‘Agronomia Colombiana, 1999. 16 (1-3): 40-45 METODOLOGIA PARA EL DISENO DE BIOENSAYOS EN TOXICOLOGIA ACUATICA Methodology for the desing of bioassays in aquatic toxicity Juana Raquel Robles Gonzalez! y Ricardo Martinez Becerra” * Profesors, Universidad de Cérdoba, Monteia * Profesor Titular. Facultad de Agronomia. Universidad Nacional de Colombia, Santafé de Bogoxs RESUMEN La ereciente descarga de resduos industites y doméstios, et derrame de hidrocarburos, asi como de otros productos {quimieos ha generado serios problemas de contaminacién en las gua y, por lo tanto, es necesario sar la metadologia adecuada gue permita medir la naturaleza y mecanismos de los efectos de ¢sos contaminantes sobre organismos vivientes. En este trabajo se busca: Determinar los. efectos letales ysubletales del endosulfan en nemétodos Panagrellus redivivus, comparar los resultados mediante los métodos Probit y Logistico. Se realizaron 16 bioensayos bajo un disefio completamente al azar, para probar las concentraciones 1,6, 3.2: 6.5: 13,1 y 26 ppm de endosulfan y un control, con cinco repeticiones y 10 individuos por unidad experimental. A 96 horas, la CLig (Concentracién Lota] Mediana) para endosulfan fue 10,89 ppm. y las CE%o (Concentvacién Efectiva Mediana) "de las variables supervivencia, recimiento’y maduracién fueron 10,54; 0,70 y 0,73 ppm, respectivamente. Palabras claves: Concentracién etal, concentracion efectiva, endosolfan, nemétodos SUMMARY ‘The growing discharge of industial and domestic wastes, spill of hydrocarbons, as well as other chemicals has generated serious problems of contamination, It is necessary to use the appropriate methodology to evalvate the nature and ‘mechanisms of these contaminants on living organisms. The objectives of this work were: To establish a methodology regarding the experimental design for bioassays, to determine lethal and sublethal effects of Endosulfan in nematode Panagrellus redivivus, and to compare the results by means of the Probit and Logit methods. Sixteen bioassays were carried ‘out under a completely randomized design, to. test the concentrations 1.6, 3.2, 65, 13.1, 26 ppm of Endoswlfan and a control, with five replications’ and 10 individuals as_the ‘experimental unit. The endosulfan CLSO was 10.89 ppm, and the CE5O for survival, growth and maturation were 10.54, 0.70 and 0.73 ppm, respectively Key words: Lethal concentration, effective concentration, endosulfan, nematodes INTRODUCCION Las pruebas de toxicidad forman parte del grupo de las medidas para evaluar el riesgo ecolégico de los contaminantes. El efecto mds obvio de un contaminante es la muerte ripida y es prctica comtin evaluar este tipo de toxicidad mediante la Clio (conceniracién de la sustancia), prucba que logra matar el 50% de los organismos utilizados en el ensayo o una medida similar (Reyes, 1996). ‘Aunque no todos los productos quimicos son nocivos para los ‘organismos vivos, la descarga al medio ambiente de éstos conlleva riesgos, ya sea por aplicacién directa (Ferilizantes, plaguicidas y herbicidas) 0 como producto de procesos de ‘combustién (6xidos de azufre y de nitrogeno ¢ hidrocarburos) 0 a través de efluentes gencradas en la fabricacién, transporte y consumo de productos utilizados por 1a sociedad modema, ha Hlevado a que en muchos de los medios naturales, se detect, en Ia actualidad, niveles realmente alarmantes ‘de un gran niimero de sustanciastéxicas (Diaz, 1995). ‘A nivel legisltivo, en nuestro pais, el Decreto 1594 de 1984 establece que las Entidades de Manejo y Administracin de Recursos (EMAR) deberin realizar las pruebas de toxicidad necesarias, asi como determinar los valores de CLso 0 CE para sustancias que afecten Ia calidad de! recurso hidrico en Io, relativo a preservacién de flora y fauna (Diaz, 1995). Las técnicas estadisticas empleadas en el presente trabajo, se pueden utilizar para estudios con especies nativas que son de consumo humano y que se desarrollan en cignagas y rios de ‘gran tamafio, Con el propésito de empezar a realizar este tipo de ‘estudio en la regién de Cérdoba, se realiz6 este trabajo con los siguientes objetivos: Establecer una metodotogia estadistica para la realizacién de bicensayos eniendo como organismo de prueba, el nematodo Panagrellus Redivivus, Determinar Ia concentracién Ietal (CLs) del endosulfan en nemitodos.Establecer los efectos subletales que el insecticida endosulfan causa en el nemitodo. CComparar los resultados obtenidos mediante los métodos Probit y Logistico. MATERIALES Y METODOS ‘Se analiza la informacién proveniente de un experimento realizado por Ja estudiante de postgrado Marta Molina, en el laboratorio de Ingenieria Ambiental de la Universidad Nacional de Colombia, en el segundo semestre de 1997 y el primer semestre de 1998 (comunicacién personal). Se us6, como sustancia de referencia, el insecticida endosulfan (Tiodan) aplicada al nemétodo Panogrellus redivivus y se Nevaron a cabo 16 bioensayos. Para este trabajo, s¢ usé une especie pura de nemétodos traida {el Canads, llamada Panagrellus redivivus. Los organismos ée prucba se expusieron a cinco* dosis (I,Sppm; 3,2ppm; 6,Snpm, 13.[ppm y 26pm de endosuifan) yun control. Se seleccionaron nemtodas y se hicieron las observaciones de los individuos en cada etapa (02; J3; J4 y adulto) al final de 96 horas de exposicién, Para cada unidad experimental, se usaron 10 organismos, con cinco repeticiones por dosis para un total de 50 individuos por concentracién. Efectos letales. La variable dependiente analizada fue: Supervivencia: Es el porcentaje de sobrevivientes en la prueba de una muestra relativa a los sobrevivientes en la poblacién control. (Saimoloff ct al, 1980) Syeuts (# de sobreviv. en la prueba) SUPERVIVENCIA= 100 x - Sram (# de sobrev. en el control) Para determinar si la supervivencia ha sido significativamente inhibida por el material de prueba se calcula la prueba ji- cuadrado, un valor mayor que cinco indica letalidad significant [Spreta- Sesni]” JI-CUADRADO = Scant Efectos subletales. Para estos efectos, se miieron las variables ‘maduractén y crecimiento, ‘Maduracién. Es la expresién del nimero de animales 14 que Tegan a la etapa adulta, La inhibicién del cambio final de la poblacisn probada en relacién con la poblacién de muestra control se expresa mediante la siguiente ecuaci [Arata] [S4peute + Apt MADURACION = 100 x [Accreall/ (eget * Acoma] Donde “pony Ape Coresponden respectivamente al nimero de los 14'y'a los adultos en la mesta de prucba, ‘Moonset ¥ Aconwei €S ct ntimero de los J4 y adultos en el control, respectivarment 4 1La prucbaji-uadrado se realiza para determinar si se presenta ‘una significancia estadstca de inhibicin de la maduracibn. Un Valor mayor que cinco indica un efecto significante sobre la maduracién, [Apia - Acca J-CUADRADO = Acct ‘Una tercera variable que se us6 fie la dismimucién en cl crecimiento del animal, Cambio incompleto de los 32-13 0 13-14 indica un efecto negative sobre cl proceso bioquimico 0 fisiolégico no esencial del nemstodo, Crecimiento, La inhibicién al erecimiento se muestra cuando vun mimero significante de animales de prueba fellan en las tapas J4 0 la etapa adulta. El crecimiento de Ia poblacién prueba, relativa al control, se puede expresar como: [i4pmas + Apmets 1! Spe CRECIMIENTO = 100. - [4eenat + A sonst J! Sexist Donde: pain Ap, coresponden respectivamente, al nimero de los 44'ya os adults en la muestra de prucba. “ecsows ¥ Aunt S07 fespectivamente, et némero de los J4 y adultos en el conto. [La prucba j-cuadrado se reali para determinar si hubo una inhibin significant 0 estimulacién de crecimiento por el material de prcba [ 4p + Aprens U4esnma + A conrad) J-CUADRADO = (esr * A cota) Un valor total resumido, que pone mayor énfasis sobre el crecimiento comparado con la maduraciGn, se us6 para indicar ‘un mejor ajuste total de la muestra probada. (4x S goers )+(2%C poets) +M pets Ajuste = 100% 7 La dismimucién en la supervivencia indica que le muestra probada esti afectada por lo procesos bicquimicos y fisiolégicos de 10s nemétodos. La disminucién en la rmaduracién indica un fracaso del nemitodo para usar su informacién genética. E! cambio de J4 a adulto suministra la mayor actividad genética en la vide de los nemétodos (Samoiloft etal, 1980). Una vez recolectados los resultados de los bioensayos, se procedi al procesamiento estadistico, con el fin de halla la varianza del eror de los datos obtenidos, Se aplicé una prueba de homogeneidad de varianzas de los errores (Harley) a los biensayos. Los resultados se analizaron mediante el software S.AS y TOXSTAT, utilizando los métodos Probit y Logistco, con el fin de obtener informacién sobre la relacién concentracién del contaminante-respuesta de los organismos y2 Aeterminar la CLipy 1s intrvalos de confianza para el 95% de toxicidad aguda CEp y Clg, RESULTADOS Y DISCUSION En cada uno de los bioensayos, se determiné el niimero de sobrevivientes, tanto en e} control como en cada concentracién evaluada, con el fin de determinar la CL y la CEsp y se midié cl tamaio de dichos individuos con el objetode apreciar los efectos sobre su crecimiento y maduracién, Efectos letales Los resultados obtenidos de cada uno de los bioensayos se presentan en el Cuadro 1. Como se puede observar en este ‘euadro al compara los resultados obtenidos mediante ambos métodos, el Probit para ambos software (SAS y TOXTAT) presenta una CLs inftir al obtenido con el método Logistco. Debido a esta situacin, se trabajé con los resultados del método Probit con el sistema S.A.S, Se nota que los bioensayos 1; 3; 4; 6; 8 10 no reportan limites de confianza de 95%, debido a que los datos no se ajustaron a una distibucién normal. Por esta razén, estos bicensayos se descartaron y el grupo qued6 conformado por 10 bioensayos. Con este nuevo grupo, se llevé a cabo el andlisis para determinar la CLig y 1a CE del endosulfan, mediante los métodos Probit y Logistco, asi como para evaluar los efectos subleiales de esta sustancia, en cuanto a crecimiento y desarrollo. Los valores de Clip oscilaron dentro de un rango que se debi6 estandarizar con el fin de calelar un valor promedio de CLs. Para oblener este rango con un alto nivel de confanza (95%) fue necesario determinar dos estimadores de los parémetros estaditics bisios, ia media (X) y la desviacignesténdar(S) Los bioensayos cuyos Clip no se encontraran dentro del rango (K-28, X+ 25), el cual representa una confianza del 95%, fueron excluidos de este estudio. Segiin el Cuadro 2, se ‘obtuvieron los siguientes valores: Media (X) = 10,8936 ppm, desviacidn estindar (S) = 1,6985ppm y el limite Superior fue 14,2907 ppm y el limite inferior, 7.4965 ppm ‘Como se observa en el Cuadro I, el grupo quedé conformado ahora por nueve bioensayos, debido a que el NP 5, cuya CLig es de 6.6483 ppm no estavo dentro del rango (7,4965 ppm, 14,2907 ppm). ‘At realizar la prueba de homogencidad de varianzas (prueba de Hartley) para todos los bioensayos que caian dentro del rango establecido (nueve bioensayos), donde la varianza (CM) mayor fue 0,95 y la varianza (CM) menor fue 0.20 (Cuadro 2), Fie = 0,95/0,20 = 4,75, el cual al compararlo con el Fy rico al 19% Fix2975,5, indo homogeneidad de varianzas. Asi, con Tos bioensayos remanentes, se encont6 cl promedtio de la CL del endosulfan en el nemétodo Panagrellus redivivus de 10,8936 ppm. y su respectivo intervalo de confianza fue (74965 ppm; 14,2907 ppm), con un coeficiente de variacién (CV) de 15,59% Curva Concentracién-respuesta La curva concentracién respuesta es una grifca en la cual se ‘expresan los porcentajes de supervivencia versus las diferentes ‘concentraciones evaluadas en los ensayos de toxicidad. 100 = % de Moralidad + % de Supervivencia. Asi que: % de Supervivencia = 100 - % de Mortalida. Matematicamente: % Supervivencia = (Sp/'Sc) * 100 Donde Sp y Se corresponden respectivamente al mimero de sobrevivientes en la muestra y nimero de sobrevivientes en el control Por lo tanto, si se einen los bivensayos que reportaton limites ‘con el método Probit y los que estin dentro del rango establecido y se caleula el poreentaje de supervivencia mediante la relacién matemtica anterior, se tienen los resultados que aparecen en el Cuadro 3. Cuadro I. Resultados de CLsputilizando los métodos Probit y Logistico, N'BIOEN.. CLS0 | (SAS) [_CL50(TOXSTAT) INTERVALO DE CONFIANZA 95%. proBiT | LoGiS. | PROBIT LOGIS._ PROBITIS.A.S) PROBIT (TOXSTAT) T | 12,8418 | 13,05920 | 12,78760 [ 13,07680 | SIN LIMITES (11,1109; 4,7173) 2 | 1218101 | 12,5170 | 12,18130 | 12,52210 | (6.34989; 38,628) (10,3726; 14,3054) 5 | 664837 | 6,76754 | 6,65540 | 6,78020 | (3.2925; 14,1905) (65,7840; 7,6848) 6 | 847327 | 839131 | 8.47630 | 840380 | SIN LIMITES (7.3477; 9,782) 7 | 12,07902 | 12,42600 } 12,07930 | 12,43200 | (5.3745; 80,3282) (10,2091; 14,2921) 9 | 1203398 | 12,30920 | 12,03400 } 12,31100 | —(8,3299; 18,6862) (10,4915; 13,8033) 11 | 1n,st46s | 12,13130 | 11,81470 | 12,13310 | (7,404; 21,4886) (10,2623; 13,6020) 12 | 10,23060 | 10,36514 | 10,23100 | 10,36830 | _(8,9436; 11,7482) (8,9570; 11,6861) 13 | 10,49830 | 10,63675 | 10,49830 | 10,63690 | _(9,2966; 11,8809) (9.3191; 11,8269) 14 | 12,19492 12,42690 | 12,19490 12,2760 | (10,7203; 13,951) (10,7273; 13,8633) 15 | 11,0161 11,15238 | 11,0160 11,15290 | (6,7957; 19,2505) (9,6160; 12,6208) 16 | 10.23979 _10,43200 | 10.24070 10,4040 | _(5,37019; 23,5806) (8.8526; 11,8464)‘Cuatro 2. Bioensayos analizados. N°BIGENSAYO] CM [CL50 (S.A,S), PROBIT] 2 0616) 12,181 5 ) 6,648 7 0,733} 12079 9 0,950] 12,034 10 0,333} ngs 12 '0,409| 10.231 B ‘0,280 10,498 4 0,233} 12,195 15 0,200 1,016 16 0.933. 10,240 ‘Cuadro 3. Valores promedio de supervivencia, crecimiento, ‘maduracién ajuste para las concentraciones de cendosulfan ‘oncentraciones]% de %de | %de [%de (ppm) __supervivencia|Crecimiento|Maduracién} Ajust| 16 1000 | 46,66 | 40,25 [7622 32 966 1962 | 1638 |63,14 65 76,2 444 0,00 | 44,81 BAL 54,2 095 0,00 |31,24 260 355. 0,00 | 2.02 Con estos resultados, se construyé una grifica de la curva concentracién-respuesta, En general, este tipo de curvas se clabora expresando Ia concentracién en escalalogeritmica en el eje X y, en el eje ¥, el porceniaje de supervivencia (%). La representacin grafica de los datos del Cuadro 3 aparece en la Figura 1. En esta figura, se observa una relacién lineal inversa entre las variables concentracién y porcentaje de supervivencia, es decir, que _a mayor concentracién de endosulfan la supervivencia de los nematodos disininuye. Como se puede ‘bservar, las eoncentraciones 6,5 ppm; 13,1 ppm y 26,0 ppm presentaron un porcentaje de supervivencia menor del 90% felativo al control, ésto pudo deberse a la presencia de materiales activos sobre procesos bioquitnicos 0 fisiolbgicos esenciales lo cual indica que en estas dosis existian condiciones txicas. Con los logaritmos de las concentraciones en el eje X y los porcentajes de supervivencia en el eje Y y al aplicar regresin lineal a estos datos, se tiene una curva ajustada, cuya ecuacién 28,93 ~ 77,469 log(X). Figura 1) 0%, al despejar X, se tiene que equivale a 10,4. Por lo tanto, para un porcentaje del $0%.se tiene que la CE media para supervivencia para los nemétodos evaluados con ‘endosulfan fue de 10,4 ppm, con un coeficiente de correlacin ent las dos variables de -0,9412 y un coeficente de determinacién de 0,859. Al comparar el valor de la CLig (10,8936 ppm) y el valor de la CEse para supervivencia (10,44 ‘ppm), se observa que no difieren significativamente, puesto que ppara ‘un porcentaje de supervivencia del 0%, las dos concentraciones deben ser iguales (Clip “CE para a supervivencia), como se explicé anteriormente. 120 32] & 6 a] 134 de supervivencia 888 7 AGSLOQ(H) + 128.99) 20 Re = 0.8859 es| 5 1 1 OD Concentraciones, Figura 1. Curva Concemtracidn-respuesta para superviveneia, Endosulfan, Efectos Subletales. Para determinar los efectos subletales del endosulfan, se evaluaron los efectos sobre crecimiento y maduracién de tos rnematodos, mediante el célculo del CE. El cvadro 3 muestra os. porcentajes de crecimiento y ‘maduracién evaluados para cada uno de los nueve bioensayos. Para oblener estos cilculos, se tuvieron en cuenta los resultados individuales de cada bioensayo. Antes de representar srdficamente los resultados de este Cuadro se determinaron las CE para crecimiento y maduraciOn a través de la curva concentracién-respuesta. Al aplicar regresin lineal, se tiene ‘una curva ajustada cuya ecuacién fue: = 44,296 — 36,916 Tog0X). (Figura 2). 50 40 2=-96,916Logtr + 44,285] 20 R= 08079 2 ‘do Croc Concentraciones Figura 2. Curva concentracién-respuesta para crecimiento. Endosulfan, Para Y =50% de crecimiento y al despear X de esta ecuacién, se obtuvo el valor de Ia CEs para crecimiento, que en este caso, fue de 0,70 pom, con un coeficiente de eorelacién de 0,898 y44 tun coeficiente de determinacién de 0,8079. Esto quiere decir ‘que, 2 partir de la concentracién 0,70 ppm, el insecticida endosulfan influye en cl crecimiento de los nemitodos Panagrellus redivivus. Como se observa, este valor difiere mucho de la Chg y de la CEs» para supervivencia. La Figura 3 presenta el crecimiento de los nemitodos evaluados con endosulfan, en la cual se observa una respuesta adversa al tecimiento con una pendiente de (-36,916ppm). Para determinar cl valor de la CEs para el efecto de maduracién de los nemétodos, se tomaron los resultados de! ‘Cuandro 3 y se ajusté una regresién lineal de la misma manera aque se hizo para el efecto de crecimiento. La ccuacién obtenida fue = 43,83~44967 log (X) (Figura 3). Al despejar, se encontr6 que el valor de X fue 0,73, luego la CE para el efecto dde maduracion del nemétodo evaluado con endosulfan fue de (0,73 ppm, la cual no difiee mucho de la CE para crecimiento, INTERPRETACION DE RESULTADOS Para determinar si los individuos han sido signifcativamente inhibidos, se realiza la prueba ji-cuadrado para supervivencia, crecimiento y maduracién. Luego, se comperan los resultados experimentales con los resultados caleulados a través de esta ‘prueba. (Cuadro $). Al analizar los valores de ji-cuadrado, se tiene que para la concentracién 13,1 ppm, el valor correspondiente fue de 10,58; el cual es mayor que cinco. Por lo tanto, a partir de la concentracién 13,1 ppm, se presenta inhibicién en la supervivencia de los nematodos. Este valor concuerda con la CLst, cuyo valor fue de 10,8936 ppm, debido 1 que éste nos indica el rango general por encima del cual se presenta letalidad significante para los organisms. Cuadro 4. Valores promedio de individuos sobrevivientes, pero si dflere dela CLip El coeficente de comeacin fue de— 4J4 y adultos para tas concentraciones de 019205 y el coeficiente de determinaién (Rt) fue 0,864. Este endosulfanevalundas valor de 12 CEs» para maduracién (0,73 ppm) refleja que el [Concentraciones (ppm) Sobrevivientes] 4 + Adultos | Adultos crn ne notes em gue eos organo ro sine (ppm Sobre Als} Aa jeguen 2 las etspas 44 0 adult, En la Figura 3, la cual representa la maduracién de los nemdtodos bajo el efecto det 32 48,0 | 90 10 incecticida, se observa una respuesta advrsa a la maduracin. 6s 380 10 00 La pendiente en este caso fue de (-44,9679pm) 1B.t0 270 oo 00 260 20 oo : 0 Cundro 5. Cundro j-cuadrado para supervivenca, of fa crecimiento y maduracivn, . Foca peTLaa AB [Concent B20. RP = 0,864 (ppm) | Sobrev. | J4+Adult, Adult.| Superv. | Crecim. Madur. i 16 | 50 | 2 | 9 | 000 | 1458 [3168 dn a2 | 4 | 9 1 | 008 | 3362 | 4602 3 6s | 38 | 1 0 | 2a | sez | 48,00 204 fia Ba | 27 0 0 | 1058. s000 | 4800 i] 26,0 2 0 0 | 46,08 50,00 | 48.00. ° s [ss] Al analizar Ys valores de jlcusdrado para crecimiento y “10 Concentraciones maduracién, se tiene que, en la concentracién 1,6 ppm, los Figura 3. Curva Concentracién-respuesta para Maduracién. Endosulfan. El Cuadro 3 muestra también, el valor total resumido, cexpresado como ajuste del endosulfan evaluado en los nueve bioensayos . Se aplic6 el mismo procedimiento de regresién lineal que se hizo para crecimiento y maduracién. La ecuacién {que se obtuvo fue: =91,648 ~ 59,394 log(X). En este caso, el valor de X fue 5,02, con un coeficiente de correlacién de 0,987 y un coeficjente de determinacién 0,9754. Por lo tanto, el valor ‘de la CE para ajuste fue de 5,02 ppm, con una pendiente de (- 59,394ppm). En el Cuadro 4, se hace una interpretacién prictica de tales porceniajes, ya que se expresa directamente el nimero de individuos que coresponde a cade porcentje. valores correspondientes fueron 14,58 'y 31,68; respectivamente. Como se observa estos valores son mayores 4ue cinco, lo cual indica que, en la concentracién 1,6 pom; hay efectos subletales en cuanto a inkibiciSn o estimulacién en el crecimiento y desarrollo de los nematodos, debido al endosulfan, comoborando el hecho de que, a partir de la concentracién 0,70 ppm (CEs para crecimiento) y 0,73 ppm (CEs para maduracin).se produjeron efectos subltales en los nemétodos. Es de notar que el material de prueba (endosulfan) afeets notoriamenteen el erecimiento y desarrollo (efectos subletal) de los nemétodos Panagrollus redivivus,indicando la presencia de materiales que inhiben el funcionamiento genético normal de Jos nemitodos.CONCLUSIONES La Concentracién Jetal media CLip del endosulfen evaluada en cl nemitodo Panagrellus rediviwis, es 10,89 ppm. Con un iervalo de confianza entre 74965 ppm y 142907 y un coeficiente de variacién (CV) de 15,59% La concentraci efectiva media (CEs) para supervivencia det endosulfan, evalusda en el nemétodo Panagrellus reivivus, es de 10,44 ppm. Valor que, a su vez, es parecido al de la concentracin letal media (10,89 ppm) Ta concentracién efeetiva media (CE, ) para ctecimiento y rmaduracién encontrada para el nemétodo Panagralls zadivisus, es 0,70 ppm y 0,73; respectivamente. Estos valores son muy importantes para los administradoes y eguladores de! ‘medio ambiente, porgue les indica el peligro potencial de los contaminates. La sustancia endosulfan causa més efectos subletales en ef crecimiento y desarrollo de los nemétodas que efectos en la supervivencia, LITERATURA CITADA DIAZ B Maria C. Efectos de los Contaminantes Téxicos en el ‘Ambiente. Ensayos de Toxicidad y su Aplicacién en el Control de 1a Contaminacién Ambiental, Facultad de Ingenieria. Universidad Nacional de Colombia. p. 1-3. Junio de 1996, REYES Carmen. Fundamentacién y Metodologia de los Ensayos de Toxicidad con Microcrusticeos. Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Colombia. p. 1,2. Junio 1996. S.AS. Institute Ine, Logistic Regressién Examples Using SAS* System, version 6. p, 145-149, 1995, SAIMOLOFF, M.R.S. Schulz, Y, Jordan, K. Denich and E, ‘Amot. A rapit simple long-term toxicity assay for aquatic contaminants using nematode Panagrellus redivivus. 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