FISIOLOGÍA Y CINÉTICA

MICROBIANA
Dra. Maribel Plascencia Jatomea
 Tema 5:

Formulación y balanceo de
medios de cultivo
“Toda la naturaleza es, como se ha
dicho, una conjugación activa y pasiva
del verbo comer”.
-William Ralph Inge
Metabolismo
Conjunto de reacciones catabólicas y anabólicas

 Catabolismo:
Conjunto de procesos que participan en la degradación de compuestos en
productos más pequeños.
Las reacciones enzimáticas que toman parte de denominan reacciones
catabólicas.

 Anabolismo:
Reacciones mediante las cuales los m.o. construyen o sintetizan sustancias
químicas complejas a partir de moléculas simples.
Las reacciones enzimáticas que toman parte se denominan reacciones
biosintéticas y requieren energía. El ATP formado en las reacciones
catabólicas es empleado en el anabolismo.
Requerimentos de nutrientes comunes

Macronutrientes o macroelementos
 Son captados por los m.o. en cantidades relativamente grandes. Más del
95% del peso seco de la célula microbiana esta constituido por C, O, H, N, S,
P, K, Ca, Mg y Fe.
 C, O, H, N, S y P. Componentes de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos
nucleicos. Son necesarios en cantidades de g/L de medio de cultivo.
 Carbono. Fuente de energía y/o compuestos para biosíntesis.
 Nitrógeno y azufre. Se encuentran en las células en forma reducida como
grupos amino y sulfhidrilo; generalmente en forma reducida, aunque algunos
m.o. los asimilan en forma oxidada. Sulfatos, nitratos, peptonas (N y S) y
cisteína.

Fijación de N2 (N2 NH3)

 K, Ca, Mg y Fe: se encuentran en la célula en forma
de cationes, desempeñando varias funciones. Se
utilizan en cantidades de mg.

 K+: necesario para actividad de enzimas, entre

ellas algunas que participan en la síntesis de
proteínas.
 Ca2+: contribuye a la termorresistencia de
endosporas.
 Mg2+: actúa como cofactor de muchas enzimas,
forma complejos con el ATP y estabiliza los
ribosomas y las membranas celulares.
 Fe2+ y Fe3+: Forma parte de los citocromos y es
cofactor de enzimas y de proteínas
transportadoras de electrones.
 Requerimientos de N, P y S

Se deben incorporar en grandes cantidades. Aunque pueden adquirirse a

partir de los mismos nutrientes que aportan C, los m.o. suelen emplear
también fuentes inorgánicas.

 N: necesario para sintetizar a.a., purinas, pirimidinas, algunos CHTOS y

lípidos.

 P: presente en ácidos nucleicos, fosfolípidos, nucleótidos como ATP, varios

cofactores, algunas proteínas y otros componentes celulares.

 S: necesario para la síntesis de sustancias como los a.a. cisteína y metionina,

algunos CHTOS, biotina y tiamina.
 Micronutrientes o microelementos
(u oligoelementos)

 Se requieren en cantidades tan pequeñas, que los

contaminantes presentes en agua, en los recipientes para el
cultivo y en los componentes habituales del medio son a
menudo suficientes.

 Normalmente son parte de enzimas y cofactores; facilitan la

catálisis de reacciones y mantenimiento de la estructura de
proteínas.

 Mn, Zn, Co, Mo, Ni y Cu deben

estar disponibles en cantidades
de g.
 Zn2+: se localiza en el centro activo de
algunas enzimas.

 Mn2+: facilita a muchas enzimas la catálisis

de la transferencia de los grupos fosfato.

 Mo2+: necesario para fijar nitrógeno.

 Co2+: componente de la vitamina B12.

 Cu2+: tiene funciones en algunas enzimas de

óxido-reducción.
 Factores de crecimiento

Son sustancias precursoras de ciertos constituyentes orgánicos de la célula que

el m.o. es incapaz de sintetizar; generalmente se requieren en pequeñas
concentraciones. Existen tres clases principales:

1. Aminoácidos síntesis de proteínas

2. Purinas y pirimidinas síntesis de ácidos nucleicos
3. Vitaminas normalmente forman la totalidad o parte de los
cofactores enzimáticos; constituyen grupos
prostéticos o centros activos de ciertas enzimas.
 Fuentes de carbono, energía e hidrógeno/electrones

Fuentes de carbono
Autótrofos CO2 como única o principal fuente de carbono
Heterótrofos Moléculas orgánicas preformadas, reducidas, a
partir de otros organismos
Fuentes de energía
Fotótrofos Luz
Quimiótrofos Oxidación de compuestos orgánicos o
inorgánicos
Fuentes de hidrógeno o electrones
Litótrofos Moléculas inorgánicas reducidas
Organótrofos Moléculas orgánicas
Requerimientos nutricionales debidas a mutaciones

Las necesidades nutricionales de los m.o. varían según las

especies; pueden cambiar en una misma especie debido a
mutaciones.

 Protótrofo: m.o. que precisa de los mismos nutrientes que la

mayoría de los miembros de su especie.
 Auxótrofo: m.o. mutado que carece de la capacidad para
sintetizar un nutriente esencial y por ello, debe obtenerlo, o a
su precursor, del medio.
Clasificación Fuente de carbono Fuente de energía

Autótrofos CO2 -------

Heterótrofos Compuestos --------

orgánicos
Quimiótrofos --------- Compuestos químicos

Quimiolitótrofos _______ Compuestos químicos

inorgánicos
Quimiorganótrofos _______ Compuestos químicos
orgánicos
Quimioautótrofos CO2 Compuestos químicos

Fotótrofos _______ Luz

Fotoautótrofos CO2 Luz

Fotoheterótrofos Compuestos Luz

orgánicos
Quimioheterótrofos Compuestos Compuestos químicos
orgánicos
Composición típica de compuestos orgánicos e
inorgánicos de m.o.

Compuesto Bacteria Levaduras Hongos

(% base seca) (% base seca) (% base seca)

Promedio Promedio Promedio

Carbono 48 46-52 48 46-52 48 45-55
Nitrógeno 12.5 10-14 7.5 6-8.5 6 4-7
Proteínas 55 50-60 40 35-45 32 25-40
Carbohidratos 9 6-15 38 30-45 49 40-55
Lípidos 7 5-10 8 5-10 8 5-10
Acidos nucleicos 23 15-25 8 5-10 5 2-8
Cenizas 6 4-10 6 4-10 6 4-10
Composición típica de compuestos orgánicos e
inorgánicos de m.o.

g/100 g en peso seco

Elemento Bacteria Hongos Levaduras
Fósforo 2-3 0.4-4.5 0.8-2.6
Azufre 0.2-1.0 0.1-0.5 0.01-0.24
Potasio 1-4.5 0.2-2.5 1-4
Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.3 0.1-0.5
Sodio 0.5-1 0.02-0.5 0.01-0.1
Calcio 0.01-1.1 0.1-1.4 0.1-0.3
Fierro 0.02-0.2 0.1-0.2 0.01-0.5
Cobre 0.01-0.02 --------- 0.002-0.01
Manganeso 0.001-0.01 --------- 0.0005-0.007
Molibdeno -------- --------- 0.0001-0.0002
Total Cenizas 7-12 2-8 5-10
 Células
Sustratos
X
S1
Productos
S2
P1
Sn
P2
Pn
Factores que limitan la formulación de
medios de cultivo:

 Algunos elementos del sustrato liberados como productos

no asimilados a material celular.
 Velocidades limitantes y estequiometría, deben
considerarse los rendimientos.
 Nutrientes específicos que pudieran ser limitantes, o
productos específicos que pueden ser inhibitorios.
 Factores ambientales.
 Factores de crecimiento (a.a., purinas,
pirimidinas, vitaminas).
Datos de composición celular

 Bacterias
C0.53 ; N0.12 ; O0.19 ; H0.07

 Levaduras
C0.47 ; N0.075 ; O0.31 ; H0.065
Crecimiento microbiano: Descripción química

aCHxOy + bO2 + cNH3 CHaOb Nd+ dCO2 + eH2O

C: a=1+d
H: ax + 3c =  + 2e
O: ay + 2b =  + 2d + e
N: c=
RQ = moles de CO2 / moles de O2 = d/b

YX/S =X Biomasa producida (Xf – X0)

s Sustrato consumido (S0 – Sf)

Medios de cultivo

 Aunque todos los m.o. necesitan fuentes de energía, C, N, P, S y

varios minerales, la composición precisa de un medio de cultivo
adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar.

 Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar

m.o. específicos, o para facilitar la identificación de una
especie en particular.

 De acuerdo al estado físico, los medios de cultivo se clasifican

en sólidos y líquidos.
Medio sintético o definido

 Son medios en que se conocen todos los

componentes.

 Los medios definidos se emplean ampliamente en

investigación ya que con frecuencia se requiere
conocer qué está metabolizando el m.o. en estudio.
 Medio BG-11 para cianobacterias

Cantidad (g/L)
NaNO3 1.5
K2HPO4.3H2O 0.04
MgSO4.7H2O 0.075
CaCl2.2H2O 0.036
Ácido cítrico 0.006 Cianobacterias, capaces de realizar la
fotosíntesis bajo condiciones aerobias
Citrato amónico férrico 0.006
Na2CO3 0.02
EDTA (sal de Na2Mg) 0.001
Solución de metales traza 1 mL/L
 Medios complejos

 Contienen algunos ingredientes cuya composición química se

desconoce. Son medios suficientemente ricos para satisfacer
las necesidades nutricionales de diversos microorganismos.

 De gran utilidad cuando se desconoce los requerimientos

nutricionales de un m.o. en particular.
 Los medios complejos contienen peptonas,
extracto de carne y de levadura

 Peptonas: hidrolizados de proteínas obtenidos de la

digestión parcial de carne, caseína, harina de soya y
otras proteínas. Sirven como fuente de C, N y energía

 Extracto de carne: contiene a.a., péptidos,

nucleótidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales

 Extracto de levadura (de cerveza): fuente de

vitaminas del complejo B, y de compuestos de N y C
Tipos de medio

 Selectivos
 Diferenciales
 Medios selectivos

Contienen sustancias específicas que favorecen el

crecimiento de un tipo particular de m.o.
Las sales biliares o colorantes como la fucsina y el
cristal violeta favorecen el crecimiento de Gram(-),
inhibiendo el desarrollo de Gram(+).
Agar Salmonella-Shigella (SS), adicionado con sales biliares para
inhibir coliformes. Se producen colonias incoloras por la
incapacidad de fermentar lactosa.

Agar sulfito de bismuto (BS). Para aislar Salmonella typhi; colonias

negras con tono metálico.

Agar sal manitol (MS), adicionado con 7.5% de sal.

Se usa para aislar estafilococos.
 Medios diferenciales

Contienen productos químicos para dar lugar a una

alteración visible del medio de cultivo
Diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una
identificación tentativa de m.o. según las características biológicas.
Ejemplo: agar sangre.

Agar Eosina azul de metileno (EMB). Contiene lactosa, sales y colorantes

(eosina y azul de metileno), para diferenciar entre fermentadores y no
fermentadores de lactosa. E. coli (fermentador) produce colonias oscuras o con
brillo metálico.

Agar McConkey. Adicionado con sales biliares y cristal violeta. Para selección
y recuperación de Enterobacteriaceae y bacterias Gram(-). Bacterias
fermentadoras de lactosa producen colonias rojas.

Agar entérico de Hektoen. Adicionado con elevada concentración de sales

biliares como inhibidor. Para aumentar el rendimiento de Salmonella y
Shigella.
Formulación de medios de cultivo

 Consiste en la formulación cuantitativa del medio, tomando

en cuenta todos los elementos o nutrientes requeridos.

 Los macronutrientes son los que controlan la velocidad de

crecimiento.

 Los medios de cultivo deben prepararse con una

formulación balanceada cualitativa y cuantitativa.
Rendimiento
biomasa/sustrato (YX/S)

YX/S = X Biomasa producida (Xf – X0)

Sustrato consumido (S0 – Sf)
s
Rendimiento de biomasa producida por fuente de
carbono consumida

M.o. aerobio = 0.5 biomasa

M.o. anaerobio = 0.1 biomasa
 Rendimiento = Y = 0.5
50% Biomasa + 50% producción
m.o. aerobio de metabolitos y mantenimiento
celular.

Sustrato (S0)

m.o. anaerobio Rendimiento = Y = 0.1

10% Biomasa + 90% producción
de metabolitos y mantenimiento
celular.
Composición celular

 Cantidad de C = 50%
 Cantidad de N = 8%

 Cantidad de P = 5%

 Cantidad de S = 3%

El hidrógeno y el oxígeno constituyen el agua

Ejercicio 1
Diseñar un medio de cultivo para un m.o. heterótrofo
simple anaerobio
Fuente de C: glucosa
Fuente de N: cloruro de amonio, NH4Cl
Fuente de S: sulfato de magnesio, MgSO4
Fuente de P: fosfato ácido de potasio, KH2PO4

La célula bacteriana tiene 50% C, 8% N, 5% P y 3% S

¿Qué cantidad de cada uno de los compuestos se tiene que

añadir a 1 L de agua para producir 20 g/L de biomasa?
Solución
Rendimiento
Glucosa
20 g biomasa 0.5 g C 180 g Glucosa = 25 g/L
L g biomasa 72 g C

25 g Glucosa 10% biomasa (anaerobio)

x 100% biomasa
x = 250 g Glucosa

Si el m.o. fuera aerobio, entonces se requieren 50 g Glucosa

Algunos métodos para medir crecimiento:

 Conteo directo al microscopio

 Método del número más probable
 Dilución en placa
 Turbidimetría
 Peso seco
 Actividad celular
 Efecto de la concentración de nutrientes sobre la
velocidad de crecimiento o proliferación de los m.o.

 La concentración de nutrientes puede

afectar la velocidad de crecimiento y la
proliferación total.
 A concentraciones muy bajas de
nutrientes, la velocidad de crecimiento se
reduce.
 A concentraciones moderadas y altas
de nutrientes, las velocidades son idénticas
pero la proliferación total (máxima)
queda limitada.

Tasa específica de crecimiento de E. coli creciendo

en un medio con glucosa como única fuente de C
(J Bacteriol. Jul 1971; 107(1): 210–216)
 Efecto de la cantidad de
nutrientes sobre el crecimiento
total (máximo):
La mayoría de los nutrientes son
convertidos en material celular, y si
la cantidad de nutrientes es limitada,
también lo será la cantidad de
material celular (biomasa).

 Efecto de concentraciones bajas

de nutrientes sobre el
crecimiento:
Es posible que el nutriente no puede
ser transportado hacia la célula a
una velocidad lo suficientemente
rápida como para satisfacer todas
las demandas metabólicas del m.o.
Relación entre la concentración de nutrientes y
producción máxima

Curvas de proliferación
a diferentes conc de
nutrientes.
A bajas cantidades se
afectan tanto la
velocidad de
proliferación como la
producción máxima.
Efecto de la concentración de nutrientes sobre la
velocidad de proliferación
Crecimiento
sincronizado

Poblaciones de células que están en la

misma etapa de crecimiento. Se pierde
la sincronía debido a que las diferentes
poblaciones no envejecen igual.

El crecimiento sincronizado se puede

obtener mediante la alteración del
ambiente (temperatura,o nutrientes).
Por ejemplo: A baja temperatura los
m.o. aumentan su talla pero no hay
división, para después incrementar a la
temperatura óptima.
Quimostato

Permite mantener la población

microbiana constante.
Consiste de un reservorio con
medio estéril un regulador de
flujo que controla la adición
de medio fresco al cultivo.
El reservorio del cultivo a su
vez tiene paso a otro
recipiente que colecta el
medio agotado.
Ecuación de Monod

Describe la velocidad de crecimiento en relación a la concentración

de nutrientes.
m =mmax [S/Ks+S]
donde:
m Velocidad específica de crecimiento.
mmax Velocidad máxima específica de crecimiento.
S Concentración de sustrato.
Ks Constante de afinidad del m.o. al sustrato.
Velocidad específica de crecimiento
max

0.5max

Ks
Concentración de Sustrato
Rendimiento celular

Expresa la masa celular obtenida o cantidad de

producto por unidad de masa o sustrato consumido

Yx/s = DX/DS,

Yp/s= DP/DS,