DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS NIVEL INGENIERÍA

CONTENIDO:
1.- EXTRACCIÓN DE PROTEINAS TOTALES
2.- ELABORACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA
3.- EXTRACCIÓN DE ARN (MÉTODO trizol)
4.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO
5.- CORRIMIENTO DE GELES DE AGAROSA
6.- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA 1. EXTRACCIÓN DE PROTEINAS TOTALES

Competencia: Conocer la técnica de extracción de proteínas totales por medio de una técnica establecida para determinar el peso
molecular de cada una de ellas a través de un marcador molecular.

I. INTRODUCCIÓN

La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los métodos más utilizados se
basan esencialmente en la destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o
químicos con la finalidad de maximizar la liberación de las proteínas de interés. El extracto obtenido es sometido a
tratamientos que separan las proteínas en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales como tamaño
o carga mediante técnicas electroforéticas las cuales son tecnologías robustas, versátiles y con alta capacidad de
resolución. La más utilizadas son: electroforesis unidimensional (SDS-PAGE), bidimensional (2-D PAGE) y
electroforesis capilar, entre otras. Uno de los avances más importantes en los inicios de la Biología Molecular, fue el
descubrimiento de las endonucleasas de restricción. Fueron descubiertas en bacterias, y son enzimas que usan para
destruir ADN que ingresa a ellas. La enzima EcoRI fue aislada de la bacteria Escherichia coli; constituida en más del
50 % de su peso seco en proteínas ha sido considerada como modelo de estudio en la identificación y cuantificación
de la misma.
Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Lo hacen en forma específica,
esto significa que cada enzima de restricción corta solamente cuando encuentra una secuencia particular de
nucleótidos, por ejemplo EcoRI reconoce secuencias de seis pares de bases GAATTC/ CTTAAG; estos fragmentos
de ADN originados pueden aplicarse para la clonación celular, análisis de ADN, mapas físicos de restricción, detección
de polimorfismos, entre otros.
II. MATERIAL Y EQUIPO
 Microcentrífuga refrigerada
 Tubos eppendorf de 1.5 ml
 Muestra de trabajo
 Incubadora
 Solución de sulfato de amonio 85% y fosfato de potasio 15%
 Solución de lisis (SDS 10% : NaCl 2M: y β-mercaptoetanol al 2%) proporción 3:2:1
 Solución de carga (loadding buffer) Tris-HCl: glicina : SDS : β-mercaptoetanol : azul de bromofenol
2X
 Termómetro
 Micropipetas de 0.5 a 10 y de 100 a 1000 microlitros
 Hielo y gradilla para tubos eppendorf

III. METODOLOGÍA
1. Obtener muestra de trabajo (células, tejido etc. + solución buffer TE1X homogenizadora FRIO “). Triturar o
macerar y filtrar.

2. Colocar 1 ml de muestra en un tubo eppendorf de 2ml, agregar 1 ml de solución de lisis celular (SDS al 10%
y NaCl al 2M y β-mercaptoetanol al 2%) agitar por inversión a temperatura ambiente durante 5min evitando
hacer espuma. Incubar a 50°c durante 10min.
3. Centrifugar a 3,000 rpm durante 3 min a 7°c
4. Recuperar 1ml de sobrenadante pasarlo a otro tubo eppendorf de 2ml frio y agregar 500 microlitros de
sulfato de amonio al 80% y fosfato de potasio pH 8, incubar en nevera 10min. Posteriormente, agregar 400
microlitros de cloroformo agitar fuertemente por 30 segundos.
5. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min a 7°c Se observa una pastilla blanca (proteínas totales)

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
 6. Tirar sobrenadante y lavar con 0,5 ml solución, resuspender las proteínas en Agua destilada estéril libre de
proteasas.
7. Guarde las proteínas en refrigeración a 4°c para su posterior uso o bien a -20°c para meses o bien a -80°c
para años. Es importante hacer diluciones decimales de preferencia si el contenido proteico es muy turbio.
8. Antes de cargar la mezcla de proteínas se debe de calentar a 40-50°c por 10 min y se procede a mezclar
20 µl de buffer de carga Loadding buffer para proteínas y 20µl o 40µl de muestra en el gel de electroforesis
de poliacrilamida.

NOTA 1: Las proteínas se observaran de color blanco de consistencia acuosa.

NOTA 2: En el caso de utilizar bacterias es necesario preparar una solución de lisis
(SDS 10%: NaOH 0.2N: β-mercaptoetanol 2% en proporción 3:2:1)
NOTA 3: En todo momento se recomienda utilizar los materiales estériles para eliminar impurezas o contaminantes
NOTA 4: Solución homogenizadora: para 10 ml agregar 50 microlitros de Tris-HCl (3 mM) pH 7.4 y 1.6 mililitros de
Sacarosa (320 mM) aforar a 10 ml. O bien se puede utilizar buffer TE1X
Nota 5: Buffer de carga al 5X (10 mL) 1). 3.125 mL Tris-HCl 1 M, pH 6.8 2). 1 g de SDS 3). 2.5 mL de
glicerol 4). 75 µL de azul de bromofenol al 2% disuelto en etanol puro. 5). 1 µL de 2-mercaptoetanol 6). Aforar a
10 mL con agua BD.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A) Discute con tus compañeros los errores presentados durante la práctica y anótalos en el espacio de abajo.
B) Elabora un diagrama de flujo donde muestren los pasos de manera resumida con imágenes.
V. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la función del 2-mercaptoetanol?
2. Menciona una aplicación de la extracción de las proteínas en el área de la salud, agropecuario e
industrial.
3. ¿Qué es una proteína recombinante?
4. ¿Qué es un factor de transferencia?
5. Menciona y explica 5 funciones de las proteínas.
6. Explica que es una isoenzima.
7. Explica que son las enzimas de restricción o endonucleasas, su función y escribe 10 de ellas con el
sitio de reconocimiento.
8. Explica ¿Cómo se prepara un buffer de corrida o Running Buffer para proteínas?
9. Explica la técnica de Western blot, anexa imágenes.

VI. REFERENCIAS
1. Griffiths, K.G, K. (2002). Detection Methods. En: Review of technologies for detecting genetically
modified materials in commodities and food. Australian Govemment Analytical Laboratories; Australia.
Pp. 122.
2. Gachet, E., Martín G. G., Vigneau F., Meyer G. 1999. Detection of genetically modified organisms (GMOs)
by PCR: a brief of methodologies available. Trends in Food Science & Technology.9: 380-388.

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA 2. Elaboración de geles de poliacrilamida y tinción con azul de Comassie R-250

COMPETENCIA: El alumno será capaz de realizar la extracción de proteínas y corrimiento de las mismas
a través de geles de poliacrilamida a partir de diversas fuentes orgánicas para su posterior análisis e
interpretación

I- INTRODUCCIÓN
El método de electroforesis de poliacrilamida SDS-PAGE para la separación de la proteína es de gran interés, ya que
el SDS-PAGE permite el cálculo de parámetros moleculares, pues los complejos SDS-proteína se separan
estrictamente según su tamaño molecular porque el SDS interacciona con las proteínas formando complejos con
características comunes independientemente de las de cada proteína. Por otra parte, el gel de poliacrilamida actúa
como un soporte restrictivo, por lo que, además de evitar la convección y minimizar la difusión, participó directamente
en el proceso de separación. Se prepara de modo que sus poros sean de un tamaño comparable al de la proteína y
de esta forma producir un efecto de tamizado molecular.
Las proteínas son biomoléculas funcionales expresadas por distintos genes presentes en el organismo, muchas de
ellas pueden sufrir alteraciones estructurales y por ende funcionales, estas alteraciones se pueden detectar a partir
de distintos análisis de biología molecular siendo la electroforesis en geles de poliacrilamida uno de los métodos más
utilizados, sin embargo con el avance de la tecnología actualmente se cuentan con métodos más rápidos y sofisticados
como lo és la electroforesis capilar cuya ventajas se ven reflejadas en la pureza, rapidez y cantidad de muestra.
La electroforesis bidimensional es otra técnica confiable de separación de proteínas ya que permite la discernir no
solo el peso molecular sino el pH con el que se encuentra dicha proteína. Con ello surgen otras técnicas como lo son
Nothern, Souther, Western Blot, entre otras.

II. MATERIAL Y EQUIPO

 Placas de vidrio o de plástico para preparar  Buffer Tris-HCl 1.5 M pH 8.0

el gel
 Etanol absoluto
 Algodón
 Cinta adhesiva o maskin tape
 Sujetador de placas con nivel
 Pipetas de 5ml y 10ml
 Micropipetas de 0.5 a 10 y de 10 a 1000
microlitros
 Vasos de precipitado de 25, 50, 100ml
 Buffer Tris-HCl 1.5 M pH 6,8
 Escalera molecular para proteínas
 Mix de Acrilamida / bis-acrilamida al 20%
 Persulfato de amonio (APS) al 10%
 Lauril Sulfato de Sodio o Dodecil Sulfato de
Sodio (SDS) al 10%
 TetraMetilenEtilenDiamino (TEMED)
 Beta-mercaptoetanol
 Agua bidestilada
 Fuente de poder
 Cámara de electroforesis vertical
 Solución de tinción Azul de Comassie R-250
 Solución para desteñir

III. METODOLOGÍA
1. Puede preparar dos geles para su corrimiento
2. Limpie las placas perfectamente con alcohol y algodón a fin de eliminar las impurezas y grasa, recuerde
utilizar guantes.
3. Una vez limpio y secas las placas únelas con un espacio de un milímetro de espesor, coloque cinta adhesiva
alrededor de las placas para evitar perdida de líquido o bien apóyese con broche.
ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
 4. Coloque las placas en el sujetador y presione.
5. Coloque el gel concentrador, deje polimerizar, posteriormente elabore gel concentrador y coloque los geles
en la cámara de electroforesis.
6. Coloque su muestra de proteínas.
7. Programe la fuente de poder a 50mA a 1 hr. o bien a 120 volts por 30hr.
8. Saque los geles de la placa con sumo cuidado y proceda a teñir en solución de tinción según indique el
docente.
9. Destiña el gel para observar sus resultados.
NOTA: EL DOCENTE ELIGIRÁ LAS CONCENTRACIONES DEL GEL DE POLIACRILAMIDA QUE CONSIDERE
PERTINENTE

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 Elabore el reporte correspondiente cuando esté terminada toda la práctica.
 Coloque un diagrama de flujo de los pasos que realizó con imágenes.
 Determine el Rf para cada proteína
 Determine el peso molecular de cada proteína

V. CUESTIONARIO
1. Explica en qué consiste la electroforesis bidimensional, pulso cortante, convencional y SDS-PAGE
2. Explique en un mapa cognitivo de tu elección la descripción de las técnicas de Southern, Nothern y Western
Blot

VI. REFERENCIAS
Voet Donald, G. Voet Judith y W. Charlotte. Fundamentos de Bioquímica la vida a nivel molecular. 2007. Segunda
edición. Editorial Médica Panamericana S.A. Pratt. pp. 101.

Yábar Varas Carlos. — Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de
electroforesis para proteínas y ADN. 2003

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA 3. EXTRACCIÓN DE ARN (MÉTODO TRIZOL)
COMPETENCIA: El alumno utiliza el método de TRIzol para la extracción, purificación y
corrimiento de ARN.

I. INTRODUCCIÓN
Un reactivo utilizado para el aislamiento de ARN a partir de células o tejidos es sin duda el TRIzol el cual
está compuesto por una solución monofásica entre Fenol e Isotiocianato de Guanidina que durante la
homogenización o lisis de la muestra mantiene la integridad del ARN.

La adición de cloroformo seguida de una centrifugación separa la muestra en dos fases, una de ellas acuosa
y la otra orgánica, el ARN permanece en la fase acuosa y puede ser recuperado por precipitación con
alcohol ISOPROPÍLICO.

II. MATERIAL Y EQUIPO

 TRIzol  Tubos eppendorf de 2ml

 Cloroformo  Juego de Micropipetas
 Alcohol Isopropílico  Puntas azules y amarillas
 Etanol al 75%  Guantes de latex
 Agua libre de RNasas o solución de SDS al
0,5%

III. METODOLOGÍA
1. En un mortero Potter, licuadora o mortero con pistilo homogenice la muestra con 5ml de buffer TE1X y
1ml de TRIzol.
2. Dejar reposar el homogenizado durante 5 min y a (TA) para la separación de las proteínas, pasar 1ml
de sobrenadante a un tubo eppendorf de 2ml
3. Agregue al homogenizado 0,2 ml de cloroformo por cada 1ml de TRIzol empleado.
4. Agite vigorosamente a mano durante 15 segundos o utilice vortex
5. Incube el homogenizado a (TA) durante 3 min
6. Centrifugue la muestra a 10,000 rmp por 10 min a 5 - 7°c
7. Después de centrifugar la muestra se observaran dos fases, una roja que corresponde a la fase
orgánica Trizol-cloroformo y una fase incolora (ACUOSA) el RNA permanece exclusivamente en esta
fase.
8. Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo Eppendorf de 2 ml
9. Precipite el RNA de la fase acuosa con alcohol isopropílico FRIO hasta cubrir el tubo eppendorf NO
MEZCLAR
10. Dejar reposar a (TA) durante 10 min. Centrifugue a 12,000 rpm al 5-7°c durante 10 min
11. Retire el sobrenadante, deje secar y si gusta puede hacer un lavado con etanol al 75% frio y centrifugue
a 7,500 rpm durante 5 min.
12. Resuspenda el RNA en 500 µl de agua libre de RNasas o bien en solución de SDS al 5%

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. DESCRIBE QUE ASPECTO TIENE EL ARN
2. QUÉ PASOS CONSIDERAN SON CRÍTICOS EN LA EXTRACCIÓN DEL ARN Y POR QUÉ.

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
V. CUESTIONARIO
1. MENCIONA 1 APLICACIÓN DE USO DEL RNA EN EL ÁREA DE LA SALUD, AGROPECUARIO,
INDUSTRIAL Y AMBIENTAL.

VI. REFERENCIAS
1. Hernández, J. 2015. Método de Extracción de RNA con TRIzol. Universidad Autónoma Metropolitana,
Iztapalapa, Dpto. de Biología Experimental, México.

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA 4. EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO
COMPETENCIA: El alumno conoce y extrae ADN plasmídico a partir de bacterias previamente
transformadas para posterior corrimiento electroforético e interpretación.

II. INTRODUCCIÓN

Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores
más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula
hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica
y expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés
(denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante.
El método empleado para la obtención del plásmido se denomina de "lisis alcalina": se basa en la
desnaturalización y precipitación selectiva del DNA cromosómico en medios con NaOH y SDS. En estas
condiciones el DNA plasmídico permanece intacto debido principalmente a su pequeño tamaño y su
naturaleza circular y superenrrollada.
El tratamiento con alta concentración de sal (acetato potásico) y SDS produce la precipitación de gran parte
de las proteínas.
El tratamiento con RNasa elimina la contaminación de RNA que puede ser importante.
La purificación del DNA plasmídico se completa entonces por precipitación con etanol. Es posible obtener
DNA plasmídico con diferente grado de superenrrollamiento que se puede visualizar tras la separación por
electroforesis y tinción con Bromuro de Etidio (BrEt).

II. MATERIAL Y EQUIPO

 Tubos eppendorf de 2ml  Cultivo de bacterias en medio LB

 Juego de Micropipetas Solución de RNasa (1 μg/ml)
 Puntas azules y amarillas estériles  Etanol al 70% Frio
 Solución de Acetato de Potasio al 3 Molar  Solución de lisis NaOH/SDS 1:1
 Agua destilada estéril  Etanol absoluto Frio
 Buffer TBE 0,5 M

III. METODOLOGÍA

1. Se toma 1 ml del cultivo de bacterias y se centrifuga en un tubo eppendorf durante 2 min (14000 rpm).
Se elimina el sobrenadante por inversión del tubo o con ayuda de una pipeta, dejando el sedimento lo más
seco posible.
2. Se resuspende el sedimento de bacterias en 250 μl de tampón de resuspensión empleando una pipeta
(aspirar y expulsar el líquido varias veces sobre el sedimento hasta que desaparezca éste). Se incuba 2
min a temperatura ambiente.
3. Se añaden al tubo 250 μl de la solución de desnaturalización NaOH 0.2N / SDS 1% 1:1 o bien puede
utilizar NP40 (IGEPAL) al 10%. Se agita el tubo por inversión suave (observar el aspecto y viscosidad de
la disolución). Posteriormente se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Se añaden a continuación 300 μl de acetato potásico 3 M frío y se mezcla el contenido del tubo (observar
el aspecto del tubo, aparecerá una turbidez blanca al precipitar las proteínas y el DNA cromosómico). Se
incuba 10 min en hielo.
5. Se centrifuga 5 min (10,000 rpm).
6. Con ayuda de una pipeta se transfiere cuidadosamente la fase acuosa sobrenadante a un tubo eppendorf
nuevo. Si la fase acuosa no está suficientemente limpia, y contiene restos del precipitado blanco, volver a
centrifugar los tubos.

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
7. En este sobrenadante se encuentra RNA y el DNA plasmídico. Estos ácidos nucleicos se precipitan con
2 volúmenes de etanol absoluto frío. Mezclar bien por inversión y guardar a -20ºC durante al menos 10 min
(congelador).
8. Pasado este tiempo, se centrifuga durante 10 min a 15000 rpm.
9. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. De contar con suficiente tiempo, el
precipitado se lava de nuevo con 0,5 ml de etanol 70% frío (20 min, centrifugación).
10. Se elimina todo el sobrenadante volcando el tubo con cuidado. El precipitado casi invisible, que
contiene DNA plasmídico y RNA, se debe secar completamente para eliminar los restos de etanol que
pueden interferir con procesos posteriores. El precipitado se disuelve en 25 μl agua estéril.
11. (OPCIONAL) Finalmente se añaden 0,5 μl de una solución de RNasa (1 μg/ml) y se incuba 20 min a
temperatura ambiente. Este tratamiento con RNasa degrada el RNA quedando una preparación purificada
de DNA plasmídico. Una alternativa a este paso es incluir la RNasa en el tampón inicial de resuspensión o
tampón de lisis

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El DNA de un plásmido recombinante presente en una bacteria se aísla por un método rápido y sencillo
(“miniprep”) que consiste en lisis bacteriana, precipitación de proteínas y DNA genómico, y finalmente
precipitación del DNA plasmídico. El objetivo es obtener suficiente cantidad del DNA para su análisis
posterior mediante electroforesis.

V. CUESTIONARIO

1. Menciona tres aplicaciones en biología molecular para el reactivo Nonident-P40 o IGEPAL

2. Menciona tres aplicaciones en biología molecular para el reactivo Tween-20
3. Explica en un mapa o diagrama de flujo la técnica de transformación bacteriana y menciona que
aplicaciones e importancia tiene esta técnica.
4. Describe el porqué de los tratamientos con: NaOH y SDS, acetato potásico, etanol, y RNasa.

VI. REFERENCIAS

1. Old RW, Primrose SB (1989) “Principles of Gene Manipulation”. Blackwell Sci. Pub.
(Oxford, England), pp 11-13. Resumen comprensivo del procedimiento.

2. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) “Molecular Cloning”. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, pp. 1.74-1.84. Excelente recetario con variaciones útiles.

3. Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José Javier Higuera, Vicente Mariscal,
Emilio Fernández Reyes. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus
Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRÁCTICA 5. Electroforesis en Gel de Agarosa al 2%

COMPETENCIA: El alumno realiza un gel de agarosa al 2% para separar las distintas muestras de
material genético extraído para su posterior interpretación.

I. INTRODUCCIÓN

Existe una gran diversidad de métodos químicos y analíticos para la separación de muestras ya sea de
acuerdo a su pH, afinidad electrónica, solubilidad o bien de acuerdo a su peso molecular, sin embargo en
biología molecular uno de los métodos empleados por excelencia es la electroforesis. Una de las más
empleadas ha sido sin duda la electroforesis en gel de agarosa ya que es versátil al poder manejar
diferentes gradientes de concentración y con ello lograr la separación de varias moléculas
independientemente de su tamaño, peso molecular o bien si se trata de ADN total, mitocondrial, de
cloroplasto, AND Plasmídico, RNA entre otros. Para teñir a las moléculas antes mencionadas se puede
utilizar bromuro de etídio (EtBr) o bien SYBR-Green, el primero tiñe a las moléculas de color rojo o naranja
y el segundo de color verde. Finalmente, la electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia
de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia
de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.

II. MATERIAL Y EQUIPO

 AGAROSA  Matraz EM de 125 ml

 Microespátula  Micropipeta de 0,5 a 10 µl
 Mechero buncen o Plancha  Puntas estériles blancas
 Buffer TAE 0,5 X  Cámara de electroforesis horizontal
 Probeta 50 ml  Fuente de poder
 Guantes de latex  Transiluminador
 Cubetas para espectrofotómeto  Espectrofotómetro uv.

III. METODOLOGÍA

1. Pesar 0,6 gramos de AGAROSA y disolver en 30ml de buffer TAE 0,5 X

2. Calentar la mezcla en mechero o plancha hasta tener un hervor
3. Dejar enfriar por 5min y agregue 1,5 µl de Bromuro de Etidio, agite y vacíe la mezcla en el molde con los
peines previamente colocados.
4. Dejar gelificar y coloque el gel en la cámara de electroforesis horizontal, adicione 400 ml de buffer TAE 0,5X
y retire los peines.
5. Realice una mezcla con sus muestras extraídas previamente descongeladas y buffer de corrida
1:1 (20 µl: 20 µl). y deposite su mezcla en los pocillos. NOTA: Coloque 5 µl de una escalera
molecular para ADN.
6. Conecte los cables y corra a 80 Volts por 40 min.
7. Transcurrido el tiempo, desconecte la cámara de electroforesis y coloque el gel en el
transiluminador e interprete resultados.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Determine la Absorbancia a 260nm y a 280nm
2. La concentración de la proteína es de:_______________
3. La concentración del ADN es de:_________________
4. La concentración del ARN es de:________________
V. CUESTIONARIO
1. En qué consiste la electroforesis pulso cortante, electroforesis bidimensional, electroforesis capilar
2. En qué consiste la técnica de Microarreglos o chip´s-microrrays.
3. En qué consiste la técnica de FISH
4.
VI. REFERENCIAS
ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
 1. Instituto Nacional de Salud. (2003). Manual de Procedimientos de Electroforesis Para Proteínas y ADN.
Lima, Perú.

PRÁCTICA 6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

COMPETENCIA: El alumno realiza una PCR empleando su material genético con la finalidad de
conocer la programación del termociclador TC-312 así como la comprensión de la función de
cada uno de los reactivos utilizados en la técnica.

I. INTRODUCCIÓN
PCR son las siglas en ingles de Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa. La
idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una
polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus
aquaticus que vive a altas temperaturas (79oC a 85oC), de ahí su nombre comercial más conocido: taq
polimerasa. Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se
sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el
ADN del organismo que queremos estudiar –donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar, los
oligonucleótidos (llamados también primers, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se
inicie la transcripción, dinucleotidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente
(cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras
sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa). Esta técnica tan ingeniosa tiene muchas aplicaciones
distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones
van desde la genética de poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina forense.
II. MATERIAL Y EQUIPO

 Termociclador  Agua destilada.

 DNA template  Micropipetas 0.5-10 l, 10-100l
 Buffer TAE 1X  Gradilla para tubos de 0.5 m.l
 dNTP´s 200M  Tubos eppendorf de 0.5 ml.
 MgCl2 2.0 mM  Taq DNA polimerasa 2.5 u en un
 Primers 20 pmoles FW y RW volumen de 50 l

III. METODOLOGÍA

1. Programar el Termociclador con el siguiente ciclado térmico: número de ciclos (25)

95.0 °C 1 min
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización 95.0 °C 30 seg
LO DETERMINA 30 seg
Alineación EL ALUMNO
72.0 °C 1 min
Elongación
Elongación final 72.0 °C 1 min
Temperatura final 4.0 °C

2. Rotular un tubo de Microcentrífuga de 1.5 mL con la leyenda “ PCR Mix

3. Preparar el master mix (área blanca) con las siguientes concentraciones finales: PCR Buffer 1X,
MgCl2 2.0mM, dNTPs 200M, Primers 20 pmoles, Taq DNA Polimerasa 2.5 U en un volumen

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR
 de 50 L por tubo (Considerar también un tubo para el control positivo y otro para el control
negativo).
4. Agregar 2 L de DNA template o muestra en cada uno de los tubos correspondientes (Para el
tubo del control negativo utilizar 2L de agua desionizada libre de nucleasas).
5. Agitar suavemente los tubos con el dedo o aplicar un ligero pulso de Microcentrífuga.
6. Colocar los tubos en el termociclador e iniciar el programa configurado en el paso No. 1.
7. Mientras transcurre el ciclado térmico preparar un gel de agarosa al 2.0% en buffer TAE 1X.
8. Después de concluido el ciclado térmico correr electroforesis 80 V por 40min.
9. Visualizar el gel en transiluminador UV.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Una vez realizada la PCR y corrido el gel, interprete resultados con el apoyo del docente.
2. Determine previamente la Tm para los oligonucleótidos Tm
FW: CAGACTGACCAGCATACGG __________
RW: GGCCATAGCGACGACTC __________

Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C) =
3. A partir de la siguiente tabla determine sus concentraciones para una reacción 1X
PCR-mix 5x 10x 15x 20x 25x 30x 35x 40x 50x 60x

PCRx10 12.5 25 37.5 50 62.5 75 87.5 100 125 150

dNTPs 2 mM 12.5 25 37.5 50 62.5 75 87.5 100 125 150
Oligo 1 100 µM 0.6 1.3 1.9 2.5 3.1 3.8 4.4 5 6.3 7.5
Oligo 2 100 µM 0.6 1.3 1.9 2.5 3.1 3.8 4.4 5 6.3 7.5
Taq 3-5 U/ µl 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 8.8 10 12.5 15
H2O (Aforar a 50 µl)

V. CUESTIONARIO

1. Explica en un mapa cognitivo la técnica de PCR tiempo real, PCR multiplex, PCR anidada y AFLPPCR
2. Hubo amplificación del fragmento de ADN en caso de ser afirmativo que significa ese resultado, en caso de
ser negativo qué parámetros considera pudieron haber afectado.
VI. REFERENCIAS
1. Espinosa, L. (2010). Guía práctica Sobre la Técnica de PCR. Ciudad Universitaria, (UNAM), México.
2. Griffiths, K.G, K. (2002). Detection Methods. En: Review of technologies for detecting genetically modified
materials in commodities and food. Australian Govemment Analytical Laboratories; Australia. Pp. 122.

ELABORÓ:
ACADEMIA DE BIOLOGÍA MOLECULAR