UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE AGRONOMÍA

Curso: Biotecnología Vegetal

Tema 11: Secuenciación de genomas. Métodos de secuenciación de

fragmentos de DNA y genomas. Proyectos de secuenciación de genomas
de plantas, microorganismos y de genomas virales.

Docente: Emerson Clovis Carrasco Lozano

Email: emerzon.cl@gmail.com

© 2014 American Society of Plant Biologists

Objetivos del tema 11

• Conocer los genomas eucariotas.

• Conocer los métodos de secuenciación de fragmentos de DNA
y genomas.
• Conocer los proyectos de secuenciación de genomas de
plantas, microorganismos y de genomas virales

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Genomas Eucariotas

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DISTRIBUCIÓN DEL GENOMA EUCARIOTA

En el genoma humano, los

genes ocupan el 25%, pero
secuencias que codifican
proeteinas son solamente
una pequeña parte de esta
fraccion

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Secuencias repetitivas es >50% del genoma eucariota

Las secuencias repetitivas son:

Transposones
Duplicaciones
Repeticiones simples

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Genomas eucariotas contienen secuencias de DNA repetitivos y no-repetitivos

Las proporciones de diferentes

tipos de secuencias varia entre los
genomas eucariotas.

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Proteinas eucariotas comunes con funciones celulares esenciales

Más de 1,300 funciones

esenciales son comunes en
sistemas eucariotas.

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 Tamaño relativo de genomas haploides de varios organismos

La mayoría de
eucariotas tiene un
tamaño de genoma
entre 107 y 1011 bp de
DNA.

Imagen tomado de: Biochemistry & Molecular Biology of

Plants, Second Edition. Edited by Bob B. Buchanan, Wilhelm
Gruissem, and Russell L. Jones. © 2015 John Wiley & Sons,
Ltd. Published 2015 by John Wiley & Sons, Ltd. Companion
website: www.wiley.com/go/buchanan/biochem

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CARIOTIPO HUMANO
En un cariotipo, las células en división se extienden sobre un portaobjetos de vidrio para liberar sus cromosomas. Los cromosomas se tiñen y alinean en función
de su tamaño global, la posición del centrómero y su patrón de tinción, para crear así un cariotipo.

Imagen tomado de: Introducción a la

Biotecnología. Segunda Edición. Editado
por Thieman, W. J. and Palladino, M. A.
(2010). PEARSON EDUCACIÓN, S.A.
Madrid (España).

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Funciones propuestas para los genes humanos asignadas a diversas categorías
funcionales

Los paréntesis
muestran porcentajes
basados en los datos
publicados en por
Venter et al. 2001, para
26.383 genes.

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El genoma cloroplástico de Oryza sativa

(A) The chloroplast genome map of rice (Oryza sativa) is representative of the
organization of plastid genes in most flowering plants. ORF, open reading frame.

(B) Schematic representations of several plant plastid genomes, showing the

conserved features: two regions of single‐copy genes and two inverted repeats
(IRs). The length of the IRs can vary widely among plastid genomes of different
species. The single‐copy regions in the plastid genome of the nonphotosynthetic
parasitic plant Epifagus are quite small because most of the genes encoding
photosynthetic proteins have been eliminated. The number beneath each DNA
segment refers to its length in base pairs.

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Genes en el genoma
del cloroplasto

*Epifagus (beechdrops) is a nonphotosynthetic, parasitic flowering plant.

†Porphyra is a red alga.
‡The plastid genome of black pine does not encode genes for NADH dehydrogenase.

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El genoma mitocondrial de Zea mays

The map of the mitochondrial genome of maize

(Zea mays) is based on a hypothetical master
circle DNA molecule that contains all of the
mitochondrial genes. Although the mitochondrial
DNA in maize is considerably larger than the
chloroplast DNA, it contains fewer genes. Several
inverted and direct repeat DNA sequences
(shown in blue, green, and magenta boxes on the
inner circle) have been identified that participate
in recombination events to produce the small
subgenomic circular DNA molecules shown in
Figure 6.27.

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Genes identificados en el genoma
mitocondrial de maíz.

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 Métodos de secuenciación de
fragmentos de DNA y genomas

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vectores para clonación de fragmentos de
DNA de mayor tamaño

1. Vectores bacteriófagos.
2. BAC (Cromosoma Artificial Bacteriano).
3. YAC (Cromosoma Artificial de Levadura).

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Secuenciación de ADN:
Determinar la secuencia de nucleótidos de una muestra de ADN.

Primeras técnicas de secuenciación:

1. Método de Maxam-Gilbert (1976)
2. Método de terminación de cadena de Sanger (1977):
Se terminó imponiendo por ser más sencillo y preciso
Se basa en el uso de dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs), que
es un nucleótido al que le faltan dos grupos –OH. De este modo,
al entrar en contacto con la DNA-polimerasa ésta no puede
enlazar otros nucleótidos al ddNTP .

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 Secuenciación de Sanger

 Primer: secuencia corta de DNA (unos 20 nucleótidos) que sirve de punto de inicio para sintetizar una
secuencia.
 Plantilla: secuencia simple de DNA que queremos copiar
 Deoxinucleótido trifosfato (dNTP): nucleótido unido a un trifosfato. Sanger usa en su lugar ddNTPs,
sin los dos grupos –OH.
 De este modo, al entrar en contacto con la DNA-polimerasa ésta no puede enlazar otros nucleótidos al
ddNTP

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 Para la secuenciación se necesita:
Una plantilla a copiar
Un primer para empezar la copia
DNA polimerasa para hacer la copia
ddNTPs que añadir al primer:
Marcados con fluorescencia o radiactividad
Finalizan la copia tras añadirse

 Se realizan cuatro reacciones separadas, cada una con un ddNTP

distinto y marcado (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).

El resultado es una secuencia complementaria a la plantilla, comenzando

con el primer, marcada de distinta manera en cada nucleótido, y de la
longitud que queramos según el número de reacciones que hagamos.

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Esquema de la secuenciación tipo Sanger

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 Pirosecuenciación
 Una alternativa más moderna (1988), más rápida y barata, aunque
menos precisa.
Aprovecha el trifosfato que se libera cuando el dNTP se une
a la cadena, en forma de pirofosfato (PPi).
Requiere de tres enzimas adicionales: ATP-sulfurilasa,
luciferasa y apirasa.
Requiere de dos sustratos adicionales: adenosin- fosfosulfato
(APS) y luciferina.
Con estas enzimas se obtiene reacciones que de manera natural
generan señales luminosas, ahorrando las marcas fluorescentes, y
haciendo el proceso más rápido y barato.

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a) Partimos, como en Sanger, de una
secuencia plantilla y un primer, pero con más
enzimas y sustratos, y sin etiquetar los dNTPs
b) La polimerasa une un dNTP, liberando un
PPi en el proceso
c) La ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP
con ayuda del APS
d) La luciferasa convierte el ATP en luz, con
ayuda de la luciferina
e) Medimos un pulso de luz
f) La apirasa se libra de los reactivos sobrantes
para que el sistema esté limpio para el
siguiente dNTP
g) El resultado final es, como en Sanger, picos
de intensidad

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Secuenciación
primer saltarín

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Secuenciación
primer saltarín

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Estrategias de secuenciación
de genomas:

(a) enfoque shotgun (bombardeo)

(b) Enfoque clonación de contig

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Etapas en la secuenciación de genomas
(shotgun):

El ADN genómico se fragmenta aleatoriamente

(shotgun)
• Los fragmentos se clonan en forma de cromosomas
artificiales de bacterias (BAC)
• Y se almacenan en bibliotecas según su tamaño
(jerarquía)
o fragmentos grandes (100-500kb)
o cósmidos (~50kb)
o plásmidos (~2kb)
• Los clones BAC se secuencian, obteniendo
secuencias desordenadas
• Se ordenarán con el ensamblado (algoritmos de
alineamiento, se usa genomas de referencia)

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Construcción de librerías metagenómicas

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 Proyectos de secuenciación de
genomas de plantas, microorganismos
y de genomas virales

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Estudio de caso: Genoma de Arabidopsis thaliana

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Representation of the Arabidopsis chromosomes

The genome contains 25,498 genes encoding proteins

from 11,000
families, similar to the functional diversity of Drosophila
and Caenorhabditis elegansÐ the other sequenced
multicellular
eukaryotes.

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Summary statistics of the Arabidopsis genome

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Summary statistics of the Arabidopsis genome

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Segmentally duplicated regions in the Arabidopsis genome.

Individual chromosomes are

depicted as horizontal grey
bars (with chromosome 1 at
the top), centromeres are
marked black. Coloured
bands connect corresponding
duplicated segments.

Similarity between the rDNA

repeats are excluded.
Duplicated segments in
reversed orientation are
connected with twisted
coloured bands. The scale is
in megabases.

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Estudio de caso: Genoma de papa

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El genoma de papa

a, Ideograms of the 12 pseudochromosomes of potato (in Mb scales). Each

of the 12 pachytene chromosomes from DM was digitally aligned with the
ideogram (the amount of DNA in each unit of the pachytene chromosomes is
not in proportion to the scales of the pseudochromosomes).
b, Gene density represented as number of genes per Mb (non-overlapping,
window size51 Mb).
c, Percentage of coverage of repetitive sequences (non-overlapping
windows, window size 51Mb).
d, Transcription state. The transcription level for each gene was estimated
by averaging the fragments per kb exon model per million mapped reads
(FPKM) from different tissues in non-overlapping 1-Mb windows.
e, GC content was estimated by the per cent G1C in 1-Mb non-overlapping
windows.
f, Distribution of the subtelomeric repeat sequence CL14_cons.
S. tuberosum group Phureja (DM). Cromosomas: 2n=4x=48
S. tuberosum group Tuberosum (RH).

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Análisis comparativo y evolución del genoma de papa.

a, Clusters of orthologous and paralogous

gene families in 12 plant species as
identified by OrthoMCL33. Gene family
number is listed in each of the components;
the number of genes within the families for
all of the species within the component is
noted within parentheses.
b, Genome duplication in dicot genomes as
revealed through 4DTv analyses.
c, Syntenic blocks between A. thaliana,
potato, and V. vinifera (grape)
demonstrating a high degree of conserved
gene order between these taxa.

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Estudio de caso: Genoma de quinoa

Chenopodium quinoa Willd., 2n = 4x = 36

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Historia evolutiva de la quinoa.

a, Seeds of C. suecicum, C. pallidicaule

and quinoa.
b, The proportion of gene pairs in each
species binned according to Ks values.
c, Maximum likelihood tree generated
from 3,132 SNPs.
d, Evolutionary relationships of
Chenopodium species, showing the
hypothesized long-range dispersal of an
ancestral C. berlandieri to South
America, and the eventual domestication
of quinoa from C. hircinum.

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Identificación y caracterización de
sub-genomas de quinua

a, Blue lines and green lines connect regions

of the C. pallidicaule and C. suecicum
genomes, respectively, with their orthologous
regions in the quinoa genome based on
BLASTN.
b, Homoeologous gene pairs in the A (blue
chromosomes) and B (green chromosomes)
sub-genomes.
c, Simplified representation of synteny
between CqA12, CqB05, CqB03 and CqA10.
d, Syntenic relationships between B. vulgaris
and the A and B sub-genomes of quinoa.

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 El Top 10 de bases de datos de genomas de plantas

http://plants.ensembl.org/species.html
http://www.etnobiofic.cat/gsad_v2/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/overview/
http://pgdbj.jp/plantdb/plantdb.html?ln=en
https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html
http://data.kew.org/cvalues/CvalServlet?querytype=1
http://www.plantrdnadatabase.com/
http://www.etnobiofic.cat/plantrdna_v3/index.php?plantrdna=spg
http://www.plantgdb.org/prj/GenomeBrowser/
http://ocri-genomics.org/PTGBase/

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