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  • 1120 Espectroscopia Raman Capitulo USP Español

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    1120 Espectroscopia Raman capitulo USP español

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    fortes 1490 (1120) Espectroscopia Raman / Informacién General usp 39 (1120) ESPECTROSCOPIA RAMAN Cambio en fa redaccién: INTRODUCCION oo omy 21s La espectroscopia Raman es una técnica espectroscdpicavibracionaly, por tanto, est elacionada con la es ppectroscopia en el inrarojo (IR) y en el intrarrojo cercano (NIR, por suSsiglas en inglés). El efecto Raman en si mismo surge como resultado de un cambio en la polarizabilidad de enlaces moleculares durante un determinado modo vibraciona y e mi de como radiacién dispersada inesticamente Un espectro Raman se genera mediante la excitacin de la muestra de interés aun estado virtual con una fuente monocro- imatica, generalmente un laser, La luz dspersada eléstcamente (sin cambio en la longitud de onda) se conoce como dispersién de Rayleigh y no presenta interés alguno en la espectrometria Raman, excepto para marcar la longitud de onda lier. Sin em- bargo, sila muestra se relaja a un nivel de energia vibracional que difiere del estado inicial,laradiacién dispersada se desplaza en energia Este desplazamiento es proporclonal ala diferencia de energia entre el estado vibractonal nial y el estado vibra- ional inal. esta luz “dispersada inelastcamente" se la denomina dispersion Raman. Solo aproximadamente uno de cada 1010" fotones que inciden sobre la muestra experimenta dispersion Raman. Por ello se emplean lseres en los espectrome- {ros Raman, Si el fotén Raman dispersado es de energia menor, se denomina dispersion de Stokes. Sies de energia mayor, se ddenomina dispersin anti-Stokes. En la préctca, casi todas las mediciones Raman itles desde el punto de vista analitico usar la dispersion Raman de desplazamiento Stokes. El espectro Raman es muy similar al especto infrarroj graicadolinealmente en absorbancia. Las intensidades, o el nimero de fotones Raman contados, se grafican en funcin de las energias de desplazamiento El eje x generalmente se denomina “Desplazamiento Ramanjem 0 "Nimero de onda/cm". I desplazamiento Raman normalmente se expresa en nimero de res de ida aboulut Uel plow yeh se ua el lac leapt a ere cnn represeritalaufereca tee Preta del mismo mado que el espectoinfarojo medio correspondiente. Lis posiciones de los nimeros de onda (desplazados de Raman) para un modo vbracional dado son idénticos alos nimeos de onda de as bandas correspondientes en un espec- trode absorcin IR. Sin embargo, los picos més fuertes en un espectro Raman a menudo son débils en un espectro IR vice- versa, Por este motivo, con frecuencia se dice que as dos técnica especroscépica son complementarias. La espectroscopia Raman es ventajosa porque a menudo se pueden realizar medicionesrpidasy exactas sin dest a muestra (lida, semisdia, iquida 0, con menor frecuencia, gas) y sn necesidad de preparar la muestra © con una prepara Cin minima, El espectro Raman conteneinformacin sobre mods vbracionalesfundamentales de Ia muestra que puede pro- Porcionar una comprension tanto dela muestra como del proceso. La seal genraimente se encuentra dentro del interval sible o dal IR cercano, lo que permite un acoplamiento elente con lafibra Spica, Esto tambien sigiiea que se puede obte ner una seFalpartiendo de cualquier medio que sea transparente ala lz del ser, como por ejemplo vidios, plisticos o mues- tras en medios acuosos. Ademis, dado que os espectrs Raman se excitan por lo general con radiacén visible o IR cercano, pueden usase elementos épticos esténdar de cuarzo o vidrio, Desde un punto de vista instrumental, os sistemas modernes Son facies de usar, proporcionan rpidos tiempos de anlsis (desde segundos a varios minutes) y son contiables. Sin embargo, debe tenerse present & peligro de usar isees de alta potencia, en especial cuando sus longitudes de onda estan en eR cercano y, por lo tanto, no son vsbes al oo humano. Las sondas de iba Spica se deben usar con precauci yrespetando las reglamentaciones gubernamentales apropiadas en lo que respectaalsers y sus clases “Ademas de a espectroscopia Raman “normal”, exsten varias tecnicas Raman mis especializads. Estas incluyen esonancia Raman (82), espectoscopia Raman de supertcie ampliiada (SERS, por ss siglas en Ingles), actividad Aten Raman (ROA, por sus siglaseningls),espectroscopia Raman anti-Stokescoherente (CARS, por sus sighs en inglés), especroscopia de ganancia © de pérdida Raman y espectroscopia hiper-Raman, Estas tcnicas no se usan amplamente en los laboratoriosfarmaceutcos ¥ no se tratan en este capitulo de informacion genera MEDICIONES RAMAN CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS Existen dos clases generales de mediciones que se realizan cominmente con espectrometria Raman: cualtativa y cuantitati- Medi nes Raman Cualitativas Las mediciones Raman cualitaivas proporcionan informacién espectral sobre los grupos funcionales presentes en una mues- tra. Debido a que el espectro Raman es especifico para un compuesto dado, las mediciones Raman cualitativas se pueden usar ‘como una prueba de identiticacién farmacopeica, asi como también para elucidacion estructural Usp 39 Informacién General | (1120) Espectroscopia Raman 1491 Mediciones Raman Cuantitativas Para instrumentos equipados con un detector que mide la potencia Sptica (como un espectrémetro transformador de Fou- rier [FT, por sus siglas en inglés|-Raman), las mediciones Raman cuantitativas utilizan la siguiente relacion entre sefial,S,, a un determinado niimero de onda, v, y la concentracién de un analito, C: 5, = Koulyy = vp) PC ‘en donde K es una constante que depende del digmetro del rayo laser, los elementos dpticos de recoleccién, el volumen de la muestra y la temperatura; 0, es la seccién transversal Raman del modo vibracional en particular, v, es el nimero de onda del laser; y, es el nimero de onda del modo vibracional; y P, es la potencia del laser. La seccién transversal de Raman, oj, €5 Caracteristca de la naturaleza del modo vibracional en particular. El volumen de muestra esté definido por ef tamafo del foco del rayo laser en la muestra, el elemento éptico usado para enfocar y las propiedades Spticas de la muestra misma. El tamafio de las zonas de medida sobre la muestra puede variar desde menos de 1 ism para una microsonda, hasta 6 mm para un siste- ‘ma de muestreo de gran superficie. Para espectrémetros Raman que miden la cantidad de fotones por segundo (tales como los espectrémetros con dispositives de acoplamiento de carga [CCD, por sus siglas en inglés}-Raman), la ecuacién correspon diente es: Kowvi(vi~ Vy PPC En las ecuaciones anteriores se observa que la sefal del pico es directamente proporcional ala concentracin. Esta relaci6n es la base para la mayoria de las aplicaciones Raman cuantitatvas. FACTORES QUE AFECTAN LA CUANTIFICACION Factores Basados en la Muestra Los factores mas importantes, basados en la muestra, que afectan negativamente la espectrometria Raman cuantitativa son la fluorescencia, el calentamiento de la muestra, la absorcién de la matriz o de la misma muestra y el efecto de polarizacién. Si la matriz de la muestra inclaye compuesto fluorescentes, [a sefial medica par In general contenciré una conteibuicién de la fluorescencia. La fluorescencia se observard slo sila longitud de onda de la excitacin del laser se superpone a una banda de absorcién de un compuesto fluorescente. La fluorescencia se observa generalmente como un amplio fondo en pendiente sub- ‘yacente al espectro Raman. La fluorescencia puede ocasionar tanto un desplazamiento de la linea base como una reduccién de fa relacién sefal-ruido. El intervalo de longitud de onda y la intensidad de la fluorescencia dependen de la composici6n quimi- 2 del material fluorescente. Debido a que latluorescencia es generalmente un proceso mucho mds eficiente que la dispersion Raman, incluso cantidades muy pequefias de impurezasfluorescentes pueden dar como resultado una degradacién significat vva de la sefial Raman. La fluorescencia se puede reducirutlizando fuentes de excitaci6n de longitud de onda mas larga, tales ‘como 785 nm 0 1064 nm. Sin embargo, cabe recordar que la intensidad de la seal Raman es proporcional a (v, - vy), de ‘manera que la ventaja de usar un liser de excitacién de longitud de onda larga para minimizar la fluorescencia es al menos parcialmente compensada por una reducida intensidad de la sefial Raman. La mejor relacién sefial-ruido se obtendré equili- brando el rechazo de la fluorescencia, la intensidad de la sefaly a respuesta del detector. La fluorescencia en los sélidos se puede mitigar en ocasiones exponiendo la muestra a la radiacién laser durante un periodo dado anterior a ia medicién. Este proceso se denomina fotoblanqueo (photobleaching) y funciona degradando las especies de alta absorcién. El fotoblanqueo es menos eficaz en liquidos, cuando la muestra es mévilo sila cantidad de material fluorescen- te es més que trazas. £1 calentamiento de las muestras con la fuente de léser puede causar una variedad de efectos, como por ejemplo cambios en la forma fisica (Tustin), conversién polimsérfica 0 el quemado de la muestra. La probabilidad de que la muestra se caliente es ‘mayor cuando el tamano de las zonas de medida en la muestra es més pequefo, es decir, cuando se usa una microsonda, Esto {es generalmente un problema para las especies coloreadas de alta absorcién o para particulas muy pequetias con una baja transferencia de calor. Los efectos del calentamiento de la muestra generalmente se observan como cambios en el espectro Raman con el transcurso del tiempo o mediante una inspeccién visual de la muestra. Ademds de disminui el flujo laser, se puede emplear una variedad de métodos para disminuir el calentamiento inducido por laser, como por ejemplo mover la ‘muestra o el liser durante la medicién o mejorar la transferencia de calor a partir de la muestra mediante contacto térmico © inmersion en un liquido. ‘También puede suceder que la matriz o la misma muestra absorba Ia sefial Raman. Este problema prevalece més con siste mas FT-Raman de longitud de onda larga donde la seftal Raman puede superponerse con la absorcién de sobretonos del IR ccercano. Este efecto dependers de los elementos Spticos en el sistema asi como también de la presentacién de la muestra. La variablidad de la dispersion en s6lidos se asocia con este efecto como resultado de las diferencias en el tamafio de particulas y la compactacion. Sin embargo la magnitud de todos estos efectos generalmente es menos grave que en NIR debido a que en la espectroscopia Raman la profundidad de penetracién es limitada y a que se utiliza una regién de longitudes de onda relat: vamente mas estrecha, 1492 (1120) Espectroscopia Raman / informacién General usP 39 Finalmente, se debe reconocer que la radiacin laser esté polarizada y los espectros Raman de los materiales cristalinos y de ‘otras muestras orientadas pueden lferi significativamente, dependiendo de la forma en que se coloque la muestra. Sie es- pectrémetro Raman es capaz de producir una radiacién polarizada linealmente en la muestra, entonces se recomienda un des- polarizador (polarization scrambler) para los analsis rutinarios de muestra. Factores de Muestreo La espectroscopia Raman es una técnica sin ruido de fondo, en donde la seal esperada en el detector en ausencia de la muestra es cero. Esta situacién puede contrastarse con espectromettia de absorcién, donde la seftal en el detector es maxima fen ausencia de la muestra. Las técnicas sin ruido de fondo son inherentemente sensibles debido a que pequefios cambios en la cconcentracién de la muestra conducen a cambios proporcionales en los niveles dela sell. El instrumento también seré sensi- bie a otras fuentes de luz que pueden causar varaciones de una muestra a otra en el nivel medido de la seal. Adicionalmente, tuna sefal fuerte de fondo, causada por fluorescencia condutciré a un incremento del nivel de ruido (photon noise shot). Por tanto, puede ser muy dificil usar la seal Raman absoluta para la determinacién directa de un analito. Otras fuentes potenciales de variacin son los cambios en la opacidad y la heterogeneidad de la muestra, los cambios de la potencia de! laser sobre la "muestra los cambios de la geomet de recoleccién éptica o la posicin de la muestra. Estos efectos se pueden minimizar realizando el muestreo de una forma reproducible y representativa El disefio cuidadoso de la instrumentacién puede reducir estos efectos pero no los puede eliminar por completo, El uso de un esténdar interno de referencia es el método més comiin y robusto para eliminar las variaciones debidas a las fluctuaciones de intensidad absoluta. Existen varias opciones para este enfoque. Se puede agregar deliberadamente un esta dar interno y s2 puedan emplear picos aslados de este estindar; 6 también puede usarse una banda debida a una subunidad ‘molecular, como un anillo aromético, cuya seccién transversal Raman no cambia con la forma en que se prepara la muestra Para los espectros en solucién, se puede emplear una banda de disolvente aislada ya que el disolvente permanecerd relativa- ‘mente sin cambios entre una muestra y otra. Ademés, en una formulacién, se puede usar un pico de excipiente si esté en un exceso considerable en comparacién con el analito. También se puede usar todo el espectro como referencia, asumiendo que tos cambios de ortentacion de la muestra ye! laser atectaran a todo el espectro por 1gual Un segundo factor importante basado en el muestreo a tener en cuenta es la contaminacién espectral El efecto de disper- sién Raman es débil y puede ser enmascarado por una cantidad de fuentes externas. Las fuentes de contaminacién comunes incluyen artefactos de los portamuestras(recipiente o sustrato) y luz ambiental. Generalmente, estos problemas se pueden identificar y resolver mediante una experimentacion cuidadosa, APARATO 4 G § Componentes Todas las mediciones Raman modemas implican lairadiacién de una muestra con lise, la recoleccién de la radiacién dis: persada, rechazando la dispersién Rayleigh de luz, diferenciando los fotones Raman por longitud de onda, y detectando el es- ppectro Raman resultante. En consecuencia, todos los instrumentos Raman comerciales comparten las siguientes caracteristicas ‘comunes para realizar estar funciones: 1. Fuente de excitacién (laser) 2. Dispositivo de muestreo 3. Dispostivo para ftrar/rechazar la luz dispersada a la longitud de onda del lser 4. Unidad de procesamiento de longitud de onda 5. Detector y componentes electronicos FUENTE DE EXCITACION (LASER) La Tablo 1 identifica varios léseres comtinmente usados para aplicaciones farmacéuticas 0 espectrometria Raman, También se han usado laseres UV para aplicaciones especializadas, pero éstos tienen muchas desventajas que limitan su utlidad para ‘mediciones analticas generales. A medida que se describan mas aplicaciones para los liseres UV, es probable que se vuelvan ‘mas comunes para la espectrometria Raman, “Tabla 1, Liseres Usados on Aplicaciones Farmacéutic Intervalo de Longitud de Potencta Tipica | Onda, nm (Region Stokes, 100 cm" 3000 con "des: fen el Laser plazamiento) Comentarios 2. del laser, nm (aime: ro entero mis cereano) Ttado so Hasta We 1075-1563 Usados cominmente en instrumentor de (NEYAG) wansformada de Fourer usp 39 Informacién General | (1120) Espectroscopia Raman 1493 Tabla 1. Lésoras Usador on Aplicaciones Farmactutieae (Continuosién) l interval de Longtud de Potencla Tipe | Onda, nm Region Stokes 1 del ser am (ie 100 cn 3080 cn der roenteroiarcerans) | Thee ene ser pezament) conmnarin : / 0 Dis | ste 30 mi 027900 Tins porto genel «2000 plcamio Rann debi pus | | Spear cob; menos comin ue cos | ie 75 Dinio | vas Soom iio Lise an de dpa nls id isa ves es ene [tata S00 aw ean7ai Tigo de fone heen ba 82 Buniade | ‘Haat W 535-6828 [ato ego de ursceni Naa) sas a Tea arate Taio om an 6328 ae Hasta wos Ao ego de hres DISPOSITIVO DE MUESTREO. Existen varios dispositivos de muestreo posibles, incluyendo interfases épticas directas, microscopios, sondas basadas en fbra

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