Inhibidores de la proteína quinasa c-src bloquean el montaje y maduración del virus del dengue

El virus del dengue es un flavivirus transmitido por mosquitos que representa una importante enfermedad infecciosa
emergente y es un problema de salud internacional. Actualmente, no existe una vacuna ni un tratamiento antiviral eficaz
para prevenir o tratar la infección por el virus del dengue. El lento avance en el desarrollo de agentes antivirales podría
verse aliviado por la disponibilidad de ensayos eficaces de detección de virus anti-dengue de alto rendimiento. En este
estudio, presentamos un ensayo basado en imágenes de inmunofluorescencia adecuado para la identificación de
inhibidores de moléculas pequeñas de la infección por el virus del dengue y la replicación. Utilizando este ensayo, hemos
descubierto que los inhibidores de la proteína c-Src quinasa exhiben un efecto inhibidor potente sobre el virus del dengue
(serotipos 1. a 4) y la murina flavivirus Modoc. El mecanismo de los estudios de acción demostró que el c-Src El dasatinib,
inhibidor de la proteína quinasa, previene el montaje de viriones de dengue dentro del complejo de replicación
membranosa inducido por el virus. Estos resultados demuestran que esta pantalla celular puede proporcionar un medio
poderoso para identificar nuevos objetivos potenciales paradesarrollo de medicamentos contra el dengue al tiempo que se
proporcionan simultáneamente sondas farmacológicas para investigar las interacciones del virus del dengue con las células
huésped a nivel bioquímico. Dada la simplicidad y excelente reproducibilidad del ensayo, debería ser útil en pantallas de
alto rendimiento tanto de pequeñas moléculas como de bibliotecas de Rnai cuando se implementa en una plataforma
robótica de pantalla de alto rendimiento basada en imágenes (HTS). Dada la seguridad clínica razonable de inhibidores
como dasatinib y AZD0530, los inhibidores de la proteína cinasa c-Src pueden tener el potencial de convertirse en un nueva
clase de agentes terapéuticos virales anti-dengue.

El virus del dengue (DENV) es un nuevo patógeno transmitido por mosquitos que causa la fiebre del dengue (DF) y una
enfermedad grave que amenaza la vida, fiebre hemorrágica del dengue/síndrome de choque del dengue (DHF/DSS) (1). El
DENV es un virus pequeño, envuelto, de cadena positiva del ARN que pertenece al género Flavivirus de la familia
Flaviviridae. Cuatro serotipos distintos (DENV1 a -4) de los virus del dengue se transmiten a los seres humanos a través de
las picaduras de las especies de mosquitos, Daedes aegypti y Aedes albopictus (2). Se ha estimado que cada año se
producen 50 casos de FD por 100 millones y 250.000 casos de FDH por 500.000 (3). Además, 2.500 millones de personas
corren el riesgo de infectarse en regiones subtropicales y tropicales del mundo (4) en ausencia de una intervención eficaz.
El ciclo de vida intracelular del DENV comienza con el receptor -endocitosis mediada del virus en las células, seguido de la
fusión de la proteína de la envoltura viral con la membrana endosomal tardía, que resulta en la liberación del genoma viral
en el citoplasma para la replicación. La replicación del genoma del ARN viral ocurre dentro de complejos unidos a
membranas formados a partir de la membrana reticular endoplasmática. Posteriormente, las partículas del virus se
ensamblan y liberan a través de la maquinaria secretora de células hospederas (5) Aunque la replicación del DENV implica
una interacción compleja entre las proteínas virales y los factores celulares, muchas de estas interacciones permanecen sin
identificar y sin caracterizar. Las moléculas pequeñas que se dirigen específicamente a diferentes etapas del ciclo de
replicación viral podrían utilizarse potencialmente como compuestos de herramientas’’ para facilitar la caracterización
bioquímica de estas interacciones del virus huésped y también podrían utilizarse para identificar puntos de intervención
farmacológica para el tratamiento de la infección por DENV. Aunque a lo largo de los años se han llevado a cabo extensos
estudios para comprender la patogenicidad de la infección por DENV, se ha avanzado poco en el desarrollo de compuestos
específicos anti-DENV. Actualmente no existen tratamientos específicos para la infección por DENV y no se dispone de
vacunas.

En este artículo, reportamos el desarrollo de un ensayo de inmunofluorescencia basado en microscopia que permite el
cribado de moléculas pequeñas que inhiben cualquier paso en el ciclo de replicación del DENV, incluyendo entrada,
replicación del ARN viral, y el montaje y secreción de virión. La fosforilación de proteínas por quinasas es responsable de la
transmisión de señales bioquímicas en muchas vías de transducción de señales, incluyendo aquellas que promueven la
supervivencia celular (6, 7) y la evasión inmune (8, 9) durante la infección por DENV, así como los que regulan la endocitosis
de otros virus (10). Además, fosforilación de proteínas virales como DENV NS5 (11, 12) por quinasas celulares se sabe para
regular su localización subcelular y, se presume, sus funciones La hipótesis de que los inhibidores de la quinasa podrían ser
utilizados para probar el impacto de las quinasas celulares y sus vías de señalización asociadas en la infección por DENV y la
replicación, Analizamos una colección de 120 inhibidores conocidos de las quinasas Ser/Thr y Tyr de mamíferos. Se
encontró que varios de los inhibidores de la proteína quinasa afectaban distintos pasos en el ciclo de replicación del DENV y
causaban disminuciones multilogarítmicas en el título viral en ausencia de citotoxicidad. Estos hallazgos proporcionan
evidencia farmacológica de que la actividad de la quinasa de células hospederas es esencial para varias etapas del ciclo de
vida del DENV y puede proporcionar nuevos conocimientos para un posible tratamiento anti-DENV
Resultados

Desarrollo de pantalla. En este estudio, se desarrolló una pantalla para detectar inhibidores de moléculas pequeñas de la
replicación del DENV para detectar moléculas pequeñas capaces de interferir con los diferentes pasos del ciclo de
replicación del DENV a través de sus efectos directos sobre los productos genéticos virales o a través de sus interacciones
con los factores celulares que participan en los procesos virales. El ensayo basado en la imagen se basa en la detección de
la proteína envolvente DENV y se describe en la información de apoyo (SI) Fig. 6. Primero evaluamos la capacidad del
ensayo para detectar cuantitativamente la inhibición de la infección DENV por una pequeña molécula, ácido micofenólico
(MPA), que se sabe que inhibe la síntesis viral de ARN de DENV (13). Las células de Vero cultivadas en una placa de 384
pocillos fueron primero infectadas con DENV 2 en una multiplicidad de infección aumento de las concentraciones del
tratamiento del MPA en comparación con las células no tratadas infectadas por el DENV. Mediante el uso de un
microscopio automatizado, la fluorescencia verde citoplasmática y la fluorescencia azul nuclear adquirida de cuatro campos
seleccionados al azar en cada pozo se tomaron imágenes y el número medio de DENV-las células infectadas se
determinaron mediante análisis automatizado de datos. El porcentaje de inhibición de la infección por DENV se midió en
función de la concentración de MPA (fig. 1B) y se encontró que era dosis-dependiente, con una EC50 de 5,7 M. Este
resultado fue consistente con mediciones previas de la actividad anti-DENV de MPA (13) Para garantizar que el ensayo
tiene una mínima variación de señal y una relación señal-fondo consistentemente alta, también determinamos el factor Z
del ensayo de cribado (14) basado en datos recogidos de 100 pozos de DENV-células infectadas tratadas con 18 M de MPA
(concentración final de 0,25% de DMSO) y datos recogidos de otros 100 pocillos de la misma placa de 384 pocillos que
estaban infectados con DENV y tratados con 0,25% de DMSO sólo en medio de cultivo celular. Se observó sistemáticamente
una relación señal-fondo de 8:1 y un factor Z de 0,75, demostrando la fiabilidad y robustez de este ensayo. Luego
recurrimos al uso de este ensayo como una herramienta para el descubrimiento de pequeños inhibidores de moléculas de
DENV.

Desarrollo de un ensayo de
inmunofluorescencia basado en imágenes para
la detección del DENV. (A) Detección de
infección por DENV de células de Vero mediante
tinción de inmunofluorescencia para proteína
envolvente de DENV (Env) en ausencia y
presencia de MPA. (B) Inhibición dependiente
de la dosis de la infección por DENV 2 de las
células tratadas con MPA.

las células no tratadas infectadas por el DENV. Mediante el uso de

un microscopio automatizado, la fluorescencia verde citoplasmática
y la fluorescencia azul nuclear adquirida de cuatro campos
seleccionados al azar en cada pozo se tomaron imágenes y el
número medio de DENV-las células infectadas se determinaron
mediante análisis automatizado de datos. El porcentaje de
inhibición de la infección por DENV se midió en función de la concentración de MPA (fig. 1B) y se encontró que era dosis-
dependiente, con una EC50 de 5,7 M. Este resultado fue consistente con mediciones previas de la actividad anti-DENV de
MPA (13)

Para garantizar que el ensayo tiene una mínima variación de señal y una relación señal-fondo consistentemente alta,
también determinamos el factor Z del ensayo de cribado (14) basado en datos recogidos de 100 pozos de DENV-células
infectadas tratadas con 18 M de MPA (concentración final de 0,25% de DMSO) y datos recogidos de otros 100 pocillos de la
misma placa de 384 pocillos que estaban infectados con DENV y tratados con 0,25% de DMSO sólo en medio de cultivo
celular. Se observó sistemáticamente una relación señal-fondo de 8:1 y un factor Z de 0,75, demostrando la fiabilidad y
robustez de este ensayo. Luego recurrimos al uso de este ensayo como una herramienta para el descubrimiento de
pequeños inhibidores de moléculas de DENV.
Revisión de una Biblioteca de Inhibidores de la Quinasa Proteica.

Con la hipótesis de que los inhibidores de la quinasa pueden ser utilizados para desenmascarar las vías de transducción de
señal celular cooptadas por DENV durante su ciclo de replicación, Utilizamos el ensayo de inmunofluorescencia para cribar
una colección de más de 120 inhibidores de cinasas de mamíferos Ser/Thr y Tyr a concentraciones predeterminadas para
ser no citotóxicas. Los objetivos de células hospederas reportados afectados por los miembros del panel de proteína
quinasa se describen en la Tabla 2 del SI. Este panel de inhibidores de quinasa incluye notablemente múltiples clases de
andamios distintos para muchas quinasas, un elemento destinado a facilitar la determinación de qué quinasa es
responsable de un efecto anti-DENV concreto.

Se identificaron inhibidores de diecisiete quinasas de proteínas (Tabla 1). De las 44 quinasas celulares diferentes que se
sabe que son objeto de nuestra colección de inhibidores, la inhibición de ciclina dependiente (Cdks), JAK, caseína (CK),
familia Src, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico tirosina (Egfrs) quinasas se asoció con antiActividad del
DENV. Notablemente, múltiples compuestos con actividad inhibidora contra Srcfamily, Bcr-Abl/c-Abl, c-Kit, y receptores del
factor de crecimiento plaquetario derivados (PDGFR) quinasas se asociaron con la actividad anti-DENV y tenían diversas
estructuras químicas (SI Tabla 3). Los inhibidores de la quinasa screbecause (incluyendo los utilizados en este estudio) a
menudo apuntan a múltiples enzimas intracelulares, utilizamos las selectividades parcialmente solapadas de estos
inhibidores para determinar qué quinasas celulares podrían ser realmente responsables de los efectos anti-DENV
observados. Un inhibidor adicional, AZD0530 (K045), fue agregado a la pantalla secundaria para ayudar en la deconvolución
de las actividades inhibidoras de la quinasa asociadas con compuestos descubiertos en la pantalla primaria. Los dieciocho
compuestos de la Tabla 1 fueron evaluados en un conjunto de ensayos secundarios para cuantificar cambios en el título
viral cuando las células fueron tratadas con inhibidores pre- o postinoculación (SI Fig. 6)

Estos experimentos nos permitieron medir el efecto de cada inhibidor sobre la salida de la infección DENV y distinguir entre
los efectos de los inhibidores individuales de la quinasa sobre los procesos que ocurren a principios del ciclo de replicación
DENV (por ejemplo, entrada viral, liberación del genoma) y que puede ser bloqueado por el tratamiento de las células
hospederas antes de la inoculación con DENV de los efectos en los procesos que ocurren más tarde en el ciclo de
replicación DENV y que sólo puede ser objetivo por la inhibición de la quinasa continua. Todos los compuestos se
analizaron a dos concentraciones no citotóxicas y se consideró que tenían actividad anti-DENV si se asociaban con al menos
una disminución de cinco veces (0,7 unidades logarítmicas) en el título viral.

Se confirmó que los compuestos Screall tenían

actividad anti-DENV cuando se añadieron antes
o después de la inoculación con algunos
compuestos que mostraban actividad anti-DENV
bajo ambos conjuntos de condiciones (Tabla 1).
Los inhibidores de las quinasas dependientes de
la ciclina (K002), c-Raf (K039), la JAK (K040), y el
inhibidor multidirigido imatinib (K014), parecen
afectar los acontecimientos tempranos en la
infección viral (por ejemplo, entrada viral,
liberación del genoma) porque la incubación de
células hospederas con estos compuestos
durante un período de tres horas antes de la
inoculación fue suficiente para causar
reducciones significativas en el título del DENV. Cinco compuestos dirigidos colectivamente a la familia Src (K003, K030,
K117), Abl (K003, K013), c-Kit (K003), PDGFR (K003), VEGFR (K003, K030) quinasas y caseína quinasa II Se encontró que
Scre(CK II, K032) tenía actividad anti-DENV tanto en ensayos previos como postinoculados. Estos datos sugieren que estos
compuestos pueden inhibir las quinasas que son importantes para múltiples procesos virales que ocurren durante o
después de la entrada viral.

Los nueve compuestos restantes, todos los cuales se sabe que están dirigidos a dos o más quinasas, mostraron actividad
anti-DENV exclusivamente en el ensayo de posinoculación. De estos nueve inhibidores, se sabe que seis tienen actividad
contra las quinasas de la familia Src, por lo que esta es la asociación más fuerte entre la inhibición de una quinasa celular y
la actividad anti-DENV. Notablemente, todos los compuestos en nuestra biblioteca conocidos por tener actividad potente
contra las quinasas de la familia Src (nueve de 120 compuestos probados en la pantalla primaria y nueve de diecisiete
compuestos probados en la pantalla secundaria) también fueron inhibidores potentes de DENV (Cuadro 1). Este resultado
incluyó inhibidores de la familia Src de la clase de compuestos pirimiddopirimidina (K003), la clase de quinazolina (K030), el
compuesto de indol sulfonamida K117, Los ras así como Kenpaullone (K144), y Lavendustins A (K028) y C (K115) (SI Tabla 3).
Este grupo de seis compuestos incluyó dos candidatos en estadio clínico: dasatinib (SPRYCEL, K005), un compuesto
tiazolylaminopirimidina actualmente aprobado para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica resistente a imatinib
(LMC) (15, 16) y AZD0530 (K045), una quinazolina que actualmente se está probando en tumores sólidos y leucemia (17).
Debido a sus respectivas etapas de desarrollo clínico, estábamos particularmente interesados en entender el mecanismo
responsable de la actividad anti-DENV de estos compuestos.

Dasatinib es un inhibidor competitivo ATP que exhibe actividad celular subnanomolar frente a BCR-Abl (el objetivo primario
en pacientes con LMC) y quinasas de la familia Src, y también puede inhibir el receptor del factor de crecimiento derivado
de plaquetas (PDGFR, IC50 28 nM), factor de células madre (c-kit, IC50 13 nM), receptor de tirosina cinasa de ephrina A2
(EPHA2, IC50 137 nM) y p38 MAP quinasa (IC50 100 nM) (revisado en (18)). AZD0530 es un inhibidor de la quinasa
considerablemente más selectivo, mostrando una potente actividad en toda la familia Src de quinasas e incluso se ha
demostrado que es 10 veces más activo contra las quinasas de la familia Src (IC50 1 5 nM) que contra la quinasa Abl (17).
Aunque dasatinib y AZD0530 apuntan a otras quinasas celulares, la asociación de la actividad de la quinasa Src con la
infección por DENV nos llevó a centrar nuestros esfuerzos de seguimiento en el papel de las quinasas de la familia Src en las
etapas postentry de la infección por DENV y la replicación.

Los inhibidores de la proteína quinasa c-src reducen la infección por DENV. Para confirmar que la proteína c-Src es
efectivamente necesaria para la replicación de DENV2, examinamos el efecto de dasatinib (K005) y AZD0530 (K045) sobre
la infección por DENV2 en células Vero, Huh-7 y C6/36. Las células fueron infectadas con DENV2 (moi de 1) y tratadas con
concentraciones no citotóxicas (50 nM a 5 M) de dasatinib o AZD0530 durante tres días. La cuantificación de los títulos
virales en sobrenadantes de cultivo por ensayo de placa reveló una inhibición dosis-dependiente de la infección por DENV2
en las tres líneas celulares tratadas con dasatinib (Fig. 2A) y AZD0530 (SI Fig. 7A). Estos resultados sugieren que la
replicación del DENV requiere una quinasa celular. Dadas las clases estructuralmente diversas de inhibidores de la quinasa
Src descubiertos en nuestra pantalla, es probable que la quinasa de la célula huésped es la principal en lugar de una
proteína viral.

La selectividad viral de dasatinib se evaluó midiendo su efecto inhibidor en condiciones de tratamiento similares frente a
clones virales representativos de los otros serotipos de DENV, así como frente al virus Modoc (un murino flavivirus) y
poliovirus tipo 1 (un virus ARN de la familia picornavirus). La inhibición de las infecciones por virus DENV1, DENV3, DENV4 y
Modoc de las células de Vero por dasatinib se produjo de una manera dependiente de la dosis similar a la observada para la
inhibición de DENV2 (Fig. 2B).

Fig. 2. Antiviral activity of dasatinib, an inhibitor of c-Src

and Abl kinases, on DENV infection. (A) Dosage
dependent inhibition of DENV2 infection was observed
in C6/36, Vero, and Huh-7 cells. (B) Viral reduction
immunofluorescence assays were performed for the
indicated viruses to determine the dose-dependent
anti-DENV activity of dasatinib.

clones representativos de los otros serotipos de DENV,

así como contra el virus Modoc (un flavivirus murino) y poliovirus tipo 1 (un virus RNA de la familia picornavirus). La
inhibición de las infecciones por virus DENV1, DENV3, DENV4 y Modoc de las células de Vero por dasatinib se produjo de
una manera dependiente de la dosis similar a la observada para la inhibición de DENV2 (Fig. 2B). En contraste, dasatinib no
mostró efecto inhibidor contra el poliovirus tipo 1 (Fig. 2B). Estos resultados pueden sugerir que las quinasas celulares
dirigidas por dasatinib y AZD0530 son específicas para el serocomplejo DENV y también pueden extenderse a los
flaviviruses relacionados, pero no a los virus ARN más distantes relacionados. Aunque las quinasas Src son el candidato más
probable para esta quinasa celular, no podríamos descartar la posibilidad de que dasatinib y AZD0530 compartan objetivos
quinasa adicionales que pueden ser necesarios para la replicación de DENV.
El silenciamiento mediado por siRNA de la proteína c-Src inhibe la replicación del DENV. Para determinar si c-Src es
efectivamente la quinasa celular que mediaba el efecto anti-DENV de dasatinib y AZD0530, determinamos el efecto de la
disminución de la expresión de proteína c-Src mediada por siRNA en la replicación de DENV. La transfección inversa de
células Huh-7 con un conjunto de cuatro Arns específicos para la proteína c-Src a concentraciones finales de Arns de 200
nM y 300 nM resultó en la reducción de los niveles de proteína c-Src en un 63% y 74%, respectivamente, en comparación
con las células transfectadas con el control de transfección (fig. 3A). Se observó citotoxicidad mínima con células Huh-7
transfectadas con 200 nM y 300 nM de siRNA c-Src (datos no mostrados). Huh-7 células tratadas con la c-Src específicos
siRNA piscinas fueron entonces infectados con DENV2 (moi de 1), y la producción de virus por estas células fue evaluados
mediante un ensayo en placa viral de sobrenadantes de cultivo recogidos el día 3 después de la infección. El tratamiento de
células con 200 nM de un conjunto de Arns dirigido contra c-Src resultó en una inhibición de unidades logarítmicas superior
a 1,5, mientras que el tratamiento con 200 nM de Arns de control negativo no tuvo efecto sobre los títulos de NVA (fig. 3B).
Estos datos sugieren fuertemente que las quinasas de la familia Src son de hecho responsables de la actividad anti-DENV de
dasatinib y AZD0530.

Fig. 3. siRNA La eliminación de los niveles de proteína

c-Src inhibe la infección por DENV. Las células Huh-7
fueron transfectadas con diferentes concentraciones
de un grupo de siRNA específico de c-Src o un siRNA de
control. (A) La eliminación de la expresión de proteína
c-Src fue confirmada por el análisis de Western blot
mediante el uso de un anticuerpo específico c-Src.
Carril 1, Control (siGlo RNA-300 nM); carril 2, piscina
siRNA específica de c-Src, 200 nM; carril 3, piscina
siRNA específica de c-Src, 300 nM. Se incluyó la
detección de GAPDH como control de carga de pozos.
(B) La infección por DENV2 se redujo en 1,5 unidades
logarítmicas en células transfectadas con 200 nM de la
piscina de siRNA c-Src, pero no se modificó en
presencia de 200 nM siGlo o 200 nM GAPDH Smartpool reactivos de control negativo.

c-Src es necesario para el montaje y secreción de DENV. La observación de que los inhibidores de la proteína quinasa c-Src
como dasatinib y AZD0530 ejercer un efecto anti-DENV cuando se añade postinoculación, pero no cuando la preinoculación
añadida sugiere que la actividad de la proteína quinasa c-Src puede desempeñar un papel importante en los procesos
virales postentrados, como la replicación del ARN viral, virión y maduración, o egresión viral. Buscamos aclarar este
problema mediante la identificación del proceso viral específico bloqueado cuando se inhibe la actividad de la proteína
cinasa Src. Los ensayos de inmunofluorescencia utilizando tres líneas celulares diferentes (Vero, Huh-7, y C6/36) se
realizaron primero para detectar la producción y distribución intracelular de proteína de la envoltura viral durante el curso
de la infección por DENV (Fig. 4) Las células fueron infectadas con DENV2 (moi de 1) y luego tratadas con dasatinib 2,5 M.
Las células fueron entonces fijadas en varios puntos de tiempo postinfección y proteína de la envoltura DENV fue detectada
por inmunofluorescencia tinción. En el día 4 después de la infección, se observó la producción de proteína de la envoltura
viral recién sintetizada en las tres líneas celulares a pesar del tratamiento con dasatinib, lo que indica que la expresión
génica viral no se vio afectada por el inhibidor de la proteína cinasa c-Src. En los días 5 y 6 postinfección, hubo
acumulaciones crecientes de proteína de la envoltura viral dentro de la región perinuclear de las células infectadas por
DENV tratadas con dasatinib (fig. 4, flechas).

Esta observación fue particularmente notable en las células de Vero y Huh7. En particular, las células que rodean a las
células infectadas por DENV2 permanecen no infectadas (no se detectó producción de proteína en la envoltura viral; fig. 4,
puntas de flecha) en muestras tratadas con dasatinib. Este efecto sobre la localización y distribución de la proteína
envolvente se observó consistentemente para las tres líneas celulares probadas con dasatinib (Fig. 4) y AZD0530 (SI Fig.
7B). En contraste, la proteína de la envoltura viral se detectó en todas las células de las monocapas celulares infectadas por
DENV2 tratadas con DMSO Para las células infectadas por DENV2 tratadas con Dmsotreated, las proteínas de la envoltura
viral se observaron inicialmente alrededor de la región perinuclear (día 4 postinfección). Para los días 5 y 6, se observó
proteína de la envoltura viral en todo el citoplasma y la membrana plasmática de las células infectadas.
Estas observaciones sugieren que la inhibición de c-Las quinasas de proteína src pueden contribuir a la retención de ENV
viral dentro de la ER, lo que provoca que las partículas virales no se formen y/o que las partículas de virus ensambladas no
transiten por el sistema secretorio del huésped para su liberación. Para distinguir entre estas dos posibilidades, se realizó
microscopía electrónica de transmisión en células Denvinfectadas tratadas con 2,5 M de dasatinib o DMSO como control
negativo. Esta concentración de dasatinib se eligió para evitar la citotoxicidad y también para minimizar los efectos
mediados por otras quinasas dirigidas por dasatinib (es decir, c-kit, PDGFR, Ephrins, p38) en concentraciones más altas (17).
Como se muestra en la Fig. 5, las células infectadas por DENV2 tratadas con DMSO (Fig. 5A) o dastinib (Fig. 5B) mostraron
estructuras de replicación membranosas que son características de la infección por flavivirus (5, 19). Para las muestras
tratadas con DMSO (fig. 5A), se observó un gran número de partículas DENV (flechas) dentro del lumen ER y vesículas
secretoras. Por el contrario, no se observaron partículas de virus dentro de la luz ER para la muestra tratada con dasatinib
(fig. 5B). Las células infectadas por el DENV tratadas con dasatinib mostraron una amplia proliferación de estructuras de
membrana inducidas por el virus las puntas de flecha) (Fig. 5B). Esta observación puede reflejar la acumulación de la
glicoproteína de la envoltura viral en la sala de emergencias. Se observaron partículas nucleocápsidas ( 25 nm, flechas) en
estrecha asociación con las estructuras de membrana en proliferación. Colectivamente, estos resultados sugieren que la
inhibición de la actividad de la quinasa c-Src impide el montaje de la virión DENV dentro de la sala de emergencias.

Fig. 4. Inhibición de la propagación viral en células infectadas por DENV tratadas con dasatinib. Se realizó un ensayo de
inmunofluorescencia para detectar la localización de la proteína de la envoltura viral (E) en células Vero, Huh-7 y C6/36
infectadas por DENV que fueron tratadas con 2,5 M de dasatinib o DMSO. Las células no infectadas están indicadas por
puntas de flecha, y la acumulación de proteína E viral en la región perinuclear está indicada por flechas. Los núcleos
celulares están manchados de azul con DAPI.

Fig. 5. La inhibición de la actividad de la proteína quinasa c-Src impide el montaje de DENV dentro de la luz ER. Las células
de Vero infectadas por DENV2 tratadas con DMSO o 2,5 M de dasatinib (A y B, respectivamente) y las células infectadas
simuladas tratadas con DMSO (C) se procesaron para
microscopia electrónica a los 4 días después de la infección.
(A) Las partículas DENV representativas localizadas dentro
del lumen ER se indican mediante flechas. (B) La
proliferación extensiva de membranas inducidas por virus
está indicada por puntas de flecha y partículas
nucleocápsidas similares son notados por las flechas. No se
observan partículas de virus dentro de la luz ER y

estructuras membranosas. (C) Morfología ultraestructural

típica de las células de Vero no infectadas. (Barras de
escala: 200 nm para A 'C.)

Discusión

Actualmente, hay pocos inhibidores documentados del

virus del dengue o incluso infecciones flavivirus
estrechamente relacionadas. Algunos de estos inhibidores
incluyen ácido micofenólico (13, 20), ribavirina (20 a 22), 6-
azauridina (20), castanospermina (23) y deoxynojirimycin
(23 a 25). También se han notificado análogos de
nucleósidos (24, 25) y compuestos de la columna vertebral
de cetamida (23) similares al péptido que inhiben la función de las proteínas flavivirus NS3 y NS5. Entre estos inhibidores,
sólo la ribavirina ha sido aprobada para uso clínico y actualmente se utiliza únicamente en el tratamiento de las infecciones
por hepatitis C flavivirus (21), en la que ha estado implicado en la causa de efectos secundarios como anemia en pacientes
(22). Por estas razones, hay una necesidad urgente de identificar nuevos inhibidores para el tratamiento de la infección por
el virus del dengue. En este estudio, desarrollamos y utilizamos un ensayo de inmunofluorescencia viral basado en
imágenes para examinar una biblioteca enfocada de inhibidores de la quinasa. Esta pantalla nos permitió identificar varias
quinasas celulares que parecen ser importantes para diferentes procesos del ciclo de vida del DENV. La actividad anti-DENV
de los compuestos identificados en esta prueba primaria fue posteriormente validada mediante ensayos de placa viral más
tradicionales. En conjunto, estos resultados demuestran que este ensayo puede ser utilizado para interrogar la bioquímica
del virus del dengue-célula huésped con moléculas pequeñas para identificar las vías celulares y los factores que son
importantes o esenciales para el ciclo de vida viral.

Las quinasas de la familia Src fueron hipotéticamente quinasas importantes en la infección por DENV basadas en los perfiles
de selectividad de los compuestos que mostraron actividad anti-DENV en las pantallas primaria y secundaria. Hay nueve
quinasas de la familia Src definidas por su homología de la secuencia quinasa-dominio y la estructura de dominio: Blk, Fgr,
Fyn, Hck, Lck, Lyn, Src, Yes, y Yrk. La proteína c-Src humana es una proteína de señalización sin receptor quinasa que
desempeña un papel importante en una variedad de procesos celulares que incluye la adhesión y migración celular,
división celular, organización citoesqueleto, transcripción génica, y apoptosis (revisado en ref. 26). La proteína c-Src
humana ha sido explorada como un blanco potencial para una variedad de dolencias humanas incluyendo una variedad de
cánceres humanos (27), leucemia (28) y osteoporosis (29) Lck, que muestra la expresión localizada en las células del
sistema inmune (predominantemente células T) y es esencial para la activación de las células T, se ha perseguido
intensamente como un objetivo para la inmunosupresión. Debido al alto grado de conservación dentro de las quinasas de
la familia Src, la mayoría de los inhibidores desarrollados contra miembros individuales de esta familia exhiben amplia
especificidad en toda la familia (28). Elegimos realizar nuestros estudios de confirmación usando dos inhibidores de la
familia Src que han avanzado en las pruebas clínicas: dasatinib, que es un inhibidor relativamente no selectivo de la familia
Src, y AZD0530, que es un inhibidor selectivo de la familia Src. Además, se compararon los resultados de la inhibición
farmacológica con los obtenidos por la eliminación de la proteína c-Src mediada por siRNA.

Nuestros resultados demuestran que los inhibidores de la cinasa c-Src bloquean la infección por DENV principalmente al
prevenir la formación de partículas infecciosas del virus dentro del complejo de replicación del virus. En general, se cree
que el montaje de flavivirus se produce por brotar de ARN viral encapsiado en el lumen ER coordinado en presencia de la
glicoproteína envoltura del virus. Después de la formación de viriones dentro de la luz del retículo endoplásmico, las
partículas del virus son transportadas dentro de las vesículas a través del sistema secretorio del huésped y liberadas por
exocitosis (revisado en ref. 5). El tratamiento de las células infectadas por DENV2 con inhibidores de la proteína cinasa c-Src
no afectó a la síntesis de glicoproteínas de la envoltura viral revelada por inmunofluorescencia tinción (Fig. 4), lo que
sugiere que ni la síntesis viral de ARN ni la expresión viral del gen se vieron afectados. Por análisis de EM, hubo ausencia de
viriones DENV dentro de la luz de la ER de las células tratadas con dasatinib en comparación con la muestra tratada con
DMSO (Fig. 5). Estos resultados sugieren que la proteína c-Src puede mediar en el surgimiento de la nucleocápside en el
lumen ER para formar partículas virales infecciosas. Esta sugerencia se apoya además en la acumulación de partículas
similares a nucleocápsidas observadas en estrecha proximidad a las membranas inducidas por virus de la ER dentro de las
células infectadas por DENV en presencia de inhibidor de la proteína c-Src quinasa (fig. 5). El hallazgo de que dasatinib tiene
actividad antiviral contra los cuatro serotipos de DENV, así como contra el virus de againstModoc sugiere que este proceso
se conserva a través de los Flavivirdae y puede ser ampliamente dirigido por los inhibidores de la cinasa Src.

Curiosamente, c-Yes, otra quinasa de la familia Src, recientemente se demostró que inhibe el tráfico de partículas del virus
del Nilo Occidental (VNO) a través del sistema secretorio huésped (30), un paso posterior en el ciclo de vida viral que se
observó para la inhibición de las quinasas de la familia Src en este estudio. Estos resultados pueden sugerir que se
necesitan quinasas múltiples de la familia Src para la replicación de flavivirus y que la focalización del proceso anterior por
inhibidores en nuestro estudio impidió nuestra capacidad de confirmar la actividad de c-Yes en el sistema DENV. También
se ha documentado que la proteína quinasa c-Src está implicada en procesos de replicación de varios virus como el virus de
la hepatitis B (31), el VIH (32) y el virus del herpes simple 1 (33).

En resumen, hemos desarrollado una imagenensayo basado en el virus del dengue que proporciona una plataforma valiosa
para investigar las interacciones de las células de Denvhost, así como para identificar pequeñas moléculas que pueden
tener potencial terapéutico para el tratamiento de la infección por DENV. Este estudio demuestra que el ciclo de vida del
DENV se puede enfocar con eficacia con moléculas pequeñas que son selectivas para las funciones de la célula huésped.
Observamos que mientras que este estudio se centró en la perturbación de las funciones de las células hospederas con
moléculas pequeñas, también deberían ser posibles los experimentos análogos con interferencia del ARN.

Será necesario seguir trabajando para dilucidar si las quinasas adicionales de la familia Src tienen un papel importante en la
regulación de la replicación viral. Además, será interesante determinar qué sustratos c-Src son blancos críticos en el
proceso de ensamblaje viral. Otros estudios con esta clase de inhibidores pueden proporcionar una mayor comprensión de
la interacción virus-huésped de este importante patógeno humano y podría potencialmente conducir al desarrollo de
agentes terapéuticos contra la infección por DENV

Materiales y métodos

Líneas celulares, virus y anticuerpos. Todas las líneas celulares, virus y anticuerpos se obtuvieron de fuentes comerciales o
académicas y se describen en detalle en Materiales y Métodos SI.

Biblioteca de Inhibidores de la Quinasa. Una colección de inhibidores comerciales y no comerciales de mamíferos Ser/Thr,
Tyr, y quinasas lipídicas fue reunida de fuentes comerciales y académicas . La parte comercial de la biblioteca fue
ensamblada principalmente de Calbiochem (San Diego, CA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), y Pierce (Rockford, IL). Los
inhibidores de la quinasa en estadio clínico no disponibles en el mercado fueron resintetizados siguiendo procedimientos
publicados. Los inhibidores se evaluaron primero para la citotoxicidad en células de Vero mediante ensayo de MTT. Se
realizaron ensayos primarios y secundarios a concentraciones inhibidoras que tuvieron efectos mínimos sobre la viabilidad
celular

Ensayo de inmunofluorescencia DENV.

En resumen, se añadió DENV2 (cepa NGC) a monocapas de células de Vero en placas de 384 pocillos a una moi de 1
durante 60 min a 37 a C con 5% de CO2. El exceso/virus sin consolidar se eliminó mediante lavado con PBS. A continuación,
se añadieron a las células infectadas por DENV2 inhibidores de la proteína quinasa de moléculas pequeñas a
concentraciones finales de DMSO de 0,02 a 10 M/0,25% (vol/vol). Las placas se incubaron durante 3 días a 37 ºC con un 5%
de CO2 antes de realizar la tinción de inmunofluorescencia. Las monocapas celulares se fijaron e incubaron con la proteína
anti-DENV E mAb (US Biologicals, Swampscott, MA), seguido de la incubación con el Ab secundario conjugado con FITC
(Zymed, San Francisco, CA). Los núcleos celulares fueron contrarrestados con DAPI (Sondas Moleculares, Eugene, OR).
Cuatro campos seleccionados al azar por pozo fueron capturados tanto en los canales FITC como DAPI mediante el uso de
un sistema de adquisición de imagen microscópica automatizada (Imagexpress; Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los
parámetros de autofoco y recolección de datos fueron predefinidos usando el software Metaxpress (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA). Las imágenes capturadas fueron analizadas usando un algoritmo automatizado (software Metamorph;
Dispositivos moleculares) para calcular el número de núcleos de células azules y citoplasma celular verde infectado por
DENV de un tamaño definido por el usuario y el valor umbral de 100. A continuación se determinó el número medio de
células infectadas por DENV por campo y se comparó con el de los pocillos de control positivo (células infectadas por DENV
con medios de cultivo celular que contienen 0,25% de DMSO). Los compuestos que inhibieron la infección por DENV en
más del 50% en relación con el control de DENV tratado con DMSO fueron considerados como "éxitos" en estos
experimentos. Los valores de IC50 fueron determinados por análisis de regresión no lineal de curvas de inhibición usando
Graphpad Prism versión 4.00 para Windows (Graphpad Software, San Diego, CA). Una descripción detallada del
procedimiento anterior se puede encontrar en el SI Materiales y Métodos.

Ensayos de citotoxicidad.

La citotoxicidad de cada uno de los inhibidores de moléculas pequeñas utilizados en este estudio se evaluó utilizando un
kit comercial (Chemicon, Temecula, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Materiales y Métodos SI).

Ensayos Secundarios.

Los efectos inhibidores de los inhibidores de moléculas pequeñas sobre la infección por DENV fueron confirmados por la
incubación de células con inhibidores antes (pretratamiento) o después (posttratamiento) inoculación con virus y, a
continuación, cuantificación del rendimiento infeccioso del DENV por ensayo de placa vírica, tal como se describe en los
materiales y métodos del SI. En resumen, las células Vero, Huh-7 y C6/36 fueron sembradas en placas de 24 pocillos, con
una densidad celular de 1 104 células por pocillo para evaluar los efectos de los inhibidores de la preinoculación, Las
concentraciones no citotóxicas de los inhibidores de la proteína quinasa se añadieron a las monocapas celulares y se
incubaron durante 180 minutos a 37 ºC. Las células tratadas con inhibidores se inocularon con DENV a una moi de 1
durante 60 minutos a 37 ºC. Los sobrenadantes de cultivo fueron cosechado 3 días después de la infección, y el
rendimiento del virus infeccioso fue determinado por el ensayo de placa viral. Para los ensayos de posinoculación, las
células se infectaron primero con DENV (moi 1) y luego se trataron con inhibidores de la proteína quinasa (como se ha
descrito anteriormente) durante 3 días, tras lo cual se cuantificaron los títulos virales mediante ensayo de placa.

El Rnai y la Transfección.

Un conjunto de cuatro siRNAs dirigido a la tirosina quinasa humana c-Src (NCBI adhesión no. NM 004383; catálogo no. L-
003110-00) y un siRNA no objetivo dirigido contra la gliceroldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, NCBI adhesión no.
NM 002046; no de catálogo. D-001830-01-05) fueron adquiridos de Dharmacon (Chicago, IL). El conjunto de siRNA fue
transfectado en células Huh-7 (densidad celular de 1 103 células) mediante el uso de Hiperfect (Qiagen, Valencia, CA). En SI
Materials and Methods se proporciona información adicional sobre experimentos de siRNA, incluyendo los efectos de la
eliminación de siRNA en los niveles intracelulares de c-Src evaluados por Western blotting.

Microscopia electrónica de transmisión.

Las monocapas de células infectadas por el DENV y las falsas infectadas se trataron con un inhibidor de la proteína quinasa
o DMSO (como se describió anteriormente) y luego fijado con glutaraldehído al 2,5% y paraformaldehído al 2,0% a 4 ºC
durante 24 h. Las muestras fijas fueron procesadas para ser incrustadas y seccionadas antes de verlas con un microscopio
electrónico de transmisión Tecnai G2 Spirit Biotwin (Tecnai, Hillsboro, OR). En los Materiales y Métodos de la IS se da una
descripción detallada del procesamiento de la muestra. Agradecemos a Nathanael S. Gray por su amplio asesoramiento en
diseño experimental y preparación de manuscritos. Las pantallas principales se realizaron con la asistencia técnica y la
instrumentación del Centro de Cribado ICCB-Longwood.