ESTRUCTURA DEL GENOMA

1. Secuenciación del DNA

La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya

finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en
un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética
heredable que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos
(de procariotas, de eucariotas en el núcleo celular, y en los plásmidos, en la mitocondria y
en cloroplastos de las plantas). Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el
estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en
campos aplicados, como la investigación forense. Además, se puede utilizar la
secuenciación del ADN para conocer las mutaciones somáticas, como las sustituciones de
bases, generadas entre distintos organismos

Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad.

Determinación de la secuencia de nucleótidos de un DNA

La determinación de la secuencia de nucleótidos de una molécula de DNA,

abreviadamente conocida como secuenciación de un ADN, es un proceso fundamental
en la investigación actual en biología. Impulsados por el desarrollo de las técnicas de
clonaje y las exigencias derivadas del análisis genómico los métodos de análisis de
secuencia han experimentado un enorme avance. Los dos procedimientos más
poderosos para la secuenciación de ADN fueron publicados en la misma fecha (1977) y
se basan en procesos totalmente diferentes: la rotura de una cadena de ADN por sitios
específicos mediante el uso de reactivos químicos desarrollada por maxam y gilbert y
la síntesis enzimática abortiva de una copia de ADN mediante la utilización de análogos
de dNTPs que impiden la elongación del proceso, puesta a punto por friedrick sanger y
sus colaboradores. Son conocidos abreviadamente por el nombre de sus autores, o
como el ‘’método de rotura química’’ y el ‘’método enzimático, de los terminadores de
cadena o de los didesoxianálogos’’ respectivamente.

En sus inicios, el método de Maxam y Gilbert resultaba más atractivo: sus reactivos
eran muy asequibles y los resultados más reproducibles. Sin embargo, luego, con el
desarrollo de los vectores para el clonaje de fragmentos de ssADN (derivados de M13 y
fagómidos) la mayor facilidad para conseguir cebadores sintéticos y las mejoras
incorporadas a las reacciones enzimáticas, el método de Sanger se ha acabado
imponiendo; es la base además de los procedimientos automatizados sobre los que se
basa el cuantioso trabajo de análisis de secuencia que demanda los diferentes
proyectos de estudios de genomas en marcha. A pesar de eso, el método de la rotura
química se continúa usando en casos particulares, como, por ejemplo, en el análisis de
regiones conflictivas por secuenciación manual.
Método de la secuenciación basado en la rotura química del DNA:

En este procedimiento (fig) la hebra de ADN cuya secuencia se quiere analizar debe
estar marcada en uno de sus extremos con 32P. Puede partirse de un ssADN así
marcado o de un dsADN que lleve el fosfato radiactivo en sólo un extremo de sólo una
hebra. Varias alícuotas de este ADN son sometidas en paralelo a distintos tratamientos
químicos (reacciones) que producirán su rotura por residuos específicos. es esencial
que las reacciones se llevan a cabo en condiciones muy controladas para conseguir un
efecto parcial que produzca, por medio término una o muy pocas roturas por molécula
de esta manera el resultado de cada incubación contendrá una mezcla muy
heterogénea de moléculas: de entre todas ellas, las que llevan el marcaje se extienden
desde un punto común (extremo marcado original) hasta otro variable (el sitio de
rotura) pero específico para cada reacción por lo que la longitud de cada fragmento
marcado Define una posición ocupada por el residuo sensible a esa reacción.

Estás mezclas de productos de rotura se aplican en pocillos contiguos para su

resolución por electroforesis en un gel desnaturalizante. suelen ser geles común 6 a
20% de poliacrilamida que contienen urea 7M para conseguir que las piezas de ADN se
muevan por el gel en forma de monohebras (imprescindible si el ADN de partida fue
un dsADN) y para evitar que formen zonas de estructuras secundaria que afectarían a
su movilidad. el gel se desarrolla a un voltaje alto lo que hace que alcance 70 grados
centígrados de temperatura esto también reduce la posibilidad estructura secundaria
Aunque obliga a dotar al equipo de un sistema de eliminación uniforme del calor para
evitar alteraciones graves en la movilidad de las bandas se pueden impedir una buena
lectura de los resultados. Las moléculas marcadas presentes en las diferentes calles
conducen directamente a la secuencia buscada. En el caso de haber llevado a cabo las
reacciones sobre un dsADN los fragmentos producidos a partir de la hebra no marcada
no se harán visibles tras la autorradiografía.