasa de mutación no
es tan alta. Sin embargo, a diferencia del polio, que se necesita de forma global y constante, la
vacuna contra EV-71, aunque sí presenta casos en todos los lugares del mundo su incidencia es
mayor en Asia, lo que vuelve a este continente un mercado competente para la distribución del
producto.

Contra la enfermedad de manos pies y boca, que es causada principalmente por el enterovirus 71,
no existe en el mercado alguna vacuna o tratamiento, sin embargo, como forma de prevención en
algunos casos se usan las vacunas para la enfermedad causada por poliovirus, y fue reportado en
la literatura que en Bulgaria, para el año 1975 se desarrolló una vacuna en contra del EV-71, a la
que no se le pudo comprobar su efectividad(2004). Actualmente existen varios estudios que
demuestran que la forma más eficaz de prevenir la enfermedad de manos, pies y boca es a partir
de una vacuna basada en una forma inactiva del virus EV-71. A pesar de los múltiples estudios
no solo sobre la vacuna, sino también sobre su producción a nivel industrial, no se conoce ninguna
empresa que comercialice y desarrolle este producto. En la actualidad la empresa china
Adimmune Corporation, es la que más avances y estudios presenta para el desarrollo de estas
vacunas, sin embargo aún no han alcanzado la etapa de producción y comercialización del
producto todavía (“Adimmune,” n.d.)

Criterios de selección del catalizador

Dado que la producción de vacunas se hace a partir de la infección de una determinada línea
celular con el virus es importante considerar: la madurez de la línea celular antes de la infección,
el mantenimiento de esta y las temperaturas y pH que requieren tanto para el crecimiento previo
y posterior a la infección; es de vital importancia, además tener en cuenta el tipo de vacuna que
se desea realizar, porque cada tipo presenta ventajas y desventajas dependiendo de las
aplicaciones y el tipo de virus a trabajar. También es importante y necesario considerar los
mecanismos y ciclos de infección del virus y su esparcimiento, así como la especificidad con
hospedantes o vectores, ya que esto permite determinar el tipo de células en el que se pueden
replicar. Otro factor importante es el tipo de medio de cultivo en el que crece la línea celular, y la
facilidad que este permita para el proceso Downstream(Gallo-Ramírez, Nikolay, Genzel, &
Reichl, 2015).

Teniendo estas consideraciones en cuenta la línea celular que se utilizara será la línea Vero,
proveniente de líneas celulares establecidas a partir de células de riñón del mono verde africano,
esta línea depende de anclaje en su cultivo por lo que deberán usarse microcarriers, en el reactor
seleccionado. Esta es una linea celular altamente usada en virologia y en la producción de vacunas
contra varias enfermedades como lo son la rabia, la influenza, poliovirus, entre otras. Algunos
estudios respaldan que para el desarrollo de una vacuna en contra de EV-71, estas células son las
que mejor producción tanto intracelular como extracelular presentan, en comparación con otras
líneas usadas para desarrollo de vacunas como lo son la WI-38, y la MR-5 (S. C. Wu et al.,
2004)(Posgrado, 1999).

Metodología
Medio
Se propone usar el medio de cultivo a utilizar es el VP-SFM de Gibco(Liu et al., 2018). En este
medio se cultivarán las células Vero en los microtransportadores (microcarrier), este medio está
libre de suero fetal bovino ya que el hecho de que este no esté presente facilita el proceso
downstream, evita la contaminación con priones y garantiza mayor homogeneidad en los lotes
de producción.
Reactor
Se usará un reactor de perfusión con lecho fluidizado que operara en continuo(ver Anexo 1).
Este será el reactor que se diseñará para cumplir con el requisito de producción de 1 ton/año.

Bibliografía
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Gallo-Ramírez, L. E., Nikolay, A., Genzel, Y., & Reichl, U. (2015). Bioreactor concepts for cell
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Liu, C. C., Lian, W. C., Butler, M., & Wu, S. C. (2007). High immunogenic enterovirus 71
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Liu, C. C., Wu, S. C., Wu, S. R., Lin, H. Y., Guo, M. S., Yung-Chih Hu, A., … Chong, P.
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bioreactor culture. Vaccine, 36(22), 3134–3139.
https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2017.02.042
Posgrado, T. De. (1999). l.
Wu, C. Y., Lin, Y. W., Kuo, C. H., Liu, W. H., Tai, H. F., Pan, C. H., … Chen, J. R. (2015).
Inactivated enterovirus 71 vaccine produced by 200-L scale serum-free microcarrier
bioreactor system provides cross-protective efficacy in human SCARB2 transgenic mouse.
PLoS ONE, 10(8). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136420
Wu, S. C., Liu, C. C., & Lian, W. C. (2004). Optimization of microcarrier cell culture process
for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development. Vaccine, 22(29–30), 3858–
3864. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2004.05.037
Anexos

Imagen 1. Reactor

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