MODALIDAD: Investigación

TITULO DEL PROYECTO:

Producción heteróloga y caracterización de la actividad aciltransferasa de la lipasa

LipA de Amycolatopsis sp. ATCC 39116: Una lipasa con potencial en la producción
de biodiésel

Fecha y firma de recibido Escuela de Biología:

ALUMNO(S) RESPONSABLE (S):

Nombre: Alejandra Ramírez Camacho Código: 21141341

Carrera: Biología

DIRECTOR DEL PROYECTO CODIRECTOR DEL PROYECTO

Nombre: Jorge Hernández Torres Nombre: Oriana Danuta Serna

E-mail: hernanj@uis.edu.co E-mail: oriana.serna@gmail.com
Máximo título académico: Ph.D. en Máximo título académico: Bióloga
ciencias

1. RESUMEN EJECUTIVO DEL PROYECTO (Máximo Una Página)

En los últimos años, los procesos catalizados por enzimas en la industria se han
vuelto más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los
catalizadores convencionales no biológicos (Plaz et al., 2002). Las lipasas
microbianas están recibiendo mucha atención debido a su potencial aplicación
biotecnológica. Además, estas enzimas juegan un papel importante en los procesos
de transesterificación permitiendo la producción de una variedad de productos como
substitutos de grasa, diseño de grasas y producción de biodiesel a partir de aceites
vegetales (Nakajima et al., 2000; Rivera, García., 2007). Debido a estas
propiedades, en esta investigación se utilizará una lipasa putativa proveniente de
un actinomiceto y se propone estudiar las condiciones de cultivo óptimas. Para ello
se llevará a cabo el diseño de un gen sintético basado en la secuencia GenBank
code WP_020417691.1 de Amycolatopsis sp. ATCC 39116, clonado en los sitios de
restricción Nco I y Bam HI del vector de expresión pET-22b (+). Para la síntesis del
gen se contratará la empresa Epoch Life Science Inc. Se transformarán células
competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) con el plásmido
recombinante y las cepas serán criopreservadas según Sambrook & Russell (2001).
Para la sobreexpresión se utilizará como inductor 0,1M IPTG y se recuperarán
fracciones celulares del medio de cultivo, períplasma y citoplasma (soluble e
insoluble) en tiempos de 0, 1 y 3 horas después de la inducción. A las fracciones
recuperadas se le realizarán pruebas de actividad hidrolítica frente al p-nitrofenil-
butirato (p-NPB), su cuantificación se llevara a cabo por el método de Bradford, se
realizará SDS-Page para corroborar donde y en qué tiempo se produce la lipasa y
se determinarán cuáles son las características de la lipasa con respecto a la
temperatura óptima y el pH para la actividad y la estabilidad de la enzima. Además,
se realizarán pruebas de transesterificación con el fin de determinar la eficacia de
la proteína para su uso en la producción biodiesel.

2. DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA (Contextualice y exponga cuál es el problema o

pregunta de investigación a responder con la ejecución del trabajo, basado en la revisión
de la literatura efectuada). (Máximo 2 páginas).

A finales del siglo XX aumenta el interés por la producción de combustibles

alternativos y renovables que sirvan como fuente de energía para la sustitución de
los combustibles hidrocarbonados. Todo esto debido a que la utilización de
combustibles fósiles en el sector de transporte y en la industria incrementa el
impacto nocivo de la contaminación por dióxido y monóxido de carbono, óxidos de
nitrógeno, hidrocarburos no quemados y compuestos organicos volátiles, (Wilches-
Flórez, Á., 2011). Adicionalmente, la alternativa de los biocombustibles es un modo
de contrarrestar el aumento en los precios del petróleo, la disminución en las
reservas, los problemas de encarecimiento y contaminación que genera el diésel
fósil y su posibilidad real del agotamiento en el futuro, además sirve como vía para
reducir el calentamiento global debido a los gases con efecto invernadero que
emiten (Faife-Pérez et.al., 2012; Castellar et.al., 2014).

Los biocombustibles son fuentes de energías renovables de gran interés, puesto

que no producen gases de efecto invernadero adicionales, ya que el dióxido de
carbono que las plantas toman cuando crecen regresa a la atmósfera al hacer
combustión para un balance cero (Wilches-Flórez, Á., 2011).
El biodiesel, es un combustible líquido producido a partir de materias renovables,
como los aceites vegetales o grasas animales, que actualmente sustituye parcial o
totalmente al diésel de petróleo en los motores diésel (Medina et al., 2012). La
producción de este biocombustible se lleva a cabo principalmente por
transesterificación de triacilglicéridos (aceites vegetales y grasas animales) y un
alcohol liviano en presencia de catalizadores (Musa, I., 2016). En este caso se
utilizan enzimas, las cuales son catalizadores de reacciones de sistemas biológicos
y cuyas dos principales características son la extrema especificidad y la increíble
velocidad de reacción, por lo cual son más utilizadas cada día en la industria. En el
proceso de transesterificación en solventes orgánicos se utilizan como catalizadores
las lipasas. (Rivera, et al., 2007; Castellar et al., 2014; Nakajima et al., 2000). La
obtención de estas enzimas de fuentes microbianas presentan mayor estabilidad
que las enzimas extraídas de plantas y animales y su producción es más
conveniente y segura (Wiseman, 1995). Además la utilización de microrganismos y
sustratos que permitan obtener a escala industrial estas enzimas utilizando
condiciones de operación facilitan la reducción de los costos de producción y se
convierten en un proceso biotecnológico económicamente viable (Aceves-Diez et
al., 2012). La producción de estas enzimas para la realización de este proceso hasta
hace poco está tomando fuerza en el país, debido a que para llevarlo a cabo se
debían importar las enzimas de otros países, lo que se convertía en una barrera
para su implementación industrial (Ranganathan et.al., 2008).
Por este motivo, en este trabajo se pretende hacer la caracterización de las
condiciones optimas para la producción de una lipasa putativa de Amycolatopsis sp.
y posteriormente, hacer pruebas de transesterificación para determinar si esta
enzima es una buena herramienta para la producción de biodiesel y reducir
considerablemente el costo de la producción de este biocombustible, ya que la
utilización de bacterias para este proceso tiene un costo generalmente menor y
puede realizarse en un periodo relativamente breve.

3. ANTECEDENTES O MARCO TEÓRICO (Máximo 4 páginas, debe incluirse la

literatura citada más reciente en el tema a tratar).

4. JUSTIFICACION DEL PROYECTO QUE AMERITE SU REALIZACION

(Máximo una página)

Actualmente, las lipasas son enzimas con potencial aplicación en la industria del
aceite, la producción de farmacéuticos, agroquímicos y componentes aromáticos,
además han recibido una gran atención en la biotecnología, por la cantidad de
ventajas que presentan (Benjamín, 1998; Jaeger, 2002). Puesto que la producción
de las lipasas se ve frecuentemente afectada por los altos costos de producción se
ha incrementado la búsqueda y utilización de microrganismos y sustratos que
permitan obtener a escala industrial estas enzimas utilizando condiciones de
operación que faciliten la reducción de los costos de producción y se convierta en
un proceso biotecnológico económicamente viable (Aceves-Diez et al., 2012).
Microrganismos con alto potencial para la producción de lipasas se pueden
encontrar en diferentes hábitats. Debido a esto, se han aislado bacterias, hongos
filamentosos, levaduras y actinomicetos que sobresalen por su capacidad para
producir lipasas extracelulares y de esta manera facilitar, la recuperación de estas
enzimas a partir del medio de cultivo (Ertugrul, Donmez, Takac. 2007). Por esta
razón, este proyecto se centra en el estudio de la lipasa de Amycolatopsis sp. para
determinar las propiedades de transesterificación de esta enzima utilizando como
sustrato el aceite de palma y en caso tal sea una nueva herramienta para la
producción de este biocombustible.

5. OBJETIVOS DEL PROYECTO (Máximo ½ página)

5.1 Objetivo general:

Caracterizar la actividad aciltransferasa de LipA de Amycolatopsis sp ATCC 39116

usando aceite de palma africana como sustrato.

5.2 Objetivos específicos:

 Evaluar la expresión del gen LipA de Amycolatopsis sp. ATCC 39116 en E.

coli BL21 (DE3).

 Determinar la actividad hidrolasa de extractos de LipA en ensayos con p-

Nitrofenil butirato (p-NPB) como sustrato.

 Determinar variaciones en la actividad aciltransferasa de LipA recombinante

en función del pH, la temperatura y la fuerza iónica.

 Estimar la actividad aciltransesterasa de LipA mediante monitoreo de FAEE

por RMN-1H.

5.3 Hipótesis y predicciones (cuando aplique)

6. MATERIALES Y MÉTODOS: (Máximo tres páginas)

6.1 Diseño y construcción del vector de expresión recombinante

En este trabajo se evaluará la expresión del gen salvaje LipA de Amycolatopsis sp.
ATCC 39116 (Amycol_LipA), una lipasa putativa. El diseño del plásmido
recombinante se basará en la secuencia WP_020417691.1 (Número de acceso –
GenBank). El gen será clonado en los sitios de restricción NcoI y BamHI del vector
de expresión pET-22b (+) (REFERENCIA) para de esa manera obtener el plásmido
recombinante pET_Amycol_LipA_NoSP.

La síntesis del gen será contratada con la empresa Epoch Life Science Inc. y la
construcción del vector se confirmará mediante secuenciación con la Macrogen Inc.
(Corea del sur).
6.2 Transformación de E. coli BL21 (DE3)
Células competentes de E. coli BL21 (DE3), serán transformadas con los plásmidos
pET-22b y pET_Amycol_LipA_NoSP por medio de choque térmico en presencia de
0,1 M CaCl2 (Sambrook, 1987).
Las cepas transformadas serán criopreservadas según protocolo propuesto por
Sambrook y Russell (2001).

6.3 Sobreexpresión de LipA de Amycolatopsis sp inducida con IPTG

La sobreexpresión se llevará a cabo en 100 mL de medio LB, suplementado con

200 μg/mL de ampicilina e incubado a 180 rpm y 37 °C. El crecimiento bacteriano
será monitoreado a 600nm hasta alcanzar una DO600 nm entre 0.8-1.2. La expresión
será inducida con 0.1 mM IPTG.

Luego de 0, 1 y 3 horas de inducción, se recuperarán 10 mL de las siguientes

fracciones celulares: medio de cultivo (FM), períplasma (FP) y citoplasma (soluble
(FS) e insoluble (FI)).

6.4 Determinación de la concentración de proteína por el ensayo de

Bradford

La cuantificación de las proteínas se llevará a cabo mediante el método

colorimétrico de Bradford con un máximo de absorción de 595nm. Para la curva
patrón se utilizará albúmina de suero bovino (BSA) con concentraciones de 0.0-1.4
mg/mL y las mediciones se realizarán 2 minutos después de la adición de colorante.

6.5 Visualización mediante electroforesis SDS-PAGE

La visualización de los extractos de proteína, se llevará a cabo según el Sistema

Laemmli mediante electroforesis en gel 15% poliacrilamida (SDS-PAGE) con una
migración de aproximadamente 3h a 120V. Seguido de la tinción con 0,1% nitrato
de plata (AgNO3) según el protocolo propuesto por Chevallet et al. (2006).

6.6 Determinación de la actividad hidrolítica de la lipasa frente a pnitrofenil

butirato (p-NPB).
La actividad hidrolítica se cuantificará mediante espectrofotometría, midiendo el
incremento de absorbancia del p-nitrofenol (pKa =7,15 a 25 °C, ε400 = 14775 M-1 cm-
1 a pH 6,0) a 410 nm durante 3 min. La reacción se llevara a cabo por la hidrolisis
de 0.4 nM p-nitrofenil butirato (p-NPB) en buffer Tris-HCl a diferentes pH y
temperaturas, para determinar un óptimo en la actividad de la proteína.

La unidad internacional de actividad (U) es definida como la cantidad de enzima

necesaria para hidrolizar 1 μmol de p-NPB por min bajo las condiciones
establecidas. La actividad específica para la hidrolisis del p-NPB será calculada con
esta fórmula:

Donde:
m = pendiente (min-1)
ε400 = coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol (14775 M-1 cm-1 a pH
(desconocido))
Vt = Volumen total de la reaccion (μL)
Vm = Volumen de la solucion enzimática (μL)
FD = Factor de dilución enzimático
Cprot = concentración de proteína en la solucion enzimática (mg/mL)
U = cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un μmol de p-NPB a
(Temperatura desconocida) °C en 1 min.

6.7 Monitoreo por Resonancia Magnetica Nuclear de protones (RMN-1H).

Transesterificación catalizada con extractos crudos de la lipasa
Las reacciones de transesterificación se llevaran a cabo utilizando 100 mg de aceite
de palma africana como sustrato. Las reacciones serán incubadas con agitación
constante y temperatura ambiente, durante 6 h. Se adicionara etanol utilizando una
adaptación de la metodología propuesta por Shimada et al. (2002). Cumplido el
tiempo de reaccion, las muestras se centrifugaran a 10 000 g y la fase oleosa será
recuperada e incubada a 80 °C durante 1 h.

El perfil de ácidos grasos y el monitoreo de FAEE de la fase oleosa recuperadas,

se determinara por RMN-1H. La caracterización de ácidos grasos se realizara de
acuerdo con el protocolo propuesto por Knothe y Kenar (2004) y la cuantificación de
etilesteres se calculara siguiendo la metodología de Nieva-Echevarria et al. (2014).
Todos los análisis se realizaran por duplicado.
Para el análisis de las lecturas se utilizara la metodología de superficie de respuesta,
con un diseño factorial de tres niveles (33). Este modelo se llevara a cabo con un
punto central y una réplica, teniendo un total de 20 ejecuciones. Los datos serán
analizados utilizando el programa STATGRAPHICS Centurión XVI V.16.1.18.

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Wiseman, A. (1995) Introduction to principles. In: Handbook of Enzyme

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8. RESULTADOS ESPERADOS. (Máxima ½ página)

9. PRESUPUESTO TOTAL Y FUENTES DE FINANCIACIÓN. (Máximo ½ página).

10. DURACION Y CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN DEL PROYECTO: (esboce en

una tabla el cronograma del desarrollo del Plan de Trabajo de grado, Máximo ½
página)

11. INSTITUCIONES. Cuando existan otras instituciones incluidas en el proyecto,

mencione el nombre y teléfono de las instituciones involucradas

12. REQUERIMIENTOS ADICIONALES (Permisos de colecta, permiso de

acceso a material genético, permiso de Comité de Ética, por ejemplo) Debe
anexarse una copia de la solicitud o los permisos ya concedidos.

Observaciones: Los firmantes aceptan tener pleno conocimiento de las normas

que reglamentan la presentación y evaluación de Trabajos de grado y se
comprometen a su cumplimiento.

Nombre y firma de los Responsables:

__________________________ ___________________________
Estudiante
Director

________________________
Codirector

EVALUADORES SUGERIDOS:
1. Nombre
Institución
Máximo título académico
E-mail
Teléfono (celular)

2. Nombre
 Institución
Máximo título acadêmico
E-mail
Teléfono (celular):

PARA USO EXCLUSIVO DEL COMITÉ DE TRABAJOS DE GRADO. En su sesión

del día_____________________________________ decide:
Aprobar No aprobar Enviar a evaluación externa
Aprobarla, sí realiza las modificaciones
Observaciones:
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

____________________________________
Presidente del Comité de Trabajos de Grado

_____________________________________
Comité de Trabajos de Grado

_____________________________________
Comité de Trabajos de Grado
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En señal de aceptación suscribo el presente documento, en Bucaramanga a los _____
(____) días del mes de ___________ de 2006.

Firma:_________________________________

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