Limpieza y desinfección de elementos periféricos e

instrumentación y control de biorreactores

Nataly Abigail Ontiveros Vidales

Introducción

Para poder llevar a cabo una fermentación con éxito es imprescindible y obligatorio tener

en todas las etapas cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el

fermentador de producción. Por lo tanto, el fermentador y su equipamiento, así como el

medio de cultivo deben estar estériles antes de la inoculación. Además, el aire que se

suministra durante la fermentación debe ser estéril y no deben existir roturas mecánicas

en el fermentador que podrían permitir la entrada de microorganismos.

Un biorreactor puede ser esterilizado, destruyendo los microorganismos, con algún

agente letal como calor, radiación o un producto químico o bien separando los

organismos viables

mediante un procedimiento físico como la filtración. Durante la fermentación se deben

observar dos puntos para asegurar la esterilidad:

 Esterilidad en el medio de cultivo

 Esterilidad del aire que entra y sale

Para lo cual es necesario una construcción apropiada del biorreactor que facilite la

esterilización, así como la prevención de la contaminación durante la fermentación

 Generalidades

Esterilización: eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto

o sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden

contaminarse nuevamente.

Sanitizante: agente que disminuye la carga microbiana total a un nivel el cual es seguro

para la salud de la población. Sólo es aplicable sobre objetos inanimados.

Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas

tales como habitaciones.

Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos

potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas (sólo pueden aplicarse externamente

sobre seres vivos).

Biorreactor: Recipiente en el que se lleva a cabo una transformación química en la que

interviene un biocatalizador.

Utilizado en procesos industriales de producción de medicamentos o enzimas, provee un

ambiente óptimo para el crecimiento celular y la productividad asegurando el control de

distintos parámetros tales como temperatura, pH, etc.

Controles de Esterilización: Son controles que se realizan sobre el método de

esterilización. Monitorean o controlan si el proceso de esterilización funciona

correctamente.

Tipo de esterilización

Calor Húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas.

Estos efectos se deben principalmente a dos razones:

El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA,

proteínas, etc) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones

inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos. Además,

las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante uniones

puente de hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a

altas temperaturas.

El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que

el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente

que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación.

Autoclave: es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar

cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a

temperaturas mayores a 100 °C. Una temperatura de 121 °C (una atmósfera de

sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir

organismos formadores de esporas (Figura 1).

(Figura 1) Influencia de la descarga incompleta de aire en la temperatura de la autoclave

Ventajas

 Rápido calentamiento y penetración

 Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo

 No deja residuos tóxicos

 Hay un bajo deterioro del material expuesto

 Económico

Desventajas

 No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

 Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos

Calor Seco: El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles

elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se

deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en

contacto con éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más

lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor

sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la

actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan

mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que son más difíciles de romper

por el calor seco.

La estufa de esterilización es el aparato utilizado en los laboratorios para esterilizar por

calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición del autoclave. La

temperatura varía entre 120° y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A

140°C se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a 160°C se requieren

al menos 2 horas de exposición.

Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodón no pueden ser esterilizados a

más de 160°C.

Ventajas

 No es corrosivo para metales e instrumentos.

 Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias

viscosas no volátiles.
 

Desventajas

 Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la

baja penetración del calor.

Agentes químicos: Dentro de los compuestos químicos podemos encontrar agentes

esterilizantes, desinfectantes y antisépticos. La efectividad de estos agentes depende de

las condiciones bajo las que actúan.

Concentración: varía con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma

concentración del agente puede producir un efecto diferente en distintos

microorganismos.

 Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma

forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

 pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes químicos. El

aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los

microorganismos afectando la concentración del agente sobre la célula. El

pH determina el grado de disociación y la efectividad del agente químico,

pues a menor disociación mayor permeabilidad y mayor efectividad. 

(Figura 2) Antisépticos y desinfectantes

Clasificación para biorreactores.

 Clasificación operativa:

Tanto biorreactores como fermentadores se clasifican primeramente de acuerdo al modo

de operación: discontinuo, semicontinuo, continuo.

Esta es una clasificación operativa y se aplica a cualquier reactor, sea químico o biológico

(biorreactor). En los reactores biológicos el modo de operación define el sistema de

cultivo que es el mismo y delimita la clasificación procesal-productiva del bioproceso

(cultivo).

Al operar un biorreactor en una determinada categoría (discontinuo, semicontinuo,

continuo), automáticamente queda determinado el modo de cultivo del sistema y se

definen los parámetros y las características operativas y de diseño que intervienen en el

proceso productivo del sistema. 

  Clasificación biológica:

Los sistemas biológicos deben interaccionar con el ambiente externo para poder crecer y

desarrollarse; es por eso que los biorreactores se clasifican biológicamente de acuerdo al

metabolismo procesal del sistema de cultivo: anaeróbico, facultativo, aeróbico.

Los bioprocesos de cultivo y las fermentaciones están basados en el metabolismo celular

del cultivo. El metabolismo define los parámetros y características operativas-biológicas

de diseño y de operación del biorreactor.

Estas características son las que intervienen en la parte biológica del sistema y tienen que

ver con el crecimiento, productividad y rendimiento del cultivo; por lo que, definen la

clasificación biológica- procesal del sistema de cultivo.

 Clasificación biológica-operativa:

Ambas clasificaciones; la biológica y la operativa, son procesalmente interdependientes y

en su conjunto afectan el diseño final del biorreactor.

Al conjuntarse ambas clasificaciones, se conjuntan también la función operativa y la

biológica para establecer entre ambas un propósito de utilización, el modo de cultivo y el

bioproceso. Siendo el propósito de utilización, el destino de cultivo del biorreactor; para

qué tipo de cultivo va a ser utilizado el biorreactor; el modo de cultivo es sinónimo de

sistema de cultivo y el bioproceso es en sí, todo el proceso.

 Modo de operación y sistemas de cultivo

El modo de operación de un sistema de cultivo, es sinónimo del modo de operar del

biorreactor o fermentador. Éste no solo influye en el diseño propio del reactor, también,

en el modelo cinético de crecimiento del cultivo y en el proceso de producción.

Existen tres modos de cultivo aunados a tres modos básicos de operación:

 Discontinuo(batch):

Por lotes o tandas, sin alimentación (F); se coloca dentro del biorreactor la carga total de

cada proceso (tanda o lote) de cultivo o fermentación y se dejar que se lleve a cabo el

proceso productivo o la fermentación por el tiempo que sea necesario; el cuál se

denomina tiempo de retención.

 Semicontinuo (fed-batch):

Por lotes alimentados, con alimentación de entrada (F1); se alimenta una línea de entrada

o alimentación (F1) para que el sistema de cultivo tenga un producto (biomasa) con

máximo de crecimiento (exponencial) y aumente la productividad.

 Continuo (continuos):

Por quimioestato, se alimenta una línea de entrada F1 o alimentación y se drena una línea

de salida F2 o lavado; de manera que los flujos o caudales de ambas líneas sean iguales y

la producción sea continua.

 Instrumentación para el monitoreo de un biorreactor

Termómetros de resistencia: Se basan en el principio de que la resistencia de los metales

incrementa con la temperatura. Cuando la corriente pasa a través del rollo, un cambio de

voltaje se produce y éste a su vez, se relaciona con la temperatura. Los termómetros de

resistencia industriales se construyen siempre de platino, cobre o níquel.

Termistores: Son resistores variables con la temperatura, están basados en

semiconductores. De la misma forma que los termómetros de resistencia, los termistores

no guardan una relación lineal entre la resistencia y la temperatura, pero si se adecuan a

los pequeños cambios de temperatura que exhiben las fermentaciones, ésta relación

puede considerarse lineal. Los termistores se fabrican con óxidos de níquel, manganeso,

hierro, cobalto, cobre, magnesio y titanio.

pH: El electrodo de vidrio es el elemento detector primario de las mediciones de pH.

El principio de medición se basa en el desarrollo de un potencial en la membrana de vidrio

sensible al pH, como resultado de la diferencia en la actividad del ion hidrógeno en la

muestra y una solución estándar de referencia (solución de cloruro de potasio) contenida

dentro del electrodo. El potencial del electrodo proporciona un voltaje que se expresa

como pH.

Medición de oxígeno disuelto: Los sensores de medición de oxígeno disuelto (OD)

consisten básicamente de una camisa de acero inoxidable o de cristal que contiene dos
electrodos y un electrolito adecuado. Para separar los electrodos y los electrolitos del

caldo de fermentación el sensor está cubierto por una membrana. El oxígeno difunde a

través de la membrana y se reduce en el cátodo, que está polarizado negativamente con

respecto al ánodo. Esto produce una corriente que puede ser traducida como

concentración de oxígeno. Habitualmente se recurre al uso de sondas de tipo poligráficas

y galvánicas. La diferencia entre ellas es que éstas últimas son más baratas. Las sondas

poligráficas pueden ser fraccionablemente más rápidas y tener una vida útil más larga.

Realmente las sondas OD nomid en la concentración de oxígeno disuelto, sino la actividad

o la presión parcial del oxígeno.

Nivel de espuma: La formación de espuma representa un problema serio en las

fermentaciones ya que se fomenta la contaminación mermando el rendimiento u

obstaculizando filtros. Comúnmente muchos medios de cultivo fomentan la formación de

espuma, principalmente en los cultivos aerobios por la producción de agentes espumantes

como proteínas, polisacáridos y ácidos grasos. El control puede realizarse por métodos

mecánicos, químicos o una combinación de los dos.

Nivel de agitación: Son comunes los rotámetros los cuales determinan las revoluciones

por minuto mediante mecanismos de inducción, generación de voltaje, sensores de luz o

fuerzas magnéticas (tacómetros eléctricos).

Éstos permiten una medición directa de las señales para alimentar los instrumentos

registradores o controladores de panel. Los tacómetros eléctricos emplean un transductor

que produce una señal analógica o digital como conversión de la velocidad de giro de la

máquina.

Equipo de protección personal

Es esencial utilizar y vestir el equipo de protección personal para minimizar los riesgos y

peligros a la salud.

 Siempre utilizar el equipo el cual sea necesario para una actividad en particular.

 Siempre seguir las instrucciones disponibles en el área de trabajo, con respecto a

las normas de seguridad y equipo de protección.

Vestimenta de protección

Para protección de contaminación, transmisión y transporte de varios

organismos. La ropa de trabajo debe de tener un buen ajuste para garantizar el sello

hermético, las mangas deben de estar ligeramente ajustadas, no utilizar la vestimenta

floja o suelta.

Gafas de protección

Para proteger los ojos de salpicaduras de líquidos.

Cofia o gorra de protección

Para protección de contaminación y el arrastre y/o transmisión de

varios organismos.
 Guantes protectores (resistentes a químicos): Para proteger las manos de

sustancias agresivas. Revisar que los guantes sean impermeables antes de

utilizarlos. Limpiar los guantes antes de utilizarlos y guardarlos después de

utilizarlos en un lugar con la ventilación apropiada.

Mascara Facial

Para proteger contra microbios patógenos y otros materiales biológicos

dañinos.

Botas de seguridad

Para proteger contra la caída de material suelto y el deslizamiento sobre

sustancia derramadas en el piso.

Indicaciones de la esterilización para algunos

elementos del biorreactor

Bombas: Los ejes de accionamiento de las bombas están situados en la parte frontal

superior. Las palancas de cambio para la operación manual de las bombas se encuentran

en la parte superior de los ejes del motor y se clasifican de la siguiente manera:

 Acido.

 Base.

 Anti espuma.
  Alimentador.

Cuando la unidad está encendida las bombas pueden ser operadas manualmente a través

de los interruptores.

Mantener el interruptor hacia la izquierda: El eje de accionamiento de la bomba gira en

sentido contrario a las manecillas del reloj.

Mantener el interruptor hacia la derecha: el eje de accionamiento de la bomba gira en

sentido de las manecillas del reloj.

Limpieza del vaso de reacción: Después de cada reacción, el vaso y los componentes del

vaso deben ser limpiados cuidadosamente. Si fuese necesario, descontamine el vaso

mediante autoclaveo o esterilización.

Llenar siempre el vaso antes de autoclavearlo o esterilizarlo. Debe asegúrese de no usar

más de 2/3 de volumen del vaso.

Esterilización del aire del biorreactor: La mayor parte de las fermentaciones industriales

operan en condiciones de agitación vigorosa y el aire que se suministra al fermentador

debe ser esterilizado.

Las fermentaciones funcionan generalmente con velocidades de aeraciones 0.5-1.0VVM

(volumen de aire/ volumen de líquido por minuto).

Un fermentador que tenga en volumen de trabajo de 50 m 3 con una viscosidad de

aireación de 1VVM necesita 3,000 m3 de aire estéril por hora.

Esterilización en “Batch”: Este es el método más común para esterilización de medios de

cultivo. Un reactor con su medio de cultivo se puede calentar de dos formas distintas, por

la inyección directa de vapor o por calentamiento indirecto a través de camisa o serpentín.

En todos los casos debe calcularse apropiadamente el tiempo de retención a la

temperatura de trabajo.

Para calcular ese valor hay que tener en cuenta el volumen a esterilizar, la carga

microbiana inicial y el valor final de la concentración de microorganismos deseado. La

inactivación térmica de los microorganismos sigue una cinética del tipo:

No
ln =kt
Xf

En la que N0 y Nf son respectivamente el número total de microorganismos al comienzo y

al final del ciclo de esterilización.

Nf solo puede alcanzar el valor de cero a tiempo infinito por lo que no puede asegurarse

nunca la completa esterilidad del medio de cultivo. Mientras el valor de N se mantiene por

encima de la unidad, el mismo posee significado real, cuando el mismo disminuyo y toma

valores decimales, su significado es estadístico.

Un valor de Nf de 0,01 implica que es esperable que 1 de cada 100 ciclos de esterilización

fallen. El valor, del tiempo de calentamiento se calcula despejando el valor de t de la

ecuación anterior. El valor de k depende del medio y, por supuesto, del microorganismo.

Su comportamiento en relaciona con la temperatura, al igual que otras constantes

cinéticas, es a través de la ecuación de Arrhenius

k = A∗e−e/ RT
Donde:

A es una constante de proporcionalidad y no cambia en forma notoria con la temperatura;

R, la ecuación general de los gases,

T la temperatura absoluta y

ε es la energía de activación aparente para la destrucción de los esporos.

Muestreo estéril: Lave la tubería, manguera o línea antes de cada muestreo para

mantener las condiciones de esterilidad. El procedimiento es el mismo al empleado para

la toma de la muestra.

Nunca de debe llenar el dispositivo de muestreo completamente, evite que el medio

toque la parte interior del tubo o manguera de entrada. Si se necesita tomar un volumen

mayor de la muestra, de deberá tomar un doble muestreo.

El dispositivo de muestreo tiene que ser esterilizado para mantener la esterilidad. La línea

tiene que se ser lavada antes de la toma de la muestra.

Limpieza del electrodo de PH: Limpiar el electrodo de pH con agua destilada y secarlo con

papel secante antes de su almacenamiento. En caso de contaminación, los siguientes

procedimientos pueden ser útiles para proteger el electrodo. Sin embargo, estos

tratamientos pueden conducir a la pérdida de la garantía de algunos equipos.

Contaminación por lípidos o grasas: Utilizar detergentes, o solventes como el etanol,

acetona y éter dietílico, estrictamente por un corto tiempo. Después, lavar con agua

destilada.
Contaminación con carbonatos e hidróxidos metálicos: Agite la parte inferior del

electrodo en una solución al 10% de HCl y lave con agua.

Contaminación con sulfuros: Agitar la parte inferior del electrodoen10% de HCl saturado

con tiourea y lave con agua.

Contaminación con proteínas: Dejar el electrodo en HCl 0,1M con 10 mg de pepsina/mL

durante varias horas y lávelo con agua.

Mantenimiento de las entradas estériles y los filtros de salida: No aplicar limpieza. Las

membranas de los filtros que están bloqueadas por la humedad se pueden secar

gasificando los filtros cuidadosamente con aire seco, limpio y presurizado o a presión. Si el

medio de cultivo o la espuma entran en los filtros, entonces deben ser sustituidos. Los

filtros pueden ser esterilizados varias veces en la autoclave. Sin embargo, los mismos

deberán ser sustituidos o reemplazados si son dañados o están bloqueados

completamente. Limpiar las tuberías o mangueras utilizadas, y verificar cuidadosamente el

daño en estas. La tubería o manguera debe ser sustituida o reemplazada, si está dañada.
 Bibliografía

https://www.researchgate.net/publication/261983198_ESTERILIZACION_INDUSTRIAL

https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/70890/COLLADO%20-%20Dise
%C3%B1o%20de%20un%20biorreactor%20de%205000%20l%20para%20la
%20reproducci%C3%B3n%20de%20la%20microalga%20Isochrysis
%20galb....pdf?sequence=1

https://www.lambdainstruments.com/fileadmin/user_upload/PDF/MINIFOR/Manual_de_

Operacion_del_Fermentador_y_Bioreactor_de_Laboratorio_LAMBDA_MINIFOR.pdf

https://es.scribd.com/document/307129192/Manual-de-Operacion-Biorreactor