ERITROPOYETINA (EPO):

La eritropoyetina se utiliza en el tratamiento de la anemia asociada con insuficiencia renal crónica en pacientes adultos y
pediátricos en hemodiálisis y en pacientes adultos en diálisis peritoneal.
Al contrario que la insulina, que se obtenía del páncreas de cerdo antes del empleo de insulina recombinante, la EPO no
tuvo un origen tan arcaico. Sólo mediante el aislamiento del gen de la EPO, así como mediante clonación y expresión in
vitro, fue posible producir la hormona en cantidades suficientes para la terapia con la ayuda de procedimientos de
fabricación biotecnológicos.
EPO se produce en Argentina desde 1990 por la compañía Sidus también bajo el nombre de Hemax.
El vehículo de expresión recombinante para la producción de las variantes de Epoetina α y β es en cada caso un subclon
genéticamente modificado de una línea celular del ovario de hámster chino (Cricetulus griseus), llamadas células CHO
(de Chinese Hamster Ovary). Para la producción de la variante de Epoetina-ω se usa una línea celular genéticamente
modificada y subclonada del riñón de hámster dorado sirio (Mesocricetus auratus auratus), conocida como células BHK
(de Baby Hamster Kidney).
Todas las variantes de EPO recombinante difieren de las nativas en la composición de las estructuras de azúcares y
diferencias entre las propias variantes recombinante.

INSULINA:
La insulina es la hormona secretada por el páncreas, cuya actividad principal es la de regular el metabolismo de los
hidratos de carbono y grasas. Se usa para el tratamiento de Diabetes Miellitus.
Las insulinas de tipo recombinante ocupan el 93% de la demanda mundial y se diferencian de las anteriores versiones en
que en vez de obtenerse a partir de bovinos o porcinos, se logra mediante fermentación.
Denver Farma, que es el encargado de producir en el país insulina humana, denominada Densulin, constituyéndose en el
primer establecimiento de América Latina en fabricar ese medicamento.
Denver Farma es una empresa farmacéutica argentina de capitales y técnicos argentinos, con sólida formación científica
y demostrables recursos tecnológicos.

INTERFERON Alfa 2b (IFN 2b):

El interferón alfa es una citoquina de potente actividad inmunomoduladora, antiviral y antiproliferativa. Su complejo
mecanismo de acción involucra a la regulación de la transcripción de genes para distintas proteínas celulares y a la
estimulación de células efectoras del sistema inmune, resultando en una acción antiviral y antitumoral.
A partir de células de origen humano, se aisla el fragmento de ADN que contiene el gen correspondiente para la síntesis
de hu-IFN beta y se clona en un plásmido recombinante capaz de transfectar una línea celular en cultivo.

La construcción genética es integrada al genoma celular permitiendo la expresión de hu-IFNß, que se secreta al medio
extracelular.
El interferón beta humano recombinante así sintetizado, es idéntico en su estructura y funcionalidad al nativo.
En Argentina es producido por Bio Sidus S.A. y Laboratorio Delta Farma S.A.

HORMONA DE CRECIMENTO (hGH):

La hormona de crecimiento es una proteína producida por la glándula hipófisis situada en la cara anterior del cerebro.
Circula en el torrente sanguíneo y tiene efectos en todo el organismo. En ocasiones es llamada somatotropina o
somatotrofina. La hormona de crecimiento utilizada para el tratamiento se denomina somatropina.
Durante muchos años el tratamiento del enanismo hipofisiario fue dificultoso. La única fuente de obtención de hormona
de crecimiento era a partir de glándulas hipofisarias extraídas de cadáveres. Estas primeras producciones de hGH no sólo
eran escasas, sino que tampoco ofrecían seguridad dado su origen extractivo de glándulas cadavéricas.
A mediados de los años 80', la exitosa producción de hGH a partir de organismos genéticamente modificados, como
bacterias o células de mamífero, permitió una amplia disponibilidad de esta proteína que rápidamente se convirtió en el
tratamiento de elección para aquella patología. Desde 1997, aplicando la tecnología de ADN recombinante, Bio Sidus
produce hGH a partir de la fermentación de bacterias que poseen el gen humano para dicha proteína.

FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS (G-CSF):

El G-CSF recombinante (fligastrim, NEUPOGEN) es una glucoproteína producida en Escherichia coli. Aumenta las
funciones fagocíticas y citotóxicas de los neutrófilos. Es eficaz en el tratamiento de neutropenia grave consecutiva a
trasplante de médula ósea y quimioterapia a altas dosis.
En Argentina lo producen los laboratorios Pablo Cassará y Bio Sidus SA.

INTERFERON BETA (IFN ):

El interferón beta en la Esclerosis Múltiple tiene efectos inhibitorios en la proliferación de leucocitos y en la presentación
de antígenos. Además modula la síntesis de citoquinas hacia la producción de las de tipo antiinflamatorio sobre todo a
nivel del SNC.
El Interferón beta 1 a es un interferón glicosilado, producido por tecnología de DNA recombinante por células CHO
(ovario de hamster chino) genéticamente modificado. La secuencia aminoacídica es idéntica a la del interferón beta
natural. El interferón beta 1 b es un interferón no glicosilado producido por tecnología de DNA recombinante por una
cepa de E.Coli. Posee sutiles diferencias estructurales con el interferón.
Biogen Idec Argentina comercializa interferon beta-1a intramuscular. En la actualidad, es el medicamento para la
esclerosis múltiple más prescripto en todo el mundo, con más de 135.000 pacientes en tratamiento, y el primero en ser
aprobado para pacientes que han sufrido un primer brote de esta enfermedad. En nuestro país, Interferon beta-1a IM
fue comercializado anteriormente por Abbott Laboratories S.A.

Nuestros conocimientos moleculares sobre las enfermedades hereditarias son

mucho más recientes. En estas el defecto genético ocasiona la función
anormal de una proteína específica. Con todo el incremento en las
investigaciones que ha ocurrido en los últimos veinte años, ha sido posible el
entendimiento al nivel molecular de muchas enfermedades, incluyendo las no
genéticas. En este sentido la caracterización de ciertas proteínas que
aparentemente faltan o no funcionan correctamente, ha abierto el camino para
una potencial estrategia terapéutica en el tratamiento de algunas
enfermedades en las que estas proteínas juegan un papel importante.

Las nuevas vacunas

En todo el mundo, desde principios de la década de 1980, laboratorios y científicos investigan el desarrollo de nuevas
vacunas que se espera, reemplazarán en un futuro a las tradicionales actualmente empleadas. Estas nuevas vacunas son
producidas por la Ingeniería Genética, basadas en la molécula de DNA y en las secuencias de aminoácidos que contienen
la información genética con la cual el organismo patógeno produce la enfermedad. La primera vacuna recombinante
para uso en humanos fue la vacuna contra la hepatitis B. Actualmente, las investigaciones se centran en mejorar las
vacunas ya existentes para lograr respuestas inmunitarias más eficaces, nuevas vías de administración y en la aplicación
de vacunas combinadas (varias vacunas en una sola dosis) para reducir el número de inyecciones. El descubrimiento y
decodificación de los genomas de bacterias y virus patógeno llevado a cabo en los últimos años, ha abierto una enorme
esperanza en el desarrollo de estas nuevas vacunas. Actualmente existen una gama de protocolos para obtener vacunas.
Así las vacunas con base en la técnica del DNA pueden incluirse en una de las siguientes estrategias:

Vacunas atenuadas: mediante técnicas de Ingeniería Genética, se pueden eliminar los genes de virulencia de un agente
infecciosomanteniendo la habilidad de provocar una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado
genéticamente puede usarse como una vacuna viva sin riesgo a que revierta al tipo virulento. En la actualidad, se
encuentra en fase de ensayos clínicos una vacuna de cepas estables del agente del cólera (Vibrio cholerae). El mismo,
está desprovisto del gen que codifica para su potente enterotoxina que provoca la enfermedad. En el caso de Salmonella
se ha ensayado quitarle ciertos genes que aunque no están relacionados con la virulencia, al desaparecer convierten la
cepa en atenuada (disminución de su virulencia en un millón de veces). Se ha demostrado su efectividad en ovejas,
bovinos, pollos y, más recientemente en humanos.

Vacunas vectores o de organismos recombinantes vivos: estas, utilizan microorganismos no patógenos (virus o
bacterias) a los cuales se les incorporaron, mediante Ingeniería Genética, genes de agentes patógenos que codifican
para los antígenos que desencadenan la respuesta inmune. El virus vacunal es uno de los vectores recombinantes más
utilizados en este tipo de vacunas, ya que tiene un genoma grande, totalmente secuenciado y permite acomodar varios
genes foráneos en su interior. De esta manera, se ha desarrollado una vacuna contra la rabia al insertar en el genoma de
este virus, un gen del virus rábico; este construido provoca la respuesta inmune en el organismo hospedador. También
se han ensayado las expresiones de genes que codifican para antígenos de virus de la hepatitis B, de la gripe y del herpes
simple. Mediante este método, se podrían desarrollar vacunas que inmunicen simultáneamente para varias
enfermedades, al insertar en el virus recombinante varios genes de distintos organismos patógenos al mismo tiempo.

Virus vivos recombinantes: los Paramyxovirus son una familia de virus que incluye agentes de enfermedad comunes
como sarampión, paperas y para influenza. La estructura genómica de estos virus es tal, que se le podrían insertar genes
adicionales que codificasen una amplia variedad de proteínas de fuentes diferentes. Así el virus del sarampión ofrece
varias ventajas como portador de genes que provoquen respuesta inmune contra otras enfermedades al mismo tiempo.
Con tecnologías recombinantes se hace posible extender el rango de enfermedades contra las que una sola cepa
atenuada del virus puede conferir inmunidad.

Vacunas de subunidades: para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, es posible aislar los
genes que codifican para las proteínas que provocan la respuesta inmune (por ejemplo, las proteínas de las cápsides).
Mediante Ingeniería Genética, esos genes se pueden clonar y expresar en huéspedes alternativos tales como bacterias
(Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) o líneas celulares de mamíferos. Luego de insertado el gen de
interés, la bacteria o levadura recombinante comienza a producir subunidades de proteínas en grandes cantidades, las
cuales son recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas. La vacuna contra la hepatitis B fue la primera vacuna
puesta en el mercado producida por este método. Esta vacuna se desarrolló aislando el gen del virus que codifica para el
antígeno HBsAg que provoca respuesta inmune. El gen que produce esta proteína se introdujo por clonación en
plásmidos de expresión de levaduras (S. cerevisiae). Una vez construido, el antígeno se produjeron en grandes
volúmenes en fermentadores industriales y de un modo seguro. En la actualidad, se está avanzando en vacunas de
subunidades frente al virus del herpes simple (HSV), y la fiebre aftosa.

Vacunas de DNA: son las vacunas actualmente en experimental que suscitan mucha expectativa. Estas consisten en
plásmidos en los que se introduce tan solo la pequeña fracción del material genético del patógeno contra el que se
pretende inmunizar (los genes que codifican la producción de uno o varios de sus antígenos). Cuando se inyecta el
plásmido en el músculo o en la piel, este penetra dentro de la célula y llega al núcleo, para comandar desde allí la
producción de los antígenos del patógeno que desencadenarán la respuesta inmune. De esta forma lo que se hace es
trasladar la fábrica de la vacuna a los tejidos de la misma persona. Actualmente, se están realizando ensayos de varias
vacunas de este tipo, para la hepatitis B, la malaria, la gripe, el herpes simple y el SIDA/VIH.

Producción de proteínas recombinantes humanas La recombinación de genes humanos en el ADN de bacterias es una de
las posibilidades que ofrece la biotecnología, y que posibilita obtener proteínas humanas con fines terapéuticos. Por
ejemplo, insulina humana obtenida a partir de la bacteria Escherichia coli. Esta técnica es de gran valor porque las
bacterias se reproducen rápidamente y pueden duplicar su número cada 20 minutos. De esta forma se pueden obtener
en poco tiempo muchas copias del gen humano inserto en el ADN bacteriano, y producir grandes cantidades de
proteínas recombinantes. A escala industrial, la producción de proteínas recombinantes involucra las siguientes etapas:

• Fermentación: las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que contienen un medio de cultivo
nutritivo.

• Extracción: las células son centrifugadas para recuperar las proteínas de su interior.
• Purificación: se separa la proteína recombinante de las otras proteínas bacterianas.

• Formulación: la proteína recombinante es modificada para conseguir una forma estable y estéril que puede
administrarse terapéuticamente.

Cada una de las fases de la elaboración implica un manejo muy cuidadoso de los materiales y un estricto control de
calidad para optimizar la extracción, la pureza, la actividad y la estabilidad del fármaco. Dependiendo del producto y del
tipo de célula utilizada, la producción de proteínas recombinantes puede ser un proceso simple o más complejo. Aunque
la complejidad del proceso aumentaría el costo final del producto, el valor nunca sobrepasará al gasto de aislar el
compuesto desde su fuente original (por ejemplo, obtención de insulina a partir de páncreas de porcinos o bovinos) para
llegar a cantidades medicinales.

Los biofármacos son principalmente proteínas recombinantes. Estas proteínas se obtienen a partir de organismos vivos,
los organismos hospedadores, en los que se ha introducido material genético procedente de otro organismo mediante
técnicas de ADN recombinante, de tal manera que el organismo hospedador o huésped, emplea su maquinaria biológica
para producir la proteína cuya secuencia está codificada en el ADN introducido artificialmente. Tradicionalmente, la
producción de proteínas consistía en el aislamiento y mejora de las propiedades biológicas de proteínas específicas a
partir de diversas fuentes naturales, como por ejemplo animales, plantas o microorganismos, para su posterior
utilización en diversas aplicaciones, terapéuticas o de otra índole. Gracias al avance en las técnicas de ADN
recombinante y al desarrollo de sistemas de expresión de proteínas recombinantes ha sido posible producir grandes
cantidades de proteínas, muchas de las cuales se encuentran en concentraciones muy bajas en su ambiente natural.

De manera análoga a lo que ocurre en el mercado de los fármacos clásicos con el desarrollo de los fármacos genéricos,
cuando los biofármacos de marca pierden su protección industrial debido a la finalización del plazo de protección por
patente, aparecen en el mercado fármacos similares para la misma indicación terapéutica, pero que debido al gran
impacto que la modificación de los métodos de producción pueden tener en la actividad del fármaco, no se denominan
genéricos, sino biosimilares. Estos biofármacos están registrados conforme a lo establecido por las agencias reguladoras
pero tienen un tratamiento particular. Los proveedores del mercado de los biosimilares, en crecimiento y expansión,
necesitan disponer de sistemas biológicos de producción robustos y muy productivos, para competir en coste con los
biofármacos originales.

Los biofármacos son principalmente proteínas recombinantes. Estas proteínas se obtienen a partir de organismos vivos,
los organismos hospedadores, en los que se ha introducido material genético procedente de otro organismo mediante
técnicas de ADN recombinante, de tal manera que el organismo hospedador o huésped, emplea su maquinaria biológica
para producir la proteína cuya secuencia está codificada en el ADN introducido artificialmente. Tradicionalmente, la
producción de proteínas consistía en el aislamiento y mejora de las propiedades biológicas de proteínas específicas a
partir de diversas fuentes naturales, como por ejemplo animales, plantas o microorganismos, para su posterior
utilización en diversas aplicaciones, terapéuticas o de otra índole. Gracias al avance en las técnicas de ADN
recombinante y al desarrollo de sistemas de expresión de proteínas recombinantes ha sido posible producir grandes
cantidades de proteínas, muchas de las cuales se encuentran en concentraciones muy bajas en su ambiente natural.

La expresión de proteínas recombinantes se ha realizado tanto en células procariotas como en células eucariotas, siendo
las primeras las más conocidas y estudiadas. Las células eucariotas más utilizadas a nivel industrial son las levaduras
(Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), los hongos filamentosos (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae), las células de
insecto (Drosophila S2) y las células de mamífero (CHO, HEK, HELA). Las levaduras son fácilmente cultivables en medios
de cultivo económicos y las proteínas que producen presentan un elevado grado de homología respecto a los
organismos superiores. Sin embargo, las glicoproteínas producidas en este huésped disponen de un patrón de
glicosilación diferente al humano, aunque se han realizado avances en la modificación de los patrones de glicosilación de
levaduras para conseguir que produzcan proteínas recombinantes terapéuticas con estructuras glicosiladas similares a
las humanas(1,2). Las células de insecto son útiles para el procesamiento de proteínas complejas, especialmente
glicoproteínas, sin embargo, su patrón de glicosilación difiere respecto a las células de mamífero(3). Finalmente, las
células de mamífero tienen la ventaja de que producen correctamente glicoproteínas humanas bien de forma transitoria
o bien de forma estable, pero el coste de la producción es elevado en comparación con los sistemas procariotas debido
al coste de materiales, a la densidad celular que pueden alcanzar los cultivos y al tiempo de generación celular, ya que
una bacteria se divide más de cincuenta veces en el tiempo en el que una célula de mamífero se divide una vez.

Dentro de los sistemas procariotas, uno de los modelos de expresión más utilizados ha sido Escherichia coli. El éxito
de Escherichia coli se basa principalmente en; i) la facilidad de manipulación del DNA; ii) el elevado número de mutantes
y vectores de expresión disponibles; iii) el amplio conocimiento de la fisiología de la célula, que permite alcanzar
densidades celulares elevadas con un medio de cultivo económico, y; iv) el conocimiento del efecto de la sobreexpresión
de proteínas sobre la bacteria. Sin embargo, Escherichia coli presenta ciertos inconvenientes en la síntesis de proteínas
recombinantes: i) no lleva a cabo procesamientos post-transduccionales propios de células eucariotas, como es el caso
de la glicosilación o fosforilación, lo cual afecta a la estructura, estabilidad, solubilidad y actividad biológica de la
proteína producida; ii) carece de chaperonas (proteínas de plegamiento) adecuadas para permitir un plegamiento
correcto de las proteínas recombinantes; iii) y no forma puentes disulfuro en el citoplasma, salvo en ciertas cepas
mutantes(4).

Para producir proteínas recombinantes en Escherichia coli es necesario que las células dispongan de un mecanismo
capaz de procesar la información genética que codifica para la proteína de interés, bien sea industrial o farmacéutico, y
permitir así producir grandes cantidades de dicha proteína. El conjunto de organismo hospedador y elementos de
procesamiento de la expresión genética para la síntesis proteica recibe el nombre de sistema de expresión.

Sistemas de expresión en Escherichia coli

En general, un sistema de expresión consiste en un conjunto de elementos genéticos configurados de manera óptima
para el control de la transcripción y traducción de las secuencias a expresar(5,6). El sistema de expresión en Escherichia
coli está constituido por dos componentes: una bacteria huésped y un vector de expresión que posee los elementos
génicos necesarios para realizar los procesos de transcripción y traducción en dicha bacteria. Respecto al vector de
expresión es preciso tener en cuenta varios criterios con el fin de obtener una expresión eficiente: el origen de
replicación, que influye en el número máximo de copias del vector de expresión por cada célula, las características de las
secuencias de inicio y final de la transcripción, entre las que se incluyen los promotores y terminadores, las señales de
comienzo de la traducción, como son el codón de inicio de la traducción y los sitios de unión al ribosoma, la localización
subcelular de la proteína que se va a expresar (citoplasma o periplasma) y el control de la segregación plasmídica. En la
segregación plasmídica es de gran importancia el mecanismo de retención del vector en la célula. El mecanismo clásico
para evitar el inconveniente de la segregación es la coexpresión en el vector de un gen codificante para la resistencia a
un marcador de selección, generalmente un antibiótico, de manera que únicamente la células que posean en su interior
el vector serán capaces de propagarse en un medio de cultivo que contenga el marcador de selección. Otro mecanismo
que previene la pérdida del vector y evita el uso de antibióticos es la inclusión en el vector de regiones cromosómicas
que complementen la auxotrofía de una determinada cepa bacteriana(7), es decir, únicamente las células que
contengan el vector serán capaces de crecer en un medio de cultivo que carezca del elemento para el que la cepa es
auxótrofa.

La cepa de Escherichia coli más utilizada en los sistemas de expresión es la BL21, debido a que es defectiva en las
proteasas OmpT y Lon, involucradas en la degradación de proteínas. En función del sistema de expresión empleado, la
cepa puede contener el módulo regulador de la expresión integrado en el cromosoma. En el caso concreto de los
sistemas de expresión pET (Novagen) y pRSET (Invitrogen) la cepa de expresión contiene el ADN del bacteriófago DE3
integrado en el cromosoma. Este bateriófago contiene a su vez el gen codificante de la T7 RNA polimerasa regulado por
el promotor lacUV5 cuya actividad se induce por medio de la adición del inductor IPTG (Isopropyl-?-D-
thiogalactopyranoside). En este sistema, el vector de expresión pET utilizado para la expresión de la secuencia
codificante de la proteína de interés, incorpora una región promotora reconocida por la T7 RNA polimerasa, de manera
que tras la adición del IPTG, la T7 RNA polimerasa expresada desde el cromosoma bacteriano induce la expresión de la
proteína a partir del vector. En el caso de los sistemas pGEX (GE Healthcare), pQE (QIAGEN), pTrc (Invitrogen), pBAD
(Invitrogen) la expresión de las proteínas recombinantes no está supeditada a la presencia de un módulo regulador
integrado en el cromosoma de la bacteria. En estos casos, los elementos reguladores del promotor para la expresión de
proteínas recombinantes están incluidos en el vector, por lo que el mismo vector puede emplearse en combinación con
diferentes cepas.

RESUMEN

En la actualidad la producción de proteínas terapéuticas se ha convertido en uno de los campos de mayor impacto a
nivel científico y biotecnológico. La expresión de proteínas recombinantes en sistemas procariontes, particularmente en
E. coli han permitido el desarrollo de una gran variedad de proteínas terapéuticas. Sin embargo, para poder producir
proteínas funcionales ha sido necesario buscar intensamente un equilibrio entre la calidad y la producción; por lo que es
necesario innovar nuevas estrategias que permitan superar las dificultades inherentes a los sistemas de expresión
procariote, por esto es esencial delimitar los alcances que pueden tener las bacterias más empleadas y aquellas que
podrían representar alternativas prometedoras para la producción de proteínas de interés. La presente revisión
bibliográfica está dirigida a realizar un estudio del estado del arte y de la técnica de los sistemas de expresión de
proteínas heterólogas que existen en torno al empleo de bacterias, con impacto en la industria farmacéutica y
biotecnológica.

INTRODUCCIÓN

El uso de proteínas terapéuticas en el tratamiento de diversas enfermedades crónicas o deficiencias hereditarias, se ha

venido implementando cada vez más en los últimos 30 años.1 Las proteínas terapéuticas son producidas en sistemas
heterólogos mediante tecnología de ADN recombinante. Actualmente, se desarrollan nuevos y mejores sistemas de
expresión, implementando nuevos plásmidos, adición de elementos genéticos del gen adicional y optimización de
codones.2 También se desarrollan cepas mutantes que asimilan nutrientes de forma eficiente, aumentando la
producción de proteínas recombinantes terapéuticas y/o reducen la producción de compuestos tóxicos que afectan su
producción, y se desarrollan procesos de cultivo cada vez más eficiente para producir las proteínas terapéuticas.1
Actualmente, estas proteínas se han convertido rápidamente en productos clave para las industrias farmacéuticas, pues
las ventas globales en el 2007 fueron cercanas a los 79 mil millones de dólares americanos, lo que representa entre el
10% al 15% del mercado de los fármacos; para el 2020 se prevéen ventas de hasta 200 mil millones de dólares
americanos.3 En nuestros días, más de 150 proteínas terapéuticas se encuentran en el mercado y más de 400 se
encuentran en pruebas clínicas, además de muchos otros en desarrollo. Entre las más vendidas se encuentran las
proteínas hematopoyéticas (23%) y los anticuerpos monoclonales (20%). Otras proteínas que tienen también altos
porcentajes de venta son las citocinas (19%), antitrombinas (11%), vacunas (11%), proteínas plasmáticas (6%) e insulina
(5%). Una de cada cuatro drogas introducidas en el mercado es una proteína heteróloga terapéutica, y ese número
tiende a crecer exponencialmente.4 La elección del microorganismo para expresar la proteína de interés depende en
gran medida de las características fisicoquímicas de la proteína a producir, estas células son ampliamente usadas debido
a su rápido crecimiento, baja labilidad al estrés mecánico, altas productividades y escalamiento sencillo.5 Los sistemas
procariontes expresan proteínas solubles o en forma de agregados intracelulares o cuerpos de inclusión, sin
plegamiento, lo que implica su estructuración in vitro. Escherichia coli es uno de los modelos más simples para la
producción de proteínas recombinantes. En el mercado, cerca del 30% de las proteínas terapéuticas «sencillas» son
producidas en E. coli.1 Por otro lado, hay otros sistemas bacterianos diferentes de E. coli que están siendo empleados
como alternativas sustentables que se mencionaran en el desarrollo del texto. En esta revisión se presenta un panorama
general del uso de bacterias como sistemas de expresión de proteínas heterólogas terapéuticas, el mecanismo de
regulación genética más empleado y/o técnica.
Nueva terapia para la regeneración del hueso
Investigadores españoles han desarrollado una estrategia basada en biomateriales y proteínas terapéuticas para
conseguir regenerar los huesos. Los resultados, publicados en Drug Delivery, han sido probados en modelos
experimentales con el fin de potenciar la respuesta reparadora de la proteína morfogenética ósea 2 y aumentar la
tasa de mineralización ósea.
26 marzo 2018 10:29

Científicos del Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA) de la Universidad de Navarra y del Centro de
Investigación Biomédica de Canarias, adscrito a la Universidad de La
La proteína BMP2 recombinante
Laguna, han desarrollado una nueva estrategia basada en biomateriales y
humana es capaz de estimular la
proteínas terapéuticas que regenera el hueso para casos con grandes
producción de hueso; actualmente se
pérdidas de masa ósea.
utiliza en cirugía ortopédica y
El  trabajo demuestra que la metaloproteinasa 10 (MMP10) acelera la traumatología en EE UU
regeneración del hueso en modelos experimentales, al potenciar la
respuesta reparadora de la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) y
aumentar la tasa de mineralización ósea. Los resultados se han publicado en Drug Delivery.

La proteína BMP2 recombinante humana es capaz de estimular la producción de hueso, de modo que actualmente se
utiliza en cirugía ortopédica y traumatología en Estados Unidos. Además, también se usa en el campo de la cirugía oral y
la odontología, para la reparación de defectos óseos y como tratamiento previo a la colocación de implantes dentales.

“Sin embargo, sus posibles efectos secundarios restringen su aplicación a defectos muy concretos. Por ello, el diseño de
nuevos sistemas bioactivos que potencien su efecto osteogénico y disminuyan las dosis requeridas permitiría un uso más
racional y seguro de esta proteína”, explica José Antonio Rodríguez, investigador del Programa de Enfermedades
Cardiovasculares del CIMA y miembro del Centro de Investigación Biomédica en Red Cardiovascular (CIBERCV).

Rodríguez es coordinador del trabajo, junto con Carmen Évora y Araceli Delgado, del Laboratorio de Tecnología
Farmacéutica de la Universidad de La Laguna.

Según los investigadores del trabajo, la propuesta de la administración conjunta de BMP-2 y MMP10 puede constituir
una estrategia con aplicación clínica, particularmente eficaz para la regeneración y reparación de defectos óseos.
19.04.2017 – 05:00 H.

Si no prestas mucha atención, parecen unos piñones tostados, o quizá unas almendras, extrañamente colocados en
bandejas con huecos hechos a medidas, encajables y apilables. ¿Quién se tomaría tantas molestias para colocar
ordenadamente unos piñones? Nadie, porque no lo son. Son crisálidas de la oruga de la col, bautizada científicamente
como 'Trichoplusia ni' pero que recibe también el curioso nombre de falso gusano medidor.

Pero quedarnos en que son meras crisálidas tampoco sería del todo exacto porque son más que eso: son unidades de
producción de proteínas recombinantes, moléculas que sirven como base para vacunas, medicamentos y kits de
diagnóstico de enfermedades. Dentro de su cáscara de keratina, el insecto está llevando a cabo la transición de gusano a
polilla, un proceso metabólico (que no llegará a completar) con un enorme potencial para la producción de proteínas,
que los científicos han aprendido a aprovechar en nuestro favor en las primeras granjas de insectos con fines
terapéuticos.

Una de estas granjas, propiedad de la compañía biotecnológica Algenex, se encuentra en Pozuelo de Alarcón, en

Madrid. Es una empresa pequeña, de 12 trabajadores, que ha desarrollado y patentado una nueva tecnología para
producir esas proteínas recombinantes a partir de insectos. El procedimiento que llevan a cabo es una mezcla entre la
cría de gusanos de seda que todos probamos de niños agujereando la tapa de una caja de zapatos y el sistema de
aprovechamiento de la energía del cuerpo humano que las máquinas utilizaban en Matrix.

De los huevos de polilla a las proteínas

Unos cuantos ejemplares se mantienen como individuos para la cría. Cada hembra de polilla de la col puede poner
hasta 1.000 huevos. De cada uno de ellos saldrá una larva que crecerá con otras docenas de larvas en cajas,
especialmente diseñadas para que todas accedan al alimento en la misma cantidad y por tanto crezcan y evolucionen al
mismo ritmo, de larvas a crisálidas.

Este es el primer momento clave del proceso: con las crisálidas colocadas en sus bandejas,  una aguja robótica las va
inoculando, mecánicamente, minuciosa e incansable, con un virus modificado para la ocasión con el objetivo de que
colonice las células del insecto y estas comiencen a producir la proteína deseada. El resultado es que entre 4 y 6 días de
incubación después, la crisálida es una cápsula llena de la proteína que servirá para fabricar vacunas y medicamentos.

Claro que para eso primero hay que extraerla utilizando procedimientos mecánicos (las crisálidas se trituran en algo
parecido a una batidora) y físicos (el 'batido' de insectos se hace pasar por varios filtros) hasta obtener
una concentración superior al 90% de la proteína.

Sin biorreactor es más fácil (y barato)

Jose Ángel Escribano, doctor en veterinaria y fundador de Algenex, explica que producir medicamentos utilizando
insectos como plataforma productiva tiene varias ventajas. "Actualmente, la innovación en vacunas apunta al uso de
moléculas biológicas recombinantes, que es lo que nosotros hacemos aquí. La forma tradicional de producirlas consiste
en utilizar cultivos in vitro de células de mamíferos o insectos, levaduras o bacterias e introducirlos en biorreactores,
una maquinaria compleja, cara y poco robusta. Utilizando estas crisálidas no hace falta biorreactor: el proceso es más
sencillo, más rápido y más barato".
Da algunas cifras: este método de producir moléculas biológicas recombinantes aumenta la productividad hasta 20
veces frente al método de producción con biorreactores, los costes se reducen dramáticamente (hasta el 95%, asegura)
ya que son los biorreactores los que más encarecen la producción y aquí no son necesarios; las proteínas se obtienen  12
veces más rápido que si se emplean células de mamífero y escalar la producción es tan sencillo como añadir más
bandejas con crisálidas.

Además, son tremendamente productivas: de una crisálida salen entre 20 y 160 dosis de vacuna dependiendo del
principio activo y dosis de vacuna utilizada. "Los insectos son organismos muy apropiados para este fin: en determinadas
fases de su desarrollo aumentan su tamaño 5.000 veces en 2 semanas, y cada año se producen toneladas de hilo de
seda, que al fin y al cabo son proteínas".

Igual que en un futuro no muy lejano los insectos serán una de las principales fuentes de proteínas en nuestra dieta (y
más nos vale irnos haciendo a la idea), Escribano cree que también nos ayudarán a obtener las proteínas en que estarán
basadas las vacunas del futuro.

Primero vacunas animales

De momento, Algenex trabaja en productos veterinarios. Su primera vacuna, contra la enfermedad hemorrágica del
conejo, desarrollada en colaboración con farmacéutica veterinaria italiana Fatro, estará en el mercado en menos de dos
años. Comenzar por la salud de los animales es un primer paso antes de pasar a productos para humanos: es  una forma
de validar su tecnología y el acceso al mercado es más rápido. También porque, como aportación a la alimentación
humana que supone la ganadería, cuidar de los primeros es cuidar de los segundos.

¿Qué falta entonces para que nuestras vacunas se hayan producido en el interior de una crisálida como estas? "El
próximo paso es que las farmacéuticas se vayan convenciendo y apuesten por esta tecnología". De momento, la
compañía Biokit, con sede en Barcelona, ya utiliza estas proteínas 'made in insectos' para kits de diagnóstico de
enfermedades infecciosas y problemas de coagulación de la sangre entre otras, pero pronto estas granjas de crisálidas
podrían ser el origen de nuestras vacunas.

Para obtener estas proteínas, en primer lugar, el gen que codifica la proteína de interés, se introduce en un plásmido
bacteriano para facilitar su manejo y, a partir de ahí, se transfiere a las células que van a "fabricar" nuestra proteína. En
los laboratorios trabajamos con distintos sistemas de expresión de proteínas recombinantes, basados en
microorganismos y líneas celulares que son fáciles de cultivar. La expresión en la bacteria E.coli es uno de los más
utilizados, por su fácil manejo y por su elevado rendimiento. Sin embargo, al tratarse de un sistema de expresión
procariota y, puesto que en muchas ocasiones queremos obtener proteínas humanas, o proteínas de microorganismos
que en la naturaleza se sintetizan en células eucariotas, a veces, las proteínas expresadas en bacterias presentan una
estructura y funcionalidad tan diferente a la nativa, que no pueden ser utilizadas. Para solventar este problema se
utilizan sistemas de expresión eucarióticos más complejos, tales como levaduras, células de insecto, células de mamífero
o plantas. 
La primera proteína recombinante que se produjo y se comercializó fue la insulina humana. Hoy en día existen muchos
ejemplos, como el interferón humano que se utiliza para el tratamiento de la esclerosis múltiple, el factor VIII de la
coagulación contra la hemofilia o la hormona de crecimiento. Además, hay vacunas basadas en proteínas recombinantes
como la de la Hepatitis B o la del Papiloma humano y también se están utilizando en ensayos de diagnóstico, facilitando
enormemente la detección de enfermedades que requerían largos y complejos análisis.
Las proteínas recombinantes han supuesto un gran avance en el campo de las vacunas y están siendo de gran ayuda en
la lucha contra las enfermedades víricas. Hasta hace poco tiempo, las vacunas virales se preparaban utilizando virus
atenuados o inactivados y, aunque el uso de este tipo de vacunas ha ayudado muchísimo en el control de las
enfermedades, en ocasiones, han surgido problemas debido a una inactivación o atenuación inadecuadas. Las proteínas
estructurales que forman el "esqueleto" de los virus, lo que se llama la cápsida viral, son las principales dianas a la hora
diseñar y obtener una vacuna. Son proteínas, capaces de generar una respuesta inmune eficaz que servirá para luchar
contra ese virus si somos infectados por él. El sistema de expresión de baculovirus es especialmente útil para sintetizar
partículas virales recombinantes a partir de la expresión de la/las proteínas estructurales que forman las cápsidas
virales. La proteína recombinante de la cápsida tiene la capacidad de autoensamblarse, es decir, de unirse entre sí
formando una estructura multimérica con un número alto de copias. Las estructuras que se forman son tan parecidas a
los virus, que en inglés se han llamado "virus like particles (VLPs)", es decir, partículas "cuasi-idénticas" a los virus y son
una de las herramientas más prometedoras en el campo de la moderna "vacunología". Hay descritas hasta 110 VLPs de
35 familias virales distintas. La tecnología de las VLPs tiene grandes ventajas: son estructuras muy estables, estructural y
antigénicamente son prácticamente indistinguibles de los virus de los que se derivan, no contienen DNA por lo que no
son infectivas y son más seguras y son capaces de estimular una fuerte respuesta inmune. 

La E.Coli como hospedero posee grandes ventajas como: se

cuenta con una gran variedad de vectores de expresión y cepas
mutantes, es de fácil manipulación, cultivos baratos con altas
densidades celulares, etc. Pero además poseen algunas
desventajas como: que realiza pocas modificaciones post-
traduccionales, carece de chaperonas, etc, lo que puede ocasionar
un mal funcionamiento de la proteína.

La síntesis del gen

Se realiza por el método de reacción en cadena de la polimerasa conocido como PCR, en donde el ADN del gen de
interés se amplifica por medio de la acción de una polimerasa como puede ser la Taq polimerasa.
- Extracción de cualquier vector de una célula
El procedimiento suele ser, lisar la célula con detergentes y quelantes de Ca y Mg para romper y desestabilizar la
membrana, respectivamente. La centrifugación separa los cuerpos más grandes de los pequeños, el uso de solventes
orgánicos (como el ácido tricloroacético), de proteasas y RNAsas permite la separación de proteínas y ARN del ADN. El
uso de una base fuerte (NaOH) permite la desnaturalización del ADN y luego el cambio brusco de pH permite que los
ADNs de menor peso (el del vector) se renaturalicen rápidamente mientras que los de mayor peso forman agregados
(ADN bacteriano) lo que luego por centrifugación se logra la separación de ambas ADN. Todos los procesos se llevan a
cabo en sistemas donde están regulados el pH, concentraciones de cofactores para el funcionamiento de las enzimas, la
temperatura, la presión osmótica y la fuerza iónica.
- Digestión enzimática con enzimas de restricción
En este paso conociendo la secuencia del inserto y que los vectores tienen un sitio de restricción se elige con que
enzimas digerir para que luego la unión inserto y el vector sea óptima.

- Unión inserto vector (ligación)

Obtenidos los cortes de restricción en este paso se utiliza la parte de la maquinaria de síntesis de ADN que se encarga de
unir las bases. La encargada de este proceso es la enzima ligasa.
- Transformación
En este paso a las bacterias se les introduce el vector con el inserto, para ello las bacterias se las vuelve competentes, es
decir que pueden captar ADN del medio, en este caso el del vector. Esto se logra utilizando energía eléctrica
(electroporación) o lavados con soluciones de Ca o Mg, estos procesos tienen como objetivo crear poros parciales en las
membranas para permitir el paso del vector.
- Búsqueda de los clones positivos (screening)
Es el proceso por el cual se buscan los clones que han incorporado el vector con el inserto para realizar su separación de
los que no lo han incorporado.
Controles durante la obtención de la cepa recombinante
Al menos se deben realizar los siguientes controles:
- La Presencia del plásmido o vector por medio de gel en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Si al correr el gel se
observa que la banda de la muestra es distinta al del vector original, es indicación de que el vector fue modificado. Al
introducir el inserto y hacer el SDS-PAGE los vectores corren distintos.
- Durante la digestión enzimática se observa hasta que punto llegó la digestión del vector por medio de un gel en
condiciones nativas. En estas condiciones el vector genera tres bandas que corresponde a su forma lineal (corre más
rápido) que se encuentra primero (desde abajo hacia arriba del gel) le sigue su forma enrollada pero con cortes que le
quitan tensión a la molécula, y por último el vector sin cortes en su forma plegada. Si la digestión fue bien realizada en el
caso de utilizar dos enzimas de restricción, en el gel se deberá observar dos bandas, correspondientes a dos ADNs
lineales, una al fragmento más pequeño en donde se liberan lo sitios de restricción y la otra al resto de la molécula del
vector. En el caso de utilizar una sola enzima se deberá observar la banda correspondiente al vector lineal.
- En el proceso de unión vector-gen sintético, se verifica que porcentaje se ha alcanzado. Solo sobreviven en el medio de
cultivo con antibiótico las bacterias que hayan incorporado el vector ligado ya que de lo contrario morirán por no poder
generan la resistencia que llevan (el DNA lineal no puede ser transcripto).

En la selección, las células transformadas se someten a un cultivo con antibiótico si sobreviven es porque incorporaron el
vector de lo contrario mueren debido a que el vector lleva la resistencia al antibiótico. Generalmente los vectores tienen
un segundo sistema de diferenciación en donde se inserta el gen en estudio esto le da cierta característica a la colonia
que incorporaron el gen-sintético. Uno de los sistemas más comunes es el de gen lacZ  que hace que las colonias se
vean azules y las que recibieron el plásmido junto con el gen sintético se ven blancas debido a que el gen fue cortado por
la secuencia del inserto.