Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.

Evaluación del crecimiento del hongo Trichoderma

harzianum en función del tiempo
Jhoan Felipe Cespedes Rojasa, Laura Catalina Cruz Estradaa.
a. Programa de Ingeniería química, Universidad de La Sabana, Chía, Cundinamarca, Colombia.
OBJETIVOS:
General: Evaluar el cremiento del hongo Trichoderma harzianum en función del tiempo utilizando una fermentación
de tipo discontinua

Específicos:
 Analizar las caracteristicas morfológicos del hongo Trichoderma harzianum a medida que cambia el tiempo,
utilizando la tincion de Gram y el azul de lactofenol verificando la pureza y la estrucutra celular.
 Determinar la cantidad de biomasa formada en función del tiempo , utilizando la tecnica de peso seco.
 Realizar el conteo de conidios, utilizando la tecnia de recuento en camara de Newbauer, determinando la
formación de conidios en fución del tiempo.
INFORMACIÓN DEL INFORME
RESUMEN
Historia del informe:
14 de mayo del 2019 En esta práctica evaluo el crecimiento del hongo Trichoderma harzianum en
función del tiempo para lograr esto, primero se realizo la producción del
Palabras clave: inoculo , una vez realizado este se verifico la pureza mediante las tecnicas
Crecimiento de tinción de gram y azul de lactofenol. Seguido de este se realiza la
Trichoderma harzianum fermentación discontinua para 7 dias , se determino la formación de biomasa
Peso seco a diferentes tiempos , pesando la biomasa seca , y llevandola a una
Camara de Newbauer concentración de g/L, y finalmete se realiza el conteo de esporas utilizando
Tinción de Gram la camara de Newbauer a los diferentes tiempos y diluciónes . Como
Azul de lactofenol resultados se pudo evidenciar que …
que se induce en el microorganismo por la presión
Introducción: osmótica generada por las sales, sin embargo, si la
El hongo Trichoderma hazarium es un hongo filamentoso concentración de las sales excede los requerimientos del
que se encuentra en gran cantidad en los suelos. Este hongo, se presentara una disminución en la
microorganismo es saprofito, anamorfico, aerobio, codiniogenesis por la disminución de la presión osmótica
además, tiene un rápido crecimiento en cultivos sólidos y en la célula. (Cardenas V., 2010)
líquidos. (Cardenas V., 2010)
Las condiciones que debe poseer el medio de cultivo para
Este microorganismo al ser expuesto a intervalos de luz que este microorganismo se reproduzca son:
(3 minutos es suficiente) evidencia una inducción a la
generación de esporas. Asimismo, la relación entre las - pH: El microorganismo se encuentra entre la
fuentes de carbono y nitrógeno debe estar en 10:1, aun caracterización de acidófilo y neutrófilo por el
mas, la esporulación que presenta este organismo es rango de pH en el que se encuentra su crecimiento
inversamente proporcional a la concentración de la fuente (2-9), sin embargo, su pH optimo se encuentra
de carbono. Por otro lado, la concentración de sales en el entre 4 y 7.
medio de cultivo es importante, dado a la esporulación - Temperatura: Es un organismo mesófilo, dado a
las temperaturas en el que presenta crecimiento

Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.1
(10°C-40°C), aun mas, la óptima esta entre 25-
30°C.
- Humedad: La humedad optima de crecimiento
esta entre 70-80%, aun mas, el rango en el que
puede adaptarse esta entre 20-90%.
- Luz: Este microorganismo es fotosensible, por tal
motivo para obtener un buen crecimiento debe
exponerse a intervalos de luz (periodos de luz y
oscuridad) de 3 minutos o de 10 a 30s de luz UV
(366nm).
- Nutrición: El hongo Trichoderma hazarium puede
degradar polímeros de hidratos de carbono por la
capacidad de producir enzimas que hidrolizan
(amilasas, pectinasas, celulasas) estas cadenas de
carbonos como celulosa, almidón y peptina.
Además de la fuente de carbono y nitrógeno
(puede ser suplementada con urea, aminoácidos,
amoniaco y nitritos) necesita de microelementos y
vitaminas como Cu, Mo, Fe, Mn, Zn y vitamina
E.
- Salinidad: Este microorganismo presenta una
esporulación optima con una concentración de
10g/L de CaCl2, en concentraciones mayores se
disminuye la esporulación, además, con sales
como NaCl y KCl no tiene un crecimiento optimo
por el cambio de la presión osmótica que se
genera dentro de la célula por los iones Na+ y K+.
La disponibilidad de los nutrientes en un medio de cultivo
afecta el crecimiento del microorganismo según la
capacidad que tenga para producir las enzimas necesarias
para degradar estas fuentes y de este modo, ingresarlas a
la célula, por tal motivo, la cantidad de tiempo que puede
demorarse el mismo microorganismo en alcanzar alguna
fase de crecimiento (latencia, exponencial, estacionaria o
muerte) con diferentes medios o fuentes de carbono puede
ser distinto. Este crecimiento en los hongos se puede
presentar por tres tipos distintos de reproducción:
(Madigan. M, Martinko. J, Bender. K., Buckley D., 2015)
- Mediante el crecimiento y extensión de las hifas
filamentosas
- Mediante la producción de esporas asexuales
(conidios)
- Por simple división celular como en las levaduras
con yemas
2
El hongo Trichoderma hazarium presenta un tipo de
reproducción asexual con conidios, por tal motivo, la
presencia de estas esporas son un indicador de la
reproducción del microorganismo. Asimismo, la fase de
crecimiento del microorganismo se identifica a través de
la cantidad de conidios presentes en cierto volumen en un
determinado tiempo, igualmente como ocurre con la
biomasa (figura 1 y 2). (Madigan. M, Martinko. J,
Bender. K., Buckley D., 2015) (J. 1. Prosser, 1991) La
tasa de producción de conidios en la fase estacionaria
disminuye en comparación con la fase exponencial
(trofofase) debido a la limitación que genera la
concentración de cierto nutriente en un determinado
tiempo, producto del consumo por parte del
microorganismo de este sustrato. Cuando la
concentración de determinado nutriente limite el
crecimiento del microorganismo, el hongo busca
adaptarse a la nueva concentración de sustrato que posee
el medio con la producción de compuestos de
almacenamiento y metabolitos secundarios en las micelas
(ideofase). (J. 1. Prosser, 1991) (T. Gomez, 2017)
Figura 1. Cantidad de conidios de Trichoderma hazarium por mL en un
determinado tiempo evaluado en diferentes medios de cultivo.
Del mismo modo, en la fase estacionaria la biomasa del
microorganismo permanece constante por el balance
existente entre la autolisis celular y el crecimiento, hasta
que finalmente domina la autolisis y el organismo entra
en la fase de muerte (figura 2). (J. 1. Prosser, 1991)
(Flores, Hassan, Corkidi, Galindo, & Serrano-Carreón,
n.d.)
 3
Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.1

1 2
Figura 3. Crecimiento de Trichoderma hazarium después de 8 dias en medio
de cultivo sólido. Figura 4. Estructura del hongo Trichoderma hazarium con
azul de lactofenol
Figura 2. Concentración de biomasa de Trichoderma hazarium en
determinado tiempo

Para la determinación de la biomasa, usualmente en los

estudios se realiza a través del método mas directo el cual
consiste en medir el peso seco microbiano a través de la Metodología:
recolección de las células por medio de una filtración o Tinción de Gram
centrifugación de una muestra liquida. Posteriormente esa
muestra se expone a calor en una estufa para la
eliminación del agua, finalmente la muestra seca se pesa.
(M. Prescott. P. Harley, 2001)
La cantidad de conidios presentes en una muestra se
hallan a través de recuento directo en una cámara de
conteo, que usualmente es un portaobjetos con una rejilla
con una profundidad conocida. El numero de
microorganismo se calcula a partir del volumen de la
cámara y la dilución que se efectuó a la muestra. (M.
Prescott. P. Harley, 2001)
A nivel macroscópico, un cultivo de este microorganismo
puede llegar a un diámetro de 9cm en 5 días, el cual, al
inicio, presenta un color blanco y textura algodonosa. No
obstante, después de cierto tiempo, se torna con una
coloración blanco-verdosa (figura 3). (Cardenas V.,
2010)
Por otro lado, en escala microscópica, este
microorganismo tiene hifas hialinas, septadas, las cuales
tiene un diámetro entre 18µm-25µm, ramificadas de Producción del Inóculo
forma piramidal (figura 4), además de poseer
clamidosporas como sistema de resistencia. Los conidios
de las paredes lisas se desprenden de los fiálides en forma
de botella con un tamaño de conidio entre 2,8-3,2 x 2,5-
2,8 µm. (Cardenas V., 2010)
 4
Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.1

Fermentación Discontinua
Determinación de viables en función del tiempo por
peso seco.

Evaluar cada tiempo de muestreo de la curva de

crecimiento.

Datos y resultados:
Una vez se haya realizado la producción del inóculo, las
cuales se obtuvierirón los siguientes resultados a
diferentes tiempos como se evidencia en la tabla , de la
tinción y el azul de lactofenol. (ver figuras 1,2,3,4,5)
Tabla 1. Resultados de las caracteristicas morfologicas
a(tinción de gram) y b(lactofenol)
Tiempo (horas) # tiempo Caracteristicas
Recuento en cámara de Newbauer microoscopicas
0 0 Figura 5ayb
48 1 Figura 6 a
80 2 Figura 7 a
144 3 Figura 8 a
168 4 Figura 9

Figura 5a. Tinción de gram para el tiempo 0.

 5
Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.1

Figura 7a. Tinción de gram para el tiempo 2.

Figura 5b. Azul de lactofenol para el tiempo 0.

Figura 8a. Tinción de gram para el tiempo 3.

Figura 6a. Tinción de gram para el tiempo 1.

Figura 9a. Tinción simple para el tiempo 4.

Los resulados de la cantidad de conidios/ml, formados a

medida que pasa el timpo se evidencian en la tabla 2.

Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.1
Tabla 2. Resultados del conteo de la camara de
Newbauer.
Ya con los datos obtenidos (como se evidencia en la tabla
2), se realiza la grafica , para analizar el comportamiento
de esta. (ver figura 10).
Figura 10. Crecimiento del Nº de conidios en función del
tiempo.
Se obtuvo la formación de biomasa a medida que paso el
tiempo como se evidencia en la tabla 3.
Tabla 3. Formación de biomada a medida que paso el
tiempo.
Una vez obtenido la concentración de biomasa a medida
que avanza el tiempo, se hace la grafica para analizar el
comporatmiento de esta.
Figura 11. Crecimiento de la biomasa en función del
tiempo.
6
Discusión:
El crecimiento del microorganismo Trichoderma
hazarium en el medio de cultivo Saboreau presentó un
crecimiento o reproducción a través de esporas asexuales
como se evidencia en las figuras 10 y 11 hasta el tiempo
3 (80h). El crecimiento del hongo se identifica que fue
hasta ese tiempo por la tendencia de las figuras 10 y 11.
La figura 10 muestra un máximo de conidios de 1,95x106
conidios/mL, el cual, después de ese punto, la cantidad de
estas esporas en el medio se reduce. Asimismo, ocurre
con la figura 11, dado al máximo presentado a las 80 h en
la cantidad de biomasa presente en el cultivo (2,556 g/L),
de este modo, después de este punto, la concentración de
biomasa disminuye. Como consecuencia, estas
tendencias en las dos figuras quieren decir que el
organismo debe adaptarse a un cambio presente en el
medio, este cambio puede ser en la concentración de un
sustrato dado al consumo de este compuesto por parte del
microorganismo que sea la fuente de carbono o nitrógeno,
por tal motivo el hongo debe activar otras rutas
metabólicas que sinteticen compuestos de
almacenamiento y metabolitos secundarios que
mantengan a la célula. (J. 1. Prosser, 1991)
Del mismo modo, la biomasa al tender a un valor
constante (figura 11) indica que la tasa de reproducción
es igual a la de muerte (autolisis), de modo similar, la
producción de conidios disminuye, lo cual indica que el
organismo entro en la fase estacionaria (ideofase). Por
otro lado, la región anterior a las 80 h en las figuras 10 y
11 refleja que el organismo estaba en la trofofase, por el
aumento de la producción de conidios/mL y de la

Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.1
concentración de la biomasa en el medio. (J. 1. Prosser,
1991)
Por otro lado, el microorganismo presenta hifas septadas
con conidios alrededor (figura 5ª), asimismo, los conidios
o esporas asexuales son esféricas de acuerdo a la figura
5b. En un principio, la figura 5a funciona para identificar
que el cultivo no está contaminado por algún otro
microorganismo, especialmente por alguna bacteria, dado
al principio de diferenciar las bacterias por el grosor de la
capa de peptidoglicano en la pared celular para el cual se
usa la tinción de Gram. No obstante, el cultivo en el
tiempo cero está limpio debido a la no presencia de
formas de bacilo o cocos con color azul o violeta, solo
están presentes las hifas con algunas esporas.
Del mismo modo, todas las demás muestras en los
diferentes tiempos (48h y 144h) están limpios (figura 6a
y 8a) de otro microorganismo que hubiera afectado el
crecimiento del hongo por la competencia que hubiera
establecido por la disponibilidad de las fuentes de
carbono, nitrógeno, oxigeno y nutrientes en el medio. No
obstante, en la figura 7ª se evidencia la presencia de
formas de bacilo con color rosa, lo cual indica que el
medio de cultivo usado para tomar la medida de biomasa
y conidios en el tiempo 2 (80h) esta contaminado por una
bacteria bacilo gran negativa. Con lo que respecta a la
muestra tomada en el tiempo 4 (168h) solo se observan
las esporas, mas no hifas, debido a la baja concentración
que hay en el medio por la fase en la que se encuentra el
microorganismo. Esta fase debe ser entre la estacionaria
y la de muerte, además, el dato de la tabla 2 demuestra
que la producción de conidios es cero. El tipo de tinción
usada para el tiempo 4 fue simple, por tal motivo no se
puede ana liar si la muestra se encuentra contaminada o
no. Asimismo, las figuras 7a y 8a muestra la presencia de
conidios.
En cuanto a la figura 6a, aparte de permitir identificar que
la muestra en el tiempo 2 (48h) no se encontraba
contaminada, permite observar la germinación de un
conidio cercano a la hifa.
Conclusiones:
7
Bibliografía:
Cardenas V. (2010). CARACTERIZACIÓN
MICROBIOLÓGICA Y PRODUCCIÓN DE
Trichoderma harzianum Y Trichoderma viride EN
CULTIVO ARTESANAL. Retrieved from
https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle
/10554/8662/tesis615.pdf?sequence=1&isAllowed=
y
Flores, C., Hassan, M., Corkidi, G., Galindo, E., &
Serrano-Carreón, L. (n.d.). PRODUCCION DE
BIOMASA VIABLE DE Trichoderma harzianum
BAJO DIFERENTES ESQUEMAS Y
CONDICIONES DE FERMENTACION. Retrieved
from https://smbb.mx/congresos
smbb/puertovallarta03/TRABAJOS/AREA_II/CART
EL/CII-12.pdf
J. 1. Prosser, A. J. T. (1991). Growth Mechanisms and
Growth Kinetics of Filamentous Microorganisms, 4,
253–274.
M. Prescott. P. Harley, A. K. (2001). Microbiología. (5ta
edición. Mc-Graw Hill Mc-Graw Hill Higher, Ed.).
Madigan. M, Martinko. J, Bender. K., Buckley D., S. D.
(2015). Biologia de los microorganismos
(PEARSON, Vol. 14). PEARSON.
T., Gomez. (2017). EVALUCIÓN DE DIFERENTES
MEDIOS DE CULTIVO Y CONDICIONES PARA
LA PRODUCCIÓN DE CONIDIOS DE
TRICHODERMA SPP MEDIANTE
FERMENTACIÓN EN LÍQUIDO Y SÓLIDO, 88.
 8
Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento de Ecol. en caldo BHI de, PP.1