UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

Facultad de Ciencias - Escuela de Química

Laboratorio de Bioquímica
Semestre II-2019

Práctica No. [6,7,8]. Determinación de la actividad enzimática de

la peroxidasa extraída de hojas de palma africana y su
comportamiento por efecto de la temperatura, concentración de
sustrato y pH.
Nicolás Muñoz Medina – 2152506
Carlos Mario Martinez – 2151872

Fecha de la elaboración de la práctica: 2019-01-27

Fecha de presentación del informe: 2019-02-27

 Resumen.
Un catalizador es una sustancia que aumenta la rapidez o velocidad de una reacción química, sin verse
alterada ella misma en el proceso global. La mayor parte de los catalizadores biológicos, aunque no
todos ellos, son proteínas que denominamos enzimas. En este estudio se realizó la extracción de la
enzima peroxidasa y se cuantifico su actividad a diferentes concentraciones de sustrato (H2O2), de
igual forma se determinó el efecto de la temperatura y del pH en la actividad de la enzima. FALTA
TODO LO OTROO QU ELOKURA

 Introducción.
Las enzimas son catalizadores específicos en la regulación de las células y los organismos. La catálisis
es esencial para hacer que muchas reacciones bioquímicas de importancia crucial se produzcan en
condiciones fisiológicas a velocidades útiles. La célula se aprovecha de la catálisis específica para
canalizar las sustancias hacia rutas que sean útiles en vez de hacia reacciones colaterales
despilfarradoras. Por definición, un catalizador aumenta la velocidad de una reacción química, pero
no se altera de forma permanente por la reacción. Los catalizadores realizan esta hazaña debido a que
disminuyen la energía de activación que se requiere para una reacción química. En otras palabras, los
catalizadores ofrecen una vía de reacción alterna que requiere menos energía. La sustancia sobre la
que actúa una enzima se denomina sustrato de esa enzima. Una enzima une una molécula de sustrato
(o, en algunos casos, varios sustratos) en una región de la enzima denominada lugar activo ; el lugar
activo es con frecuencia un bolsillo o una hendidura rodeada por cadenas laterales de aminoácidos
que facilitan la unión del sustrato y por otras cadenas laterales que intervienen en la catálisis. La
compleja estructura terciaria de las enzimas hace posible que en este bolsillo se ajuste el sustrato de
manera muy estrecha, lo cual explica la extraordinaria especificidad de la catálisis enzimática, la
unión del sustrato al sitio activo de la enzima provoca un cambio en la conformación tanto de la
enzima como del sustrato. Pero las enzimas hacen algo más que distorsionar o colocar simplemente
sus sustratos. A menudo, encontramos cadenas laterales de aminoácidos específicos colocados en los
lugares adecuados para facilitar el propio proceso catalítico. En muchos casos estas cadenas laterales
son grupos ácidos o básicos que pueden impulsar la adición o eliminación de protones. Cuando el
proceso catalítico se ha completado, la enzima debe ser capaz de liberar el producto o productos y
volver a su estado original, para estar preparada para un nuevo ciclo de catálisis. Cualquier factor
ambiental que distorsiona la estructura proteínica puede alterar la actividad enzimática. Las enzimas
son especialmente sensibles a variaciones de la temperatura y del pH. Las velocidades de las
reacciones catalizadas por enzimas también aumentan con la temperatura. Sin embargo, las enzimas
son proteínas que se desnaturalizan a temperaturas elevadas. cuanto mayor es la temperatura, mayor
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es la velocidad de reacción; es decir, es mayor el número de colisiones, provocando la ruptura de

puentes de hidrógeno y la destrucción de interacciones apolares. La temperatura óptima de una
enzima es aquella a la que actúa con su máxima eficiencia.
La concentración de iones hidrógeno, expresada como un valor de pH, afecta a las enzimas de diversas
formas. En primer lugar, la actividad catalítica está relacionada con el estado iónico del sitio activo.
Los cambios en la concentración de iones hidrógeno pueden afectar a la ionización de los grupos del
sitio activo, los cambios en los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima,
los cambios drásticos del pH a menudo provocan desnaturalización. Aunque unas pocas enzimas
toleran cambios importantes de pH, la mayoría son activas sólo dentro de un intervalo estrecho de
pH. Por esta razón, los seres vivos emplean amortiguadores para regular rigurosamente el pH. El
valor de pH en el que la actividad de una enzima es máxima se denomina pH óptimo. La pérdida de
la estructura cuaternaria es frecuentemente reversible, pudiéndose recobrar la actividad catalítica, por
el contrario, la pérdida de la estructura terciaria es frecuentemente irreversible y lleva asociada una
pérdida total o parcial de la actividad; la alteración de la estructura secundaria es irreversible,
provocando un efecto de coagulación y la inactivación total de la enzima.
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos orgánicos
e inorgánicos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno (el cual es el sustrato). Estas
enzimas entran en la categoría de oxidoreductoras y se clasifican con los números E.C 1.11. Las
peroxidasas vegetales frecuentemente conocidas como peroxidasas clase III, son enzimas
monoméricas que intervienen en una amplia gama de procesos fisiológicos, tales como: la
lignificación, la suberización, el metabolismo de las auxinas, el ensamblado de las proteínas de la
pared celular, la tolerancia a sales, el estrés hídrico y la defensa contra el ataque de patógenos.
Aparecen en los tejidos vegetales después de la infección por patógenos, y su expresión en plantas
superiores puede ser inducida por bacterias, hongos y virus. De ahí que la identificación de
marcadores, tanto bioquímicos como moleculares, puede resultar de gran valor en la identificación
varietal y en la caracterización de genotipos en un programa de mejoramiento genético, ya que facilita
la selección de resistencia a determinados patógenos.

 Resultados
Las gráficas y tablas de resultados fueron adjuntados en ANEXOS.
 Discusión
Con la finalidad de cuantificar la concentración de la enzima peroxidasa se utilizó el método
colorimétrico de Bradford, obteniendo concentraciones de 0,148 y 0,140 mg/mL para las enzimas 1
y 2 respectivamente. De las cuales se prepararon diferentes diluciones y se midió la actividad
enzimática con una solución sustrato de H2O2 cuyos valores están reportados en la Tabla 1 y Tabla
3. Las Tablas 2 y 4 presentan los valores de actividad enzimática con el cambio de temperatura en
un intervalo de tiempo en donde se evidencia la falta de datos que no fueron reportados por los grupos
asignados. Las Gráficas 3 y 4 presenta la concentración de la enzima vs actividad enzimática, en
ambas se notó que la actividad enzimática disminuyó en las diluciones que se calentaron, puesto que
por efecto térmico la proteína cambia su conformación estructural dificultando el acceso del sustrato
al sitio activo, por ende, con forme más tiempo se caliente la solución de la enzima menos actividad
catalítica presenta, también se aprecia que la actividad enzimática es proporcional a la concentración
de la enzima aunque en la Gráfica 3 (E1) después de calentar 5 minutos no presentó este
comportamiento por culpa del mal desarrollo de la medición.

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A partir de la dilución 1/25 de la solución de la enzima se evaluó la actividad enzimática vs

concentración de sustrato. la Tabla 5 muestra los datos obtenidos experimentalmente y la Gráfica 5
presenta la curva obtenida que va de acuerdo con lo esperado, ya que muestra un comportamiento
logarítmico característico de la cinética Michaelis Menten, pero aun así no es viable para calcular la
velocidad máxima; para ello se recurrió a la representación de Lineweaver-Burk (Gráfica 6), la cual
proporciona directamente la velocidad máxima de la enzima cuyo valor es 0,158 µmol/minuto y
utilizando el valor de la pendiente se obtuvo un 𝐾𝑀 de 28,999 para la constante de Michaelis-Menten,
dado que es relativamente grande, significa que la enzima posee poca afinidad por el sustrato, esto es
debido a la poca concentración de la enzima producto de la dilución, ya que disminuye la probabilidad
de la interacción enzima-sustrato. El procedimiento puede obtener un mejor resultado si se es
utilizado una mejor relación entre la concentración de la enzima y el sustrato, para que la enzima
presente un comportamiento ajustado a la cinética enzimática de Michaelis Menten, se requiere que
la concentración del sustrato sea mayor que la de la enzima.
La Tabla 6 presenta los valores obtenidos de la actividad enzimática de la peroxidasa con variaciones
en el pH. Según la literatura el máximo de actividad de la peroxidasa se presenta en el pH optimo, en
donde el sitio activo de la enzima presenta las condiciones perfectas para que se forme el complejo
enzima-sustrato. El pH óptimo de la peroxidasa presente en la literatura es de 6.5, comparando con
la Gráfica 6 obtenida experimentalmente se logra observar que la máxima actividad se logra a un pH
de 6, pero pierde actividad de manera rápida al aumentar el pH a 7, esto pudo deberse a la mala toma
de datos de la absorbancia en las mediciones con el espectrofotómetro y/o al mal uso de la
micropipeta al realizar la dilución, por otro lado se logra apreciar que a pH básicos, la actividad de la
peroxidasa es nula, como ya se había mencionado anteriormente las enzimas son específicas para su
sustrato, por ende, los cambios en la concentración de iones hidrógeno pueden afectar a la ionización
de los grupos del sitio activo, lo que ocasiona un cambio en la conformación de éste dada la repulsión
que generan los grupos ionizados, generando que el sustrato no se logre acoplar de manera efectiva
al sitio activo de la enzima. De manera similar sucede a pH ácido, en donde la actividad de la enzima
no es nula. Esto puede deberse a las pequeñas interacciones que presenta el complejo enzima-sustrato
a este pH.

 Conclusiones
FALTA
 Bibliografía
1. Mathews, Christopher; Van Holde, Kensal; Ahern, Kevin. Bioquímica. PEARSON
EDUCACIÓN S.A, 3ra, 2002, pag:403-459.
2. MacKee, Trudy; MacKee, James R. Bioquímica, las bases moleculares de la vida.
McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. 5ta, 2004, pag:166-207.
3. Berg, Jeremy; Tymoczko John; Stryer Lubert. Bioquímica. EDITORIAL REVERTÉ S.A.
6ta, 2007, pag:150-198.
4. Castro Rivera, Jhon Alexander;Baquero Duarte, Lucia Estrella;Narváez Cuenca, Carlos
Eduardo.CATALASE, PEROXIDASE AND POLYPHENOLOXIDASE FROM PITAHAYA
AMARILLA FRUITS (Acanthocereus pitajaya), Rev.Colomb.Quim. vol.35 no.1 Bogotá
June 2006. (ESTA ES LA DE PH OPTIMO Y TODA ESA MONDA)

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5. Hidalgo Cuadrado,Nazaret;CARACTERIZACIÓN QUÍMICO-FÍSICA DE LA

PEROXIDASA DE PALMA; Universidad de salamanca, facultad de ciencias químicas,
departamento química-fisica. 2011. (COLOQUELA EN LA DISCUSIÓN ALTERNADA
CON LA DE ARRIBA) (4-5 DISCUSIÓN 1-2-3 INTRODUCCIPN)

 Autoevaluación crítica de trabajo grupal

Nombre Nota Observaciones
Carlos Mario Martínez -11100 -

Nicolás Muñoz Medina 5,00 -

 ANEXOS

Primera parte.

2.5

1.5
A.E

y = 16.613x + 1.0267
1 R² = 0.686

0.5

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
[E] mM
Gráfica 1. Actividad enzimatica vs concentración de sustrato para la enzima 1.

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1
0.9 y = 11.75x + 0.0738
R² = 0.946
0.8
0.7
0.6
0.5
A.E

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
[E] mM

Gráfica 2. Actividad enzimática vs concentración de sustrato para la enzima 2.

2.5

1.5
A.E

0.5

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08
[E] mM
0 minutos. 5 minutos
Gráfica 3. Efecto en la temperatura para la enzima 1.

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0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
A.E

0.3
0.2
0.1
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08

[E] mM
0 minutos 10 minutos

Gráfica 4. Efecto en la temperatura para la enzima 2.

Dilución [E] A.E

1a2 0,074 2,1219
1a5 0,0296 1,8035
1 a 10 0,0148 1,5404
1 a 25 0,00592 0,70615
Tabla 1. Datos de concentración y actividad enzimática para la enzima 1.

0 minutos 5 minutos
Dilución A.E [E] A.E [E]
1a2 2,1219 0,074 - 0,074
1a5 1,8035 0,0296 0,0519 0,0296
1 a 10 - 0,0148 - 0,0148
1 a 25 0,70615 0,00592 0,599 0,00592
Tabla 2. Datos de concentración y actividad enzimática tomados en intervalos de tiempo a diferente
temperatura para la enzima 1. (los datos que se encuentran en rojo no sé tomaron)

Dilución [E] A.E

1a2 0,07 0,8515
1a5 0,028 0,5296
1 a 25 0,0056 0,0727
1 a 50 0,0028 0,0915
Tabla 3. Datos de concentración y actividad enzimática para la enzima 2.
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0 minutos 10 minutos
Dilución A.E [E] A.E [E]
1a2 0,8515 0,07 0,4087 0,07
1a5 - - - -
1 a 10 - - - -
1 a 25 0,0727 0,0056 0,1038 0,0056
1 a 50 0,0915 0,0028 0 0,0028
Tabla 4.Datos de concentración y actividad enzimática tomados en intervalos de tiempo a diferente
temperatura para la enzima 2. (los datos que se encuentran en rojo no sé tomaron)

Segunda parte.

Cálculos segunda parte.

1 molH2 O2
1mLsln 30µLH2 O2 ×
34.0147gH2 O2
(30µLH2 O2 × )×( ) = (40.06 mL sln)(x)
1000µL 1L
100mL × 1000mL

1000mM
X = 6.6x10−3 M × = 6.605mM
1M
Diluciones:
1. (6.605mM)(2.5mL) = (X)(3mL)
X = 5.504mM

2. (6.605mM)(2.0mL) = (X)(3mL)
X = 4.403mM

3. (6.605mM)(1.5mL) = (X)(3mL)
X = 3.302mM

4. (6.605mM)(1.0mL) = (X)(3mL)
X = 2.202mM

5. (6.605mM)(0.5mL) = (X)(3mL)
X = 1.101mM

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0.03

0.025

0.02
A.E

0.015

0.01

0.005

0
0 1 2 3 4 5 6 7
[E] mM

Gráfica 5. Actividad enzimática vs variaciones en la concentración de sustrato.

A.E [E]
0,02792 6,605
0,02423 5,504
0,02192 4,403
0,01615 3,302
0,01153 2,202
0,00576 1,101
Tabla 5. Datos de la actividad enzimática a diferentes concentraciones de sustrato.

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200
180
160 y = 182,88x + 6,3282
140 R² = 0,9985

120
1/A.E

100
80
60
40
20
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1/[E] mM

Gráfica 6. Representación de Lineweaver-Burk de la actividad enzima de la dilución 1/25 de la

enzima.

 Velocidad máxima:
1
= 6,3282
Vmax

Vmax = 0,15802 mmol⁄minuto

 Constante de Michaelis Menten:

KM
m=
Vmax

KM
182,88 =
0,15802

K M = 28,899

Tercera parte.

Cálculos de la preparación de los buffer.

 𝑝𝐻 = 4
x
4 = 4,757 + log [ ]
0,1 − x
x = 0,01489
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0,01489 mol 82,0395 g

x= × × 25 = 0,0305 acetato de sodio
1000 mL 1 mol
 Ácido acético

0,1 − x = 0,1 − 0,01489

0,08511 mol Ácido acético 60,052 g Ácido acético 100 mL sln

= × × × 25mL
1000 mL 1 mol Ácido acético 30 g Ácido acético

= 0,423 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 Á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑙 50%

pH medido = 2,10
 𝑝𝐻 = 5
x
5 = 4,7 + log [ ]
0,1 − x
x = 0,0636 mol
0,0636 mol 82,0343 g acetato
x= × × 25 mL
1000 mL 1 mol
= 0,1304 g de acetato de sodio

 Ácido acético
0,1 − x = 0,1 − 0,0636
0,0364 mol Ácido acético 60,052 g Ácido acético 100 mL sln
= × × × 25mL
1000 mL 1 mol Ácido acético 30 g Ácido acético
= 0,18215 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛 Á𝑐𝑖𝑑𝑜
 𝑝𝐻 = 10
x
10 = 10,33 + log [ ]
0,1 − x
x = 0,0318 mol
0,0318 mol 84,007 g
x= × × 25 mL
1000 mL 1 mol
= 0,06678g bicarbonato de sodio
 Carbonato de sodio
0,1 − x = 0,1 − 0,0318
0,0682mol 105,988 g Ácido acético
= × × 25mL
1000 mL 1 mol Ácido acético
= 0,180g carbonato de sodio

 𝑝𝐻 = 11

10
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x
11 = 10,33 + log [ ]
0,1 − x
x = 0,082 mol
0,082 mol 84,007 g
x= × × 25 mL
1000 mL 1 mol
= 0,17283g bicarbonato de sodio
 Carbonato de sodio

0,1 − 𝑥 = 0,1 − 0,082

0,0177mol 105,988 g Ácido acético
= × × 25mL
1000 mL 1 mol Ácido acético
= 0,04689g carbonato de sodio

0.14

0.12

0.1

0.08
A.E

0.06

0.04

0.02

0
0 2 4 6 8 10 12
pH
Gráfica 5. Actividad enzimática vs pH

pH A.E
2,1 0,05884615
3,5 0,10038462
6 0,13153846
7,4 0,05538462
10 0
11 0
Tabla 6. Datos de la actividad enzimática a diferente pH

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