Exhibición de investigación sobre la detección y recuperación de células tumorales

circulantes de sangre periférica de pacientes con cáncer usando microfluidos espirales

del equipo del Profesor Chwee Teck Lim en el Departamento de Ingeniería Biomédica
y el Instituto de Mecanobiología, Universidad Nacional de Singapur, y el Profesor
Jongyoon Han en la Alianza Singapur-MIT para Investigación y Tecnología (SMART),
Singapur. (Ilustraciones de Larisa Bulavina del Instituto de Mecanobiología de la
Universidad Nacional de Singapur)

Título: Un biochip de microfichas en espiral de ultra alto rendimiento para el

enriquecimiento de las células tumorales circulantes

El microchip de microfichas en espiral para detectar y caracterizar células tumorales

circulantes raras de la sangre de pacientes con cáncer no solo puede proporcionar
información crítica sobre la biología del tumor, sino que también es muy prometedor
para el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento del cáncer.

……………………………

La detección y caracterización de células tumorales circulantes (CTC) raras a partir

de la sangre de pacientes con cáncer puede proporcionar una visión crítica de la
biología del tumor y puede ser muy prometedor para el tratamiento del cáncer. La
capacidad de recopilar una gran cantidad de CTC viables para varios ensayos
posteriores, como las mediciones cuantitativas de biomarcadores específicos o el
análisis de mutación somática dirigida es cada vez más importante en la oncología
médica. Aquí, presentamos un dispositivo microfluídico simple pero confiable para
el aislamiento basado en el tamaño, sin etiquetas, de ultra alto rendimiento de CTC
a partir de volúmenes de sangre clínicamente relevantes. El tiempo de
procesamiento rápido de la técnica (7,5 ml de sangre en menos de 10 min) y la
capacidad de recolectar más CTC a partir de grandes volúmenes de sangre se
presta a una amplia gama de posibles aplicaciones genómicas y
transcriptómicas.Una ventaja fundamental de este protocolo es la capacidad de devolver
todas las fracciones de sangre (es decir, plasma (centrifugación), CTC y glóbulos blancos
(WBC) (clasificación basada en el tamaño) que pueden utilizarse para diversos estudios de
biomarcadores o sensibles al tiempo ensayos moleculares tales como qRT-PCR. El uso clínico
de este biochip se demostró mediante la detección de CTC del 100% (10/10) de muestras de
sangre tomadas de pacientes con cáncer de mama y pulmón metastásico en etapa avanzada.
La tasa de recuperación de CTC varió de 20 a 135 CTCs mL-1 y se obtuvo con alta pureza (de
1 CTC de cada 30-100 WBC, lo que da un agotamiento de aproximadamente 4 log de los
WBC). Se identificaron con ensayos de inmunofluorescencia (pan citoqueratina + / CD45-) y
sondas moleculares tales como HER2 / neu.

Introducción:

Las células tumorales circulantes (CTC), células cancerosas de origen tumoral sólido que se
vierten en el torrente sanguíneo a partir de tumores primarios o secundarios de pacientes,
contribuyen directamente a la diseminación metastásica hematógena y al crecimiento posterior
de células tumorales en sitios distantes dentro del cuerpo1. 2 El aislamiento y la recuperación
de estos CTC es muy desafiante, principalmente debido a su rareza en sangre periférica y su
heterogeneidad.3 Sin embargo, el enriquecimiento de los CTC puede ayudar a los médicos a
comprender mejor la biología de la metástasis y la progresión de la enfermedad y contribuir al
cáncer gestión por potencialmente que sirve como una poderosa herramienta de pronóstico
clínico y análisis no invasivo de genotipos tumorales para el tratamiento terapéutico de las
enfermedades relacionadas con el cáncer.3,4. Sin embargo, los enfoques clínicos
convencionales para el aislamiento de CTCs de sangre periférica, incluyendo
citometría de flujo, centrifugación de 5 gradientes, 6 y fluorescencia y clasificación
de células activadas magnéticamente, 7,8 a menudo se basan en técnicas de
reconocimiento de antígenos, que son costosas y
limitado en rendimiento y pureza La mayoría de las técnicas requieren largos
tiempos de procesamiento, lo que resulta en una baja viabilidad celular de los CTC
enriquecidos. Tampoco permiten el fraccionamiento completo y la preservación de
plasma, glóbulos blancos (WBC) y CTC. Por lo tanto, un método confiable para el
enriquecimiento rápido, eficiente y efectivo de las CTC será fundamental para
profundizar nuestra comprensión del proceso metastásico y contribuir al campo de
la oncología clínica.

Microfluidics es una de las tecnologías que se desarrollan más rápidamente para la innovación
en la investigación del cáncer. La aplicación de sistemas microfluídicos para la separación de
CTC proporciona oportunidades sin precedentes para el enriquecimiento eficiente de estas
células extrañas de la sangre, lo que permite una caracterización molecular detallada de ellas a
nivel de célula única.9 Aunque se han informado varios dispositivos microfluídicos para el
aislamiento de CTC que utilizan antígenos de superficie de células epiteliales como EpCAM
(molécula de adhesión de células epiteliales), 10,11. estas plataformas / técnicas se basan
en la mediación de la interacción de CTC diana con características recubiertas con
anticuerpos anti-EpCAM, que incluyen micropilares10 o superficies nanoporosas12
en condiciones laminares controladas con precisión y eficacia confiable. Sin
embargo, algunas células tumorales expresan poca o ninguna EpCAM (p. Ej., Para
células que experimentan transición mesenquimal epitelial (EMT)), lo que da como
resultado la recuperación incompleta de CTC1,13. Además, los enfoques de
aislamiento inmunomagnético implican la manipulación bioquímica de las células, lo
que son inviables o desafiantes tanto para el cultivo como para el análisis molecular
aguas abajo.14,15 Hasta la fecha, también se han desarrollado varios dispositivos
microfluídicos que emplean fuerzas dielectroforéticas para el aislamiento de células
cancerosas en función de las diferencias en las respuestas de las células al campo
eléctrico.14,16,17

Aunque esto permite la clasificación de células sin etiquetas sin depender de la

inmunoquímica, esta técnica es limitada debido a las sutiles diferencias dieléctricas
entre CTC y células sanguíneas, lo que afecta el rendimiento y la pureza y los altos
campos eléctricos que potencialmente pueden causar la expresión génica
(fenotípica) cambios.18 Para superar las limitaciones anteriores, se han explotado el
tamaño y la deformabilidad de las células para aislar los CTC de la sangre. Se cree
que la mayoría de los CTC son más grandes que los otros componentes sanguíneos
(<20 mm) (glóbulos rojos, glóbulos blancos periféricos y plaquetas), 19,20
incluyendo células tumorales obtenidas de pacientes con cáncer de pulmón de
células pequeñas.21 Esto evita la necesidad de cualquier conocimiento previo de
las características bioquímicas de las células diana, al tiempo que permiten la
recolección de supuestos CTC independientemente de su expresión EpCAM.. Los
métodos de aislamiento de CTC basados en tamaño / deformabilidad más populares
se basan en el uso de membranas grabadas por seguimiento o filtros
microfabricados.22,23 Estas técnicas están limitadas por el volumen de sangre que
se puede procesar debido a problemas derivados de obstrucción del filtro, baja
recuperación, baja pureza y baja viabilidad celular debido al daño celular causado
por la alta cizalla que se produce cuando las células pasan a través de los poros del
filtro
Los sistemas de filtración hidrodinámica para la separación basada en el tamaño en
los dispositivos microfluídicos pueden superar estas deficiencias de los enfoques
actuales que incluyen obstrucción, baja recuperación y problemas de viabilidad
celular.24,25 El flujo laminar controlado dentro de los canales microfluídicos se puede
manipular para generar tamaños dependientes trayectorias celulares para el
enriquecimiento CTC de alta resolución. Anteriormente, informamos sobre una
novedosa plataforma de microfluidos para el fraccionamiento de la sangre (también
conocida como "Dean Flow Fractionation") y la aplicamos con éxito para el aislamiento
de CTC de sangre completa.25,26 Hemos demostrado que el biochip espiral integrado
es capaz de procesar sangre con un hematocrito de 20-25%, lo que permite el
procesamiento y el enriquecimiento de células raras con una velocidad de 3 ml h-1.

Aquí, informamos el desarrollo de un biochip espiral multiplexado simple pero confiable para el
aislamiento de ultra alto rendimiento, aislamiento sin etiquetas de CTC para abordar los
desafíos de la plataforma de enriquecimiento CTC de próxima generación, como alta
sensibilidad (tasa de detección cercana al 100%) ), alta pureza (750 WBCs mL-1), alto
rendimiento (7.5 mL en menos de 10 min), enriquecimiento sin etiquetas, simplicidad y facilidad
de operación. A diferencia de la versión anterior, este dispositivo puede funcionar con un
mínimo de dos bombas de jeringa en lugar de tres (es decir, simplificando la automatización) y
puede procesar un mayor volumen de muestras de sangre en menos tiempo con una
sensibilidad y pureza relativamente más altas. El procesamiento de un mayor volumen de
muestras de sangre puede aumentar la cantidad de CTC enriquecidos para
múltiples análisis aguas abajo, como tinción inmunofluorescente, RT-PCR
cuantitativa (qRT-PCR),
 hibridación fluorescente in situ (FISH) y también pruebas moleculares sensibles al
tiempo como la secuenciación de ARN. El uso clínico de este biochip se demostró
mediante el aislamiento de CTC del 100% (10/10) de muestras de sangre tomadas
de pacientes con cáncer de mama y pulmón metastásico en etapa avanzada. Las
células recuperadas no están etiquetadas y, por lo tanto, son más viables para la
propagación,
pruebas de desarrollo de medicamentos y otros análisis posteriores. Este diseño es
ideal para el desarrollo de un dispositivo de detección y recuperación de CTC
automatizado y de bajo costo para el diagnóstico de cáncer
y pronóstico