Fluorescencia: bandas espectrales

Espectros de excitación y emisión

Espectro de emisión: se obtiene midiendo la fluorescencia emitida por la

muestra a distintas longitudes de onda, manteniendo la luz de excitación
a longitud de onda constante.

Espectro de excitación: la luz de excitación se barre a través de distintas

longitudes de onda, manteniendo la luz de emisión a una longitud de
onda constante.
 ¿Cuál es la diferencia entre el espectro de excitación y el
de absorbancia de una molécula?

El espectro de excitación es, en general, muy similar al de

S2 absorción. Relacionados con el mismo proceso.

Las diferencias, si las hay, se deben a factores instrumentales

(espectrofotómetro vs. espectrofluorímetro)
S1

So

absorción = excitación
 Fotoluminiscencia: bandas espectrales

Corrimiento de Stoke (nex – nem)

Intensidad Excitación
Fluorescencia
Fosforescencia

 (nm)
em = ex F de resonancia (base de fluorescencia atómica)

Espectros del fenantreno

Intensidad relativa

Longitud de onda (nm)

¿En qué region del espectro aparecerá el espectro de emisión si
la molécula se excita con luz de distintas ?

La relajación radiante siempre se produce del nivel

excitado con menor energía S1* (regla de Kasha). Por lo
S1
tanto, la energía emitida es siempre la misma

S0 El espectro de emisión aparece en la misma región

espectral, independientemente de la longitud de
onda de excitación
Espectros de la quinina
La intensidad de la emisión se relaciona con la longitud de onda de excitación,
pero la distribución espectral (posición del espectro de emisión) es siempre la
misma independientemente de la longitud de onda de excitación.

Intensidad de fluorescencia
Intensidad de fluorescencia

Espectro de
emisión
Espectro de excitación

Longitud de onda (nm)

Los perfiles de emisión obtenidos son idénticos, pero la intensidad de

fluorescencia decrece en el orden EM1 > EM2 > EM3, de acuerdo a la amplitud de
la excitación.
 Los espectros son imágenes especulares

Los niveles de energía vibracional de ef y ee son similares. Si la probabilidad de transición entre,

por ej., los niveles cero y 1 (0 →1) es la más alta, la transición de emisión recíproca (1 → 0) es
también altamente probable. Por lo tanto, estas bandas tendrán intensidades (alturas) similares
(el corrimiento entre ambas está dado por pérdida de energía vibracional).

El espectro de excitación y el de emisión de un compuesto frecuentemente aparecen

como imágenes especulares, con una sobreposición en la línea de resonancia.
Los espectros son imágenes especulares

Antraceno
 Excepciones a la regla de la imagen especular

Promoción a distintos estados electrónicos excitados (S1, S2) y emisión a partir de

S1. Ejemplo: naproxeno, quinina

S2
S1

Intensidad
S0

Longitud de onda (nm)

 Excepciones a la regla de la imagen especular

Transferencia de energía en estado excitado. Ejemplo: formas tautoméricas que

absorben radiación a distintas longitudes de onda pero la emisión se produce
desde el nivel más estable.

a* F
b*

b
a


 Excepciones a la regla de la imagen especular

Ejemplo: 4-(2-hidroxi-1-naftilazo) bencensulfonato de sodio (HNBS)

Excitación

Emisión (exc=500 nm)

Emisión (exc=400 nm)

 Excepciones a la regla de la imagen especular

pKa = 11
pKa* = 4

En estado excitado el OH
es más ácido y la emisión
1-hidroxipireno 3,6,8 trisulfonato se produce desde la
especie deprotonada.

El espectro de emisión es
imagen especular del
Intensidad

espectro de absorción de la
forma deprotonada

Longitud de onda (nm)

Excepciones a la regla de la imagen especular

Intensidad de fluorescencia

Longitud de onda (nm)

 Excepciones a la regla de la imagen especular

Intensidad de fluorescencia

Longitud de onda (nm)

Formación de complejo en estado excitado que emite radiación (a alta cc del

analito). Ejemplo: pireno
 Otras bandas en el espectro

Además de las bandas de fluorescencia, se pueden observar otras

bandas correspondientes a las dispersiones Rayleigh y Raman

F RAYLEIGH

FLUORESCENCIA RAYLEIGH
2° orden

RAMAN RAMAN
2° orden


 Otras bandas en el espectro

Cuando la luz de excitación interacciona con moléculas de solvente, estás

moléculas se promueven a estados posibles entre S0 y S1.
Si la molécula de solvente se relaja emitiendo radiación (sin pérdida de
energía), esta radiación corresponde a la dispersión Rayleigh

S1

S0
RAYLEIGH

La emisión Rayleigh posee la misma

energía que la luz incidente
 Otras bandas en el espectro

La banda Rayleigh aparece a la misma longitud de onda que la banda

de excitación.

F
RAYLEIGH

EMISIÓN
EXCITACIÓN

280 300 320 340 

 Otras bandas en el espectro

Si las moléculas de solvente excitadas se relajan hasta el primer estado

vibracional excitado emitiendo radiación, esta radiación corresponde a la
dispersión Raman.

S1

S0

La luz de dispersión Raman usualmente

posee menor energía que la luz incidente.
El Raman siempre se ve a una diferencia constante de número
de onda en relación al número de onda de la excitación.