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Identificación de microorganismos presentes en

lixiviados de desechos domésticos

Valeria Tabares , Jose David Pereiro , Jose Luis Parra


a a a, b

vale-tabares@hotmail.com, josedavidpereiro@gmail.com, joseparra1997@gmail.com

a
Departamento de Ingeniería Bioquímica, Universidad Icesi, Cali, Colombia
b
Departamento de Ingeniería Industrial, Universidad Icesi, Cali, Colombia

Laboratorio de Microbiología Industrial

Santiago de Cali, 6 de septiembre de 2019

ABSTRACT

Tomando aproximadamente 20ml de lixiviados de desechos de cocina se realizó una técnica de


siembra en cinco medios de cultivo diferentes con el objetivo de reconocer la presencia de distintos
microorganismos. Luego de 72 horas, se identificaron diversas poblaciones microbianas tales como
bacterias coliformes, amilolíticas, proteolíticas, y pseudomonas. Además, mediante la preparación de seis
diluciones, se realizó un recuento en superficie de la población microbiana presente en la muestra del
lixiviado; con el cual se concluyó la necesidad de diluir aún más las muestras debido a la incapacidad de
ejecutar el recuento a raíz del desmesurado crecimiento microbiano. Lo anterior da muestra, y permite
inferir el elevado número de microorganismos presentes en el lixiviado de desechos de hogares comunes
de la ciudad de Cali. Para cuestiones experimentales también se realizaron tinciones Gram que evidenciaron
que Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, y Staphylococcus aureus un coco Gram positivo.

Palabras Clave: Siembra, Cultivo, Bacterias, Lixiviados, Tinción de Gram.


Introducción Como objetivo, este estudio pretende distinguir,
observar, aislar y caracterizar diferentes colonias
de bacterias presentes en los desechos orgánicos
Los medios de cultivo se componen de de la basura doméstica, con el fin de determinar
soluciones que contienen los nutrientes cuáles microorganismos actúan en el proceso de
imprescindibles para permitir el crecimiento compostaje y que compuestos orgánicos son
tanto de microorganismos, células, virus o tejidos factibles para ser degradados. También
biológicos en general. Dependiendo del tipo de corroborar la presencia de microorganismos que
cultivo que se quiera llevar a cabo, el medio podrían ser responsables de la emisión de
constará de nutrientes y condiciones específicas sustancias tóxicas y/o enfermedades. Además, se
para tal fin. Estos medios de cultivo se pueden buscó constatar la utilidad que tienen los medios
obtener comercialmente o se pueden preparar en de cultivos utilizados en el estudio para el
el laboratorio (Barrero, s.f). aislamiento e identificación de bacterias
(Programa de Ingeniería Bioquímica 2019-2).
Los medios de cultivo hacen posible el análisis de
muestras de interés industrial, como lo son los
lixiviados. Los lixiviados son líquidos oscuros
producto de la descomposición de materia Metodología
orgánica qué, con la precipitación de agua, son
disueltos o arrastrados al fondo de los
contenedores de desechos. Es importante
mencionar que la degradación de los residuos Siembra y recuento en placa
orgánicos ocurre tanto en procesos aeróbicos
como anaeróbicos por parte de microorganismos. Con el fin de preparar las disoluciones se
La descomposición de estos compuestos tomaron 10mL de lixiviado proveniente de
mediante los procesos mencionados produce desechos domésticos. Se adicionaron en 90mL de
numerosas cantidades de toxinas perjudiciales caldo Casoy estéril, se agitaron uniformemente
para otros organismos o para el medio ambiente, por 5 segundos; a esta muestra se le asignó
como lo son por ejemplo el amoniaco, y el ácido dilución 10-1 siendo esta la dilución de mayor
sulfhídrico. Por tales razones, y dado el acelerado concentración. Luego se tomó 1mL de la dilución
crecimiento demográfico, es de carácter descrita anteriormente y se agregó a un tubo de
prioritario el mejoramiento de los servicios ensayo con 9mL de agua peptonada al 0,1%
sanitarios, lo cual implica nuevas tecnologías y estéril. Se rotuló como dilución 10 -2 siendo esta
mejores métodos del procesamiento de los la segunda muestra. Se repitió el procedimiento
desechos del hogar (De Jesús, 2018). Lo anterior hasta la disolución 10-6, siendo la dilución de
abre un gran campo tanto investigativo como menor concentración de lixiviado en su medio.
aplicativo para la microbiología y la ingeniería Después de esto se tomaron 0,1mL de cada
bioquímica, ya que un método alternativo para la dilución y se inocularon con un asa metálica
eliminación de residuos es el compostaje, el cual esterilizada con un mechero, en la superficie de
implica identificar los posibles microorganismos cajas de Petri con agar Casoy, correspondientes
capaces de degradar estos residuos. Por lo para cada dilución. Las siembras se incubaron a
anterior, este estudio se basa en las bacterias que 35 ± 2°C durante 72 horas bajo condiciones
son los descomponedores más importantes y aerobias.
abundantes en la tierra, las cuales poseen una
amplia gama de enzimas capaces de romper Tinción de Gram
químicamente una gran variedad de compuestos Para lograr diferenciar algunas morfologías y
orgánicos, que representan casi el 60% del total características de la muestra de lixiviado, y de
de residuos sólidos que se crean (Laich, 2011). unos cultivos anteriormente preparados de
Staphylococcus aureus y Escherichia Coli; se
tomó una pequeña porción de muestra y se
homogeneizó en una lámina con una gota de agua ANÁLISIS DE RESULTADOS
destilada, dejando secar al lado de un mechero.
Posteriormente, a cada lámina se le añadieron de
5 a 10 gotas de Cristal Violeta y Lugol dejando Para las diferentes diluciones de la
actuar durante 1 minuto cada una. Seguidamente muestra de lixiviado se obtuvieron un número
se le añadió la misma cantidad de alcohol acetona elevado de colonias que no permite su recuento
dejando actuar durante 30 segundos y fucsina como se puede apreciar en la Imagen 1. Por lo
dejando actuar durante 1 minuto. A cada uno de cual, para esta situación en específico, se puede
estos pasos se le realizó un respectivo lavado de afirmar que es necesario realizar más diluciones
la lámina para eliminar el exceso de reactivo. para así poder alcanzar el rango necesario y
Finalmente, se observó en el microscopio. especificado que es de 30 a 300 colonias. Así
sería posible reportar el recuento en UFC/mL. Por
lo tanto, se reporta que el recuento en placa de las
Siembra por aislamiento o agotamiento colonias de todas las diluciones dio mayor a 300.
Se dice que hay más de 300FD x10 UFC/mL,
Para la siembra por aislamiento se utilizó la donde FD es el factor de dilución, siguiendo la
dilución 10-1, la cual fue preparada previamente. ecuación 1; donde cabe destacar que en este caso
Se tomó la muestra de la dilución con un asa se está haciendo una siembra por superficie
metálica esterilizada con un mechero, y se añadió (sembrando 0,1mL).
al medio en ¼ de la caja Petri. En la Figura 1 se
explica la técnica de estriado, que consiste en No. de colonias x FD x 10
tomar el asa metálica y mediante un movimiento Ecuación 1. Cálculo UFC/mL
ondulatorio distribuir la muestra en otra cuarta
parte de la caja Petri. Se repitió lo anterior hasta
completar los espacios restantes del agar,
finalizando con una última estriada hacia el
centro de la caja Petri. Este procedimiento de
siembra por aislamiento o agotamiento se realizó
en 5 medios de cultivos los cuales fueron
Cetrimide para Pseudomonas aeruginosa,
Chromocult para bacteria coliformes, Baird
Parker para Staphylococcus aureus y almidón y
leche para el aislamiento de bacterias productoras
de enzimas. Todos los procesos descritos
anteriormente se incubaron a 35 ± 2°C durante 72
horas bajo condiciones aerobias.

Figura 1. Bonilla, M., Pajares, S., et al. (2016).


Técnica de siembra por estrías

Imagen 1. Diluciones de 10-2 hasta 10-6 en Agar


Casoy.
El recuento de los medios de cultivo de la Imagen al. 2017); como se observa en la Imagen 1 el agar
1, se reporta como >3x 107UFC/mL, esto se Casoy se presta para que crezcan colonias de
debió al origen de procedencia de lixiviado, ya diferentes tamaños y colores, así mismo, como el
que fue extraído de un centro de recolección de crecimiento fue tan exuberante se vio como si el
desechos de todo un conjunto residencial; en agar estuviese manchado o lleno de colonias. Lo
donde es característico encontrar residuos de anterior se debe a que el agar tiene nutrientes
verduras, carne, frutas, huesos y cáscaras de ricos en carbono y nitrógeno que permiten el
huevo, alimentos. Los dos últimos residuos crecimiento de una amplia variedad de bacterias.
orgánicos mencionados poseen una gran cantidad Este medio es utilizado para el desarrollo y
de carbonato de calcio (CaCO3). Este reacciona aislamiento de microorganismos no exigentes.
con ácidos en el medio para ajustar el valor del
pH cuando este alcanza una saturación de H +, Las tinciones de Gram se hicieron con el fin de
absorbiéndolo y haciendo tender el potencial de poder distinguir las morfologías de las diferentes
hidrógeno, pasando de un medio ácido a neutro. bacterias presentes en la muestra de estudio
Esto es benéfico para la proliferación de las (lixiviado) comparándolas con muestras de
diferentes bacterias de la muestra (Biktasheva, et bacterias ya sembradas, los resultados se
muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Morfologías vistas desde el microscopio de tres cultivos después de la tinción de Gram.
NOMBRE DE LA DESCRIPCIÓN FOTOGRAFÍA DEL
MUESTRA MICROSCOPIO

Lixiviado Cantidad de microorganismos


incapaces de distinguir por su alta
densidad de población microbiana.
Se vieron las dos morfologías:
cocos y bacilos y también los dos
tipos de bacterias según su pared,
Gram (-) y Gram (+).

Bacilos Gram negativos, morados


Escherichia coli por posible error en la tinción de
Gram. Se cree que fue por el tiempo
de la solución alcohol-acetona.

Cocos Gram positivos de color


Staphylococcus aureus violeta
El error experimental que tuvimos en las Cada uno de los diferentes medios de cultivos
tinciones de Gram fue que para el cultivo de E. utilizados a lo largo de la práctica poseen
coli nos tenía que dar la muestra un color más diferentes condiciones (nutrientes, consistencia
claro, tendiendo a rosado, esto se pudo dar por adecuada del medio, pH, entre otros) que
diversos factores en la práctica, como por estimulan el crecimiento de un tipo específico de
ejemplo: no hacer un buen lavado en la muestra bacterias, aunque todas comparten una
del colorante, la muestra pudo estar infectada, la característica en general y es su brillo a simple
calidad del colorante pudo no haber sido la mejor, vista.
la solución de alcohol acetona pudo no haber
sacado todo el cristal violeta haciendo que Si bien, el agar Chromocult es un medio selectivo
cuando se aplique la fucsina no se tiña la muestra y diferencial que permite la diferenciación y
como debe ser, entre otros. enumeración de E.coli y bacterias coliformes;
este medio contiene una combinación de dos
Luego de esto, se realizaron cinco siembras por sustratos cromogénicos lo cual hace posible la
aislamiento con diferentes medios, con el fin de detección simultánea de los dos tipos de bacterias
determinar la presencia o ausencia de diferentes coliformes como se puede apreciar en la Imagen
microorganismos, los resultados se presentan en 2.
la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados de siembras por


aislamiento en diferentes medios de cultivo.

NOMBRE PRESENCIA O OBSERVACIONES


DE LA AUSENCIA
MUESTRA

Agar Presencia de Colonias rosadas y una


Chromocult E.coli y morada, planas,
Coliformes circulares.

Agar Presencia de Colonias redondas de


Cetrimide Pseudomonas color blanco con un
aeruginosa halo amarillento.

Agar Presencia de Colonias notorias por


Almidón amilasas la presencia del Lugol, Imagen 2. Agar Chromocult con presencia de
blancas, redondas con bacterias coliformes y E.coli.
un halo translúcido
En este agar se observaron colonias fucsias
Agar leche Presencia de Colonias distribuidas por todo el agar y, así mismo, se
bacterias protuberantes, de color encontró una colonia púrpura o morada. En este
proteolíticas y/o blanco, circulares con caso, las colonias fucsias indican la presencia de
ácido lácticas un halo translúcido. coliformes. Puesto que, por medio de la
producción de la enzima β-D-galactosidasa que
Presencia de Colonias redondas, de es característica de las bacterias coliformes se
Agar Baird- Staphylococcus tamaño pequeño de escinde un sustrato (salmon-GAL) y esta produce
Parker aureus color negro brillante. una reacción cromógena (cambio de luz) que se
evidencia por el color en las colonias (fucsia). Por
otra parte, también permite ver la presencia de E.
coli en la muestra, debido a que esta bacteria
produce una enzima característica conocida como piocianina o fluoresceína que se produce cuando
β-D-glucuronidasa que junto a la acción de la β- hay escasez de moléculas de hierro para permitir
D-galactosidasa se obtienen colonias púrpuras o la quelación de estas.
moradas. También es importante recalcar que en
este agar se vieron colonias incoloras, es decir,
colonias sin el color fucsia o púrpura
característico de los coliformes o E. coli
permitiendo afirmar que hay colonias no
coliformes. Las bacterias coliformes totales y
Escherichia coli se consideran indicadores
bacterianos en cuanto a la protección de la salud
pública. Los coliformes totales detectables
indican una posible contaminación asociada con
el sistema de distribución de agua, mientras que
E. coli es un indicador de contaminación fecal (
Zhang, et al., 2015). Como el lixiviado provino
de residuos domésticos, es posible encontrar
desechos de todo tipo donde se desarrollen estas
bacterias, como carne cruda, leche cruda, frutas y
verduras contaminadas por el contacto con las
heces de animales domésticos o salvajes en algún
momento durante su cultivo o manipulación
(Organización mundial de la salud, 2018).
Además, desechos sanitarios de mascotas, bebés
Imagen 3. Agar Cetrimide con Pseudomonas
y ancianos. aeruginosa, con exposición a luz UV

Por otro lado, el Agar Cetrimide se caracteriza


por identificar bacterias productoras de
piocianina o fluoresceína que es característico de
las bacterias pertenecientes a la familia
Pseudomonadaceae. Como se muestra en las
Imágenes 3 y 4, se vieron colonias grandes e
incoloras con producción de un pigmento
difusible al medio (amarillo) evidenciándose la
producción del sideróforo o compuesto
fluorescente por medio de la radiación UV. De las
condiciones que caracteriza este agar es que
ayuda al crecimiento selectivo de Pseudomonas
aeruginosa, debido a que la cetrimida (bromuro
de cetil trimetil amonio) es una sal de amonio
cuaternario, que actúa como un detergente
catiónico cuando entra en contacto con las células
bacterianas; causando la liberación de nitrógeno
y fósforo, que a su vez tiene efectos
desnaturalizantes en las proteínas de la membrana
de las células bacterianas (Rijal, 2015). No
obstante, también es importante discutir que el
crecimiento en este agar no es tan exuberante, lo
cual está asociado con el antimicrobiano
agregado al medio que inhibe el crecimiento de Imagen 4. Agar Cetrimide con Pseudomonas
otras especies y así mismo, a la producción de la aeruginosa, sin exposición a luz UV.
Las Pseudomonas aeruginosa son un
microorganismo ubicuo. La mayoría de las
personas están en contacto diariamente con este
tipo de bacteria, dado que se encuentran
ampliamente en el ambiente, tanto en alimentos,
suelos, aguas dulces o saladas, como en plantas y
animales. Sin embargo, estas solo representan un
riesgo sanitario para las personas cuyo sistema
inmunológico es deficiente. Este tipo de bacterias
son denominadas patógenos oportunistas puesto
que rara vez originan enfermedades en individuos
sanos, pero como dicho anteriormente, si lo hacen
en personas inmunosuprimidas (Martín, 2004).

Para los aislamientos de las bacterias productoras


de enzimas, se obtuvieron los resultados de las
imágenes 4 y 5.
Imagen 6. Agar almidón con bacterias amilolíticas

En el agar de almidón se observaron dos tipos de


colonias. Una con el halo transparente y la otra
sin el halo, mostrando dos características de las
bacterias presentes como se puede apreciar en la
Imagen 5. Las bacterias que producen la enzima
amilasa (exoenzima) que permite la hidrólisis del
almidón y productos afectan la composición de
este compuesto y, por esta razón, no se produce
el halo con el Lugol, debido a que no se forma el
complejo color púrpura-negro. Las bacterias que
no producen esta enzima no hidrolizan el almidón
y por esta razón al agregar el Lugol no se ve el
halo transparente; puesto que, sí se forma el
complejo almidón-Lugol que presenta la
coloración característica. Esto permite evidenciar
la diversidad microbiana que hay en la muestra
del lixiviado de bacterias amilolíticas y bacterias
no amilolíticas. Las bacterias amilolíticas
fermentan hidratos de carbono, participando
enzimáticamente en varias etapas del proceso de
Imagen 5. Agar leche con bacterias proteolíticas y/o compostaje (Guano, 2017).
ácido lácticas
Por otra parte, en el agar de leche, se observaron
colonias grandes y pequeñas, unas colonias de
color blanco y otras de color amarillo como se
puede apreciar en la Imagen 6. Así mismo,
también se observaron colonias con el halo
traslúcido o transparente, característico de las
bacterias proteolíticas y/o ácido lácticas.
También se observaron colonias sin el halo. Este
agar se basa en la capacidad que tienen algunas
bacterias de producir proteinasas que hidrolizan
ciertas proteínas y en este caso serían las
proteínas de la leche. La formación de este halo
está asociada con el rompimiento de las proteínas
que hay en el medio y este es un medio rico en
glucosa, leche, triptona y extracto de levadura, lo
que las hace ser más notorias a simple vista. Al
disminuir la concentración de estas en el medio,
causa un cambio en la concentración y esto
permite que no esté el compuesto que en
propiedades normales absorbe luz a la longitud de
onda visible y por esta razón es que atraviesa la
luz y da una apariencia transparente o traslúcida.
Estas bacterias junto con otros microorganismos
se han caracterizado por aumentar la calidad del
compost (Yánez, 2016). Además de esto, se Imagen 7. Agar Baird-Parker con presencia de
pueden encontrar en todos los hábitats incluidos Staphylococcus aureus.
alimentos y el cuerpo humano. Es por esto que
resulta normal encontrar este tipo de bacterias en Este aislamiento se basa en la capacidad que tiene
nuestro cultivo. Entre otras funciones, se utilizan esta bacteria (Staphylococcus aureus) para
como probióticos: microorganismos que reducir el telurito a telurio y a detectar dos
ingeridos vivos y en cantidad adecuada ejercen enzimas: la lecitinasa a partir de la lecitina del
un efecto beneficioso para la salud. Existen en el huevo y las lipasas por el alto contenido de ácidos
mercado bifidobacterias que se presentan grasos en el medio. En este caso se obtuvieron
liofilizadas, es decir, en forma de polvo que se colonias negras que está relacionado con la
rehidrata antes de su ingestión, y son de uso producción del telurio a partir del telurito.
clínico. También se utilizan en la fabricación de También se observaron unas zonas pequeñas
leches fermentadas, tipo yogur, que tienen gran transparentes alrededor de las colonias
aceptación por su menor acidez, y a su vez encontradas (negras) y también zona de
ejercen el papel de “alimento funcional” (Nácher, precipitación en el agar para confirmar la
2015). presencia de lipasas. S. aureus posee una gran
capacidad para sobrevivir en un ambiente adverso
Adicionalmente vemos que el agar Baird-Parker, y, por la acción de sus determinantes de
tiene una selectividad moderada y diferenciación patogenicidad (cápsula mucoide polisacárida,
para aislar y hacer el recuento de Staphylococcus componentes antigénicos de la pared, producción
aureus, en este caso, no hubo tanto crecimiento de enzimas como catalasa; coagulasa,
como se evidencia en la Imagen 7, pero se vieron hialuronidasa, estafiloquinasas, lipasas, β -
algunas colonias características (color negro y lactamasas, o la secreción de diversas toxinas
brillante). como la exotoxina epidermolítica; enterotoxinas
o la toxina del síndrome de shock tóxico), acaba
produciendo infección tanto de origen
comunitario como hospitalario, convirtiéndose en
la principal especie patógena de su género;
causando brotes de infección nosocomial
(Camarena., Sánchez, 1999).
CONCLUSIONES [3] Biktasheva, L., et al. (2017). Fungal and
bacterial successions in the process of co-
La existencia de diversos microorganismos en los composting of organic wastes as revealed
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coco Gram positivo respectivamente. [4] Bonilla, M., Pajares, S., Vigueras, J., et al.
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Mediante los cultivos en distintos agares y la
tinción de Gram se dilucidó la relación entre los [5] Camarena, J. J., & Sánchez, R. (1999).
nutrientes asociados a los microorganismos, el Infección por Staphylococcus aureus resistente a
metabolismo, y las características de las colonias. meticilina. Departamento de Microbiología.
Se concluyó que las bacterias productoras de Hospital Universitario Doctor Peset. Valencia.
enzimas como las amilolíticas y proteolíticas
pueden ser una alternativa sostenible para la [6] Cortázar, A., González C., Coronel, C., et al.
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