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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA DE BIOLOGÍA EXPERIMENTAL


Practica No.11
Análisis Bioquímico del metabolismo bacteriano

Objetivo: El alumno realizará las pruebas bioquímicas para analizar, identificar y


entender el metabolismo de algunos microorganismos.

INTRODUCCION
La identificación de microorganismos en base a su estructura colonial y
microscópica no es concluyente por lo cual se recurre a la identificación fisiológica,
para lo existen un gran número de pruebas metabólicas.
Al conjunto de reacciones bioquímicas que tienen lugar en la célula se le
llama metabolismo. Dentro del metabolismo ocurren dos tipos de reacciones: las
anabólicas, que son las que suceden en la célula para formar macromoléculas; y las
catabólicas, que convierten sustratos a formas más simples o más oxidadas para
obtener la energía requerida por las reacciones anabólicas.
Los principales procesos por los cuales se obtiene la energía y su conversión
en ATP, son:
1) Fermentación: Se obtiene ATP por fosforilación a nivel sustrato.
2) Respiración: El ATP se obtiene por fosforilación oxidativa.
3) Fotosíntesis: la obtención de ATP se lleva a cabo por fotofosforilación.

La fermentación es un proceso anaeróbico en el cuál tanto los donadores como los


aceptores de electrones son compuestos orgánicos, aminoácidos y otros más.
Existen varios tipos de fermentaciones llevadas a cabo por microorganismos y los
productos de éstas, son principalmente ácidos orgánicos, alcoholes, cetonas y CO2.

Tipo de fermentación Productos principales Microorganismos que la


producen
Alcohólica Etanol y CO2 Algunas levaduras y
Zymomonas
Homoláctica Ácido láctico Lactobacillus y Streptococcus
Heteroláctica Acido láctico, etano y CO2 Lactobacillus, Leuconostoc
Acido mixta 2,3-butanodiol, butanol, Shigella, Salmonella, Klebsiella,
succinato, lactato, acetato, H2 y Eschericchia coli
CO2
Butírica Butirato, acetato, H2 y CO2 Clostridium butyricum
Propiónica Propionato, acetato y CO2 Propionibacterium, Clostridium
propionicum
Acética Acetato Clostridium acéticum,
Acetobacterium
*Manual de prácticas. Laboratorio de Bacteriología y Micología Generales. Georgina Reyna López (2012).

METABOLISMO DE AMONIÁCIDOS.

Los microorganismos además de requerir una fuente de carbono y una de


energía, necesitan una fuente de nitrógeno para construir su propio material celular.
Esta fuente de nitrógeno puede ser de moléculas orgánicas como las proteínas,
aminoácidos, bases nitrogenadas; o bien inorgánica a partir de nitrógeno molecular,
amonio, nitritos o nitratos. Dentro del metabolismo de los aminoácidos existen
algunas enzimas capaces de llevar a cabo reacciones de desaminación,
descarboxilación y desulfuración de aminoácidos o degradarlos completamente. La
desaminación de moléculas como la arginina, produce citrulina y amonio. Las
reacciones de descarboxilación la sufren aminoácidos básicos como la lisina,
ornitina, arginina y las enzimas que las llevan a cabo se llaman descarboxilasas; el
proceso es anaeróbico irreversible y requiere de un cofactor denominado piridoxal.
La degradación de aminoácidos como cisteína o metionina lleva a la
producción de ácido sulfhídrico; la enzima que lleva a cabo esta reacción se llama
cisteinasa y metionina-redustasa respectivamente.

RESPIRACIÓN.
La respiración es un proceso de fosforilación oxidativa, asociada a una
cadena de electrones que genera un gradiente electroquímico, el cual es utilizado
por la ATP sintetasa para acoplar ATP. La capacidad respiratoria se encuentra
ampliamente distribuida entre los microorganismos. Todos los eucariotes (con
excepción del grupo de los microesporidios que no poseen mitocondrias), tienen
capacidad de respirar usando oxígeno como aceptor final de electrones. Como
donadores de electrones se usan compuesto orgánicos como succinato, NADH y
FADH que provienen del metabolismo de azúcares o aminoácidos. Los procariotes,
además de contar con respiración aeróbica, algunos grupos poseen también la
capacidad de respirar anaeróbicamente y pueden usar NO 3-, NO2-, (SO4)2-, CO2, S°,
Fe3+ o fumarato como aceptor final de electrones. Entre los procariotes litotróficos,
los donadores de electrones pueden ser moléculas orgánicas o inorgánicas entre las
entre las que se encuentran H2, H2S y NH3.

MATERIALES
Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo glucosado.
Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo malonato.
Tubos de 13x100 mm con campana de Durham con 3 mL de caldo base, rojo de
fenol y glucosa, sacarosa y manitol respectivamente.
Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio inclinado de Kliger.
Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio inclinado de citrato de Simmons.
Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo triptona.
Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio SIM (Sulfide Indole Motility).
Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio inclinado de LIA (Lysine Iron Agar).
Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio de caldo nitrato
Placas de agar nutritivo

Reactivos:
Solución de KOH-creatina
Solución de α-naftol
Reactivo de Kovac’s o Ehrlich
Papel tornasol rosa
Reactivo de α-naftil amina
Solución de ácido sulfanílico
Reactivo de oxidasa/papel filtro ó discos de reactivo
Solución de peróxido de hidrógeno al 10%.
PROCEDIMIENTO

I) FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS: GLUCOSA, SACAROSA Y MANITOL.


1) Inocular con una asada de cada microorganismo los tubos con caldo base,
campanas de Durham y rojo de fenol con glucosa, sacarosa y manitol
respectivamente. NO AGITAR LOS TUBOS.

2) Incubar a 37°C por 24 horas.


3) Observar los resultados. Tomando en cuenta que el rojo de metilo en condiciones
acidas toma un color amarillo; ligeramente alcalino (pH 7.4) color naranja y alcalinas
se torna rojo.

-Producción de ácido: la coloración del medio se torna amarilla.


-Producción de gas: es positiva si se forma una burbuja dentro de la campana de
Durham.

II) FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN MEDIO KLIGER.

1) Inocular por picadura cada una de los microorganismos, en la superficie de los


tubos con medio Kligler.
2) Incubar los tubos a 37°C por 24 horas.
3) Observar si hay:
Fermentación de glucosa: coloración amarilla en la superficie del tubo
Producción de gas: aparición de burbujas en el medio de cultivo.
Producción de H2S: formación de un precipitado negro en el medio.
Alcalinización: el medio se torna de rojizo a violeta.

III) FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS. PRUEBAS DE ROJO DE METILO Y


VOGES PROSKAUER (MR Y VP).

1) Inocular dos tubos de caldo glucosado para cada cepa. Uno marcado como
MR y el otro como VP.
2) Incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.
3) A los tubos marcados como MR, adicionar 5 gotas de reactivo de rojo de
metilo, sin agitar.
La prueba es positiva por la formación de un anillo rojo en la parte superior del
tubo.
4) A los tubos marcados como VP, adicionarles 6 gotas de reactivo de α-naftol y
2 gotas de solución de KOH-creatina. Agitar suavemente. Dejar reposar de 20
a 30 minutos.
La prueba de Voges-Proskauer es positiva por la aparición de un color rojo en
el tubo debido a la formación de acetil-metilcarbinol).

IV) UTILIZACION DE ÁCIDOS ÓRGANICOS:


1) Inocular por estría abierta, la superficie un tubo con agar citrato de Simmons
para cada cepa.
2) Inocular con una asada, un tubo con caldo malonato, para cada cepa.
3) Incubar a 37°C por 24 horas.
4) La prueba es positiva cuando hay crecimiento y la solución vira a azul.
V) METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: PRODUCCION DE ÁCIDO SULFHÍDRICO
E INDOL.
1) Inocular por picadura cada una de las cepas en cada tubo de medio SIM.
2) Incubar los tubos a 28°C por 24 horas.
Observar e interpretar:
• Producción de H2S: formación de precipitado negro.
• Movilidad: Se observa turbidez en regiones alejadas de la picadura de
inoculación.
• Producción de Indol: añadir 4 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich;
la prueba es positiva por la aparición del color rojo.

VI) METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: PRODUCCIÓN DE AMONIACO E INDOL.


1) Inocular con una asada de cada cepa en los tubos de caldo triptona
respectivamente.
2) Colocar una tira de papel tornasol en la tapadera del tubo sin tocar el medio
de cultivo.
3) Incubar a 37°C durante 24 horas.
4) Observar el cambio de color de rosa a azul del papel tornasol por la liberación
de amoniaco.
5) Añadir 4 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich como en la sección anterior,
la prueba es positiva con la aparición del color rojo en la superficie.

VII) METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: PRODUCCION DE LISINA-


DESCARBOXILASA:
1) Inocular por picadura y estría un tubo con medio LIA con cada una de las
cepas.
2) Incubar los tubos a 37°C por 24 horas.
3) Observar los Resultados:
- Descarboxilación positiva: color púrpura en el fondo del tubo.
- Descarboxilación negativa: color amarillo en el fondo del tubo.
- Desaminación positiva: color naranja en la superficie del tubo.
- Desaminación negativa: no hay cambio de color.
- Producción de H2S: formación de un precipitado negro.

VIII) RESPIRACIÓN: REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS.


1) Inocular cada cepa en los tubos de caldo nitrato respectivamente.
2) Incubar a 37°C por 24 horas.
3) Añadir 3 gotas de α-naftil amina y 3 gotas de solución de ácido sulfanílico.
4) Observar y registrar:
-Una coloración rojo ladrillo indica la presencia de nitritos por la formación de un
compuesto diazoico.

IX) RESPIRACIÓN: PRUEBAS DE CITOCROMO OXIDASA Y CATALASA.


1) Sembrar por estría abierta cada placa con agar nutritivo con cada cepa
respectivamente.
2) Incubar todos los tubos por 24 horas.
3) Para la prueba de oxidasa: tomar una asada a un trozo de papel filtro y
agregar el reactivo de oxidasa ó bien colocar un disco sobre una porción del
crecimiento en la caja. La prueba es positiva por la aparición de una
coloración color púrpura en el disco o papel filtro.
-El sistema citocromo oxidasa se encuentra por lo general en organismos
aerobios y por lo que utilizan el oxígeno como aceptor final de electrones y
producir H2O2.

4) Una vez hecha la prueba anterior, en otra porción del crecimiento en la placa,
añadir unas gotas de la solución de peróxido de hidrógeno al 10%. La prueba
es positiva por la aparición de burbujas.
-La mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos poseen la
enzima catalasa, la cual descompone el peróxido de hidrógeno evitando su
acumulación en la célula.

RESULTADOS

Prueba de fermentación de E. coli B. subtilis Cepa aislada


carbohidratos
Glucosa Ácido
Gas
Durham Sacarosa Ácido
Gas
Manitol Ácido
Gas
Glucosa
Kligler Gas
H2S
Alcalinización
MR (Rojo de Metilo)
VP (Voges Proskauer)
Prueba de utilización de
ácidos orgánicos
Citrato de Simmons
Malonato
Prueba metabolismo de
aminoácidos
H2S
SIM Indol
movilidad
Caldo Amoniaco
triptona Indol
Descarboxilación
LIA Desaminación
H2S
Respiración
Reducción de nitratos a nitritos
Oxidasa
Catalasa

*Prueba positiva +, negativa -


CUESTIONARIO

1) Indicar el fundamento de cada prueba bioquímica realizada.


2) Hacer una investigación bibliográfica con los resultados de las pruebas
bioquímicas y reportar la identificación del posible microorganismo de la cepa
problema; sustentando sus argumentos.

BIBLIOGRAFIA:
-Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología y Micología Básicas. Aut:
López Reyna Georgina. (2003) Ed. Stock.
-Conceptos y práctica de Microbiología General. Rojas Triviño Alberto. Universidad
Nacional de Colombia (2011).
- Introducción a la Microbiología. Ingraham J.L., Ingraham C.A., Ed. 2004. Reverté.
España.