Práctica No.

Extracción de ADN humano

Introducción

La extracción de ADN es uno de los procedimientos más útiles en biología molecular. La pureza y
cantidad de ADN son factores fundamentales a la hora de realizar metodologías como la
PCR, la clonación de fragmentos de ADN, la digestión con enzimas de restricción o
la secuenciación. Esto, debido a la interferencia que pueden presentar compuestos como
nucleasas, proteínas, iones u otros compuestos.

En esta práctica se lleva a cabo la extracción de ADN a partir de células epiteliales de boca. Es
importante resaltar que los protocolos de purificación de ADN se extienden a otros tejidos,
organismos o incluso medios. La diversidad de fuentes de obtención de ADN supone retos
distintos al procesamiento de las muestras, debido a las condiciones fisicoquímicas diferenciales
que estas presentan.

El proceso de purificación de ADN humano llevado a cabo en esta práctica se realiza mediante el
uso del kit Quick-gDNA™ MiniPrep Plus (Zymo Research). Se pretende estudiar la calidad
del ADN extraído mediante este procedimiento con el fin de familiarizar al estudiante con los
procedimientos básicos de biología molecular como son: la electroforesis, la extracción y
purificación de ADN.

Objetivos

 Comprender los principios involucrados en el proceso de extracción de ADN.

 Realizar la extracción y purificación de ADN a partir de células epiteliales de boca.
 Analizar la importancia de este procedimiento en el desarrollo de la biología
molecular.
 Visualizar el ADN extraído en geles de agarosa.

Materiales y Métodos

Obtención de células epiteliales y Lisis

1. Realice un enjuague bucal con agua

2. Utilice un hisopo de algodón esteril y frote varias veces el carrillo bucal realizando un
raspado de sus células bucales mediante movimientos circulares en el vestíbulo de la boca
(parte interior de las mejillas). Asegúrese de realizar un raspado con suficiente fuerza, sin
lastimarse, pero sacando la mayor cantidad de células bucales posibles, se recomienda
realizarlo de modo circular 20 veces en cada lado.
3. Coloque el isopo en solución salina al 0,85%
 4. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4°C y descartar el sobrenadante hasta dejar
200µl.
5. A 200µl de muestra agregar 200ul de BioFluid & Cell Buffer y 20µl Proteinasa K, realizar
mezclar por 6 segundos y dejar a 55°C 10 minutos.

Purificación por columna

1. Agregar Binding Buffer 1:1 con la mezcla anterior. Es decir agregar 420µl de Binding Buffer
y mezcle.
2. Transferir la mezcla a columna con un tubo de colección.
3. Centrifugar a 13000 g por 1 minuto y descartar el tubo de colección con el contenido.
4. Tomar un nuevo tubo de colección y agregar 400ul de Pre-Wash Buffer a la columna.
5. Centrifugar a 13000 g por 1 minuto y agregar 700ul de Wash Buffer a la columna.
6. Centrifugar a 13000 g por 1 minuto y agregar 200ul de Wash Buffer a la columna.
7. Centrifugar a 13000 g por 1 minuto o hasta drener completamente el líquido.
8. Centrifugar a 13000 g por 1 minuto o hasta drener completamente el líquido, para
eliminar las trazas de etanol.
9. Transferir columna a eppendorf de 1.5ml.
10. Agregar 50ul de Elution Buffer a la columna.
11. Incubar a T° ambiente por 5min
12. Centrifugar a 13000 g por 2 minutos.
13. Incubar a 55ºC por 5 minutos para resuspender el ADN adecuadamente.
14. Guardar tubo eppendorf con ADN eluido a -20°C.