¿Qué es una librería o genoteca?

Nuestro genoma
•Genoteca genómica – moléculas de vector que contienen
insertos de DNA genómico
•Genoteca de cDNA – moléculas de vector que contiene
insertos de cDNA
Recuerda: RNA cDNA (específico de tejido)

¿Por qué necesitamos una genoteca?

Encontrar lo que buscamos es como buscar una aguja
(gen) en un pajar (genoma/mRNA)

Nuestro gen!
n
cto u
r
eri

ve gar a

r
ma
dig

for
Li

ns

LIBRERÍA LIBRERÍA
tra

genoma

BÚSQUEDA DE
COLONIAS USANDO
La pregunta es: ¿qué plasmico contiene nuestro gen de UNA
interés y como lo aislamos de la genoteca?
“SONDA”

¿Qué podemos usar como sonda? La lógica de cribar una genoteca

Normalmente: El cribado es un compromiso entre:

Un oligonucleótido Una cadena corta de ácidos nucleicos El tamaño del genoma A genomas más grandes mayor
(sintetizada por nosotros) que hibrida número de colonias hay que
con nuestro DNA objetivo cribar

Una sonda de cDNA Un trozo de DNA mayor Tamaño del inserto A medida que el tamaño del
inserto es mayor, menor
número de colonias que cribar
Un anticuerpo El vector debe producir la expresión de
proteínas!

1
 Para P = 99% y F = 20,000 bp…..

ESPECIES TAMAÑO DEL N

N = LOG 10( 1 – P ) GENOMA

LOG 10( 1 – F )
E coli 4.6 x 10 6bp 1.1 x 10 3

N = no de recombinantes necesarios de cribar

P = probabilidad de obtener el clon Human o 3.0 x 10 9bp 6.9 x 10 5

F = tamaño medio de inserto en vector

Para placas con 500 colonias, hay que cribar > 1000 plates
para tener un 99% de probabilidad para tener una colonia
positiva

TIPO LIBRERÍA VECTOR INSERTO MÁXIMO

cDNA plásmido < 10kb

fago 23kb

Genomic cósmido 45kb

BAC 350kb
YAC 1000kb

Figure 9.2

Propiedades que un vector bacteriano debe Vectores:

Vectores:
• llevan el DNA extraño (normalmente plásmidos
tener
• origin of replicación, sitios de E.R. únicos
1. Capaz de replicarse:
replicarse: Vectores plasmí
plasmídicos:
dicos:
• replicarse de manera autónoma (su propio origen de • ocurren de manera natural,
replicación) moléculas dsDNA
• extracromosómico al cromosoma del huesped • Insertos de hasta 15kb de
longitud RruI

2. Marcadores de selecció
selección: • se replica en células del PvuI
PstI

• normalmente resistencia a antibiótico en E. coli huesped

• actividad B-galoctosidasa • 1,000 bp a 100 kb

3. Sitios de restricció
restricción únicos:
nicos: pBR322 (generado
(generado por
• sitio presente sólo una vez en el plásmido ingenierí
ingeniería gené
genética)
tica)
• al linearizar el fragmento puede ser clonado • 2 genes antibióticosR
• sitios de restricción únicos
• solo 10-50 copias/
copias/c élula
4. Alto nú
número de copias si es posible:
posible:
• 1-50 copias (mientras más mejor)

2
 Digiere DNA extraño con
Plásmidos
el mismo enzima
bacterianos se han
manipulado para que Linearizar • Si el sitio de
plásmidos reconocimiento es de 6 bp
sirvan de vehículos
está al azar en el genoma
(vectores) para la con enzimas corta cada 4096 bp (4 6)
replicación de nuestro de restricción
• genoma humano
DNA 3 x 10 9 bp…>7 x 10 5
fragmentos
Propiedades: Una población
• origen de replicación completa de
transfomantes
• MCS (sitios de representa una •Fragmentos individuales se
restricción para librería ligan a plásmidos
introducir el DNA genómica individuales de DNA
• métodos de selección • transformación introduce
del plásmido en la plásmidos individuales
bacteria (clones) en bacteriasf

Pasos implicados en clonaje molecular Pasos implicados en clonaje molecular

4. Transfiere el vector con inserto a cé

cé lulas vivas
• Se llama Transformació
Transformación
Selection
• Se generan copias por replicació
replicación, y por tanto se
conocen como clones de DNA
1. Digerir DNA purificado para clonar es decir obtener el inserto y • Cada clon es gené
genéticamente idé
idéntico
el vector con el MISMO E.R
5. Seleccionar células que llevan plámidos recombinantes
2. Tomar los fragmentos de DNA digerido con un tamañ
tamañ o • resistencia a antibiótico, producto coloreado
adecuado para insertarlo en el vector
3. Ligar con DNA ligasa para formar DNA recombinante ¿Cómo sabemos que un plá
plámido contiene un inserto?
inserto?

Selecció
Selección y cribado de molé
moléculas recombinantes:
recombinantes
Posibilidades en una bacteria transformada:

• La bacteria sola (no transformación) - 1x107 posib. Uso de marcadores

de selecció
selección
• bacteria + plá
plásmido religado pBR322
pBR322 tiene 2 genes
• Bacteria + inserto DNA religado (sin sitio ori) AntibioticR cada uno con un
sitio único E.R.
• Bacteria + plá
plásmido + inserto (molé
moléculas • Inserto en sitio Sal1 se inactiva el
recombinantes)
recombinantes) gen tet R
• se llama inactivació
inactivación por
Necesitamos un modo de seleccionar fácil y rápido inserció
inserción
por recombinantes • convierte el fenotipo de
la bacteria:
• ¿Cómo usamos los marcadores de selección? TetR a Tet S

3
 Colonias con E. coli AmpR
Colonies missing on Tet plate
insert

Master Plate Replica Plate

Ampicillin in Tetracycline in
media media

Volver a la placa original y picar colonias que

no crecen en placas Tet. Estas tendrán el
Seleccionar E. coli con plásmidos inserto de interés.
1) crecer en medio LB con Amp (las E. coli con plásmidos serán AmpR)
-permite eliminar todas las E. coli sin transformar (no tendrán plásmido y serán
AmpS)
2) Pero estamos interesados en plásmidos con inserto – ¿como podemos identificar
estos clones usando marcadores de selección?

3) Hacer una placa réplica de una placa original Amp y transferir a placas con Tet.
Plásmidos con inerto no crecerán en Tet (al ser Tet S)

Selección de transformantes – el plásmido confiere

resistencia a un antibiótico

Amp r Amp r

recombinante

transformantes
Ampicillina

Selección de transformantes recombinantes – p.e.

selección blanco/azul. El operón de la lactosa (Lac)

Lactose
B-galactosidase
galactose + glucose (+allolactose)
INSERTO – inactiva el gen lacZ’:
colonias blancas

mRNA policistrónico Blue

X-gal lacZ’

lacI C-
ter
m
-ve plasmid

Alolactosa se une al represor lac e inhibe represión

IPTG
El gen lacI está controlado aparte (situado aguas arriba)

Expresión de lac Z, posibilita a E. coli metabolizar glucosa Genoma de la bacteria

Expresión de lac Y permite a E. coli importar lactosa
lac A es una tiogalactosidasa transacetilasa

4
 Vectores pUC:
pUC:
β- galactosidasa (Lac Z) convierte lactosa en galactosa + glucosa
Amp r

recombinantes

transformantes

Como identicar clones de interés en este plásmido

El cribado de colonias azules y blancas es lo más usado en procesos de clonación • Usar un producto sintético llamado X-gal
• β-galactosidasa brompe X-gal a galactosa + colorante azul

Identificar Transformantes
Select for White colonies on Ampicillin (AmpR)
(LacZ-)
and X-gal plates (LacZ

pUC Vector

Blue white

Ampicilina + medio X-Gal

Medio con Ampicilina Permite seleccción y cribado en una placa.

No hace falta réplica. Picar colonias blancas

Clonaje direccional
Evita autoligación y a menudos se quiere introducir en una
orientación determinada
• Se puede hacer usando dos enzimas de restricción
distintos en el vector
• Generar el DNA a clonar con los dos mismos enzimas
de restricción
• DNA sólo se puede insertar en una dirección

5
 Los virus también se pueden usar para
Sub-clonación clonar moléculas de DNA exógenos
debido a su capacidad de propagarse en
bacterias

plásmido A plásmido B

• digerir DNA de
fago lambda
• eliminar sección
intermedia
(contiene genes
para lisogenia)
• ligar DNA
extraño a los
brazos del fago •infect E.
lambda coli

• mezclar con
proteínas de la
cápsida para
empaquetar DNA
recombinante

Crear una librería

genómica usando fago
lambda... Cósmidos
smidos

•Infectar una célula • Es un plá

plásmido pequeñ
pequeño que contiene el sitio cos, un
bacteriana con un origen de replicació
replicació n de un plá
plásmido y genes de
fago recombinante resistencia a antibió
antibió tico
(CLON)
• mezclar con • Se empaqueta como un bacterió
bacteriófago,
fago, pero el
bacteria sin infrectar plá
plásmido se replica como un pláplá smido cuando el
y plaquear DNA está
está en la bacteria
• Pueden insertarse fragments de DNA 35 y 45
Todas las placas de kilobases
fago juntas es una
genoteca genómica

6
 Vectores en levaduras
Cósmidos
Cromosomas artificiales en levaduras (YACs)
YACs)

• Vectores que son híbridos entre plásmidos y

1. Contiene los componentes siguientes:
siguientes :
fago lambda • Un centr
centróómero que permite al cromosoma que se transfiera a ccé é lulas
hijas durante la divisió
división celular
• Se pueden replicar en la bacteria como un • Un tel
teló
ó mero al final del cromosoma de levadura que permite replicació
replicaci ón
plásmido y empaquetar como un virus correcta y evita degradació
degradaci ón
• Una secuencia de replicaci
replicació
ón autó
aut ónoma (ARS) que consiste en
• Pueden contener fragmentos de DNA más secuencias de DNA especespecíífica que permite la replicació
replicació n de la mol
molé écula
• Un gen que permite un modo de detectar la detecció
detecci ón del fragmento
grandes que los plásmidos insertado
2. Util para clonar grandes fragmentos de DNA (entre 200 y 1500 kilobases)

Estudios genéticos
Cromosomas artificiales de bacterias clásicos identifican
Resumen de la
un gen con un
(BACs)
BACs) fenotipo construcción de una
interesante…como genoteca genómica
lo clonamos
• Vectores sinté
sint éticos que se han usado para clonar fragmentos grandes de
cromosomas de eucariotas ((entre
entre 100 y 300 kilobases
kilobases))

• Usado en el an
anáálisis de grandes fragmentos de genomas complejos,
complejos , genes
completos y construcci
construcció ó n de mapas fí
f ísicos de genomas

• Generado usando un pl plá

ásmido pequeñ
peque ño, llamado factor F (fertilidad
( fertilidad),
), permite
la clonaci
clonacióón y marcadores de selecció
selecció n

• El factor F permite al vector integrar grandes fragmentos de DNA, siendo

hasta un 25% del tama
tamañño del cromosoma bacteriano
La genoteca genómica
contiene >10 6 clones
individuales ¿Cómo identificamos un
clon que contiene un gen
de interés en una
genoteca?

Nuestro genoma

¿Cómo identificamos un clon

que contiene un gen de interés
en una genoteca?

Nuestro gen!

7
 n
cto u
r
eri

ve gar a

r
ma
dig

for
Li

ns
LIBRERÍA LIBRERÍA

tra
genoma

BÚSQUEDA DE
COLONIAS USANDO
La pregunta es: ¿qué plasmico contiene nuestro gen de UNA
interés y como lo aislamos de la genoteca?
“SONDA”

Información sobre la secuencia de proteína da información

¿Qué podemos usar como sonda? sobre la síntesis de sondas de oligonucleótidos
Normalmente:

Un oligonucleótido Una cadena corta de ácidos nucleicos

(sintetizada por nosotros) que hibrida
con nuestro DNA objetivo

Una sonda de cDNA Un trozo de DNA mayor

Un anticuerpo El vector debe producir la expresión de

proteínas!

• replica plate
Cribado usando secuencias similares plaques or
colonies onto
filter
• Si un tejido está enriquecido en un mRNA
determinado, éste se puede usar como sonda Librería genómica
• denaturedeDNA
fago lambda
on filter
– p.e. secuencias de genes de globina
plaqueadas en placas
• A veces es más fácil aislar una secuencia de un • incubate with
petri
radiolabeled
organismo que de otro, y este gen relacionado se probe
puede usar para pescar el mismo gen de otro Cada clone ocupa un that
• detect cells
genoma lugar específico
contain encorrect
– p.e. secuencias de genes de actina una placagene by
autoradiography
• grow up
appropriate
clone

8
 • replica de
placas o
Ejemplo:
colonias en un
filtro Estamos interesado una proteína (P450) que metaboliza
drogas anti-HIV
• desnaturalizar
DNA en el filtro Hemos purificado una proteína de 50kDa y reconstituimos una
actividad que metaboliza la droga (estamos bastante seguros
• incubar con
que hemos purificado la proteína correcta)
sonda
radioactiva Secuenciamos los aminoácidos del amino N
• detectar las La secuencia que obteniemos es:
células que
MALIPDLAM????. ilegible….
contienen el gen
por
autoradiografía
Queremos saber la secuencia de aminoácidos completa y tener
• crecer el clon el clon para manipularlo
apropiado

Usamos el código genético para designar oligonucleótidos para el

No secuenciamos proteínas para tener su secuencia de aas cribado
completa: técnicamente dificil
Deducimos la secuencia de aas a patir de su secuencia de cDNA
Necesitamos clonar el cDNA para el enzima P450

¿Qué hacemos?
1. Hacemos una genoteca de cDNA de un tejido que exprese
altos niveles de la proteína (si cantidad de proteína es alta, es
lógico que cantidad de mRNA sea alta y por tanto
enriquecemos el cDNA)
2. Cribamos la genoteca con una sonda: - ¿oligonucleotido?
- ¿anticuerpo?

M A L I P D L A M Secuencia de proteína

5’ UUA AUU CCU GAU

G C C C Codones de mRNA
CUU A A posibles
C G
n
ci ó

A
ma

G
for

GENOTECA
ns

U/
UN AU U/C/ CCN GA U/C mRNA consenso
tra

C
A

Por ej. UUN AUG CCN GAC

Reverso complementario

5’ GTC NGG GAT NAA Secuencia de la sonda

AAAAAAAAAA 3’
5’ 5’

9
 Hacer una copia en nilon de la placa de bacterias OBJETIVOS
Cribar nuestra copia en nilon con nuestro oligo marcado 1. Qué es clonar
El oligo hibridará con nuestro plásmido recombinante que
2. Enzimas que se usan en tecnología del DNA
contengo el reverso complementario de la secuencia del oligo
recombinante
3. PCR

* 3 Generación y cribado de genotecas

* 4. ¿PORQUÉ? – Expresión del gen / mutagénesis.
Picar y
* * crecer 5. Secuenciación del DNA
(clon)

NILON AUTORA PLACA DE AGAR

DIOGRAFÍA

¿Por qué el peñazo de clonar? Razones posibles-

•Secuenciación de cDNA sequence …. Determinar la secuencia de

Purificar por cromatografía
aminoácidos de una proteína de afinidad
bacteria
•Expresar el cDNA – proteína, producir grandes cantidades y
proteína pura Ni

•Crear una proteína con etiqueta: p.e. Generar una etiqueta de His Ni
HI
S ligate
Ni
VECTOR
Eluir
HIS

Eg plasmid

Otras proteínas

Determinados resíduos de Aas se pueden mutar: Si podemos obtener nuestro vector recombinante:

M A L I P D L A M Secuencia de proteína

5’ UUA AUU CCU GAU

Posibles codones de
mRNA
Dentro de células humanas y si permaneciera estable y
expresada la proteína lo podríamos usar como terapia
génica
Si cambiamos UUA AUU CCU GAU a
UUA AGG CCU GAU o Mutación I/R
Sin embargo, no funciona – actualmente se están
UUA CCU GAU o Delección intentando vectores virales
UUA UAG Truncar

stop

10
OBJETIVOS Secuenciación del DNA

1. Qué es clonar Nos informa de la secuencia del gen / cDNA / aminoácido

2. Enzimas que se usan en tecnología del DNA ¿Cómo se hace? Método enzimático de Sanger- recordar DNA
recombinante polimerasas:
Necesitamos un cebador con un 3’OH libre
3. PCR
DNA se sintetiza en una nueva cadena SIEMPRE en dirección
3 Generación y cribado de genotecas 5’ 3’
4. ¿PORQUÉ? – Expresión del gen / mutagénesis. Se basa en le parada de polimerización en los dideoxinucleótidos de
la nueva cadena
5. Secuenciación del DNA
5’ 3’OH
3’ 5’

Dideoxinucleotidos:
N
5’ se usan para parar la síntesis en una base específica
P
N N
5’
+ P
P

N N
P P
DNApol
N N
P P

P
OH OH

Análogo Dideoxy
P
N
P
NO TIENE 3’ OH
OH

Dideoxynucleótidos N
5’ • Se preparan 4
N N P reacciones de síntesis
+
5’ P P de DNA diferentes
N N
P P
• comienza la síntesis
N
DNApol
N
de un lugar donde se
P P
ceba específicamente
P • se añaden los
OH
P
H componentes para
N
P síntesis de DNA + No
ddNTP específico para 3’OH...
H PARADA!! for cada una de las 4
reacciones

11
 Correr las 4 A
reacciones A
T
diferentes en un C
gel de T
G
electroforesis… G
los fragmentos G
C
más pequeños T
(más cercanos A
T
al cebador) T
migra más lejos C
G
G
G
Para la cadena C
G
sintetizada ... T
Leer
5’>3’

Secuenciación automática de
DNA:
• cada reacción se marca
específicamente con una
molécula fluorescente distinta A
A
•Puesto que cada fragmento se T
5’ a 3’ para la marca con un color distinto se C
T
cadena pueden cargar en la misma
G
sintetizada... calle G
•Un laser incorporado en el G
C
aparato puede iluminar las T
bandas y grabar la señal A
fluorescente cuando el DNA T
pasa el detector… T
C
G
G
Señal azul G
computador fluorescente C
G
detectada T

Resumen
La salida del detector se envía directamente a un
computador y la secuencia de DNA se graba (en 1. ¿Qué es clonar?
tiempo real) a medida que se corre el gel…
Hacer múltiples copias de la misma cosa

2. Enzimas empleados en tecnología de DNA

Ejemplo de salida:
recombinante
DNA polimerasa
RNA polimerasa
Transcriptasa reversa
Endonucleasas de restricción
DNA ligasa
Fosfatasa
Quinasa

12
3. Hacer genotecas 4. ¿Por qué? – expresión del gen / mutagénesis
DIGERIR / LIGAR / VECTOR / TRANSFORMACIÓN / Estudios de función génica / purificación / mutagénesis
HUESPED
5. Secuenciación del DNA
• Genoteca genómica – moléculas de vector que contienen
DNA polimerasa / cebador / ddNTPs
insertos de DNA genómico
• Genoteca de cDNA – moléculas de vector que contienen
insertos de cDNA – recuerda RNA cDNA (específico
de tejido) MOLECULAR
• Tamaño del inserto / tipo de vector BIOLOGY OF THE
GENE
• Tipos de sonda

4. PCR.

13