ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL

FACULTAD DE CIENCIAS

SIMULACIONES DE DINÁMICA MOLECULAR DE LA

INSERCIÓN FORZADA DEL PÉPTIDO ANTIMICROBIANO
BACTENECÍN EN UNA MEMBRANA BILIPÍDICA

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE MAGISTER EN

FÍSICA

JOHNNY CRISTÓBAL LEÓN SEGOVIA

jcleons@gmail.com

Director: MARCO VINICIO BAYAS REA, PhD

marco.bayas@epn.edu.ec

QUITO, OCTUBRE 2019

 DECLARACIÓN

Yo, Johnny Cristóbal León Segovia, declaro bajo juramento que el

trabajo aquı́ descrito es de mi autorı́a; que no ha sido previamente pre-
sentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado
las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.

La Escuela Politécnica Nacional puede hacer uso de los derechos co-

rrespondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propie-
dad Intelectual, por su Reglamento y por la normatividad institucional
vigente.

JOHNNY CRISTÓBAL LEÓN SEGOVIA

 CERTIFICACIÓN

Certifico que el presente trabajo fue desarrollado por Johnny Cristóbal

León Segovia, bajo mi supervisión.

Marco Vinicio Bayas Rea, PhD

DIRECTOR
 AGRADECIMIENTOS

Cada dı́a que pasa tenemos mucha más gente a quien agradecer por
los logros que vamos obteniendo. De todas formas no quiero quedarme
corto en listar las personas, porque con cada una que me encontré en el
camino han aportado para mi crecimiento. Agradezco a los profesores de
la Maestrı́a en Fı́sica con quienes tuve el gusto de aprender no solo de
los libros sino también de sus experiencias y vivencias.

Johnny
 DEDICATORIA

Este objetivo no se hubiese logrado sin el apoyo de mi familia, quiero

dedicarles de todo corazón a mis hijos Juanes, Cami, Dayis y a mi
esposa y amiga Angie, como cariñosamente los digo.
Índice general

Lista de figuras viii

Lista de tablas x

Resumen 1

1 Introducción 1

2 Propiedades Biofı́sicas del Bactenecı́n 5

2.1 Estudios Experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2 Estudios Computacionales . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3 Métodos 9
3.1 Dinámica Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2 Potencial de Fuerza Media (PMF) . . . . . . . . . . . . . 10
3.2.1 Identidad de Jarzynski . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.3 Sistema Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.4 Preparación de Sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.5 Equilibración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.6 Inserción forzada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.7 Cambios en la membrana durante la inserción del Bactenecı́n 17
3.7.1 Área por lı́pido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.8 Modificación de la estructura del Bactenecı́n . . . . . . . 17
3.8.1 RMSD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.8.2 Radio de Giro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

vi
 3.9 Trabajo y Potencial de Fuerza Media . . . . . . . . . . . 18

4 Inserción del Bactenecı́n en la bicapa lipı́dica 20

4.1 Interacción del Bactenecı́n con la bicapa . . . . . . . . . 20
4.2 Cambios en la estructura del Bactenecı́n . . . . . . . . . 27
4.3 Deformación de la bicapa lipı́dica . . . . . . . . . . . . . 29
4.4 Análisis de la trayectoria de la inserción en función de la
Energı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.5 Trabajo del Bactenecı́n en el eje perpendicular a la mem-
brana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.6 Potencial de Fuerza Media . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5 Conclusiones 39

Referencias 42

Anexos 47
Índice de figuras

2.1 Estructura del Bactenecı́n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2 Representación esquemática de la orientación de la estructura tipo lazo-β

del Bactenecı́n respecto a la membrana. A: Ángulos de inclinación τ con

respecto al eje normal a la membrana y B: Ángulo de rotación θ alrededor

del vector ~a. Figura tomada de la referencia [5]. . . . . . . . . . . . 7

2.3 Orientaciones preferenciales en las que el Bactenecı́n se adhiere a la mem-

brana. Figura tomada de la referencia [5]. . . . . . . . . . . . . . . 8

3.1 Representación gráfica de la fuerza externa aplicada sobre el Bactenecı́n

en dirección perpendicular a la membrana. . . . . . . . . . . . . . 16

4.1 Inserción del Bactenecı́n sin restricciones de movimiento de la bicapa lipı́di-

ca aplicando una fuerza de 100pN . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.2 Inserción del Bactenecı́n con diferentes restricciones de movimiento de la

bicapa, aplicando una fuerza de 100pN . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.3 Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 150 pN . . . . . . . 23
4.4 Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 200 pN . . . . . . . 24
4.5 Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 250 pN . . . . . . . 24
4.6 Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 300 pN . . . . . . . 25
4.7 Evolución de la inserción forzada del Bactenecı́n en la bicapa lipı́dica . . 27
4.8 RMSD del Bactenecı́n durante la inserción forzada en la bicapa lipı́dica . 28
4.9 Radio de Giro del Bactenecı́n durante la inserción forzada en la bicapa

lipı́dica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.10 Concentración de lı́pidos en la capa superior . . . . . . . . . . . . . 31
4.11 Concentración de lı́pidos en la capa inferior . . . . . . . . . . . . . 33

viii
4.12 Energı́a Bactenecı́n-lı́pido e Inserción del Bactenecı́n en la bicapa . . . . 34
4.13 Energı́a péptido-lı́pido en relación a la inserción . . . . . . . . . . . 35
4.14 Posición inicial del Bactenecı́n respecto a la membrana . . . . . . . . 36
4.15 Trabajo realizado por el Bactenecı́n al aplicar una fuerza externa de 200pN . 37
4.16 Perfil de Energı́a Libre para la inserción del Bactenecı́n en la membrana

bilipı́dica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Índice de tablas

3.1 Evolución del Sistema Bactenecı́n-DPPC sin aplicar ninguna fuerza externa 15

4.1 Tiempo medio de simulación para que el Bactenecı́n atraviese la membrana

para distintas fuerzas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.2 Tiempo de simulación para que el Bactenecı́n atraviese la membrana con

una fuerza de 200 pN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

x
Resumen

Para entender a nivel atómico como el Bactenecı́n interactúa con la

membrana bilipı́dica de las bacterias durante el procesos de inserción, se
estudió este proceso usando simulaciones de dinámica molecular. En es-
tas simulaciones se aplicaron fuerzas perpendiculares a la membrana con
valores que van desde 100pN hasta 300pN , sobre cada uno de lo carbo-
nos alfa de los residuos Cys3, Cys11 y Val7 del Bactenecı́n. Se analizaron
las trayectorias y se encontró que existen lugares donde es más difı́cil la
inserción del Bactenecı́n debido a la existencia de barreras energéticas.
Estas barreras energéticas se dan principalmente por interacción elec-
trostática de los residuos Arg1 y Arg4 con la bicapa lipı́dica. Durante la
inserción se encontró que tanto la bicapa lipı́dica como el Bactenecı́n su-
fren cambios estructurales. Los resultados de la simulación dan un valor
de perfil de energı́a libre de −4, 247,87Kcal/mol o −2,95 ∗ 10−17 J para
que el Bactenecı́n atraviese la membrana. Este valor negativo indica que
el proceso ocurre de manera espontanea en condiciones de equilibrio.
El cálculo del perfil de energı́a libre se realizó mediante la identidad de
Jarzynski, a partir del trabajo realizado por la fuerza externa.

1
Abstract

To understand at an atomic level how Bactenecin interacts with the

bilipid membrane of bacteria during the insertion process, this process
was studied using molecular dynamics simulations. In these simulations,
perpendicular forces were applied to the membrane with values ranging
from 100pN hasta 300pN , on each of the alpha carbons of the Cys3,
Cys11 and Val7 residues of the Bactenecin. The trajectories were analy-
zed and it was found that there are places where Bactenecin insertion
is more difficult due to the existence of energy barriers. These energy
barriers are mainly due to electrostatic interaction of the Arg1 and Arg4
residues with the lipid bilayer. During insertion, it was found that both
lipid bilayer and Bactenecin undergo structural changes. The simula-
tion results give a free energy profile value of −4, 247,87Kcal/mol or
−2,95 ∗ 10 − 17J for the Bactenecı́n to cross the membrane. This negati-
ve value indicates that the process occurs spontaneously in equilibrium
conditions. The calculation of the free energy profile was carried out th-
rough the identity of Jarzynski, based on the work done by the external
force.

1
Capı́tulo 1

Introducción

Los péptidos antimicrobianos catiónicos (CAPs por sus siglas en

inglés) son pequeñas moléculas protéicas que hacen parte del sistema
inmunologico de un amplio rango de organismos que tienen como ob-
jetivo brindar defensa contra infecciones microbianas [1]. Al momento
los mecanismos de acción de los CAPs no son totalmente conocidos [7].
Se ha comprobado que algunos de estos péptidos matan bacterias tan
rápidamente que es imposible caracterizar lo que ocurre durante el pro-
ceso que precede a la muerte celular [6]. En otros casos, el proceso de
muerte celular puede tardar minutos e incluso horas. Independiente del
tiempo que se requiera para esta, deben ocurrir los siguientes cuatro
pasos: atracción, acoplamiento, inserción del péptido y permeabilización
de la membrana. Cada uno de estos pasos se realiza de forma diferente
dependiendo tanto del péptido antimicrobiano como del tipo de bacteria.

Se han planteado diferentes tipos modelos para explicar la interacción

péptido-bacteria. Los modelos más simples que buscan explicar la per-
meabilidad de la membranas por péptidos, involucran la formación de
porinas o canales a través de la membrana. Dentro de los modelos más
conocidos se encuentra el modelo del poro toroidal, en el cual, los poros
trabajan en contra del núcleo de hidrocarburos, rompiendo la segregación
normal de las partes polares y no polares de la membrana, proporcionan-
do superficies alternativas para los hidrocarburos lipı́dicos y los grupos

1
de cabezas para interactuar favorablemente entre ellos; y el modelo de
poro de barril, en donde el poro trabaja con el núcleo de hidrocarburo
de la bicapa, usándolo como plantilla para el autoensamblaje del péptido.

Además de los modelos de poros descritos anteriormente, la activi-

dad de los CAPs también ha sido descrita utilizando algunos modelos
comunes, en los cuales no hay intervención de los poros, que han sido pro-
puestos para explicar o categorizar el mecanismo de acción de los CAPs.
El llamado “modelo de alfombra” es el modelo fenomenológico carente
de porinas más comúnmente citado y fue propuesto en 1996 [9] para
explicar el mecanismo de acción del Cecropin P1 en mamı́feros. El Ce-
cropin P1, es un péptido antimicrobiano aislado del intestino del cerdo,
el cual siempre se encuentra orientado de forma paralela a la superfi-
cie de la membrana y está activo solo a altas relaciones Péptilo:Liı́do.
Concluyeron, que el péptido está únicamente activo cuando forma una
“alfombra” sobre la superficie de la bicapa. El “modelo de detergente”
también, es a menudo citado para explicar el colapso catastrófico de la
integridad de la membrana y la filtración que se produce posterior a es-
te, observada con algunos CAPs a altas concentraciones del péptido [10].

Si bien estos modelos han servido para tener conceptos unificados, ca-
recen de una base molecular o fı́sico-quı́mica especı́fica para la actividad
de permeabilización de la membrana. Aunque estos modelos pueden ha-
ber inspirado esfuerzos de diseño exitosos [11], rara vez se han utilizado
para hacer predicciones moleculares especı́ficas. En contraste, algunas
discusiones han propuesto modelos fı́sico-quı́micos que deberı́an ser mu-
cho más útiles, como el caso de un modelo basado en la forma de la
molécula para describir la actividad del péptido antimicrobiano; en es-
te modelo, se sugiere que la interacción de los CAPS y las membranas
podrı́an describirse con diagramas de fase, como se describen las mezclas
de lı́pidos [14] [15].

2
 Se ha propuesto, que la separación de fase lipı́dica lateral o la agrupa-
ción de lı́pidos inducida por péptidos antimicrobianos catiónicos explica
sus propiedades biofı́sicas: la selectividad y la actividad biológica [16],
[17]. Han proporcionado evidencia experimental para apoyar esta idea
que sugiere que la filtración podrı́a ocurrir en defectos de frontera[16] de
la bicapa lipı́dica. Por otro lado se ha descrito la actividad de los CAPSs
en términos de unión, inserción y perturbación [18] [19] [20] [21] utilizan-
do modelos cinéticos y termodinámicos. Una vez que estas descripciones
cuantitativas de la actividad de los CAPS están parametrizados para
correlacionar la secuencia peptı́dica o la composición con la actividad,
permitirı́a realizar predicciones de la actividad y por lo tanto, podrı́a ser
útil para la ingenierı́a [22].

En el estudio de los mecanismos de acción de los péptidos antimi-

crobianos, los métodos experimentales tienen serias limitaciones para
la obtención de modelos con detalle atómico, es por esta razón que se
usan métodos computacionales tales, como las simulaciones de dinámica
molecular, que proveen información adicional a la obtenida con las técni-
cas experimentales [2][3]. Estas simulaciones, constituyen una alternativa
altamente utilizada para estudiar los procesos membranales [4]. La des-
cripción de las interacciones entre el péptido y la membrana a medida
que este la atraviesa da información relacionada con los mecanismos que
causan la destrucción de la membrana.

Uno de los péptidos antimicrobianos catiónicos que ha suscitado el

interés cientı́fico en los últimos años es el Bactenecı́n [36][37]. En el tra-
bajo de Morales A. se estudió el comportamiento de este péptido en la
cercanı́as de una membrana de DPPC. Las simulaciones mostraron que
existen ciertas orientaciones preferentes donde el péptido se acercó a la
membrana [5].

3
 En el presente trabajo se realizó el estudio del mecanismo por el cual
se produce la inserción del Bactenecı́n en la bicapa lipı́dica. Para realizar
este trabajo se aplicó una fuerza externa para obligar al péptido a atra-
vesar la membrana, esta fuerza se aplicó sobre los carbonos alfa de los
residuos Cys3, Cys11 y Val7 del Bactenecı́n en dirección perpendicular
al plano de la membrana. Los resultados que se obtuvieron son fuera del
equilibrio, por lo que fue necesario recurrir a la identidad de Jarzynski
[33] para analizar los resultados de energı́a libre en equilibrio. Las simu-
laciones también permitieron analizar los cambios estructurales que se
produjeron tanto del Bactenecı́n como de la bicapa.

4
Capı́tulo 2

Propiedades Biofı́sicas del

Bactenecı́n

El Bactenecı́n es el CAP natural mas pequeño y está conformado por 4

Argininas, 2 Cisteı́nas y otros 6 residuos hidrofóbicos (RLCRIVVIRVCR)
[38] [39]. Las dos Cisteı́nas forman un enlace disulfuro que le da al Bac-
tenecı́n una estructura tridimensional en forma de lazo-β muy estable en
entornos con diferentes grados de lipofilicidad [40]. El plano del Bacte-
necı́n está definido por las posiciones de los carbonos alfa de los residuos
Cys3, Cys11 y Val7.

Figura 2.1: Estructura del Bactenecı́n

Se han realizado muchos estudios sobre este péptido catiónico corto

para modificar su selectividad y aumentar su actividad, ya sea en su
forma lineal o cı́clica, realizando sustituciones de aminoácidos con el fin
de aumentar o disminuir la hidrofobicidad del péptido. Informes recientes

5
también muestran que el estado oligomérico del Bactenecı́n determina
su modo de acción y determina la fuerza de la actividad [12].

2.1 Estudios Experimentales

Se han realizado pruebas del efecto anitimicrobiano del Bactenecı́n

con membranas modelo y el resultado ha sido bastante satisfactorio,
de hecho, comparado con otros péptidos (RTA3, BMAP-18 y CA-MA),
el Bactenecı́n fue el que obtuvo mejores resultados. Todos los péptidos
mostraron una actividad bactericida superior al 97 %. En este mismo
estudio se pudo observar que la membrana de la bacteria se permeabiliza
[12].
Otros estudios experimentales realizados con el Bactenecı́n tienen que
ver con la conservación de alimentos. En este caso la alanina de la posi-
ción 6 se reemplazó con una lisina y se evidenció una eficacia antibiofilm
- bactericida contra monocitogenes aislados de Listeria en productos ali-
menticios y entornos de procesamiento de alimentos. De esta manera se
puede extender la vida útil de productos alimenticios[13].

2.2 Estudios Computacionales

Existe evidencia de que la atracción de los péptidos hacia las bac-

terias se debe a la fuerza electrostática provocada por el péptido y la
estructura aniónica o catiónica de la membrana [5][7]. Una vez que los
péptidos se encuentran cerca a la superficie, estos deben anclarse a la
bacteria. Este proceso es muy importante, sin embargo no existe mucha
información acerca de estudios que indiquen la forma de este anclaje [7].

Se realizaron simulaciones de dinámica molecular, colocando el pépti-

do Bactenecı́n en las cercanı́as de la membrana lipı́dica, con diferentes
orientaciones del Bactenecı́n respecto al plano de la membrana de DPPC.

6
La orientación se describe en base a dos ángulos, uno de inclinación y el
otro de rotación (τ, θ) (figura 2.2) [5].

En las simulaciones de dinámica molecular se revelaron detalles es-

tructurales del comportamiento del péptido antimicrobiano Bactenecı́n
en las cercanı́as a una membrana lipı́dica en la escala de los nanosegun-
dos. Se encontró que el Bactenecı́n es relativamente más estable en la
presencia de la membrana. Ası́ también, que la interacción con la mem-
brana hace que el Bactenecı́n se oriente de una forma especı́fica y se
aproxime a esta. La orientación alcanzada por el Bactenecı́n luego de
2ns de simulación hace suponer que este es un efecto de la interacción
electrostática con la bicapa [5].

Figura 2.2: Representación esquemática de la orientación de la estructura tipo lazo-β del

Bactenecı́n respecto a la membrana. A: Ángulos de inclinación τ con respecto al eje normal a
la membrana y B: Ángulo de rotación θ alrededor del vector ~a. Figura tomada de la referencia
[5].

Las simulaciones mostraron comportamientos diferentes del péptido

para cada orientación inicial, sin embargo se las pudo clasificar dentro
de tres grandes grupos: el primero, en las cuales el péptido no entró en
contacto con la membrana; el segundo, en donde el péptido se acercó a
la membrana, se adhirió a su superficie y permaneció adherido a esta
hasta el final de las simulaciones; y finamente un tercer grupo en las
cuales el Bactenecı́n se adhirió a la superficie de la membrana y luego

7
se insertó parcialmente en ella. Las orientaciones para el tercer grupo
fueron (90, 0), (90, 180), (90,-40), (90, -90). Para el caso de la orientación
inicial (90,-90), tanto el acercamiento del péptido hacia la membrana,
como la inserción parcial en la misma se dan de una manera continua
(aproximadamente lineal). Mientras que en las otras tres simulaciones
el péptido se acerca rápidamente a la membrana y permanece adherido
a esta durante un intervalo de tiempo considerable (entre 4ns y 6ns),
antes de insertarse en la membrana [5].

Figura 2.3: Orientaciones preferenciales en las que el Bactenecı́n se adhiere a la membrana.

Figura tomada de la referencia [5].

También se encontró que existe una correlación entre la interacción

de la Arg1 ó la Arg12 del Bactenecı́n con las cabezas de los lı́pidos y
el acercamiento del péptido a la membrana. Adicionalmente, el análisis
energético del acercamiento del péptido a la membrana mostró que la
energı́a total de interacción estaba dada básicamente por la contribución
electrostática ( 90 %). Esto se corrobora con la existencia de una fuerza
electrostática atractiva neta de la membrana sobre el péptido, cuando
este se encuentra en la cercanı́as de la membrana [5].

8
Capı́tulo 3

Métodos

3.1 Dinámica Molecular

La simulación de dinámica molecular es una técnica computacional

que permite obtener la evolución temporal de un arreglo de átomos que
interaccionan entre sı́, mediante la resolución de sus ecuaciones de mo-
vimiento [25][26][27]. Las interacciones entre los átomos del sistema se
describen en los llamados campos de fuerza, que se obtienen median-
te cálculos mecano-cuánticos y medidas experimentales [29][28][5]. Los
campos de fuerza contienen dos tipos de términos: los primeros (contri-
buciones “enlazantes”) describen las interacciones entre los átomos que
se encuentran ligados con enlaces covalentes, mientras que los segundos
(contribuciones “no enlazantes”) describen las interacciones electrostáti-
cas y las interacciones de van der Waals [31].

En este estudio, se usó el programa NAMD [26], el mismo que uti-

liza una función de energı́a potencial que incluye cinco contribuciones
que corresponden tanto a las interacciones de tipo enlazante como no
enlazante:

U (~
r1 , r~2 , ..., r~N ) = Uenlace + Uangulo + Utorsion + UvdW + UCoulomb (3.1)

9
 X
Uenlace = kie (ri − r0 )2
ei
X
Uangulo = kia (θi − θ0 )2
ai
X
Utorsion = kit [1 + cos(ni φi − γi )]
ti
XX σij 12 σij
UvdW = 4ij [( ) − ( )6 ]
i j>i
rij rij
X X qi qj
UCoulomb =
i j>i
40 rij

Uenlace corresponde a la interacción entre pares de átomos con enla-

ces covalentes, descrita mediante un potencial armónico que describe el
estiramiento o contracción del enlace. Uangulo a la flexión angular asocia-
da a las variaciones de los ángulos entre cada par de enlaces covalentes
que comparten un átomo en el vértice, también modela mediante un po-
tencial armónico. Utorsion a la variación del ángulo diedro formado entre
átomos unidos por tres enlaces covalentes que se encuentran sometidos
a una torsión. UvdW a la interacción de van der Waals, aproximada por
el potencial de Lennard-Jones. UCoulomb a la interacción electrostática
modelada mediante el potencial de Coulomb [30][31].

3.2 Potencial de Fuerza Media (PMF)

El potencial de la fuerza media de un sistema con N partı́culas es el

potencial que proporciona la fuerza promedio sobre todas las configura-
ciones de las n + 1...N partı́culas que actúan sobre una partı́cula j en
cualquier configuración fija de un conjunto de 1...n partı́culas.

10
 e−βV (−∇j V )dqn+1 ...dqN
R
−∇j ω n = R , j = 1, 2...n (3.2)
e−βV dqn+1 ...dqN

Donde −∇j ω n es la fuerza promediada, es decir, “fuerza media” sobre

la partı́cula j. Y ω n es el potencial de la fuerza media. Para n = 2, ω 2 (r)
es el trabajo promedio necesario para llevar las dos partı́culas desde una
separación infinita a una distancia r.

El PMF también se define como el perfil de energı́a libre en una

coordenada de reacción [41]. Para este trabajo la coordenada de reacción
es el desplazamiento en el eje z, que corresponde al eje perpendicular a
la membrana.

Las células vivas se definen en parte por la posesión de una barrera de

membrana que rodea su perı́metro, delimitando ası́, la frontera entre el
interior y el exterior. La existencia de esta barrera, ası́ como las proteı́nas
mediadoras en el intercambio de iones y otros sustratos a través de ella,
conduce inmediatamente a la cuestión de cómo se logra el transporte a
través de la membrana, sea este activo o pasivo y en particular, cómo
se hace selectivamente. Estos cambios son a menudo pequeños o incluso
inexistentes para los canales pasivos, pero pueden ser bastante grandes
para los transportadores activos. La ruta del sustrato también puede
caracterizarse por la energı́a libre del sustrato a lo largo de ella, es decir,
por el potencial de fuerza media, que dicta la velocidad de transporte y
la selectividad [35].

3.2.1 Identidad de Jarzynski

La identidad de Jarzynski es una relación entre las diferencias de energı́a

libre en equilibrio con la distribución del trabajo realizado en una serie

11
de procesos fuera del equilibrio, como una integración termodinámica.
Permite obtener información del equilibrio ası́ como las diferencias de
energı́a libre, desde el promedio de los procesos fuera del equilibrio.

∆G = G(t) − G(0) ≤ hW i (3.3)

Para procesos a presión y temperatura constante (NPT) la identidad

Jarzynski es:

e−β∆G = he−βW i (3.4)

donde β = kB T −1 y kB es la constante de Boltzmann. Este método ha

sido probado en cálculo de simulaciones teóricas [33] y experimentales
[34]. El promedio exponencial del trabajo, en la ecuación de Jarzynski,
tiene un gran aporte de las trayectorias correspondientes a pequeños
valores de trabajo W0→t . Por lo tanto, para estimar la energı́a libre se
requiere un mayor muestreo de tales trayectorias [32][41]. La ecuación
(3.4) puede ser expandida como sigue:
1 1
−β∆G = −βhW i+ β 2 (hW 2 i+hW i2 )+ β 3 (hW 3 i−3hW 2 ihW i+2hW i3 )+...
2 3!
(3.5)
en donde, hW i es el promedio de los trabajos de una misma trayec-
toria. Los términos de menor orden de la expansión están menos in-
fluenciados por el error estadı́stico; el error sistemático introducido por
los términos de mayor orden puede ser considerado menor que el error
estadı́stico. Si la distribución del trabajo es gaussiana, los órdenes de
magnitud mayor a 3 puede aproximarse a cero, de manera que la ex-
pansión puede llevarse hasta el segundo término sin gran error. Ası́ la
expresión para calcular la energı́a libre puede ser:

1
∆G = hW i − (hW 2 i − hW i2 ) (3.6)
2kB T
La ecuación (3.6) no depende del promedio exponencial. En esta apro-

12
ximación, tenemos dos errores involucrados, para la ecuación (3.4) te-
nemos el error estadı́stico debido a un muestreo insuficiente y para la
ecuación (3.6) tenemos el error sistemático debido al truncamiento por
la aproximación de los términos de mayor orden. Para el error estadı́sti-
co debemos realizar un muestreo suficiente de la misma trayectoria para
que este error sea mı́nimo y para el error sistemático, a su vez, debemos
obtener una distribución gaussiana del trabajo. Para que la distribución
del trabajo sea gaussiana el proceso de inserción debe ser lento, para ası́
obtener un mayor muestreo en cada punto, de modo que las magnitudes
de mayor orden de la expansión acumulativa sean aproximadamente cero
[32][41].

3.3 Sistema Molecular

Se toma el modelo Bactenecı́n-DPPC usado en el trabajo de Morales

A.[5]. En ese trabajo se realizaron simulaciones para diferentes orienta-
ciones del Bactenecı́n respecto a la membrana. La orientación con la que
se obtuvo un mayor acercamiento del péptido fue la de (τ, θ) (90, −90)
y es la orientación que se usa en este trabajo.

3.4 Preparación de Sistema

Con el sistema Bactenecı́n-DPPC se realizó la minimización energéti-

ca del sistema en 10 mil pasos, luego se calentó hasta 310K. Este proceso
se efectuó con restricciones de movimiento del péptido, fijando los carbo-
nos alfa del Bactenecı́n para que se mantenga la orientación del péptido
respecto a la bicapa lipı́dica.

El proceso de minimización se usa para buscar mı́nimos locales del

sistema, mediante la variación sistemática de la posición de los átomos

13
y calculando la energı́a de la estructura. La minimización de energı́a
utiliza un sofisticado gradiente conjugado y un algoritmo de búsqueda
de lı́nea. El método de gradientes conjugados se usa para seleccionar
direcciones de búsquedas sucesivas (comenzando con el gradiente inicial)
que eliminan la minimización repetida en las mismas direcciones. A lo
largo de cada dirección, primero se coloca un mı́nimo grupo (se delimita
rigurosamente) y luego se converge mediante la búsqueda de la mejor
sección o cuando sea posible un método cuadráticamente convergente
que usa información de gradiente [26].

3.5 Equilibración

Se realiza la equilibración del sistema Bactenecı́n-DPPC a 310K y

1atm durante 1ns manteniendo la restricción de movimiento a los car-
bonos alfa del Bactenecı́n.

A continuación se ejecutan las simulaciones de dinamica molecular

del ensamble a 310K y 1atm sin restricciones de movimiento durante un
tiempo de 10ns. Los resultados de estas simulaciones se encuentran en la
tabla 3.1 que muestra tanto la distancia del centro de masa del péptido
al plano de la membrana y también la mı́nima distancia del péptido al
mismo plano.

La simulación donde hubo mayor acercamiento del Bactenecı́n a la bi-

capa lipı́dica fue aquella cuya distancia de los centros de masa quedaron
a 4,7Å y la distancia mı́nima fue de −4,47Å. Para la inserción forzada
usaremos como bases esta simulación.

14
 Simulación Distancia CM (Å) Distancia Mı́nima (Å)
1 6.28 -2.15
2 8.17 0.16
3 24.92 15.09
4 4.77 -4.47
5 5.96 -3.67
6 10.73 1.84
7 6.12 -3.23
8 18.56 9.88
9 5.33 -3.89
10 9.47 1.18

Tabla 3.1: Evolución del Sistema Bactenecı́n-DPPC sin aplicar ninguna fuerza externa

3.6 Inserción forzada

Se aplicó una fuerza sobre los carbonos alfa de los residuos Cys3,
Val7 y Cys11 del Bactenecı́n perpendicular al plano de la membrana.
Se aplicó sobre estos carbonos porque son los que dan la estructura de
lazo β al Bactenecı́n. NAMD permite aplicar una fuerza externa a uno
o varios átomos. Esta fuerza se puede aplicar de dos formas, una para
tener una velocidad constante y la segunda que corresponde a una fuerza
constante. Para realizar la inserción forzada se usa el método de fuerza
constante.

15
Figura 3.1: Representación gráfica de la fuerza externa aplicada sobre el Bactenecı́n en
dirección perpendicular a la membrana.

Se inició el procedimiento aplicando una fuerza de 100pN a cada uno

de los carbonos. Para aplicar la fuerza se crea un script tcl. En este script
se indican cuales son los átomos sobre los cuales se aplica la fuerza y se
pasa como parámetro dicha fuerza. Este script se llama desde el archi-
vo de configuración .namd, el mismo que contiene los parámetros para
la simulación. Una consideración importante es que NAMD usa como
unidades para la fuerza Kcal/mol.Å por lo que es necesario realizar la
conversión a pN .

La fuerza se incrementó en valores de 50pN y se ejecutaron las si-

mulaciones hasta llegar a un valor de 300pN aplicada a cada uno de los
3 carbonos alfa del Bactenecı́n. Durante esta primera fase se evaluó la
fuerza con mejores resultados, de acuerdo a los parámetros establecidos
para esta investigación. Es decir que se ejecute en un tiempo razonable
y que además permita obtener información de lo que ocurre durante la
inserción.

16
3.7 Cambios en la membrana durante la inserción
del Bactenecı́n

3.7.1 Área por lı́pido

El área por lı́pido es el área promedio de la membrana para el núme-

ro de lı́pidos de una monocapa. Se construye una malla de puntos sobre
el plano x − y de la bicapa lipı́dica separados 2Å y se calcula el área pro-
medio local por lı́pido en un cuadrado de 20Å cuyo centro es cada punto
y se realiza una interpolación de la superficie. Para la región interna de
la membrana es simplemente el área del cuadrado de 20Å dividido por
el número de átomos de fósforo que se encuentran en dicha área [5].

3.8 Modificación de la estructura del Bactenecı́n

3.8.1 RMSD

Cuando se tienen dos estructuras similares, a menudo se quiere com-

pararlas para saber cual es la diferencia entre ellas y saber cuanto cam-
bió la estructura durante una simulación. Para hacer esta comparación
se debe encontrar la desviación cuadrática media (RMSD).
"P # 21
Nα 2
α=1 (r~α (tj ) − hr~α i)
RM SDα (tj ) = (3.7)
Nα
siendo
N
t
1 X
hr~α i = r~α (tj ) (3.8)
Nt j=1

donde Nα es el número de átomos cuyas posiciones se están compa-

rando, Nt es el número de pasos (tiempo), r~α (tj ) es la posición del átomo
α en el tiempo tj y hr~α i es el promedio de la posición del átomo α para
el las posiciones r~α .

17
3.8.2 Radio de Giro

El radio de giro es un número que ayuda a caracterizar la posición

de los átomos respecto al centro de masa y sirve también para comparar
dos estructuras similares (rgyr ).

− r~c )2
P
im i (~
ri
rgyr = P (3.9)
i mi
donde r~i es la posición de cada átomo, r~c la posición del centro de
masa y mi la masa de cada átomo.

3.9 Trabajo y Potencial de Fuerza Media

La inserción del Bactenecı́n en la membrana se calcula tomando la

distancia del plano que forman los nitrógenos (N) de la capa superior
de la bicapa lipı́dica y el centro de masa del Bactenecı́n. Esto se hace
mediante una resta vectorial y ası́ se obtienen las distancias para cada
paso de la simulación. En este caso, 200 pasos corresponde a un nano
segundo es decir que cada paso corresponde a 5ps. La coordenada que
nos interesa es la del eje z, que corresponde a la perpendicular al plano
y es la misma dirección en la que se colocó la fuerza externa de 200pN
en cada uno de los 3 carbonos alfa.

Para cada uno de estos pasos de simulación, se calcula el trabajo

realizado por el Bactenecı́n para atravesar la membrana. Esto se hace
para cada una de las simulaciones efectuadas. El trabajo total de cada
simulación corresponde a la suma de los trabajos por cada paso de 5ps.
Para cada uno de los periodos de 5ps se obtiene el trabajo promedio.
Finalmente se suman estos promedios para obtener el trabajo promedio
total del Bactenecı́n.

Una vez que se han obtenido las distintas trayectorias, calculamos

18
el promedio de las mismas para cada uno de los registros tabulados,
es decir por cada nano segundo tendremos que hacer 200 cálculos. Con
este promedio realizamos el cálculo del trabajo hW i, ası́ como también
hW i2 y hW 2 i. Una vez que se han calculado estos valores procedemos a
calcular la energı́a libre usando la fórmula (3.6).

19
Capı́tulo 4

Inserción del Bactenecı́n en la

bicapa lipı́dica

4.1 Interacción del Bactenecı́n con la bicapa

Se inician las simulaciones con una fuerza externa de 100pN . Durante los
primeros 5ns la inserción es mı́nima y luego de 10ns el Bactenecı́n se ha
insertado considerablemente en la membrana. Se ejecuta la simulación
hasta 30ns y se observa que el Bactenecı́n ha atravesado totalmente la
membrana, pero debido a que la membrana tiene dimensiones limitadas,
el Bactenecı́n la empujó en la dirección de inserción y esta termina por
salirse del área de simulación, lo que hace que al final de la simulación
los datos no se los pueda tabular adecuadamente.

20
Figura 4.1: Inserción del Bactenecı́n sin restricciones de movimiento de la bicapa lipı́dica
aplicando una fuerza de 100pN

Para mantener la membrana cerca de su posición inicial, se fija el mo-

vimiento de algunos lı́pidos de la bicapa. Se inicia fijando los lı́pidos de
las esquinas y los lı́pidos de los lados tanto de la capa superior como de la
capa inferior, en total 8 lı́pidos por cada capa. Se realiza una simulación
con estas restricciones y se observa que la bicapa lipı́dica se torna muy
rı́gida y el péptido no puede atravesarla.

A continuación se reduce el número de restricciones a 6 lı́pidos para

cada una de las capas y se observa que la bicapa lipı́dica se mantiene en
su posición original y la inserción del Bactenecı́n es bastante similar a
cuando no hay restricciones. Se reducen las restricciones y se dejan fijos
únicamente los lı́pidos de las esquinas de las bicapa lipı́dica, es decir 4
por cada capa. Con estas restricciones se procede nuevamente a realizar
las simulaciones y se observa que con esta configuración se obtiene un
mejor resultado, dado que la bicapa lipı́dica se mantiene un su posición
y además el Bactenecı́n se inserta con mayor rapidez. En la figura 4.2 se

21
puede ver el comparativo de los tiempos de inserción forzada aplicando
una fuerza de 100pN cuando no se tienen restricciones de movimiento
de la membrana y cuando hay restricciones de 4, 6 y 8 lı́pidos por capa.

Figura 4.2: Inserción del Bactenecı́n con diferentes restricciones de movimiento de la bicapa,
aplicando una fuerza de 100pN

Con 100pN , el tiempo aproximado para atravesar la membrana fue

de 30ns, lo que requiere demasiado tiempo de procesamiento, dado que
para cada ns de simulación se necesitan aproximadamente 16 horas de
procesamiento, es decir que para los 30ns se tardó aproximadamente 20
dı́as y considerando que fueron varias simulaciones el tiempo de proce-
samiento invertido hasta este momento fue de 3 meses.

De acuerdo a lo planificado, se realizan las siguiente simulaciones in-

crementando la fuerza en 50pN , es decir se aplicará una fuerza de 150pN
en cada uno de los carbonos alfa.

22
 Figura 4.3: Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 150 pN

En la figura 4.3 se puede observar que aproximadamente a las 20ns el

Bactenecı́n atraviesa la membrana, igualmente el tiempo de simulación
es demasiado grande, por lo que nuevamente se incrementa la fuerza en
50pN . Con la fuerza de 200 pN, se realiza la simulación y se observa que
el Bactenecı́n atraviesa la bicapa lipı́dica aproximadamente a los 9,5ns.
Figura 4.4

23
 Figura 4.4: Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 200 pN

El siguiente paso es ejecutar la simulación incrementando la fuerza

en 50pN , es decir se aplicará una fuerza de 250pN a cada uno de los
carbonos alfa.

Figura 4.5: Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 250 pN

24
 En la figura 4.5 se puede observar que a aproximadamente a los 3,6ns
el Bactenecı́n atraviesa la membrana. Finalmente se incrementa fuerza
en 50pN , de tal forma que se aplicará una fuerza de 300pN a cada carbón
alfa. El resultado de esta simulación se puede observar en la siguiente
gráfica.

Figura 4.6: Inserción del Bactenecı́n aplicando una fuerza de 300 pN

De acuerdo a los resultados obtenidos se puede observar que los me-

jores resultados para realizar esta investigación se dan con 200pN , dado
que el tiempo de procesamiento que se requiere es adecuado para realizar
el trabajo. Con 250pN y 300pN el Bactenecı́n atraviesa muy rápidamen-
te la bicapa lipı́dica y es posible que no se consiga suficiente información
para realizar el análisis de las interacciones que se requieren.

Una vez que se ha decidido trabajar con 200pN sobra cada carbono
alfa, vamos a realizar la mayor cantidad de simulaciones de acuerdo a las
restricciones de tiempo y de procesamientos planteadas para este trabajo.

25
 Fuerza (pN ) Tiempo medio (ns)
100 29,41
150 21,96
200 6,29
250 3,63
300 2,27

Tabla 4.1: Tiempo medio de simulación para que el Bactenecı́n atraviese la membrana para
distintas fuerzas

Se realizaron 20 simulaciones con esta fuerza y con los datos obteni-

dos se calculó el trabajo realizado por el Bactenecı́n durante el proceso
de inserción y usando estos valores de trabajo se calculó el Potencial de
Fuerza Media mediante la identidad de Jarzynski.

En la tabla 4.2 se pueden ver los resultados de las 20 simulaciones

realizadas con una fuerza de 200pN aplicadas sobre cada uno de los car-
bonos alfa.

SMD Frame Tiempo (ns)

1 1515 7.58
2 979 4.90
3 1456 7.28
4 1267 6.34
5 1162 5.81
6 1312 6.56
7 1250 6.25
8 946 4.73
9 1600 8.00
10 1252 6.26
10 1600 8.00
11 949 4.75
12 1400 7.00
13 1097 5.49
14 1128 5.64
15 1146 5.73
16 1221 6.11
17 1600 8.00
18 981 4.91
19 1282 6.41

Tabla 4.2: Tiempo de simulación para que el Bactenecı́n atraviese la membrana con una
fuerza de 200 pN

26
 El Bactenecı́n atraviesa la membrana en diferentes tiempos que van
desde los 4ns hasta cerca a los 9ns. El tiempo que tarda en atravesar la
bicapa lipı́dica depende de la trayectoria que toma el Bactenecı́n.

En la figura 4.7 se muestran instantáneas de la simulación donde el

Bactenecı́n se va insertando en la membrana hasta que la atraviesa. La
membrana termina con una deformación ya que los lı́pidos de las capas
superior e inferior ya no se encuentran en la ubicación inicial y además
se forma una hendidura en la capa superior de la membrana en el lugar
donde se insertó el Bactenecı́n.

Figura 4.7: Evolución de la inserción forzada del Bactenecı́n en la bicapa lipı́dica

4.2 Cambios en la estructura del Bactenecı́n

Para validar que cambio tiene el Bactenecı́n, se calcula el RMSD

durante todo el tiempo de la simulación.

27
 Figura 4.8: RMSD del Bactenecı́n durante la inserción forzada en la bicapa lipı́dica

En la figura se puede observar que durante el proceso el RMSD del

Bactenecı́n cambia, esto quiere decir que la disposición de los átomos
ha cambiado durante el proceso. Existen lugares donde el RMSD tiene
cambios grandes.

28
Figura 4.9: Radio de Giro del Bactenecı́n durante la inserción forzada en la bicapa lipı́dica

En la figura anterior se puede observar que hay una variación del radio
de giro durante el proceso, esto complementado con el RMSD, nos indica
que el Bactenecı́n se deforma durante la inserción en la bicapa lipı́dica.

4.3 Deformación de la bicapa lipı́dica

A medida que el Bactenecı́n se va insertando en la membrana, se

puede observar en cada una de las simulaciones que la bicapa lipı́dica
tiene algunas variaciones. Para cuantificar estos cambios lo que se hizo
es calcular el área promedio local por lı́pido. Para calcular está area se
divide en el plano x − y de la membrana en cuadros de 20Å y calculamos
dentro de esta área la cantidad de lı́pidos presentes.

29
Figura 4.10: Concentración de lı́pidos en la capa superior a los 0ns

Figura 4.11: Concentración de lı́pidos en la capa superior a los 2ns

30
Figura 4.12: Concentración de lı́pidos en la capa superior a los 4ns

Figura 4.13: Concentración de lı́pidos en la capa superior a los 6ns

31
Figura 4.14: Concentración de lı́pidos en la capa superior a los 8ns

Figura 4.15: Concentración de lı́pidos en la capa inferior a los 0ns

32
Figura 4.16: Concentración de lı́pidos en la capa inferior a los 2ns

Figura 4.17: Concentración de lı́pidos en la capa inferior a los 4ns

33
 Figura 4.18: Concentración de lı́pidos en la capa inferior a los 6ns

Figura 4.19: Concentración de lı́pidos en la capa inferior a los 8ns

En las imágenes se puede observar que justo antes de la inserción

forzada del Bactenecı́n, la distribución por área del lı́pido es bastan-
te homogénea, sin embargo, a medida que avanza la inserción se puede
observar como en un área especı́fica la concentración de lı́pidos ha dismi-
nuido mientras que en el lado opuesto ha ido aumentado. Si se compara
el resultado con la simulación, se puede observar que donde hay dismi-
nución de las concentración justamente corresponde al área por donde
se insertó el Bactenecı́n en la bicapa lipı́dica. En la capa inferior, figura
4.11, se ve que cuando el Bactenecı́n atraviesa la membrana hay una

34
reorganización de los lı́pidos, de tal forma que están mejor distribuidos
a los 8ns que a los 6ns.

4.4 Análisis de la trayectoria de la inserción en fun-

ción de la Energı́a

En las simulaciones se pueden observar lugares donde es más difı́cil la

inserción del Bactenecı́n en la membrana que en otros. En la figura 4.12,
se han colocado el gráfico de la energı́a de interacción entre el Bacte-
necı́n y la bicapa lipı́dica y el gráfico de la de inserción del Bactenecı́n
en la membrana. En el gráfico de la energı́a se pueden observar unos
picos de energı́a. El primero corresponde cuando inicia la inserción de
Bactenecı́n en la bicapa lipı́dica aproximadamente a 0,8ns, el siguiente
pico se observa a los 2,8ns y es donde el Bactenecı́n a atravesado la ca-
pa lipı́dica superior y comienza a insertarse en las capa lipı́dica inferior.
El tercer pico se da cuando el Bactenecı́n comienza a atravesar la capa
lipı́dica inferior. Ası́ como existen estos picos también podemos obser-
var que existen mı́nimos de energı́a. Estos picos se dan por una mayor
interacción en el Bactenecı́n y la membrana.

35
 Figura 4.20: Energı́a Bactenecı́n-lı́pido e Inserción del Bactenecı́n en la bicapa

Se puede también observar que en los mı́nimos de energı́a la penetra-

ción del Bactenecı́n en la membrana es mucho más lenta. Ası́ entre 1 y
2ns se inserta el Bactenecı́n aproximadamente 1Å mientras que de 3 a
4ns la inserción es de 5Å. Se pudo determinar que la interacción es neta-
mente electrostática y que los residuos que tienen una mayor interacción
con la membrana son los Arg1 y Arg4.

En la figura 4.13 se distinguen varios mı́nimos de energı́a, sobre todo

alrededor de −15Å, que es justamente cuando el Bactenecı́n a atravesado
la primera bicapa, es decir se encuentra en la mitad de la membrana,
por lo tanto el péptido interactúa con las dos capas lipı́dicas. El otro
mı́nimo que se puede observar aproximadamente a los −4Å se da cuando
el Bactenecı́n se insertó completamente en la bicapa lipı́dica superior.

36
 Figura 4.21: Energı́a péptido-lı́pido en relación a la inserción

4.5 Trabajo del Bactenecı́n en el eje perpendicular

a la membrana

Como la inserción se realiza en sentido opuesto al eje z, los valores de las

distancias de penetración del Bactenecı́n en la membrana en el eje z, son
negativas. El cálculo de la distancia se termina cuando el bactenecı́n o
la membrana atraviesan el área de trabajo, es decir cuando la distancia
entre el Bactenecı́n y la bicapa lipı́dica se vuelven positivos.

37
 Figura 4.22: Posición inicial del Bactenecı́n respecto a la membrana

A continuación se presenta el trabajo realizado por la fuerza externa

aplicada al Bactenecı́n ası́ como el perfil de energı́a libre que se obtiene de
las simulaciones. Al inicio vemos que el trabajo es prácticamente lineal,
lo que sugiere que las fuerzas debidas a las interacciones electrostáticas
no son de la relevantes respecto a la fuerza externa, sin embargo, a me-
dida que el Bactenecı́n se inserta en la membrana, comienzan a ser más
preponderantes las interacciones entre los átomos de tal forma que el
trabajo varı́a porque la inserción disminuye.

38
Figura 4.23: Trabajo realizado por el Bactenecı́n al aplicar una fuerza externa de 200pN .

4.6 Potencial de Fuerza Media

En cuanto al perfil de Energı́a Libre en el eje z, se puede observar

que este se va haciendo cada vez más negativo hasta que llega al valor de
−4, 247,87Kcal/mol o −2,95 ∗ 10−17 J. El hecho de que la energı́a libre
nos de un valor negativo indica que el proceso puede darse de forma
espontánea sin que existe la necesidad de una fuerza externa.

39
Figura 4.24: Perfil de Energı́a Libre para la inserción del Bactenecı́n en la membrana bi-
lipı́dica.

40
Capı́tulo 5

Conclusiones

En este estudio se analizaron las caracterı́sticas del paso forzado del

Bactenecı́n a través de la membrana, según se presentan en simulaciones
de dinámica molecular. Existen tres aspectos importantes revelados por
las simulaciones. Las trayectorias mostraron la existencia de barreras
energéticas que el Bactenecı́n debe superar para atravesar la membrana.
Otro aspecto importante es la existencia de deformaciones sustanciales
en la membrana ası́ como en el Bactenecı́n. Finalmente se mostró que la
permeación del Bactenecı́n en la membrana es energéticamente favorable.

Las trayectorias mostraron que existen algunos lugares donde es más

difı́cil la inserción lo que nos indica que existen barreras energéticas que
hacen que el Bactenecı́n no pueda atravesar la membrana con mayor rapi-
dez. Con una fuerza externa aplicada de 100pN , las barreras energéticas
hicieron que el Bactenecı́n tenga mayor dificultad en atravesar la mem-
brana, sin embargo en un tiempo largo de simulación la atravesó. Por
otro lado cuando la fuerza externa aplicada fue de 300pN , estas barreras
energéticas no se notaron y en las simulaciones de dinámica molecular
parece que todas las trayectorias son similares, lo que hace que se pier-
dan este tipo de detalles que son muy importantes.

La deformación de la bicapa lipı́dica ası́ como del Bactenecı́n, duran-

te el paso del Bactenecı́n a través de la membrana son caracterı́sticas

41
inherentes al proceso. En el caso del Bactenecı́n, las deformaciones pa-
recen estar asociadas a su interacción con las barreras energética. En la
sección donde el Bactenecı́n atraviesa la bicapa lipı́dica disminuye la con-
centración de lı́pidos, lo que sugiere que la membrana se hace permeable.
La pérdida de integridad estructural de la membrana ante la presencia
del Bactenecı́n es consistente con su actividad bactericida. Hay que no-
tar que esto sucede con un solo péptido, pero si fuesen muchos más es
muy probable que también exista una destrucción de la membrana. En
consecuencia, se puede decir que existen dos procesos por los cuales el
Bactenecı́n actúa como antibacteriano, el primero que es la permeación
de las membranas de las bacterias y el segundo la destrucción de la mem-
brana.

A pesar de que el proceso fue estudiado en condiciones fuera del

equilibrio, mediante la identidad de Jarzynski [33] fue posible encon-
trar el Potencial de Fuerza Media en el equilibrio. El valor correspon-
diente de energı́a libre que se obtuvo es negativo (−4, 247,87Kcal/mol
o −2,95 ∗ 10−17 J), lo que indica que la inserción del Bactenecı́n en la
bicapa lipı́dica se da de manera espontánea en condiciones de equilibrio.
La permeación de la membrana ha sido probada de forma experimental
mediante el cultivo de bacterias a las que posteriormente se les hace in-
teractuar con el Bactenecı́n [12]. La tendencia del Bactenecı́n a atravesar
la membrana explicarı́a su capacidad de matar las bacterias de manera
natural.

El cambio de energı́a libre calculado para el paso del Bactenecı́n a

través de la membrana es significativo desde el punto de vista biológi-
co. Para los procesos de plegado proteı́nico el cambio de energı́a libre
está entre 10 y 15Kcal/mol. Mientras que la energı́a liberada por la
hidrólisis del adenosı́n trifosfato (ATP), molécula utilizada en todos los
procesos biológicos como fuente de energı́a, es de ∼ 8Kcal/mol. Con-

42
secuentemente, la permeación del Bactenecı́n a través de membranas
biológicas es energéticamente muy favorable y explicarı́a la efectividad
de este péptido como bactericida.

43
Referencias

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49
Anexos
ANEXO A: Aplicación de la fuerza sobre los carbonos alfa

# Want to force one atom

# 1 kcal/mol·°A ~ 69.48 pN.

# 26380 P1 1 ARG NE NC2

# 26382 P1 1 ARG CZ C
# 26580 P1 12 ARG NE NC2
# 26582 P1 12 ARG CZ C
#Carbonos alfa
# 26414 P1 3 CYS CA CT1
# 26481 P1 7 VAL CA CT1
# 26558 P1 11 CYS CA CT1

set atom3 26414

set atom7 26481
set atom11 26558

print "Fuerza (N): $zforce"

proc calcforces { } {
global atom3 atom7 atom11 zforce
set zforcex [vecscale [expr 1/69.48] $zforce]
print "Fuerza (kcal/mol·°A):$zforcex"
addforce $atom3 $zforcex
addforce $atom7 $zforcex
addforce $atom11 $zforcex
}
ANEXO B: Distancia de penetración del Bactenecín en la bicapa
lipídica.

### Script para calcular la distancia entre el centro de masa del Bactenecín y el centro de
masa de los nitrógenos de la capa lipídica.

#lipidos fijos 13 17 29 32 42 49 51 54

set outfile [open distanciaCM_N1.dat w];

set nf [molinfo top get numframes]

set selprotein "protein"

set sellipid "lipid and name N and resid 13 17 29 32"
set lipid [measure center [atomselect top $sellipid frame 0] ]
for {set i 0 } {$i < $nf } { incr i } {
set protein [measure center [atomselect top $selprotein frame $i] ]
set dist1 [vecsub $protein $lipid]
puts $outfile "$i $dist1"

}
close $outfile

ANEXO C: Concentración de lípidos por área de la bicapa

###Concentración de lípidos por área

proc area_select {sel} {
set minmax_sel [measure minmax $sel]
set min_sel [lindex $minmax_sel 0]
foreach {x1 y1 z1} $min_sel break
set max_sel [lindex $minmax_sel 1]
foreach {x2 y2 z2} $max_sel break
set area1 [expr ($x2 - $x1) * ($y2 - $y1)]
return $area1
}
proc area_fine {sel} {
set selection [$sel text]
set minmax_sel [measure minmax $sel]
set min_sel [lindex $minmax_sel 0]
foreach {x1 y1 z1} $min_sel break
set max_sel [lindex $minmax_sel 1]
foreach {x2 y2 z2} $max_sel break
set maxx [expr round($x2 - $x1) ]
set maxy [expr round($y2 - $y1) ]
set sum 0
for {set i 0 } {$i <= $maxx } { incr i 5} {
for {set j 0 } {$j <= $maxy } { incr j 5} {
set sel_1 [atomselect top "$selection and [expr $x1 + $i] <= x
and x <[expr $x1 + $i +5 ] and [expr $y1 + $j] <= y and
y <[expr $y1 + $j +5]"]
set surface [area_select $sel_1]
set sum [expr $sum + $surface]
}}
return $sum
$sel_1 delete
}
proc area_det {name_psf name_dcd fram out} {
set ext "_out"
mol new "$name_psf.psf" type psf waitfor all
mol addfile "$name_dcd.dcd" type dcd waitfor all
set outfile [open area_$name_psf$ext$out.txt w];
for {set i -50 } {$i <=30 } { incr i 2 } {
for {set j -50 } {$j <=30 } { incr j 2 } {
set sel_lip1 [atomselect top "lipids and resid 1 to 36 and name P
and $i<= x and x <[expr $i + 20] and $j<= y
and y <[expr $j + 20]" frame $fram]
set num1 [$sel_lip1 num]
set sel_lip2 [atomselect top "lipids and resid 1 to 36 and $i<= x
and x <[expr $i + 20] and $j<= y and y <[expr $j + 20]" frame $fram]
set area2 [area_fine $sel_lip2]

if {$num1 > 0} {set area4 [expr $area2/$num1]} else {set area4 $area2 }

#if {num1 > 0}{puts "error"}

puts $outfile "[expr $i + 10] [expr $j + 10] $area2 $area4 $num1"

}}
close $outfile
$sel_lip1 delete
$sel_lip2 delete
mol delete all
}

ANEXO D: RMSD. Desviación cuadrática media

# rmsd

set outfile [open rmsd.dat w]

set nf [molinfo top get numframes]
set frame0 [atomselect top "protein and backbone and noh" frame 0]
set sel [atomselect top "protein and backbone and noh"]
# rmsd calculation loop
for { set i 1 } { $i <= $nf } { incr i } {
$sel frame $i
$sel move [measure fit $sel $frame0]
puts $outfile "[measure rmsd $sel $frame0]"
}
close $outfile

ANEXO E: Radio de Giro

#radio de giro
source radiog.tcl

set outfile [open radiog.dat w];

set nf [molinfo top get numframes]

set frame0 [atomselect top "protein and backbone and noh" frame 0]

set sel [atomselect top "protein and backbone and noh"]

# rgyr calculation
loop
for {set i 1 } {$i < $nf } { incr i } {

$sel frame $i

$sel move [measure fit $sel $frame0]

puts $outfile "[measure rgyr $sel]"

close $outfile

ANEXO F: Trayectorias del Bactenecín durante de la Inserción

Forzada