Técnicas de genética molecular

Técnicas de genética molecular

- Detección de secuencias de ADN y ARN

- Localización de un gen
- Estructura y función de una región genómica
- Expresión génica

Se requieren métodos para trabajar con una pequeña

parte del ADN o del ARN
 Electroforesis

Separación de moléculas por tamaño y carga eléctrica

Permite visualizar fragmentos de ADN:

electroforesis en gel de agarosa

electroforesis en gel de poliacrilamida
electroforesis capilar
 Electroforesis en gel de agarosa

Preparación:
 Electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis horizontal:
 Marcadores de tamaño molecular

Escaleras de fragmentos de tamaño conocido

100 pb p-GEM PhiX-HaeIII
 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Preparación:
 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Electroforesis vertical:
 Electroforesis capilar

Secuenciador automático

ABI 3130
 Visualización de los fragmentos de ADN

Agentes intercalantes emisores de fluorescencia en

transiluminador de luz UV
 Agentes intercalantes

Bromuro de etidio (Sharp en 1973):

- molécula plana capaz de unirse al ADN

- agente carcinogénico y mutagénico.
- se une al ADN de dos formas:
- unión fuerte intercalándose entre los pares
de bases,
- unión débil, “no intercalante”, luego de que
los sitios de intercalación están saturados.
 Agentes intercalantes

Intercalación de la molécula de
BrEt- entre dos bases contiguas en
la molécula de ADN.
Luego de la unión, la fluorescencia
del colorante a la luz UV aumenta
casi 20 veces.
Máximo de emisión del BrEt- a
595 nm.
 Agentes intercalantes

Riesgo de exposición al BrEt: cancerígeno

Utilización de colorantes inocuos:
Sybr Green, Sybr Gold, Sybr Safe, GelRed, GelGreen.
 Visualización de los fragmentos de ADN

Marcación radioactiva del ADN con 32P y

detección por autorradiografías

1 2 3 E 4 5 6 7 8 9 10
 Visualización de los fragmentos de ADN

Nitrato de plata, con transiluminador de luz visible

 Visualización de los fragmentos de ADN

Marcación con fluoróforos + lector láser

Obtención de moléculas de ADN genómico
 Obtención de moléculas de ADN genómico

Etapas generales de una extracción de ADN:

-ruptura de membranas
-digestión proteica
-purificación
-precipitación
-resuspensión del ADN
Obtención de moléculas de ADN genómico
 Fuentes de ADN

• Sangre:
• leucocitos de mamíferos (camélidos: eritrocitos
nucleados)
• Eritrocitos y leucocitos de otros grupos
 Fuentes de ADN

• Otros fluidos corporales:

• Líquido amniótico
• Semen
• Orina
 Fuentes de ADN

• Pelos:
• Con folículo: ADN nuclear y mitocondrial
• Sin folículo: ADN mitocondrial
 Fuentes de ADN

• Epitelio bucal:
• hisopado de mucosa bucal
• enjuague bucal
• hisopado de objetos
 Fuentes de ADN

• Hueso:
• exhumaciones
• restos arqueológicos
 Fuentes de ADN

• Materia fecal:
 Fuentes de ADN

• Material vegetal:
• Hojas
• Semillas
• Flores, etc.
 Fuentes de ADN

• Microorganismos:
• Cultivos de laboratorio
• Material arqueológico (sarro dental antiguo)
 Obtención de ARN

Minimizar la actividad de ARNasas (¡muy estables!)

- uso de material descartable libre de ARNasas
- tratamiento del material de vidrio y las soluciones con
DEPC 0,1%
- uso de inhibidores de ARNasas (tiocianato de guanidina
y agentes reductores)
- trabajar rápido, en baja temperatura, con tapas
cerradas
- utilización permanente de guantes