Manual Toxicologia Editado Oct 2006 Luis Ferrari

Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología.
Manual de Técnicas Analíticas

en el
Laboratorio
de
Toxicología y Química Forense
Leda Giannuzzi
Doctora en Ciencias Químicas, Catedrática en Toxicología y Química Legal,
Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata.
Investigadora del CONICET.
Luis Alberto Ferrari

Doctor Químico y Lic. En Ciencias Farmacéuticas. Jefe del Laboratorio de
Toxicología y Química Legal de la Suprema Corte de Justicia de Buenos Aires.
Catedrático en Química Forense en la Universidad de Morón.
COLABORADORES:
Lic. Miriam G. Arado.

Dr. Darío Andrinolo
Lic.Carlos H. Colángelo
Bioq. Angeles de Cristofano
Lic. Antonio Forte
Bioq. Valentina Garrote
Bioq. Mónica Molinas
Dr. Rodolfo R.Nieto
Bioq. Cristian Oliver
Bioq. Fernando Rainoldi
Bioq. Aníbal Ramos
Dra. Mabel Tomas
Leda Giannuzzi-Luis Alberto Ferrari

I.S.B.N. 987-05-0147-8
Queda hecho el depósito que indica la Ley 11273.
Editorial Praia®
Morón, Buenos Aires, 2006
PRÓLOGO
“Inmensa es la gracia poderosa que reside en

Hierbas, plantas, piedras y sus raras cualidades;
Porque no existe en la tierra nada tan vil, que
no rinda a la tierra algún beneficio especial”
Romeo y Julieta, Act.II, III. W. Shakespeare
Con el espectacular avance en las ciencias básicas que sustentan a la Toxicología, especialmente
aquellas relacionadas con los métodos instrumentales cualitativos y cuantitativos de alta
performance, nos pareció necesario concebir un libro que incluyera las pruebas utilizadas con
mayor asiduidad en un laboratorio toxicológico clínico, forense y/o criminalístico.
Es común en ésta materia que los manuales o compendios a los que estamos habituados consultar
omitan o describan con excesiva brevedad los procedimientos analíticos, limitándose a señalar
referencias bibliográficas que demandarían tiempo y esfuerzo en adquirirlas e interpretarlas.
En esta contribución hemos puesto mucho énfasis en la descripción detallada de técnicas, paso por
paso para la ejecución de las diversas pruebas, que surgen de publicaciones recientes y que, lo
más importante, hemos podido mayormente ponerlas en práctica en nuestra labor cotidiana. Con
ello, creemos poder aportar al alumnado y colegas que incursionen por esta disciplina nuestra
propia experiencia y visión de las técnicas a que haremos referencia.
Algunos capítulos, como drogas de uso indebido en pelo, metales pesados, y restos de
deflagración de pólvoras entre otros, contienen introducciones teóricas un tanto extensas, con el
objeto que el lector se familiarice con los principios en los que se sustenta la práctica a la que se
referirá posteriormente y una mejor lectura de los resultados técnicos. Por otro lado, estos
capítulos incluyen metodologías e interpretaciones bastante novedosas por ser de reciente
aplicación en nuestro medio.
Hemos intentado brindarles métodos que cumplan un criterio de alto estándar cualitativo en
cuanto a sensibilidad, reproducibilidad, confiabilidad, precisión y economía.
Se espera que ésta publicación pueda ser utilizada con fines didácticos y asimismo como guía y
libro de consulta para profesionales y estudiantes.
Queremos destacar las contribuciones de nuestros maestros y colegas para enriquecer el manual.
Agradeceremos cualquier crítica o sugerencia que nos permita mejorar la obra.
Leda Giannuzzi y Luis Alberto Ferrari

Octubre de 2006
Índice
Capítulo 1: Aspectos de seguridad en el laboratorio de toxicología.
Autor: Dra. Leda Giannuzzi.
Capítulo 2: Recolección y almacenamiento de las muestras en el laboratorio de

toxicología clínica y en el análisis toxicológico forense:
Autor: Dr. Luis A. Ferrari.
Capítulo 3: Toxicología Analítica.

Autores: Bioq. Angeles de Cristofano, Dr. Leda Giannuzzi, Bioq. Cristian Oliver.
Capítulo 4: Tóxicos Volátiles y Gaseosos.

Autores: Dra. Mabel Tomas, Dra. Leda Giannuzzi y Dr. Luis A. Ferrari
Capítulo 5: Abuso de sustancias volátiles

Autor: Bioq.Cristian Oliver.
Capítulo 6: Detección de sustancias no permitidas en caballos de carrera SPC (Sangre

Pura de Carrera) y AT (American Troters).
Autores: Bioq. Angeles de Cristofano, Bioq. Aníbal Ramos.
Capítulo 7: Pesticidas
Autor: Bioq.Cristian Oliver.
Capítulo 8: Tóxicos Metálicos.

Autores: Bioq. Fernando Rainoldi, Dra. Leda Giannuzzi, Bioq. Cristian Oliver
Capítulo 9: Estudio de restos de deflagración de pólvoras por métodos químicos e

instrumentales.
Autor: Dr. Luis A. Ferrari.
Capítulo 10: Manchas hemáticas.
Autor: Dr. Rodolfo Nieto.
Capítulo 11: Manchas de semen.
Autor: Dr. Rodolfo Nieto.
Capítulo 12: Documentos Cuestionados.

Autor: Bioq. Valentina Garrote, Lic. Antonio Forte.
Capítulo 13: Ficotoxinas.

Autor: Dr. Darío Andrinolo.
Capítulo 14: Micotoxinas.

Autor: Bioq. Mónica Molinas.
Capítulo 15: El pelo como matriz para la búsqueda de Drogas de Uso Indebido.
Autor: Lic. Qca. Miriam Arado.
Capítulo 16: Investigación de Drogas de Abuso y Sustancias de Corte.

Autor: Dr. Luis A. Ferrari
Capítulo 17: Espectrofotometría de Absorción Atómica.

Autor: Lic. Qco. Carlos Colángelo.
Editores: Leda Giannuzzi – Luis A. Ferrari.

La información consignada en cada capítulo es de producción, opinión y responsabilidad de los autores
mencionados a continuación del título del capítulo. Los editores no se hacen responsables por el
contenido u originalidad de los mismos.
Capítulo 1: Aspectos de seguridad en el laboratorio de

toxicología.
Autor: Dra. Leda Giannuzzi.

Profesora Adjunta de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la Universidad Nacional de La
Plata.
Introducción.
Los análisis llevados a cabo en un laboratorio de toxicología emplean compuestos químicos

de variada toxicidad. El riesgo que implica su manejo no siempre es reconocido por lo operadores.
Si bien son numerosas las precauciones que los analistas deben tener en cuenta, como por
ejemplo la evaporación de solventes orgánicos sobre baño de agua o plancha calefactora y nunca
sobre llama directa, no todos los laboratorios tienen incorporado en su rutina la necesidad de
emplear una campana de extracción de gases cuando se trabaja con sustancias corrosivas o
solventes volátiles, como el caso mencionado anteriormente o como sucede durante el revelado
visual de las placas cromatográficas (TLC).
Otro ejemplo lo constituye la manipulación de ácidos y bases. Se sabe que al preparar

soluciones diluidas, estas sustancias deben ser agregadas al agua destilada y nunca en forma
inversa. Sin embargo, no siempre se tiene en cuenta la necesidad de almacenar ácidos y bases
en lugares separados y nunca en lugares elevados.
Gran parte de las muestras analizadas son de origen biológico. Resulta muy posible que
las mismas sean portadoras de agentes infecciosos, particularmente del virus de
inmunodeficiencia humana adquirida y de las hepatitis virales B o C. Esto obliga a considerar a
todas las muestras como potencialmente peligrosas y a manipularlas con sumo cuidado, desde
su obtención hasta su desecho final.
El trabajo en el laboratorio debe realizarse respetando normas e indicaciones que

garanticen la integridad y seguridad de las personas y los bienes involucrados en la tarea. Existe
excelente bibliografía sobre los aspectos de seguridad en un laboratorio y en particular en uno
de toxicología, por lo cual el presente capítulo presenta los problemas mas frecuentes que
pueden ocurrir durante el trabajo diario de un laboratorio de toxicología acerca de la
manipulación de sustancias químicas, solventes, ácidos, muestras biológicas etc. Este capítulo
pone énfasis en las pautas de trabajo mas seguras que deben aplicarse estrictamente para
disminuir los riesgos de accidentes.
1. Precauciones generales.
Todo el personal del laboratorio debe estar adecuadamente entrenado respecto de las
normas de seguridad. Todas las instrucciones sobre formas de manipulación y disposición final
de las muestras biológicas, solventes orgánicos y otras sustancias peligrosas deben presentarse
en forma escrita, en la forma de un manual de procedimientos operativos.
Es fundamental que todo el personal administrativo, técnico y de maestranza del laboratorio,
conozca, recuerde, utilice y haga cumplir estas reglas como una forma eficaz de desarrollar una
tarea segura para el operador y su entorno.
Las reglas mas importantes en un laboratorio de toxicología se resumen a continuación:
1.1 Pautas generales sobre el cuidado personal.
a) No fumar, comer, beber ni almacenar alimentos o bebidas en el laboratorio.

b) Utilizar guantes descartables (látex o vinílicos) para manejar las muestras biológicas (suero,
sangre, orina u otros fluidos biológicos) y sustancias químicas. Lavarse las manos con abundante
agua y jabón finalizada la tarea.
c) Utilizar siempre guardapolvo dentro del laboratorio, el que debe sacarse en el momento de
retirarse del mismo. No utilizar abrigos sobre este debido a que se elimina su función protectora. No
transferir el guardapolvo al hogar dentro de bolsos o mochilas, sino dentro de una bolsa plástica.
d) Utilizar anteojos de seguridad y máscara protectora de nariz y boca para el manipuleo de
muestras que puedan producir salpicaduras, material particulado, proyecciones o liberar gases que
arrastren el material sólido.
e) Nunca pipetar con la boca. Emplear propipetas o peras de goma para cargar las muestras.
Utilizar pipetas automáticas con tips descartables para cargar las muestras.
f) Usar el cabello recogido durante el trabajo dado que puede tener accidentes en caso de estar
cerca del fuego. En caso de tener el pelo más largo de los hombros colocarlo dentro del
guardapolvo
g) No maquillarse en el laboratorio.
h) Usar calzado apropiado, siempre cerrado (no utilizar sandalias).
1.2 Sobre el laboratorio.
a) Usar campanas de extracción de gases.

b) Descartar siempre las agujas en descartados portátil de paredes impermeables resistente a
c) ador permite retirar la aguja de la jeringa con un simple moviendo evitando tocar la aguja. No
debe encapucharse nuevamente las agujas ni retirarlas con la mano.
d) En el caso de emplear la centrifugación, los tubos deben estar cerrados para evitar los riesgos
de explosión por ignición del vapor del solvente así como los riesgos asociados con la formación
de aerosoles durante la centrifugación de un material que puede ser infeccioso o tóxico. No
debe abrirse la centrífuga en movimiento, ni frenarse manualmente; puede cubrirse la tapa con
papel absorbente humedecido en desinfectante.
e) Repasar mesadas de trabajo con lavandina 10% recientemente preparada antes y después
de finalizada las tareas.
1.2 Precauciones en un laboratorio biológico.
Existen ciertas precauciones básicas que deben observarse en un laboratorio que trabaja
con muestras biológicas. Estas se refieren al cuidado que debe tenerse con las muestras
respecto a evitar contagios de enfermedades por parte del operador y otras referidas a su
descarte. Entre ellas podemos mencionar:
1) Cuidar que todos los recipientes que contienen muestras biológicas sean de materiales
resistentes, posean cierre hermético, no presenten pérdidas o salpicaduras y se almacenen en
lugares seguros.
2) Todos los elementos (envases, materiales descartables, algodones, papeles absorbentes,

jeringas, guantes, etc.) que de alguna manera estuvieron en contacto con muestras biológicas,
deben ser descartarse en bolsas rojas. Dichas bolsas una vez completas deben colocarse en una
bolsa roja más grande y almacenarlas en lugares seguros, debidamente identificados. La
disposición final la lleva debe llevar a cabo una empresa que se encarga de ello.
3) Las muestras biológicas ya procesadas deben descartarse en lavandina.
4) Las muestras de orina ya procesadas pueden eliminarse sin tratamiento previo.
5) Los operadores deben recibir las vacunas de la hepatitis A y B.
Los accidentes en un laboratorio que maneja muestras biológicas inevitablemente

ocurren, y a continuación se describen los más frecuentes y las pautas para remediarlo.
1.2.1. Contacto directo o salpicaduras con sangre.
En casos de contaminación directa de piel intacta con muestras de sangre, debe

procederse de la siguiente manera:
- lavar con abundante agua y jabón,
- luego, lavar con solución diluida de hipoclorito de sodio.
- En casos de piel no intacta, membranas mucosas, punción con agujas o cortes en general se
debe proceder de la siguiente manera:
- lavar con abundante agua y jabón,
- lavar con solución de agua oxigenada al 3%,
- lavar con solución diluida de hipoclorito de sodio.
- Si el ingreso es a través de la boca se debe realizarse buches con abundante solución de agua
oxigenada al 3%.
- Si el ingreso es a través de los ojos, lavar con abundante solución fisiológica. Retirar lentes de
contacto si los hubiese.
Frente a estos casos debe comunicarse inmediatamente con el centro médico especializado
más cercano y notificar el accidente a fin de recibir el tratamiento correspondiente.
1.2.2. Derrames o roturas de envases conteniendo material biológico.
En casos de derrames de líquidos se debe absorber el material mediante el uso de papel

absorbente, usando guantes. Para el caso de material biológico, luego lavar toda el área y los
elementos utilizados con hipoclorito de sodio (1:10). Luego descartar todos los materiales en
bolsas rojas. Todo el procedimiento se realizará empleando guantes, barbijo y ropas protectoras.
1.3 Métodos de descontaminación del material biológico.
1.3.1 Métodos químicos.
Muchos elementos (tubos conteniendo muestras orgánicas, jeringas, etc., deben

descontaminarse previo a su descarte. Además debe descontaminar una zona de trabajo
diariamente antes y después de iniciar la tarea. Ello se realiza mediante solución de hipoclorito de
sodio. Sin embargo, no todos conocen como se prepara correctamente la solución y el tiempo de
contacto necesario para lograr su efecto. Se requiere 5 g. de cloro libre por litro de solución para
lograr una adecuada desinfección. Estas soluciones deben prepararse diariamente dado que
pierden su concentración con el tiempo. Esta solución se logra con las siguientes soluciones de los
compuestos en las concentraciones indicadas a continuación:
* Hipoclorito de sodio (5% cloro disponible) 10% (V/V)
* Hipoclorito de calcio (70% cloro disponible) 0,7% (V/V)
* Dicloroisocianato sódico (60% cloro disponible) 0.9% (V/V)
* Cloramina T (25% cloro disponible) 2,0% (p/V)
El tiempo de contacto con el desinfectante depende del material a descontaminar. Las
jeringas se descontaminan antes de su descarte con hipoclorito de sodio al 10% en el recipiente
para material contaminado durante al menos 30 minutos.
Los tubos con material orgánico o sangre deben sumergirse en hipoclorito de sodio al 10% y dejar
en contacto al menos 60 minutos.
1.3.2 Método físico (Esterilización).
La esterilización es el método físico que destruye bacteria, hongos, levaduras y virus en

forma completa. A continuación se transcriben las condiciones de esterilización que garantizan la
inactivación (muerte) de todos los virus, bacterias y esporas.
- Esterilización por vapor a presión durante 20 minutos a 1 atmósfera y 121º C.
- Esterilización por calor seco durante 2 horas a 170º C.
1.4 Rotura en la centrífuga de tubos con material infeccioso.
La centrífuga debe mantenerse cerrada durante 30 minutos para dejar que los aerosoles
decanten. Proteger los ojos con gafas, guantes, barbijo y ropa protectora y cubrir el material
derramado con algodón embebido en desinfectante durante 10 minutos en un recipiente para
esterilizar en autoclave. Rotor, portatubos o tubos que no puedan esterilizarse en autoclave se
sumergirán en un desinfectante apropiado no corrosivo.
1.5 Riesgo asociado al manejo de sustancias químicas en el

laboratorio.
Un laboratorio de toxicología debe emplear reactivos de grado analítico. Los niveles

máximos de impurezas así como la forma correcta de almacenarlos se encuentran
generalmente descriptos en la etiqueta del envase. En la etiqueta figuran las características de
reactividad de los productos químicos y también la forma de manejarlos.
Existen normas que establecen los datos de seguridad en el uso del material: Los
fabricantes deben proporcionar las llamadas hojas de seguridad del producto químico que en
inglés es MSDS (Material Safety Data Sheets Description) con cualquier producto que se
fabrique. La MSDS es un documento técnico que contiene información detallada acerca del
producto químico como ser: su número de identificación CAS (Chemical Abstract Service),
sinónimo), ingredientes peligrosos, datos físicos, peligros de incendios y explosiones,
información de riesgos para la salud, procedimientos para derrames, fugas y desechos,
información de protección del personal, precauciones especiales y comentarios.
Las planillas de seguridad de las sustancias químicas pueden ser encontradas en

algunas de las páginas de Internet gratuitas, de fácil ingreso y actualizadas describen a
continuación:
• Fichas internacionales de seguridad química
http: //www.mtas.es/insht/ipcsnspn/spanish.htm.
• Bases de datos de compuestos químicos

TOXNET Toxicology data network http://toxnet.nlm.nih.gov
• Entidades relacionadas con seguridad química:

http://www.nihs.go.jp/GINC/webguide/csinfo.html
• Emergencias químicasErg2000
http://www.tc.gc.ca/canutec/erg_gmu/erg2000_menu.htm
Existen riesgos muy serios para las personas que trabajan en un laboratorio. Los
productos químicos generan importantes peligros potenciales para la salud y presentan diversas
categorías como las que se detallan a continuación.
Corrosivos: productos químicos de pH menor a 2 o mayor de 12. Los ácidos y bases se

encuentran en esta categoría, provocando la destrucción visible de la piel en caso de contacto.
Producen lesiones en el tracto respiratorio por inhalación.
Sustancias tóxicas: venenos, irritantes y asfixiantes. No interactúan directamente con los

tejidos pero interfieren en los procesos metabólicos. Penetran al organismo por ingestión,
inhalación o absorción cutánea. Entre estos debemos nombrar los compuestos del cianuro que
por ingestión o inhalación de ácido cianhídrico provocan intoxicación aguda. Por ello, estos
compuestos deben almacenarse bajo llave en el laboratorio y en lugares ventilados.
Carcinógenos: son compuestos que provocan cáncer en animales o seres humanos. Los
productos químicos reconocidos como carcinogénicos potenciales o bajo sospecha de provocar
cáncer deben estar claramente etiquetados y deben manejarse en un área específica del
laboratorio con equipo protector adecuado. Es posible obtener una lista de los mismos en el
National Toxicology Program (NTP) y en la International Agency for Research on Cancer (IARC)
Los productos químicos mutágenos y terátogénicos ocasionan aberraciones

cromosómicas o malformaciones congénitas dado que presentan el potencial para provocar
daño irreversible o la muerte de las generaciones futuras.
Los productos inflamables y combustibles presentan riesgo de incendio. Además muchos

de ellos, son peligrosos para la salud. Algunos ejemplos son el xileno, éter etílico, acetona y
alcoholes. Existe una diferencia técnica entre los líquidos inflamables y combustibles. Los
líquidos inflamables tienen punto de ignición inferior a 60ºC y los líquidos combustibles tienen
punto de ignición por encima de 60ºC. El punto de ignición es la temperatura más baja en la que
se produce suficiente vapor para formar una mezcla susceptible de ignición en la superficie del
líquido. Es necesaria una fuente de calor (una chispa eléctrica, chispa estática, llama) para que
el vapor se encienda. El mayor riesgo que presentan los líquidos inflamables o combustibles en
el laboratorio es su almacenamiento. Deben almacenarse en zonas alejadas del fuego y en
recipientes bien cerrados y con ventilación.
Los reactivos explosivos se descomponen con rapidez y producen gases en expansión lo

cual origina la explosión. El ácido pícrico en su forma cristalina es explosivo al impacto.
Los compuestos reactivos tienen estructuras moleculares de alta reactividad. Es probable

que sean oxidantes con elevado contenido de oxígeno, compuestos con grupos redox,
compuestos que reaccionan violentamente con el agua o el aire húmedo, como óxidos de
metales anhídridos, compuestos pirofóricos que reacionan espontáneamente con el aire o
compuestos que forman peróxidos en determinado tiempo y se tornan explosivos como el éter
etílico.
La reactividad de los productos químicos es un concepto relacionado tanto con sus

características intrínsecas de peligrosidad como con las de sus condiciones de manipulación.
Debe prestarse especial cuidado a las sustancias que presentan reacciones violentas con el
agua, tanto por las reacciones exotérmicas que se producen como por desprendimiento de
gases o vapores inflamables o tóxicos, ya que ello implica una manipulación, almacenamiento y
eliminación diferenciada.
Algunas de las sustancias que reaccionan en forma violenta con el agua son: ácidos
fuertes anhidros, alquilmetales y metaloides, amiduros, carburos, flúor, fosfuros, halogenuros de
ácido, halogenuros de acilo, halogenuros inorgánicos anhídridos (excepto alcalinos), hidróxidos
alcalinos, hidruros, imiduros, metales alcalinos, óxidos alcalinos, peróxidos inorgánicos y
siliciuros.
Existen también compuestos que reaccionan violentamente con el aire y pueden generar
al cabo del tiempo inflamación espontánea. En algunos casos puede influir también el nivel de la
humedad del aire. Algunos ejemplos son alquilmetales y metaloides, arsinas, hidruros, boranos,
fosfinas, fósforo blanco, fosfuros, metales finamente divididos, nitruros, xilenos, siliciuro.
Otro aspecto que debe considerarse entre los cuidados en el laboratorio es la

incompatibilidad entre reactivos. La incompatibilidad se refiere a sustancias cuya mezcla
provoca reacciones exotérmicas pudiendo además emitir gases inflamables o tóxicos. Esto es
especialmente importante en el momento de diseñar su almacenamiento.
Las sustancias ácidas pueden producir reacciones peligrosas. Así por ejemplo, la adición
de ácidos a efectos de reducir el pH de un medio o simplemente para limpieza, debe realizarse
conociendo previamente si existe incompatibilidad entre los componentes del medio y el ácido
adicionado. A modo de ejemplo se señalan algunas de reacciones peligrosas de los ácidos:
El ácido clorhídrico en contacto con sulfuros, desprende sulfuro de hidrógeno, con

hipoclorito, desprende cloro y con cianuro, desprende cianuro de hidrógeno.
El ácido nítrico en contacto con algunos metales, desprende dióxido de nitrógeno, con
ácido fórmico o ácido oxálico desprende, monóxido de carbono y con alcohol etílico, desprende
etano.
Muchas sustancias químicas pueden formar peróxidos durante su almacenamiento. Los
peróxidos, en ciertos casos, pueden provocar explosiones violentas. Su presencia se puede
detectar de una manera muy sencilla mediante la aplicación del test de detección de peróxidos:
a 10 ml de la muestra, añadir 1 ml de una solución acuosa al 10% de KI recientemente
preparada. Si aparece una coloración amarilla estable, debida a la liberación de yodo, se puede
dar por confirmada la presencia de peróxidos. La adición de algunas gotas de ácido favorece la
reacción y la sensibilidad puede mejorarse extrayendo la solución acuosa con 1 ml de
tetracloruro de carbono y gotas de almidón. El almidón produce un complejo violáceo en la fase
orgánica. La falta de coloración debe considerarse como prueba negativa.
Entre los compuestos que suelen producir peróxidos en forma espontánea podemos
nombrar: compuestos alílicos, compuestos diénicos, compuestos isopropílicos, compuestos
vinilacetilénicos, compuestos vinílicos, cumeno, estireno, tetrahidronaftalenos, éteres,
haloalquenos, N-alquilamidas, ureas.
Algunas sustancias químicas presentes en forma de monómeros pueden polimerizarse

rápidamente provocando una explosión o rotura de los frascos. Entre estos pueden citarse
acetato de vinilo, acroleína, acrilonitrilo, 1,3-butadieno, óxido de etileno, estireno, etc. La
polimerización puede tener lugar por simple exposición a la luz, calentamiento, presencia de
impurezas ácidas o metálicas, choques, etc. El almacenamiento de monómeros debe realizarse
en pequeñas cantidades, conteniendo estabilizadores o inhibidores de polimerización y lejos de
productos susceptibles de liberar trazas de ácidos y bases.
Existe la posibilidad que durante el almacenamiento prolongado de productos inestables

éstos se descompongan y que en ciertas circunstancias, como choque, calentamiento o
desplazamiento simple, puede generar una explosión. Los amiduros alcalinos y ciertas sales de
diazonio se pueden incluir dentro de este grupo de productos. El cloruro de aluminio, por otra
parte, acumula el ácido formado por descomposición a causa de la humedad absorbida a lo
largo del tiempo. Cuando se abre el recipiente, puede ocurrir la rotura del mismo y la proyección
de su contenido.
La apertura de un recipiente que ha permanecido largo tiempo cerrado sin usarse es una
operación que debe realizarse con precauciones, especialmente, la apertura de frascos
esmerilados cuyo tapón haya quedado trabado. Los productos líquidos inestables es
recomendable guardarlos en ampollas selladas.
Cada institución debe preparar un plan de emergencia teniendo en cuenta sus áreas de
riesgo y contar con procedimientos generales que permitan controlar situaciones irregulares.
En caso de quemaduras de tipo químicas proceder de la siguiente manera:
- Quitar la ropa de la zona afectada.

- Lavar con abundante agua.
- Pedir ayuda, indicando el nombre de la sustancia que provocó la quemadura.
a) Acidos
-Lavar con abundante agua.
-Neutralizar la acidez de la piel con bicarbonato de sodio durante 20 minutos.
b) Bases
-Aplicar sobre la zona afectada solución saturada de ácido bórico o acético al 1%
c) Halógenos
-Lavar con hidróxido de amonio al 20%.
d) Sustancias reductoras
-Aplicar una compresa de permanganato de potasio al 0,1 %.
e) Acido fluorhídrico
-Lavar con abundante agua fría. Prestar atención a la piel debajo de las uñas.
-Colocar compresas de solución saturada de sulfato de magnesio heptahidratada, enfriada con
hielo durante por lo menos 30 min.
1.6 Medidas preventivas para llevar a cabo reacciones químicas

peligrosas.
Si la reacción que se va a llevar a cabo reviste características de peligrosidad, dado que se
trata de una reacción no descrita previamente, existe la posibilidad de la aparición de reacciones
secundarias peligrosas. Por ello, debe procederse de manera cuidadosa con la preparación y
desarrollo de la misma, tomando las medidas preventivas adecuadas entre las que cabe citar:
• No realizarla nunca sin autorización del responsable del laboratorio y sin recabar
información sobre las medidas preventivas a aplicar.
• Emplear las mínimas cantidades posibles de reactivos.
• Emplear procedimientos a escala micro o semimicro disponibles dado que la sensibilidad
de los métodos analíticos de separación y confirmación suele ser elevada presentando
menor riesgo por el uso de mínimas cantidades.
• Recoger toda la información disponible sobre la reactividad y características de
peligrosidad de los reactivos y productos esperados de la misma.
• Disponer del material adecuado y suficiente para su realización, que cumpla los
requisitos técnicos necesarios.
• Llevar a cabo la reacción en una vitrina o instalación específica adecuada a los riesgos
esperables de aquella.
• Disponer de ropa de trabajo y equipos de protección personal adecuados al riesgo y de
los elementos de actuación suficientes (extintores adecuados, mantas ignífugas,
neutralizadores, absorbentes, equipos de ventilación y respiración de emergencia,
duchas y lavaojos) en relación a los posibles incidentes y accidentes. Avisar al resto del
personal del laboratorio de la realización de la reacción.
Bibliografía.
Química analítica cuantitativa.Kolthoff et al. (4a. Ed.), Nigar, Buenos Aires, 1976.
Self Instruction Sheet for Users of Laboratory Instruments in Intermediate Hospital Laboratories,
P.M.G. Broughton, OMS, 1987.
Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies, Food and Drugs Administration, USA,
1987.
Handbook for SRM Users, U.S. Department of Commerce, National Bureau of Standars, 1985.
Quality Assurance in the National Water Quality Laboratory, Canada Center for Inland Waters,
Ontario, 1986.
Computer Evaluation of Control Material, P.R. Foulis, Am. Clin, Lab., Marzo 1989.
The Oxford Guide to Calibration Validation of Laboratory Pipettes, J.E. Devine, 1985.
A Quality Assurance Program for Health and Environmental Chemistry, M. Gautier y E. Gladney,
Am. Clin. Lab, Julio 1987.
Accuracy in Weighing: Optimizing Technique, R. Hoesly, Am. Lab., Junio 1989.
Dangerous Properties of Industrial Materials (6a. de), N.I. Sax, Van Nostrand Reinhold, New York,
1984.
Hazardous Chemical Information and Disposal Guide, M.A. Armour et al., Department of Chemistry,
University of Alberta, Edmonton, Alta T6G 2G2, Canada,1984.
Safety in the Chemical Laboratory, American Chemical Society, Easton PA, 1981.
Toxicology laboratory Hazards, in Hazardous Material Toxicology. Clinical Principles of

Environmental Health. Ed. Sullivan, Jr. and Krieger. Willians & Wilkins 1992.
Health Aspects of Chemical Safety – Emergency Response to Chemical Accidents – WHO/IPCS,

1981.
Hospital Preparedness for Chemical Accidents. Young, L Plant Technology and Safety
Management Series No. 3, 1990.
Guiding Principles for Chemical Accident. Prevention, Preparedness and Response OECD, Paris
1992.
Accidentes químicos: aspectos relativos a la salud. Guía para la preparación y respuesta.

IPCS/PNUMA – OIT – OMS, OCDE. 1998.
Medical Management Guidelines for Acute Chemical Exposures, U.S. Department of Health &
Human Services Volume III. San Rafael, ATSDR, 1992.
Capítulo 2.
Recolección y almacenamiento de las muestras en el
laboratorio de toxicología clínica y forense.
Autor: Dr. Luis Alberto Ferrari. Catedrático de Toxicología y Química Legal en la
Universidad de Morón. Perito Químico Judicial.
Introducción.
En la actualidad, el laboratorio de toxicología se encuentra con un gran número de

muestras biológicas conteniendo sustancias en concentraciones al nivel de trazas. La
investigación para analitos desconocidos se lleva a cabo mediante la denominada marcha
sistemática toxicológica. La adecuada elección, recolección y envío de las muestras es de
fundamental importancia ya que la calidad de un resultado nunca puede ser mejor que el de la
muestra.
Para la determinación de los diferentes tóxicos suelen emplearse con mayor frecuencia
muestras biológicas como orina, sangre, contenido estomacal y vísceras en casos forenses.
También el pelo, la saliva y las uñas están siendo hoy en día consideradas como matrices
alternativas de gran importancia en el análisis toxicológico.
Para la recolección de la muestra se debe proporcionar instrucciones detalladas a las

personas o entidades encargadas, las cuales deben incluir el tipo y la cantidad mínima
requerida, tipo y cantidad de conservante que se debe añadir, la forma de etiquetado de los
contenedores y las condiciones de empaquetado y transporte.
A continuación se describen los procedimientos necesarios para la toma de muestra

destinadas al laboratorio de toxicología clínica y a las destinadas a un laboratorio pericial.
2.1 Recolección y almacenamiento de las muestras en el laboratorio

de toxicología clínica.
La toma de muestra para un laboratorio de toxicología clínica es de vital importancia para

lograr una adecuada identificación y cuantificación posterior.
El tipo de muestra analizada debe ser identificada con el nombre completo del paciente, el
día y hora de recolección así como la naturaleza de la muestra aunque sea evidente. Esto
resulta importante si gran número de pacientes han sido afectados en un accidente o cuando se
obtienen varias muestras del mismo paciente. Todas las muestras biológicas deben ser
almacenadas a 4 ºC previo al análisis y mantenidas a 4 ºC durante 3 a 4 semanas en el caso en
que se requieran futuros análisis. En los casos de implicancias médico legales la muestra a
analizar debe ser almacenada a –20ºC hasta que la investigación haya concluido.
La disponibilidad del material biológico es un punto importante a considerar. La elección

de la muestra esta estrechamente vinculada con la toxicodinámica del analito buscado.
Mediante el conocimiento de su distribución, metabolismo y eliminación se han diseñado
técnicas analíticas orientadas a la búsqueda de la droga madre y/o sus metabolitos para su
identificación y si fuera necesario, su cuantificación.
Por otra parte, la vinculación entre el caso clínico y el analista es de vital importancia
para los resultados del análisis toxicológico. Idealmente esta relación debe comenzar antes que
la muestra sea recolectada indicando algún requerimiento especial en algunos casos para la
toma de muestra.
Antes de empezar un análisis es importante conocer, en la medida de lo posible,

información acerca del paciente (tiempo transcurrido entre la ingestión o exposición al
tratamiento médico, la recolección de la muestra, resultados de laboratorio en ensayos clínicos,
la sintomatología y las características sociales, ocupacionales y cualquier otro dato que pudiera
recabarse, ya que ello condiciona la interpretación de los resultados.
La muestra de orina se encuentra disponible en gran cantidad y generalmente contiene

mayor concentración de drogas u otros venenos que la sangre. La presencia de metabolitos
puede ayudar a la identificación cuando se emplean técnicas cromatográficas. Para un adulto,
se requieren un mínimo de 50 ml de orina que debe ser recolectado en un recipiente sellado,
estéril y sin agregado de preservadores. La muestra debe ser tomada tan rápido como sea
posible, de preferencia antes del inicio de tratamiento terapéutico. Sin embargo, ciertas drogas
tales como los antidepresivos tricíclicos (amitriptilina, imipramina) causan retención urinaria y
una toma de muestra muy temprana puede contener cantidades no detectables de droga.
Contrariamente, una pequeña cantidad de sustancias tóxicas pueden encontrarse luego de
algunas horas o días de producida la intoxicación como en el caso de una intoxicación con
paracetamol.
Las muestras de orina también resultan óptimas para la marcha sistemática tendiente a
determinar drogas de abuso entre las que se incluyen cocaína, anfetaminas, opiáceos,
barbitúricos, benzodiacepinas. Puede requerirse orina de 24 hs. o una única micción con un
mínimo de 50 ml. Para la determinación de psicofármacos (antidepresivos tricíclicos,
fenotiazinas, butiferonas, dibenzacepinas, anfetaminas, anticonvulsivantes, opiáceos,
barbitúricos y benzodiacepinas) la muestra de elección también es la orina de 24 hs pudiendo
también determinarse en una única micción de 50 ml. Para estos últimos casos (drogas de
abuso y psicofármacos) las muestras de orina deben ser llevadas lo antes posible al laboratorio
pudiendo permanecer hasta un máximo de 5 días en refrigeración.
Para la determinación de marihuana (cuyo principio activo es el tetrahidrocanabinol) en

muestras de orina esta debe recolectarse durante 24 hs. y puede ser almacenada durante 15
días en refrigeración y de 4 a 6 meses bajo congelación. También las muestras de orina son
excelentes matrices para determinar fenoles requiriéndose orina de 24 horas, siendo su
conservación de hasta 6 meses en refrigeración si se agrega ácido acético al 1%.
En el caso de los metales, debido a la eliminación circadiana que presentan muchos de

ellos (As, Hg, Cu, Cr, Tl y Pb), se prefiere su estudio en muestras de orina de 24 horas. En
general las muestras de orina pueden ser tomadas en recipientes comunes limpios, a excepción
de la determinación de plomo (el recipiente que debe ser tratado con ácido nítrico 1:1 durante 24
hs y luego enjuagado escrupulosamente con agua bidestilada para eliminar posibles impurezas).
Para la determinación de coproporfirinas totales en orina (indicadores de exposición a plomo) las
muestras corresponden a orina de 24 horas que debe ser recolectada en un frasco oscuro
conteniendo carbonato de sodio como conservador en cantidad suficiente para una
concentración final de 0,1 – 0,5%. Para la determinación de ácido delta amino levulínico (δ-ALA,
marcador biológico de exposición al plomo) se requiere orina de 24 de horas recolectada en
frasco oscuro conteniendo solución saturada de ácido tartárico aproximadamente 1 ml/ 100 ml
de orina. Su conservación debe realizarse en refrigeración por un máximo de 7 días siendo el
pH no superior a 10.
Otro tipo de muestras utilizadas en la toxicología clínica son las de sangre. Las muestras
de sangre (plasma o suero) son generalmente empleadas para los análisis cuantitativos de
algunas sustancias tóxicas como el monóxido de carbono y plomo, siendo un volumen adecuado
10 ml de muestra con heparina. Para la determinación del monóxido de carbono en sangre la
muestra puede obtenerse y conservarse en jeringa heparinizada pudiendo mantenerse durante
3 días a temperatura ambiente o en refrigeración. En este caso hemos notado que el análisis
mediante cooximetría presenta dificultades por taponamiento del sistema tubular de recolección
de sangre entera en muestras con más de 48 horas desde la toma de muestra.
Para el análisis de alcohol (etanol, metanol y otros alcoholes) en sangre, se requiere al
menos de 2 ml de sangre en un tubo que contenga oxalato o fluoruro para su conservación
pudiendo mantenerse refrigerada durante 15 días. El espacio de aire superior entre la sangre y
el tubo (headspace) debe ser mínimo si se debe analizar una muestra en la que se sospecha
una intoxicación con monóxido, ácido cianhídrico o si se desea calcular el alcohol en sangre de
un individuo.
Las muestras de sangre también pueden ser requeridas para algunos metales como el
cadmio, plomo, cromo o litio colectándose en jeringa heparinizada pudiendo conservarse hasta 7
días a temperatura ambiente. La determinación de δ-ALA dehidratasa debe ser realizada en
sangre tomada en jeringa heparinizada siendo trasladada rápidamente al laboratorio (no más de
2 o 3 horas). El plomo es un caso particular, debido a que se requiere un conjunto de ensayos
conocidos como perfil plúmbico en el cual para la realización del diagnóstico es necesario incluir
las determinaciones de plomo en orina, sangre, la enzima delta ala dehidratasa en sangre así
como ácido delta aminolevulínico y coproporfirinas en orina obtenida como fue anteriormente
descripto.
El monitoreo de drogas terapéuticas se realiza en el suero o plasma debido a que la

concentración en la circulación es el parámetro de importancia.
Los plaguicidas organoclorados pueden ser analizados en sangre tomada en jeringa

heparinizada en el cual el paciente requiere ayuno no menor de 8 horas, pudiendo las muestras
conservarse en refrigeración durante 1 mes o 3 meses en condiciones de congelación. Los
pesticidas de tipo organofosforados pueden ser determinados de manera sencilla en forma
indirecta mediante la medición de la actividad de las colinesterasas en sangre no hemolizadas.
La determinación de la colinesterasa eritrocitaria o sérica se realiza sobre una muestra

de sangre con anticoagulante, plasma o el paquete celular luego de una centrifugación. La
muestra de sangre debe ser trasladada al laboratorio dentro de las 6 hs de extraída o bien si es
plasma puede ser conservada durante 4 días en refrigeración o 7 días en congelación.
Otro tipo de muestras utilizadas son las de contenido estomacal. Estas pueden incluir
vómito, aspirado gástrico o lavado estomacal. Es importante obtener la primera muestra del
lavado, mientras que la última puede contener escasa cantidad del tóxico. Se requiere al menos
un volumen de 20 ml sin agregado de preservadores para realizar un amplio rango de ensayos.
Las muestras de contenido estomacal pueden ser muy variables y requieren procedimientos
adicionales como ser filtración y/o centrifugación para realizar los análisis. En general, cuando
ha transcurrido más de una hora de la ingestión esta muestra carece de utilidad debido al
vaciado natural del estómago.
Las matrices alternativas como las muestras de cabello han adquirido importancia en los
últimos años debido a las ventajas que presentan respecto de las muestras tradicionales de
sangre y orina. Entre las ventajas se describe el hecho que las drogas o sus metabolitos
permanecen en el pelo un amplio período de tiempo (semanas a meses) respecto de las
matrices tradicionales. Por otra parte, las muestras de pelo son estables indefinidamente,
presenta una forma simple de recolección, no siendo un método invasivo. El análisis en pelo ha
sido aplicado con éxito al análisis de drogas antipsicóticas como haloperidol, en pacientes en
hospitales psiquiátricos. No obstante su uso en clínica sigue siendo restringido hasta hoy, dado
que pocos fármacos han sido suficientemente estudiados para establecer correlaciones entre
concentración en pelo versus dosis administradas.
Una amplia variedad de drogas de abuso (cocaína, opiáceos, anfetaminas, cannabinoles

y fenciclidina) han sido determinadas en pelo humano. Además el análisis en pelo permite
diferenciar entre una exposición ambiental y el uso activo de las drogas mediante la
cuantificación correspondiente. Asimismo, permite también conocer la cronología del consumo
analizando diferentes segmentos a diferentes distancias del origen (folículo piloso).
En los últimos años se ha prestado interés al estudio de ciertas drogas en muestras de

uñas debido a su similitud con las muestras de pelo ya que muchos tóxicos suelen acumularse
en dichas matrices. Se ha estudiado las uñas como matriz para la para investigación de drogas
de abuso durante períodos prolongados así como en los exámenes forenses. Las drogas
principalmente estudiadas han sido metanfetaminas y cocaína.
Recientemente se ha informado sobre la detección de algunas drogas de abuso y

psicotrópicos en médula ósea y ciertos huesos, como los de la cresta ilíaca. Inclusive se ha
detectado cocaetileno, especie química indubitable del consumo conjunto de cocaína y etanol.
Por último, también otros fluidos biológicos han concentrado el interés forense como la
saliva, sudor, líquido cefalorraquídeo y líquido amniótico pero su empleo como material para la
extracción de drogas se encuentra en etapas de desarrollo.
La cadena de custodia debe empezar en el momento de la toma de muestra. La cadena

de custodia incluye a los procedimientos que deben quedar por escrito en la documentación
referidos a cualquier manipulación o transporte de la muestra desde un individuo o lugar a otro,
así como intentar minimizar en lo posible el número de personas que manipulen la muestra.
En capítulos adjuntos se analiza con detalle la toma de muestra y su conservación para

cada grupo de tóxicos que se presentan en un laboratorio de toxicología así como para
muestras vinculadas con la toxicología legal.
2.2 Toma y remisión de Muestras en el Análisis Toxicológico

Forense.
La adecuada selección, recolección, preservación y envío de especimenes biológicos y

cualquier otra muestra con el propósito de una investigación toxicológica forense es sumamente
importante. El éxito de un estudio analítico y su interpretación dependen en gran parte de esta
etapa.
Es cierto que no todo estudio analítico toxicológico en la esfera clínica debe concluir
necesariamente en el ámbito forense. No obstante los casos de resonancia pública acaecidos
en las dos últimas décadas nos han enseñado a movernos con prudencia en este sentido. Es
decir, la posibilidad que estos estudios terminen debatiéndose en un estrado judicial.
Cada laboratorio debe dar instrucciones precisas sobre el tipo de matriz que debe
recolectarse y su cantidad mínima necesaria (según la metodología que aplicará) que contemple
una muestra adicional para repetición del análisis, si este fuera requerido con posterioridad.
La información básica que debe consignarse para casos de análisis post-mortem incluye
un informe de autopsia minucioso, indicando los mínimos detalles de la observación
macroscópica.
-Historia Clínica (especialmente en casos mala praxis).

-Drogas que se piensa o se sabe que consumía el individuo antes de morir.
-Profesión ó actividad laboral que desarrollaba.
-Síntomas ó conducta que presentaba el individuo antes de fallecer.
Debe remitirse también todo efecto que se estime pudo estar relacionado con el deceso de
la víctima, como ropas contaminadas u objetos encontrados en el lugar del hecho.
En caso de individuos vivos, consignar todo dato aportado por el mismo paciente o
familiares, tipo de tareas que desarrolla, hábitos alimentarios, etc. El profesional médico debería
expresar sus sospechas, aunque no las considere relevantes. Téngase en cuenta que el analista
se vale mucho de esas observaciones para poner énfasis en la búsqueda de una o varias
sustancias y sus congéneres. Más aún, cuando no se tiene una orientación bien definida al
respecto.
En el ámbito legal, las muestras remitidas pueden ser divididas en diferentes áreas según
sea el estudio posterior que se llevará a cabo:
1) análisis toxicológicos,
2) estudios inmunohematológicos,
3) análisis anátomo-patológicos y
4) estudios en química ambiental.
A continuación se describen las muestras con énfasis en el modo de recolección y

almacenamiento de los materiales biológicos.
2. 3 Análisis toxicológico forense.
Para la realización de los estudios toxicológicos forense, el tipo de muestras habitualmente

remitidas en caso de individuos fallecidos puede ser: sangre, orina, vísceras, pulmón, corazón,
cerebro, tráquea, hígado, riñón, bazo, tejido adiposo (grasa), pelo (pericraneal, púbico, axilar),
uñas, humor vítreo, bilis.
Es importante que el profesional que intervenga en la toma de muestra seleccione
aquéllas que, según la anamnesis, ofrezcan mayor posibilidad de detectar el compuesto que se
presuma involucrado en el caso.
El tipo de muestras que puede obtenerse en individuos vivos incluye sangre o suero, orina,
vómito o aspirado gástrico, pelos, uñas, saliva. La selección de algunas de estas matrices queda
supeditada a la disponibilidad de las mismas o bien al tipo de tóxico sospechado y sus
características farmacocinéticas.
A continuación se describe la forma que consideramos correcta de remitir el material
biológico para estudio.
2.3.1 Vísceras.
Deben colocarse en recipientes rigurosamente limpios, sin agregado de ningún tipo de

sustancia con fines de preservación ú otro motivo, especialmente formol. Si pudiera disponerse
de un recipiente para cada órgano sería ideal, pero se acepta en la práctica colocarlos de la
siguiente manera: recipiente I para cerebro, recipiente II para hígado, riñón y bazo, recipiente III
para pulmón y corazón, y recipiente IV para estómago y su contenido.
Dichos recipientes pueden ser de vidrio incoloro, pero sería más apropiado disponer de
frascos de vidrio color caramelo, especialmente para sustancias fotosensibles. El cierre debe ser
hermético. Si no es posible debe sellarse con parafina. Evitar tapas de papel o cartón. Pueden
utilizarse recipientes plásticos con tapas del mismo material que permitan un cierre hermético.
El lacrado excesivo de los recipientes conteniendo líquidos debe evitarse debido a que
durante las maniobras de apertura resulta común la caída del lacre dentro del líquido,
contaminando los extractos.
Los frascos mencionados deben colocarse dentro de bolsas plásticas capaces de cerrarse
herméticamente por algún medio, por ejemplo el calor. Actualmente se encuentran disponibles
bolsas plásticas de distintos tamaños con un tipo de cierre inviolable. Ello indica que en el caso
de pretender abrir los recipientes ya cerrados, se destruye el soporte permitiendo de este modo
detectar las maniobras dolosas de apertura.
Una vez embaladas, deben rotularse correctamente con iniciales o numeraciones internas
del laboratorio que no den lugar a confusión, utilizando tinta firme resistentes a soluciones
acuosas. Es conveniente colocar las bolsas en recipientes apropiados (por ejemplo cajas de
cartón resistentes) asegurando que los recipientes contenidos no puedan sufrir roturas durante
el traslado al laboratorio.
Las muestras deben colocarse finalmente en refrigerador a 4°C. La temperatura ideal es –

20ºC, donde la actividad enzimática en los sistemas biológicos se halla prácticamente
paralizada. Sin embargo, debe recordarse que la congelación produce expansión del volumen
de líquidos y tejidos, produciendo la rotura de envases de vidrio. En general se debe respetar un
volumen libre de al menos un tercio para dar lugar a la expansión del material. Estudios de
degradación de analitos mostraron que a estas temperaturas los tejidos y humores biológicos
sufren poca pérdida de los mismos por biotransformación. Sin embargo debe considerarse a
cada analito como particular en al ámbito biológico donde se halla.
Es necesario enviar la muestra lo antes posible al laboratorio, evitando interrumpir la
cadena de frío durante el traslado. Si deben recorrerse grandes distancias, pueden utilizarse
recipientes de telgopor con hielo en su interior o bien utilizar bidones refrigerantes, evitando el
contacto directo de los mismos con las muestras.
2.3.2 Sangre.
Los recipientes para enviar muestras de sangre pueden ser frascos, preferiblemente
pequeños, con su respectiva tapa para lograr cierre hermético ó bien tubos de ensayo con cierre
perfecto. Debería agregarse en la mayoría de los casos, fluoruro de sodio como preservador,
aunque si es refrigerada y llevada rápidamente al laboratorio no es imprescindible. Se necesitan
como mínimo 10 ml para someter este fluido a estudio toxicológico general y 2 ml para estudio
de alcoholemia (esto si se cuenta con cromatógrafo gaseoso ó se aplica la técnica de
microdifusión).
Cuando se envasa sangre ó suero, no debe quedar espacio vacío en el recipiente, es decir
se debe evitar cámara de aire, que produce pérdidas importantes no sólo de etanol sino de
cualquier otro tóxico volátil. Para evitar esto, debe llenarse al ras, cubrir con tapa en forma
correctamente ajustada y si es posible, sellarse con precinto de aluminio (como los viales de
medicamentos inyectables).
Un procedimiento correcto en la toma de muestra consiste en no enjuagar con alcohol los

recipientes que se propone utilizar para colocar las muestras de sangre ó suero. Tampoco debe
utilizarse este solvente para desinfectar la piel del individuo al que se extrae muestra hemática
para análisis de alcoholemia.
Es recomendable no solicitar frascos pequeños en Hospitales ó Unidades Sanitarias

debido a que muchas veces quedan restos de medicamentos que no se extraen con lavado
“casero”, provocando confusiones en el ulterior estudio analítico. En los casos de extracciones a
imputados de un ilícito, se recomienda la extracción de por lo menos dos muestras sanguíneas
consecutivas, con un intervalo de una hora entre ambas extracciones. Debe anotarse la hora y
rotularse claramente (esto resulta importante para determinación de alcoholemia retrospectiva).
2.3.3 Orina.
La toma de muestra de orina se realiza en forma similar a la recolección sanguínea,

obviamente colocada en recipientes de mayor capacidad. Debe enviarse como mínimo 10 ml,
pero es conveniente remitir toda la existente en vejiga en casos post-mortem o la emitida por
individuo vivo, durante 24 hs. Se debe rotular y cerrar perfectamente. Debe indicarse mes, día y
hora de emisión ó recolección y fecha y hora de una dada circunstancia por la que se le pide la
determinación (determinación de cocaína o metabolitos). No debe agregarse ninguna sustancia
como conservante y debe refrigerarse a 4°C.
2.3.4 Pelo.
Para la recolección de las muestras pilosas debe cortarse en sector occipital (coronilla)
bien al ras del cuero cabelludo, en lo posible 1 ó 2 grs. (en la práctica un puñado o mechón es
suficiente). Tomar el extremo cercano al cuero cabelludo y colocarlo sobre el papel ó cartón para
luego abrochar con aplique de broches de tamaño apropiado y colocar otro papel o cartón
encima del anterior. Luego, pegar o atar según corresponda siendo aconsejable resguardarlo de
la luz en papel de aluminio. El envoltorio debe permanecer firme y debe indicarse claramente la
zona cercana al cuero cabelludo y la distal.
Para el caso de requerir determinación de drogas en vello pubiano y axilar, este debe ser
cortado al ras de la piel y colocarlo en sobre de papel común. Si la muestra se toma de un
individuo fallecido es aconsejable arrancar el pelo para obtener el bulbo piloso mejorando las
posibilidades de detección retrospectiva de ingesta.
2.3.5 Restos óseos.
Para realizar las determinaciones toxicológicas en restos óseos, las muestras deben
remitirse en cajas ó bolsas de cartón cerradas. Si las piezas óseas halladas estuvieran
húmedas, se deben dejar secar a la sombra y recién luego enviarlas en sobres de papel
cerrados.
Generalmente se utilizan huesos procedentes de la cresta ilìaca o bien huesos largos
como femur.
Investigaciones muy recientes han mostrado la importancia de este tejido en casos
postmortem (McGrath & Jenkins, 2004). Inclusive ciertas drogas que no fueron halladas en
sangre fueron detectadas en hueso (nortramadol, quinina, cocaetileno, además de otros
psicotrópicos).
2.3.6 Prendas para la investigación de pólvora.
Tanto los residuos como las partículas de pólvora parcialmente quemadas, se depositarán
sobre una superficie en una disposición definida, dependiendo de la distancia que existe entre el
blanco y la boca del cañón. Cuando se trata de disparos de contacto deberán examinarse todas
las ropas que se hallan en el camino del proyectil.
Existen numerosos factores que afectan la retención de residuos sobre la prenda de modo
que el valor de prueba queda condicionado al seguimiento estricto de los pasos detallados en el
instructivo:
1. Las prendas de la víctima deben ser retiradas en forma lenta y por sectores. De no ser
posible, se sugiere cortar las mismas por zonas que no comprometan orificios y/o desgarros que
han de ser fundamentales para el análisis.
2. Si existieran manchas de sangre húmeda deben secarse al aire ó con corriente tibia de aire y
flujo débil.
3. Las prendas deben colocarse una por una, en forma separada, entre dos planchas de cartón
perfectamente dispuestas, atadas con hilo, evitando roces ó corrimientos, principalmente en las
zonas donde hay presunción de existencia de residuos de fulminante ó esquirlas de bala.
Resulta importante asegurar el área a analizar.
2.3.7. Estudios inmunohematológicos.
La toma de muestra para estudios inmunohematológicos tiene como objetivo la

identificación en cadáveres y/o individuos, de manchas de sangre y manchas de semen.
La recolección de muestras para la identificación de cadáveres y/o individuos puede
obtenerse en distintas circunstancias. Una de las posibilidades puede ser mediante el
procedimiento de autopsia (cadáveres), obteniendo una muestra sanguínea de
aproximadamente 15 ml por punción intracardíaca directa, utilizando aguja y jeringa
descartables (estériles y secas). Luego se envasa la muestra en tubo cónico, con tapa a rosca,
con sus respectivos rótulos y demás garantías de ley y se mantiene refrigerada entre 4 y 6ºC (no
debe congelarse). En aquellos casos en los cuales sobre la misma muestra se solicita la
determinación de alcoholemia, el anticoagulante a emplear debe ser el fluoruro de sodio en una
concentración de 15 mg/ml, debiéndose observar la misma norma que para el caso anterior y
conservarla entre 4 - 6ºC.
2.3.8 Recolección de muestras para la identificación de manchas

biológicas.
Un hecho fundamental en el análisis de este tipo de muestras lo constituye el proceso de

obtención y su posterior conservación. Una inadecuada recolección y/o mala preservación
puede alterar este tipo de evidencias, a tal punto que no sólo dificultarían sino que directamente
imposibilitarían este tipo de pericias ya que los elementos a evaluar son en general sumamente
lábiles.
2.3.9 Manchas de sangre.
En un principio, estas manchas poseen un color rojo brillante que paulatinamente

cambiará a una tonalidad pardo-rojiza. Para su levantamiento, un elemento a tener en cuenta
es el tipo de superficie sobre la cual se encuentra asentada.
Si el soporte no es absorbente, luego de una minuciosa descripción de la distribución,

posición y forma de las manchas (es de suma utilidad la obtención de fotografías), se puede
proceder a poner en contacto la mancha con una gasa apenas húmeda en solución fisiológica,
trasladándola posteriormente a un tubo cónico con tapa a rosca especialmente si la cantidad es
escasa ó eventualmente, a una cápsula de Petri, descartable. A continuación y en un lugar
adecuado, se dejará secar la gasa, pudiendo usarse un secador de cabello con aire frío. Luego
el material será rotulado, lacrado e individualizado de modo tal que pueda identificarse
claramente de dónde fue obtenida cada una de las muestras y cumpla con las garantías. Debe
conservarse seco en lugar refrigerado.
Si la superficie es absorbente, por ejemplo una alfombra, cortinas, colchones, etc, se

evaluará la conveniencia de proceder a cortar la mancha o bien el envío del material en cuestión
al laboratorio, siempre respetando, de ser necesario, las condiciones de secado previamente
citadas.
Si las manchas están asentadas sobre prendas, las mismas se dejarán secar en iguales
condiciones a las ya expuestas, extendiéndola sobre bastidores ó superficies adecuadas,
evitando el doblado, ya que podrían mancharse zonas que, en un principio, no lo estaban,
alterando así la evidencia original. Una vez seco, se debe envolver por separado, prenda por
prenda, en papel madera y proceder a continuación conforme a las garantías de ley.
Finalmente, cuando se trata de sangre no coagulada se pueden seguir dos

procedimientos. El primero de ellos consiste en tomar con una pipeta Pasteur ó bien con una
jeringa, un volumen determinado de sangre (3 ml) y colocarlos en un tubo de ensayo ó frasco
conteniendo igual cantidad de solución fisiológica. La segunda posibilidad consiste en colocar
una tela de algodón ó papel de filtro de modo tal que absorba dicho fluido el cual sería secado a
continuación según las condiciones ya descriptas. En ésta operación el elemento absorbente
será sostenido con pinzas adecuadas para tal fin. Finalizadas las operaciones enunciadas
precedentemente, se procederá a rotular y lacrar el material obtenido. También puede sugerirse
la realización de extendidos sobre porta objetos de vidrio.
2.3.10 Manchas de semen.
El elemento de importancia es el espermatozoide y su observación en forma completa es

prueba irrefutable de la presencia de esperma. Dicha célula es muy lábil, siendo habitual que la
cabeza se separe de la cola, imposibilitando el diagnóstico. Es menester secar las prendas, ya
que la humedad afecta los espermatozoides. En caso de obtener hisopados deben colocarse en
tubos de ensayo ó cónicos con tapa a rosca (limpios, secos y estériles).
Realizar extendidos sobre porta objetos de vidrio, dejar secar y luego envolverlos con
papel, separando uno de otro y rotular para su posterior identificación, cumplimentando en todos
los casos las garantías de ley.
2.4 Recolección de muestras para análisis en química ambiental.
A continuación se describen los procedimientos que deben seguirse para la correcta toma
de muestras de tipo ambiental (aguas, barros, sedimentos y efluentes industriales) donde se
excluyen las muestras de tipo aire dado la complejidad de las mismas en cuanto a
equipamiento, instrumental y variedad de posibilidades.
2.4.1 Muestreo, preservación y almacenamiento de muestras de agua.
El correcto resultado de una determinación no depende tan sólo del análisis propiamente
dicho. Esto se logra asegurándose una buena recolección de la muestra y una eficaz
preservación hasta el momento de su análisis. Ciertos parámetros conviene determinarlos in
situ, por ejemplo: temperatura, gases disueltos, pH, cloro residual, turbidez y color. Es muy
importante que la muestra obtenida sea representativa del curso de agua a analizar.
En todos los casos, aunque los frascos estén perfectamente limpios, deben ser
enjuagados con la muestra 3 ó 4 veces.
Es de suma importancia que al entregar una muestra al laboratorio, el frasco esté bien
rotulado, consignando en él la fecha y hora del muestreo, la localización y el nombre del
operador. Es conveniente que la solicitud de análisis llegue al laboratorio acompañada de una
planilla donde se encuentren los datos obtenidos en campo.
2.4.2 Toma de muestras de aguas para examen bacteriológico.
Una muestra mal extraída llevará a conclusiones erróneas en lo referente a la calidad del
agua que pretende representar.
Para el caso de muestras de agua obtenidas de grifo, debe elegirse aquel que esté
comunicado directamente a la cañería de distribución, es decir, que el ramal en que se
encuentre el grifo no debe estar conectado con tanques domiciliarios, filtros, ablandadores ú
otros artefactos similares.
Los procedimientos que se realizan en la rutina de la toma de muestra de agua
comprenden:
- Limpiar la boca del grifo.
- Abrir el grifo totalmente y dejar fluir el agua durante 5 minutos.
- Cerrar el grifo.
- Esterilizar el grifo calentando la boca del mismo durante 2 minutos con llama de una lámpara
de alcohol ó con un hisopo de algodón embebido en alcohol.
- Abrir nuevamente el grifo y dejar fluir el agua durante 10 minutos.
- Destapar cuidadosamente el frasco evitando todo contacto de los dedos con la boca del mismo
y con la tapa.
- Llenar el frasco, colocar la tapa inmediatamente.
- Rotular y remitir refrigerado a 4ºC, de inmediato al Laboratorio.
Para el caso de un grifo situado en la cañería de un pozo semisurgente, se debe abrir el
grifo y dejar fluir el agua durante 30 minutos (si se trata de un pozo de uso continuo) o durante 5
horas (si se trata de un pozo que se utiliza poco ó si está fuera de servicio). A continuación
proceder según la técnica detallada anteriormente.
2.4.3 Toma de muestras de aguas para examen físico-químico.
En este caso se debe tomar en cantidad suficiente (generalmente 1 litro) de muestra y

envasarla en un recipiente limpio Los recipientes no deben necesariamente estar esterilizados.
Rotular y remitir al laboratorio.
2.4.4 Toma de Muestra de barros ó sedimentos.
En todos los casos deben tomarse los mismos en frascos de boca ancha, debidamente
identificados con rótulos a tal fin. Remitir al Laboratorio sin preservante de ningún tipo. La
cantidad a recoger será de unos 300 grs. Tomar la muestra con espátulas ó dispositivo ad-hoc.
2.4.5 Toma de muestra de efluentes industriales.
Debe tomarse la muestra a la salida del establecimiento en cantidad acorde a los

parámetros a medir y utilizar los envases según indicación del perito. Enjuagar varias veces el
recipiente con el líquido del efluente. Remitir la muestra al Laboratorio rotulada.
Bibliografía.
La evidencia Medico-legal en delitos contra las personas y muertes violentas. Ferrari L. A. en

Laguens R. M. Editorial S.C.J.B.A, 2000.
Instructivo para tomas de muestra para análisis toxicológicos clínicos. López, C. M. Red
REDARTOX, Argentina, 2001.
Laboratory Guidelines for toxicological analysis. de Zeeuw R. A. et al. Bull. The Int. Assoc. For.
Toxicologists, 31 (4) 23-26, 2001.
Postmortem production of Ethanol and factors that influence interpretation. A critical review.
O’Neal, C; Poklis, A. The Am. Journal For. Med and Pathol., 17 (1) 8-20, 1996
Pelos y uñas como herrarmientas en el estudio de drogas de uso indebido. Ferrari, L.A; Arado
M.G. Actas de las 1ras Jornadas Toxicológicas del Interior. Ed. por el Colegio Bioquímico de
Córdoba., p.35-39, 2000.
Pre-analytical aspects in postmortem toxicology: Skoop, G. Forensic Sci. Int. 142, 75-100, 2004
Stability of drugs postmortem: a review. Drummer O. H. Proceedings 35th TIAFT meetings.

University of Padova, 13-18, 1997.
Clarke’s analysis of drugs and poisons. Widdop, Moffat, Osselton Eds. Vol I. Pharmaceutical
press, 2004.
Analysis of postmortem bone/bone marrow specimens for drugs of importance in forensic

toxicology. McGrath K & Jenkins, A. Justice & Health p.362, 2004
Guía de toma de muestra, conservación, transporte y análisis toxicológico. Resol. 650/02 del
Ministerio de Salud de la Nación, 2002
Capítulo 3
Toxicología Analítica.
Autores:
Dra. Leda Giannuzzi.
Profesora Adjunta de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP.
Bioq. Angeles de Cristófano.
Profesional del Laboratorio de Control Antidoping dependiente de Lotería de la Provincia de
Buenos Aires.
Bioq. Cristian Oliver.
Perito de la Sección de Toxicología del Laboratorio Químico Pericial de la Dirección General de
Policía Científica de la Policía de la Provincia de Buenos Aires.
Docente de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP.
3. Introducción.
En el contexto de las Ciencias Forenses la Toxicología Analítica se halla directamente

involucrada en diversos aspectos de la toxicología experimental y aplicada.
En el presente manual se describirán las técnicas usadas en la determinación de tóxicos

gaseosos y volátiles (monóxido de carbono, ácido cianhídrico y cianuros, alcoholes, etc.) y
tóxicos orgánicos no volátiles (drogas, tanto prescriptas como ilegales, pesticidas, toxinas, etc) y
metales. Los últimos capítulos están dedicados a la Química Legal (explosivos, semen, sangre,
tinta). Esta clasificación se relaciona estrechamente con los métodos para separar los agentes
tóxicos de la matriz en la que se encuentran. El agente de interés puede existir en una solución
simple o puede estar unido a proteínas u otros constituyentes celulares. El objetivo es separar el
agente tóxico en cantidad y pureza suficientes para permitir su caracterización y cuantificación.
A su vez el compuesto madre no siempre está presente en cantidades importantes como para
ser separado y los metabolitos conocidos pueden proveer indirectamente la información de la
sustancia madre. Sólo recientemente han surgido métodos disponibles que permiten la medida
directa de algunos analitos sin la separación previa de su matriz.
El procedimiento analítico toxicológico incluye usualmente dos pasos. El primero

consiste en realizar un análisis preliminar que permite identificar las muestras negativas, que no
contienen el analito o alguno de sus metabolitos de las drogas u otros tóxicos que pudieran estar
presentes en la muestra (pruebas de screening o tamizado). El segundo paso involucra la
confirmación de la identidad de las sustancias presentes en las muestras positivas.
Las pruebas de screening proveen sólo resultados preliminares y tienen poder de
decisión. Indican claramente la ausencia de una droga, es decir, no informan falsos negativos.
Sin embargo, un resultado positivo debe ser confirmado por otro método específico. Siempre
debe realizarse al mismo tiempo que se analiza la muestra un control positivo y uno negativo.
Un control negativo (blanco) ayuda a asegurar que falsos positivos (por ejemplo contaminación
con reactivos o material de vidrio con el analito en cuestión o la presencia de componentes de la
muestra) no sea obtenido. Igualmente, la inclusión de un falso positivo sirve para asegurar que
los reactivos han sido preparados en forma correcta y han mantenido su estabilidad. Un
resultado sospechoso falso positivo debe ser repetido usando material de vidrio correctamente
lavado y enjuagado finalmente con agua bidestilada. En toda circunstancia los ensayos de
comprobación deben realizarse sobre una nueva alícuota de la muestra, lo cual implica que en
el momento de decidir que ensayos van a realizarse debe considerarse reservar un volumen
adecuado para confirmar el resultado.
El material de vidrio debe estar escrupulosamente lavado a efectos de evitar

contaminaciones inesperadas. Así, el material de vidrio debe ser tratado por inmersión en
solución sulfocrómica (ácido sulfúrico concentrado densidad 1,83 conteniendo 100 g/litro de
dicromato de potasio (ácido/dicromato, ácido crómico) uno o dos días y luego sometido a un
profundo enjuague. Los ensayos de tamizado o preliminares emplean generalmente técnicas
inmunoquímicas debido a la rapidez y su aplicación a un amplio rango de analitos.
El segundo paso anteriormente descrito se refiere a la confirmación que permite asegurar

la exactitud y fiabilidad del resultado. Este paso se realiza mediante técnicas basadas en
principios físico-químicos diferentes de las usadas para la identificación y deben involucrar
técnicas estructurales (espectrometría de masa, infrarrojo, NMR) y al menos tan sensibles como
las de screening. Así, la cromatografía de gases o cromatografía líquida de alta presión (HPLC)
son las que generalmente se emplean en este paso. Se recomienda el uso de la espectrometría
de masas (MS) acoplada bien a la cromatografía de gases (GC/MS) o a la cromatografía líquida
(HPLC/MS) para aumentar la sensibilidad y especificidad del análisis.
La cuantificación emplea métodos específicos y sustancias de referencia certificadas así

como estándares internos. Estos últimos son sustancias que deben poseer característica física y
química similar posible al analito. Por este motivo, en los análisis por GC/MS son ideales las
sustancias deuteradas de los analitos en estudio como estándares internos. Estos compuestos
se deben añadir al principio del procesado de la muestra y siempre antes de someterla a una
extracción con el objeto de evaluar la recuperación del método. Los marcadores que se añaden
después de la extracción se conocen como patrones externos.
La elección de un método analítico se realiza en función del menor número de errores

aleatorios o sistemáticos que pueda generar y debe ser vigilado por el programa de Garantía de
Calidad. Previamente debe realizarse una revisión bibliográfica y se deben considerar los
instrumentos disponibles y la duración de los análisis. Posteriormente hay que comprobar
parámetros tales como:
• Linealidad: consiste en verificar que, en el patrón de calibración utilizado, la relación entre la

respuesta, definida por el área o altura de los picos cromatográficos y la concentración, es
lineal en el intervalo de concentraciones presentes en las muestras analizadas.
• Sensibilidad: un método es sensible cuando cambios pequeños de concentraciones

originan cambios significativos en la respuesta analítica. El límite de detección se define
como la señal más baja del analito, expresada en concentración, que se puede diferenciar
de un blanco analizado en las mismas condiciones. El límite de cuantificación es la
concentración más baja que se puede determinar con seguridad y precisión aceptables y
debe ser, al menos, dos veces el valor del límite de detección.
• Recuperación: Se determina en una muestra a la que se le agrega patrones de

concentración conocida del analito en cuestión y procesada con igual método analítico que el
empleado en las muestras de concentración desconocida. Esta concentración obtenida se la
relaciona con la obtenida a partir de un patrón puro que no ha sido sometido a ningún
tratamiento.
• Precisión: es una medida del error variable y se define como la concordancia entre medidas
repetidas de la misma muestra. Existen dos tipos: intraensayo e interensayo, también
conocida como reproducibilidad.
• Seguridad o exactitud: es la medida del error sistemático y se define como la concordancia

entre el valor medio medido y el valor de referencia aceptado.
Siempre que no se utilice un método oficial de análisis, como los de la AOAC (Analitical
Official Analysis Chemical), es conveniente validar el método usado. La validación es un proceso
por el cual se evalúan las características de un método y se comprueba que las mismas
cumplen una serie de requisitos preestablecidos. Es una parte muy importante del programa de
garantía de calidad y permite asegurar que los resultados analíticos tienen la exactitud
adecuada para su aplicación.
En toxicología analítica se utilizan con frecuencia el sistema de unidades internacionales

(SI) de masas en los cuales deben ser informados los resultados de los análisis cuantitativos. El
fentogramo (fg) = 10-15g, picogramo (pg) = 10-12g, nanogramo (ng) = 10-9, microgramo (µg) = 10-
6
g, miligramo (mg) = 10-3g, gramo (g) y kilogramo (Kg)=103g son las unidades de masas
utilizadas; siendo el litro (L) la unidad de volumen. Otras unidades de concentración empleadas
son: mg %, mg/dL, µg/ml, y ppm (partes por millón). Resulta útil recordar que 1mg/L = 1ppm =
1 µg/ml = 0.1 mg% = 0.1mg/dl.
Los avances en la instrumentación analítica permiten aumentar la sensibilidad en las

determinaciones de las sustancias que se desean investigar, lográndose cuantificar cantidades
del orden de los fentogramos. Si bien ello es altamente deseable para el analista toxicológico,
pueden presentarse en algunos casos el riesgo de informar resultados falsos positivos
especialmente en los análisis de drogas de abuso. Debido a ello, deben establecer valores de
corte o cut-off, también llamados umbrales positivos.
Estos valores de corte son las concentraciones de los analitos por encima de las cuales
se considera como seguro un resultado positivo. Estos valores tendrían que estar consensuados
entre todos los laboratorios y deberían ser diferentes según se aplicaran en toxicología clínica,
forense, laboral, ambiental, etc.
3.1 Garantía de calidad.
Un laboratorio toxicológico proporciona resultados epidemiológicos, de diagnóstico,

terapéuticos, etc., en el ámbito clínico, laboral, legal, deportivo, etc., donde los posibles errores
analíticos pueden influir enormemente en la libertad y derechos civiles del individuo y en la
salud. Por ello, las mediciones analíticas deben realizarse de forma tal que satisfagan un
requerimiento acordado como ser un sistema de calidad que produzca resultados de alta
calidad. También es necesario contar con un control de calidad que diseñe las actividades para
proporcionar dichos resultados y por último una garantía de calidad que asegure que las
actuaciones del control de calidad se ejecuten correctamente.
La garantía de calidad ha sido definida como "el conjunto de acciones realizadas para
asegurar la fiabilidad de los resultados", e incluye todos los procedimientos cognoscitivos y
mecánicos, diseñados para minimizar o identificar todas las fuentes de variaciones pre-
analíticas, analíticas y post-analíticas, que puedan influir en la obtención de resultados de gran
calidad analítica.
Basándose en la definición anterior, un laboratorio analítico debería realizar su propia

garantía de calidad en tres niveles diferentes, que abarcaran todos los aspectos de sus
actividades, incluyendo las funciones administrativas y que serian los siguientes:
• Logístico-estructural: que incluye el espacio del laboratorio, reactivos, equipos,
instrumentación, personal y los procedimientos de cadena de custodia
• Analítico-interpretativo: que incluye muestreo (recolección, selección y
almacenamiento), preparación de la muestra, disponibilidad de materiales de
referencia, selección del método analítico, revisión de los resultados por personal
especializado y formatos del informe.
El Control de Calidad provee un medio para detectar errores inaceptables en el caso que
surjan evitando la entrega de resultados inexactos. Además genera información que puede ser
usada para recuperar o rastrear datos. En el caso que surjan errores, ofrece un medio para
identificar la causa y la manera de tomas medidas para solucionarlos. El control de calidad
incluye controles de calidad internos y la participación en controles de calidad externos para
comprobar la efectividad de la garantía de calidad.
El control de calidad interno en laboratorios analíticos es la verificación final de la

correcta ejecución de todos los procedimientos (incluyendo la calibración) que están descriptos
en el protocolo analítico y de todas las medidas a tomar para asegurar las buenas prácticas de
laboratorio. Se lleva a cabo incluyendo materiales de referencia especiales, llamados “materiales
de control” en la secuencia analítica. Los materiales de control deben ser en lo posible
representativos de los materiales que se están ensayando en lo respecta en la composición de
la matriz, el estado físico de preparación y del intervalo de concentración del analito. Tanto los
materiales de control como aquellos usados para las calibraciones deberán ser trazables a
materiales de referencia certificados o por lo menos a un método de referencia reconocido.
La importancia y trascendencia de los análisis toxicológicos ha motivado que algunos

organismos internacionales establezcan normativas para garantizar la calidad y fiabilidad de los
resultados. Entre ellos se encuentran el National Institute of Drugs of Abuse (NIDA, 1988), la
Society of Forensic Toxicologists y la American Academy of Forensic Sciences (SOFT/AAFS,
1997), la Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1993), la International Association of
Forensic Toxicologists (TIAFT, 1994) y la Society of Hair Testing (SHT, 1997).
Las instalaciones del laboratorio deben ser tales que permitan la producción de datos
analíticos de alta calidad y han de estar dirigido por una persona adecuadamente calificada, que
organice la parte científica y al mismo tiempo sea capaz de aplicar técnicas de administración de
personal y, finalmente, el equipo técnico integrante debe poseer adecuada educación
profesional y entrenamiento y entender la importancia del programa de calidad y el papel que
cada empleado desempeñe en él.
La adecuada elección, recolección y envío de las muestras resultan ser muy importantes
en los análisis toxicológicos, ya que la calidad de un resultado nunca puede ser mejor que la de
la muestra. Deben proporcionarse instrucciones detalladas a todas las agencias y entidades que
trabajen con el laboratorio, que deben incluir el tipo y la cantidad mínima de muestra requerida,
el tipo y cantidad de conservante que se debe añadir, instrucciones para el adecuado etiquetado
de los contenedores, así como las condiciones para el empaquetado y transporte. Debe existir
una cadena de custodia, reflejada en una documentación que debe acompañar a las muestras
desde el lugar de recogida hasta el laboratorio junto con la petición del análisis.
La cadena de custodia debe empezar en el momento de la toma de muestra, debiendo

quedar recogido en la documentación cualquier manipulación o transporte desde un individuo o
lugar a otro, al tiempo que se debe intentar minimizar en lo posible el número de personas que
manipulen la muestra.
El procedimiento analítico incluye, usualmente, dos pasos: un análisis preliminar que

permita identificar las muestras negativas, que no contienen ninguna sustancia o metabolito, o
detectar las drogas u otros tóxicos que pudieran estar presentes en la muestra; el segundo paso
sería la confirmación de la identidad de las sustancias presentes en las muestras positivas.
Actualmente existen programas de control de calidad externo abiertos bien establecidos

para el análisis de orina en USA por el American College of Patologists, la Association of Clinical
Chemists, la American Academy of Forensic Sciences y la Californian Association of
Toxicologists y en países europeos como Holanda, por el Kwaliteitsbewaking Klinishe
Geneesmiddelanalyse en Toxicologie, España por el Instituto Municipal de Investigaciones
Médicas (IMIM), en Italia por el Centre of Behavioural and Forensic Toxicology (CBFT), etc.
Antes de emitir el informe, todos los datos analíticos deben ser revisados por una
persona con capacidad científica y con experiencia en los métodos analíticos empleados. La
revisión debe incluir, al menos, documentación sobre la cadena de custodia, validez de los datos
analíticos cualitativos y cuantitativos (cromatogramas de la muestra, de patrones y de un blanco)
y datos del control de calidad. Por último se emitirá un informe escrito que presente los
resultados del análisis y toda la información relevante de forma clara, exacta y sin
ambigüedades (International Standards Organization, 1982).
Además es necesario disponer de un archivo de registros, que documente las

actividades y operaciones llevadas a cabo y que incluya una copia del informe, datos de la
cadena de custodia, hojas de trabajo, datos de laboratorio y registros de los análisis de garantía
de calidad y de los controles de calidad. Todo esto debe ser lo más claro posible de manera que
nos permita seguir todos los pasos del análisis y sacar conclusiones en caso de desviaciones.
Se deben guardar durante un tiempo, que depende de las normativas gubernamentales, pero
que, en general, es como mínimo de cinco años y tienen, por tanto, un valor potencial a largo
plazo, sobre todo en los análisis toxicológicos que puedan estar envueltos en litigios,
especialmente cuando los juicios se celebran años después de haber emitido el informe.
Los programas de control de calidad externo pueden tener dos objetivos diferentes
• Educacional: cuando se pretende mejorar los resultados de los laboratorios participantes,

tener un sistema para comprobar la fiabilidad de los datos analíticos, tener un empuje para
solucionar los pequeños fallos detectados y para poseer un sistema de intercambio de
información científica y técnica.
• Acreditación: cuando se pretende poseer una base racional para la selección o licencia de
un laboratorio para una tarea determinada o, del mismo modo, para descalificarlo para esta
tarea si los resultados están por debajo de un cierto nivel.
• Uno de los motivos de la gran disparidad en los resultados de los controles de calidad
interlaboratorio es la gran variedad de métodos analíticos empleados, ya que, prácticamente,
cada laboratorio emplea el suyo propio, que es diferente de los demás.
Los laboratorios que realicen análisis toxicológicos deberían estar acreditados, como ya
se exige a los centros de control antidoping o a los que hacen análisis de drogas en el ambiente
laboral en algunos países. Esta acreditación permitiría la autoregulación para asegurar la
fiabilidad de nuestros resultados, reduciría el potencial para trabajos incompletos o imperfectos y
ayudaría a establecer argumentos razonables cuando nuestro trabajo pudiera ser juzgado.
3.2 Analítica de los Tóxicos Gaseosos y Volátiles.
La determinación de tóxicos volátiles y gaseosos presentan ciertas similitudes en los

métodos de detección y por ello, se analiza la analítica de los mismos en forma conjunta. El
aislamiento de tóxicos volátiles del material que lo contienen se realiza a través de la destilación
en sus diversas variantes, los cuales se desarrollarán a continuación. Posteriormente al
aislamiento, se realiza la cuantificación de las sustancias en estudio mediante el empleo de
diversas metodologías como cromatografía gaseosa (CG), cromatografla gaseosa de alta
resolución (HRCG) con empleo de columnas capilares, métodos enzimáticos, métodos
acoplados, etc.
3.2.1 Destilación.
A través de la destilación simple y fraccionada pueden separarse sustancias volátiles de

mezclas homogéneas. Pueden separarse sustancias solubles en el medio en que se
encuentran, generalmente acuoso (tejido, orina, sangre, etc.). La destilación simple presenta
aplicación limitada debido a que los puntos de ebullición de las sustancias a separar deben
diferir al menos como 30°C y por otra parte, se requiere una cantidad de muestra considerable.
En cambio, a través de la destilación fraccionada pueden separarse sustancias cuyos puntos de
ebullición se encuentren más cercanos.
En Toxicología una técnica muy apropiada es la destilación con arrastre por vapor dado
que proporciona varias ventajas con respecto a las anteriores. Es de suma importancia en el
caso en que sea necesario separar una pequeña porción de un compuesto débilmente volátil de
un material no volátil. Como técnica, puede ser directa o indirecta. En el caso de la destilación
con arrastre por vapor directa, el vapor de agua se genera en el mismo recipiente que contiene
la muestra, mientras que en la indirecta el vapor se genera en un recipiente y se hace burbujear
en otro que contiene la muestra con el material biológico (por ejemplo, vísceras). Se recomienda
el empleo de la destilación indirecta en el caso en que puedan registrarse proyecciones o
carbonización de la muestra.
• Fundamento de la destilación con arrastre por vapor.
Si dos sustancias (un compuesto de escasa volatilidad y agua del material biológico) son
insolubles, las presiones parciales de ambas sustancias se suman para dar una presión de
vapor total. Cuando la suma de estas presiones es iguala a la presión atmosférica ambas
destilarán juntos. Así, la mezcla destilará por debajo del punto de ebullición de cada una de las
sustancias presentes. Este hecho hace posible la separación de sustancias con alto punto de
ebullición a bajas temperaturas, resultando muy adecuada su aplicación a sustancias que se
descomponen. La recolección del destilado puede realizarse a través de una fracción única o
varias de menor volumen. En esta última modalidad, las primeras fracciones tendrán una alta
concentración de los tóxicos más volátiles y las posteriores estarán más enriquecidas en los
menos volátiles.
Estos conceptos se aplican a menudo en toxicología al separar compuestos volátiles ácidos

y básicos. Al respecto, se realizan dos destilaciones: una en medio ácido en la que se recogen los
tóxicos volátiles ácidos y neutros y otra en medio alcalino en la que se separan los tóxicos volátiles
alcalinos.
• Destilación en medio ácido.
A partir de alrededor de 100 gr de material (almacenado a bajas temperaturas para evitar

pérdidas por volatilización) se procede a la maceración con igual cantidad de agua destilada a
fin de obtener una papilla fluida. Se incorpora la misma a un balón de destilación, se acidífica
con ácido tartárico al 10% y se adiciona gotas de silicona como antiespumante. El balón se
coloca en un manto calefactor o en un baño de agua, conectándose al refrigerante por un lado y
al generador de vapor por otro (en el caso de una destilación indirecta). Se coloca un pequeño
volumen de agua en el tubo colector el que puede refrigerarse exteriormente con hielo
efectuándose la destilación hasta recoger un volumen de destilado similar al de la muestra
original.ediante la acidez tartárica se logra un pH adecuado y se evitan alteraciones eventuales
de ciertos complejos; en algunos casos (fenoles), aconsejándose el tratamiento con solución de
ácido sulfúrico 20%. El aspecto del destilado es generalmente límpido salvo en el caso de
vísceras o del material biológico por destilación de ácidos grasos de bajo peso molecular o por
solventes no miscibles con agua. Los compuestos orgánicos de carácter ácido o neutro y de
bajo peso molecular (alcoholes, cetonas, aldehídos, ácidos, fenoles, hidrocarburos alifáticos,
aromáticos y halogenados) pueden ser aislados por destilación en medio ácido.
• Destilación en medio alcalino.
La solución remanente de la destilación en medio ácido se deja enfriar, se trata con

solución de NaOH 10% hasta pH 10 o bien con un exceso de OMg. Es aconsejable el agregado
de un antiespumante también en esta destilación. Dado que el tratamiento con NaOH puede dar
lugar a descomposiciones se prefiere el agregado de OMg, aunque con este agente no se
obtiene una destilación completa. El destilado se recoge en ClH 2N, lo que permite fijar las
bases volátiles. Es importante controlar el pH del destilado ya que puede requerir un agregado
posterior de HCI. Se continúa hasta la obtención de 80 a 100 ml. Dicho destilado, además de
contener las bases volátiles salificadas, presenta cierta proporción de NH4CI y un exceso de
ácido fijador. Los compuestos de carácter básico como aminas, iminas, alifáticas y/o aromáticas)
son retenidas por transformación en las sales correspondientes.
3.2.3 Microdifusión.
La microdifusión es un procedimiento muy útil para aislar e identificar tóxicos volátiles,

pudiendo aplicarse a muestras de sangre, orina y saliva. El fundamento de esta técnica es el
siguiente: si una solución de una sustancia volátil y un solvente puro se mantienen en
compartimentos separados pero en contacto con la misma atmósfera, el soluto volátil tenderá a
particionarse en el solvente puro. De esta manera, se logra la difusión del soluto volátil desde la
solución inicial al solvente hasta que se llegue a un equilibrio. Si se dispone de una sustancia
que convierta el soluto volátil en no volátil, la difusión ocurre hasta que la presión de vapor en la
atmósfera disminuya hasta casi cero. La microdifusión se realiza en cámaras de Conway (Fig.
3.1) que poseen dos compartimentos: externo (muestra y agente liberador) e interno (agente
atrapante). En cada caso, se produce la captación y/o reacción del tóxico volátil produciéndose
la remoción completa del primer compuesto al cabo de un tiempo y temperatura previamente
determinados.
En este sistema es necesario examinar una serie de equilibrios que determinan las
condiciones en las que finalmente ocurrirá la separación del analito desde la muestra.
Fig. 3.1 Cámara de Conway

En el compartimento externo se debe tener en cuenta por un lado los equilibrios en fase
líquida de disociación, adsorción o formación de complejos del analito (Aext) con los restantes
elementos de la matriz que constituye la muestra. Así por ejemplo, en la microdifusión del
monóxido de carbono (CO) desde sangre es necesario considerar la formación del complejo con
el grupo hemo de la hemoglobina y en la separación del ácido cianhídrico (HCN) desde
cualquier matriz líquida es necesario considerar su constante de disociación ácida. En ambos
casos (carboxihemoglobina y cianuro) se encuentra presente una forma no volátil del analito
(Aext)*.
En la volatilización del analito (Avol) desde el compartimento externo y su posterior

disolución en el compartimento interno también se involucran las respectivas constantes de
equilibrio. Finalmente, el analito en el compartimento interno (Aint), por acción del agente
atrapante, puede mantener un equilibrio con una forma no volátil del mismo.
Finalmente, puede formarse un complejo o un producto de oxidación el cual se denomina

(Aint)*. El proceso en su conjunto, entonces, estará establecido por las condiciones en que se
realiza y en qué medida estas modifican cada una de las constantes de equilibrio involucradas.
A (ext) * ←→
k1
A(ext) ←→
K2
A( vol ) ←→
K3
A(int) ←→
K4
A(int) *
El diseño de cada experiencia de microdifusión deberá considerar las constantes de

equilibrio que incidirán en un procedimiento para la separación cuantitativa del analito en
cuestión y necesariamente los resultados se refieren a una curva de calibración construida con
patrones de concentración conocida.
3.2.4 Cromatografía gaseosa (CG).
Los métodos de cromatografía gaseosa son los de mayor aceptación en la actualidad.

La cromatografía gaseosa es un método de gran valor para la cuantificación de los tóxicos
gaseosos y volátiles dado que presenta rapidez, especificidad y gran sensibilidad. En Inglaterra,
se utiliza como el método oficial para la determinación de la alcoholemia (tenor de alcohol en
sangre) especialmente en aquellos sujetos en los cuales la prueba con un analizador de aire
espirado se traduce en la sospecha que se encontraban bajo la influencia del alcohol. Para
tóxicos gaseosos, el método de elección es la cromatografía de head-space. En esta se permite
el equilibro de la fase líquida de la muestra con su fase vapor, dentro de un frasco de tapón
perforable de donde se extrae una alícuota del vapor para analizarla en el cromatógrafo.
La cromatografía de gases (GC) permite la separación e identificación de compuestos

volátiles en mezclas complejas. Esquemáticamente el proceso que tiene lugar en un
cromatógrafo de gases es el siguiente: la muestra líquida se vaporiza en un inyector que está a
temperatura elevada, donde una corriente de gas portador inerte y de alta pureza lo arrastra a lo
largo de la columna. Allí tiene lugar el proceso de separación bajo condiciones controladas de
temperatura; posteriormente el efluente de la columna pasa a un detector termostatizado, cuya
señal se recoge en función del tiempo en una carta o cromatograma.
La separación por GC de los distintos compuestos presentes en una muestra depende

de la diferencia en sus coeficientes de distribución entre la fase móvil y la estacionaria a una
temperatura determinada, conociéndose perfectamente las condiciones para esta separación.
Las fases estacionarias empleadas más frecuentemente, debido a su universalidad, son
las de silicona, como metilsilicona o 2-5% fenilmetilsilicona. Algunas fases estacionarias
moderadamente polares, como 14% cianopropil metilsilicona, también han sido propuestas
En cuanto al tipo y dimensiones de la columna, las primeras columnas eran

empaquetadas, de vidrio o metálicas, de 2-6 mm de diámetro interno, donde la fase estacionaria
estaba adsorbida sobre un material inerte. Pero la aparición, en los años setenta, de las
columnas capilares las desplazó completamente, debido a su mejor eficacia separativa, ruido de
fondo más bajo así como su mayor inercia y sensibilidad.
Actualmente las columnas que se emplean son de sílice fundida, con una longitud de 12-
30 metros, un diámetro interno que oscila entre 0,2 y 0,25 mm, en la que la fase estacionaria se
encuentra ligada químicamente a sus paredes con un grosor de película entre 0,25 y 0,33 mm.
El gas portador empleado suele ser He, cuyo flujo en los instrumentos modernos se mantiene
constante aunque se produzca un aumento de las temperaturas.
Para mejorar la separación el calentamiento del horno se realiza de forma programada,

pudiendo consistir en una única rampa de temperatura, que empieza a 40-100 ºC hasta 280-310
ºC a una velocidad de 5-30 ºC/min, otros proponen dos rampas, una primera rápida a 20-40
ºC/min. seguida de otra más lenta a 10 ºC/min. Incluso algún autor llega a proponer un programa
de temperaturas con cuatro rampas.
Existe una gran variedad de detectores aplicables en GC, como el de conductividad

térmica (TCD), de ionización de llama (FID), de nitrógeno-fósforo (NPD), de captura de
electrones (ECD), de fotoionización (PID), fotométrico de llama (FPD) o de conductividad
electrolítica. De todos ellos, tres son los que encuentran una mayor aplicación en el análisis
toxicológico. Así, al principio la identificación se realizaba con detectores no selectivos como los
FID, que responden a prácticamente todo tipo de compuestos. Posteriormente, la introducción
de detectores más selectivos como el NPD supuso una considerable evolución; este detector es
específico y considerablemente más sensible para los compuestos que contienen átomos de N o
P en su molécula, siendo particularmente útil para el análisis de drogas de abuso y
medicamentos, ya que la mayoría de ellos poseen átomos de N, así como en el análisis de
plaguicidas que contengan átomos de N y/o P. Otro de los detectores selectivos que se emplean
actualmente es el ECD, que posee gran sensibilidad para los compuestos electronegativos con
átomos de halógenos o grupos nitro o carboxilo en su molécula.
Los compuestos presentes en la muestra se identifican por sus tiempos de retención, que
es el tiempo transcurrido desde la inyección de la muestra hasta que cada compuesto presente
en la misma llega al detector. En la práctica se usa más el tiempo de retención relativo. Estos
parámetros son una propiedad característica de cada compuesto en unas condiciones
cromatográficas específicas, pero no son un sistema satisfactorio de identificación, ya que las
condiciones operativas no se pueden reproducir fiablemente de un laboratorio a otro, no
permitiendo la estandarización, que, por otra parte, se puede conseguir mediante otros
parámetros, como son los índices de Kovats. Más recientemente se han desarrollado algoritmos
y otros métodos de búsqueda para automatizar el barrido. El área del pico es proporcional a la
cantidad del compuesto. Consecuentemente, la GC nos proporciona información de la identidad
y cantidad de los compuestos analizados.
Los problemas con esta técnica se presentan cuando se trata de analizar compuestos de
elevado peso molecular, termolábiles o polares. Desafortunadamente muchos tóxicos poseen
grupos funcionales polares. Además durante los procesos metabólicos de biotransformación se
introducen grupos polares en las moléculas para disminuir el carácter lipofílico y favorecer la
excreción en la orina. Los métodos convencionales de GC no permiten el análisis de estas
sustancias polares, por lo que la modificación de la molécula, mediante una derivatización
adecuada, es un prerrequisito imprescindible.
Otra gran limitación de la CG es que la información que proporciona no es definitiva, se

basa sólo en el tiempo de retención y puede ocurrir que haya sustancias que eluyan juntas o
muy próximas, por lo que se requiere un método de confirmación, como el que nos proporciona
la espectrometría de masas.
La espectrometría de masas (MS) se acopló a los métodos cromatográficos, lo que

revolucionó el análisis de mezclas de compuestos orgánicos debido a su sensibilidad y
especificidad. Detectores selectivos de masas llevó que la cromatografía de gases acoplada a la
MS (CG/MS) se convirtiese en la técnica instrumental más adecuada para la identificación y
cuantificación de moléculas orgánicas
Aunque existen otros, los dos métodos de ionización más usados en la actualidad son el
impacto electrónico (EI) y la ionización química (CI). El EI es un proceso físico donde se
transfiere energía mediante la colisión de electrones con las moléculas de la muestra, lo que
origina su fragmentación en iones. El espectro de impacto electrónico resultante es altamente
reproducible y característico de la molécula en estudio. La CI, en cambio, es un fenómeno
químico, donde la muestra se mezcla con un exceso de gas ionizante, como metano, isobutano
amoniaco, etc. originándose nuevos iones con una unidad de masa mayor que el peso
molecular. En esta ionización se originan muy pocos iones de fragmentación, y el M+1 producido
es el mas intenso de todo el espectro.
En cuanto a la detección, los espectrómetros de masas actuales pueden operar en dos

modos diferentes, el de registro total o full scan y el de iones seleccionados selected ion
monitoring (SIM). En la modalidad de registro total, el espectrómetro barre todos los iones
presentes dentro de un rango de valores masa/carga, que normalmente oscila entre 40 y 650. El
espectro de masas o patrón de fragmentación obtenido proporciona una información estructural
muy útil. Esta modalidad de registro total también se puede aplicar al análisis cuantitativo, no
obstante, para este propósito es preferible el SIM, sobre todo cuando las concentraciones son
muy bajas.
En la modalidad SIM, el instrumento se prepara para detectar únicamente uno (single ion
monitoring) o varios (multiple ion monitoring) iones de abundancia relativamente grande, o de
relación masa/carga significativa, en el espectro de masas del compuesto de interés, resultando
un cromatograma que responde sólo a compuestos en cuya fragmentación estén presentes los
iones seleccionados.
La elección del modo de ionización y de detección dependerá de los requerimientos del

análisis, ya que como hemos visto anteriormente cada uno proporciona una información
diferente. La modalidad SIM es sólo posible cuando se conocen el espectro de masas y el
tiempo de retención de los analitos y es la de elección para el análisis cuantitativo, debido a su
mayor sensibilidad sobre el full scan, tiempos de barridos más cortos y mejor resolución en la
sobreposición de picos. Por otro lado, la ionización mediante EI usando la modalidad de full scan
es, obviamente, la que tiene mayor aplicabilidad en el campo toxicológico, ya que el espectro de
EI que se obtiene, en estas condiciones, es como una huella dactilar, que contiene suficiente
información para caracterizar la molécula, permitiendo confirmar su identidad, o, en el caso que
ésta se desconozca, buscarla en las librerías de espectros de referencia que estén disponibles.
Los detectores de masas de doble cuadrupolo (MS-MS) o incluso de triple (MS-MS-MS)

se caracterizan por su gran sensibilidad, del orden de los fentogramos, y selectividad, ya que en
esta modalidad se selecciona un ion del espectro de masas original, el cual es sometido a una
nueva fragmentación en el otro cuadrupolo. Para confirmar la presencia de un compuesto han
de coincidir los dos patrones de fragmentación.
Al igual que en GC, no todos los compuestos orgánicos se pueden analizar por esta
técnica, debido a su termolabilidad, polaridad o falta de volatilidad. Aunque en muchos de ellos
se puede aplicar otra técnica como HPLC o HPLC-MS, en algunos casos el problema se
solventa con una derivatización previa al análisis por GC-MS.
La formación de derivados, previa a la inyección de la muestra empezó a utilizarse en

1953, casi al mismo tiempo que la GC. Tienen como objetivo modificar la estructura de la
molécula del analito, y son un prerrequisito antes del análisis por GC y GC/MS de compuestos
no volátiles, termolábiles y polares. La disminución de la polaridad también mejora las
propiedades cromatográficas de los compuestos, minimizando la adsorción en la columna y
proporcionando, consecuentemente picos con mejor resolución. La derivatización cambia el
tiempo de retención y el patrón de fragmentación del espectro de masas, al mismo tiempo que
proporciona más información estructural, sobre todo en moléculas con espectros de masas muy
pobres, como anfetamina, MDMA, etc. Normalmente se obtienen espectros de masas con iones
de relación masa/carga mas alta y mayor abundancia, evitándose las interferencias con iones de
compuestos contaminantes.
La formación de derivados también se pude usar para incrementar las propiedades

electronegativas de un compuesto, introduciéndole grupos con gran afinidad por los electrones,
como son átomos de halógeno, que se traduce en una mayor sensibilidad y selectividad en el
análisis por GC-ECD y por GC/MS en la modalidad NCI.
Los grupos funcionales susceptibles de derivatización, en muchos compuestos y en sus
metabolitos, son los grupos hidroxilo, cetona, ácido carboxílico y amino. Existen numerosos
reactivos que permiten la derivatización de estos grupos funcionales polares, haciendo factible el
análisis por GC y GC-MS. Entre todos los métodos de derivatización posibles, la sililación,
acilación y alquilación, han demostrado ser los más versátiles y de uso más extendido.
La formación de derivados sililados combina la estabilidad química y térmica con una

gran volatilidad, los derivados son fáciles de preparar y muestran un excelente comportamiento
en GC (Segura y col. 1998). La gran versatilidad de agentes sililantes que pueden reaccionar
con los distintos grupos funcionales, permite una amplia aplicación en el análisis toxicológico
(Polettini, 1998). Otra ventaja de este método de derivatización es que no requiere la
evaporación del exceso de reactivo, con lo que se acorta el tiempo de análisis, pero también se
acorta la vida media de la columna cromatográfica. Los silil derivados son más sensibles a la
hidrólisis que otros derivados que posean los sustituyentes alquilo con más impedimento
estérico. La reacción, por tanto, se ha de realizar en condiciones totalmente anhidras, para evitar
la hidrólisis.
Los derivados acilados de uso más extendido en el análisis toxicológico son los
haloalquilacilados, concretamente perfluoracilados (trifluoracil, pentafluoracil o heptafluoracil),
debido a que se incrementa la afinidad electrónica de los compuestos. Otra ventaja adicional es
que en los espectros de masas, los iones con mayor abundancia tienen masas muy altas. En
estos derivados conviene evaporar el exceso de reactivo, para evitar problemas en el GC. El uso
de estos reactivos, por otra parte, puede ocasionar reacciones colaterales debido a las
condiciones extremadamente ácidas del medio de reacción. Esta característica hace que estos
derivados no sean adecuados para sustancias lábiles en medio ácido.
La metilación es uno de los métodos de alquilación que tiene más aplicaciones en el

análisis por GC-MS, debido al aumento pequeño en el peso molecular y a la alta volatilidad de
los derivados. Otros reactivos muy usados para derivar grupos carboxílicos son los alcoholes de
elevado peso molecular y los que contienen halógeno, ya que los ésteres halogenados, como
explicamos anteriormente tienen ventajas cuando se emplean procedimientos especiales de
detección como GC-ECD, GC-MS-NCI e incluso GC-MS-MS (Oliveira y col. 1995).
A veces los compuestos a analizar están en forma racémica siendo conveniente su

separación, especialmente en casos en los que uno sólo de los isómeros sea
farmacológicamente activo. No obstante, aunque tanto la HPLC como la EC son técnicas que
permiten esta separación, hay situaciones y grupos específicos de sustancias (anfetamina,
metanfetamina, fenfluramina, metilfenidato, etc.) que requieren una separación por GC. Para ello
hay que someterlas previamente a una derivatización quiral.
En cualquier caso en la elección del método de derivatización conviene considerar en

primer lugar el modo de ionización que se vaya a emplear. Así para trabajar en NCI conviene
obtener los derivados perfluorados, mediante acilación o alquilación; en cambio cuando se
aplique el EI y se pretenda realizar un análisis cualitativo general, el método de elección será la
sililación mediante BSTFA, ya que aunque una de las limitaciones más importantes de la
obtención de derivados es la escasez de librerías de espectros de referencia que posean
información sobre ellos; afortunadamente la nueva edición de la librería PMW (incluida en los
equipos de Agilent) o NIST subsana, en parte, el problema al incluir los derivados de
prácticamente todos los compuestos, especialmente los TMS-derivados.
Durante el proceso de derivatización pueden ocurrir efectos secundarios no deseados,

como son, entre otros, la formación incontrolada, si las condiciones de reacción no se
establecen bien, de derivados minoritarios no deseados, o, si la derivatización es incompleta, de
múltiples derivados con compuestos polifuncionales. Estos efectos no deseados pueden afectar
la estabilidad de los derivados y al análisis por GC/MS debido a contaminación de la columna,
acortando la vida media de la misma, también se producen picos muy anchos en el frente del
cromatograma que pueden originar interferencias con los detectores. Consecuentemente estos
efectos hay que eliminarlos antes de la inyección. A veces se requiere la evaporación del
reactivo de derivatización para evitar una derivatización secundaria en el bloque de inyección.
3.2.5 Cromatografía por Head-space.
A fin de proceder a la identificación y cuantificación de tóxicos volátiles en muestras de

sangre u otro medio biológico, se utiliza la cromatografía gaseosa, implementando la técnica de
“head space” para separar los analitos de la matriz, previo a la inyección en el cromatógrafo.
Fundamento: a una temperatura dada existe un equilibrio de partición (aire - material

biológico) para una sustancia volátil determinada, utilizándose agentes liberadores del tóxico.
Luego, el tóxico presente en la fase vapor es analizado por cromatografía gaseosa (CG).
3.2.6 Cromatografía líquida.
La introducción de la cromatografía de gases en la década de 1950 y de la cromatografía

líquida de alta resolución (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), quince años
después, dotaron a la química y a las ciencias de la vida con dos poderosas herramientas.
El rápido crecimiento de la cromatografía líquida (1970-1980) ha sido particularmente

impresionante en vista de su amplia aplicación, con posibilidad de análisis de compuestos
térmicamente inestables, que exhiben baja volatilidad, con altos pesos moleculares y/o amplios
rangos de polaridad (Zuccaro y col. 1997; Poletini, 1999).
Una de las contribuciones más significativas al establecimiento de la cromatografía

líquida como técnica analítica de rutina fue la introducción de la fase reversa químicamente
enlazada, ya que puede ser usada para una gran variedad de compuestos orgánicos, no iónicos,
ionizables e iónicos, con la apropiada elección de aditivos en las fases móviles, dentro de las
limitaciones de los pKa y de pH.
Además de esta versatilidad, ofrece la posibilidad de inyección de muestras acuosas,

considerada inicialmente como una gran ventaja y de distintos sistemas de detección tales como
ultravioleta-visible, fluorescencia (natural o formación de derivados pre o post-columna),
electroquímico, etc.
Sin embargo dos cuestiones han dificultado su utilidad para el barrido de compuestos en
una sistemática toxicológica:
1ª. El requerimiento de establecer una colección de datos de tiempos de retención, ya que en

HPLC están influenciados por la reproducibilidad de los mismos (incluso con idénticos
materiales de empaquetado), diferencias en parámetros técnicos e instrumentales, tamaño de
columna, volúmenes muertos y diferente precisión en los sistemas de bombeo con la
consecutiva variación en la composición de la fase móvil o perfil del gradiente (Bogusz y col.
1991).
2ª. La pobre especificidad de una detección a una simple longitud de onda en el ultravioleta-
visible, método de detección mas usado (Logan y col. 1990).
Los avances tecnológicos en los equipos, columnas y detectores han mejorado el control de los
factores que afectan al comportamiento de la retención y a la reproducibilidad.
A pesar de la buena situación actual de la HPLC en el análisis toxicológico, se siguen
presentando problemas que podemos clasificar en:
• Asociados a la instrumentación: presión, fugas, chequeo de válvulas, mezcladores,
lámparas del detector etc. Suelen ser simples después de identificarlos, aunque su
resolución consume tiempo. Pueden prevenirse con un buen mantenimiento.
• Asociados a la separación propiamente dicha: línea de base, tiempos de retención
(cambio de columna, fases móviles, tipo de columna, temperatura...), perfiles de los
cromatogramas (colas en los picos, picos fantasmas, negativos, dobles o asimétricos,
anchos...), inestabilidad del detector, etc. El síntoma es obvio, suelen ser difíciles de
identificar y a veces imposibles de corregir.
• La falta de bibliotecas espectrales para una primera identificación.
En algunos casos se sigue aprovechando la oportunidad de inyección de muestras

acuosas o bien la filtración y precipitación directa con disolventes. Sin embargo, la complejidad
de los fluidos biológicos y los casos en que bajas concentraciones pueden ser tóxicas,
aconsejan extracción, purificación y concentración, bien de forma independiente de la
determinación, donde la fase sólida compite con la extracción líquido-líquido, o en linea con el
cromatógrafo con pre-columnas para pre-concentración y purificación y posterior envio a la
columna analítica (column switching), pre-tratamiento con diálisis etc., que permiten la inyección
directa de la muestra sin pérdida de analitos durante pasos críticos como la evaporación. Esto
mejora la recuperación, sensibilidad y reproducibilidad.
Respecto a las columnas, la evolución en fases estacionarias de gel de silice (fase

normal), quirales o exclusión son patentes, aunque la fase reversa químicamente enlazada
sigue siendo la más usada para compuestos de interés en la sistemática toxicológica. La
producción de rellenos de fase reversa de alta pureza, libres de metales y desactivados es
quizás el más importante desarrollo en este tipo de columnas en los últimos 15 años. Los
recientes avances han conseguido una distribución homogénea de la acidez de los grupos
silanoles con lo que las columnas son más estables y generan picos reproducibles, agudos y
simétricos, sin embargo no llegan a evitar las colas de algunos compuestos básicos que
requieren la adición de una base competitiva a bajos pH o la adicción de contraiones (par iónico)
para compuestos fuertemente ácidos o básicos.
En general se considera preferible la elución isocrática ya que el comportamiento de la

retención es más reproducible, la contribución al fondo por la fase móvil en el espectro de UV-
Vis no cambia durante el cromatograma y la cuantificación es más eficaz. Sin embargo para
cubrir el amplio rango de compuestos se requiere de eluciones en gradiente o columnas con
diferente fase estacionaria acopladas en serie.
A estas mejoras en la separación se ha unido la generalización del uso del detector de

fotodiodos (Diode Array Detector, DAD) que posibilita la obtención de datos del espectro UV
durante el tiempo de cromatograma y la detección de impurezas, aplicando el análisis
multicomponentes para efectuar análisis cuantitativos válidos independientemente de la
resolución o anchura de pico. Es muy versátil y ofrece importantes ventajas, comparado con el
detector UV convencional, en el barrido de muestras desconocidas. Otros tipos de detectores
(fluorescencia, electroquímico) más sensibles y específicos, no se utilizan en barridos de
muestras desconocidas ya que suelen necesitar derivatización y no suelen permitir eluciones en
gradiente
El potencial del detector de fotodiodos para picos no resueltos fue un progreso en el

análisis de muestras biológicas, de naturaleza muy compleja. Junto con la HPLC ofrece la
posibilidad de utilizar la retención cromatográfica como un parámetro de identificación, bien
manejando escalas de índices de retención o tiempos de retención relativos con el consecuente
intercambio de bases de datos de HPLC-DAD para posibles contactos inter-laboratorios, o
unidades de tiempo de retención en usos intra-laboratorio. Esto se ha manifestado en la
publicación de numerosos trabajos en que se describen aplicaciones de la HPLC a la detección
de un gran número de compuestos y/o sistemática toxicológica general.
Sin embargo, a pesar de las purificaciones cuidadosas ciertas interferencias pueden

inducir a resultados falsos positivos o impedir apropiada identificación y cuantificación de los
compuestos de interés, además de la conocida limitada especificidad del espectro UV y su
variabilidad como función del pH. Por esas razones los toxicólogos han estado esperando el
acoplamiento entre HPLC y espectrómetro de masas. La interfase ha sido siempre el punto débil
en dicho acoplamiento ya que tiene que eliminar la fase móvil y transformar las moléculas,
disueltas en dicha fase móvil, en iones en fase gaseosa, sin degradación térmica. Se han usado
diferentes tipos de interfases, analizadores de masas y modos de detección. Sin embargo, la
bibliografía más reciente en toxicología analítica se centra en las que utilizan ionizaciones a
presión atmosférica, electrospray e ionización química en combinación con detector de
espectrometría de masas o tandem masas-masas. Ambas interfases suelen ir instaladas en el
mismo instrumento y pueden seleccionarse indistintamente.
Seremos más exigentes con la estabilidad química y aumento del periodo de vida de las
columnas. En los últimos años no se aprecia una tendencia clara a implementar columnas de
menor longitud ni diámetro de partícula, a pesar de que se reduciría el uso y coste de
disolventes y disminuirían los requerimientos al acoplar el detector de masas.
La combinación de la versatilidad de la separación por HPLC con la selectividad de la

detección por espectrometría de masas, con interfases a presión atmosférica, tendrá que salvar
los obstáculos que todavía limitan su aplicación, especialmente en lo que respecta a la
reproducibilidad de los espectros de masas, condiciones de ionización estandarizadas, y
estudios sistemáticos, decisivos para ser técnica de identificación en toxicología. Otro factor
limitante es su alto costo de adquisición y mantenimiento aunque bajará e indudablemente se
harán mas pequeños y de mas fácil manejo. Sin embargo su introducción en el análisis
toxicológico ha abierto nuevas perspectivas de determinación simultánea de grupos de
compuestos no derivatizables y metabolitos polares
En la actualidad ninguna técnica instrumental es autosuficiente para el barrido de todos

los compuestos, es por ello que asistiremos a la generalización de acoplamientos, quizás en
algunos casos sofisticados, entre ellas, lo que ya supone nuevas estrategias analíticas.
3.3 Analitica del estudio de tóxicos fijos.
La espectrofotometría de absorción atómica es el procedimiento más empleado en la

determinación de elementos traza en medios biológicos. Existen cuatro modalidades: llama,
cámara de grafito, vapor frío y sistema de hidruros volátiles. La modalidad de llama es adecuada
para la medida de elementos en alta concentración. La atomización electrotérmica o cámara de
grafito (EAAS) es la idónea para el análisis de elementos en muy bajas concentraciones. El
sistema de hidruros volátiles (SHV) se aplica con gran efectividad para conseguir volatilizar
algunos metales en forma de hidruros (As, Se, Sb, Ti, etc.), y con el sistema de vapor frío
obtener mercurio atómico. Esto a su vez, proporciona un medio para aislar al elemento de la
matriz de la muestra, con lo cual se consigue mayor sensibilidad y disminución de las
interferencias. Los procedimientos analíticos por este sistema en medios biológicos son
innumerables.
3.3.1 Analítica de los tóxicos orgánicos no volátiles o Tóxicos Orgánicos Fijos.
Bajo la denominación de Tóxicos Orgánicos Fijos (TOF) o no volátiles se incluye una

gran variedad de sustancias orgánicas, de interés toxicológico, que no pueden aislarse por
destilación de las matrices que los contienen, sino que debe recurrirse a la acción de disolventes
orgánicos (en medio ácido o alcalino) para su separación y posterior identificación.
La mayoría de estos tóxicos sufren profundos cambios metabólicos en el organismo y, en

consecuencia, pueden aparecer en los fluidos o tejidos en su forma original o como productos
de biotransformación (metabolitos), libres o conjugados con diferentes compuestos (ácido
glucurónico, sulfatos, aminoácidos, etc.). Las propiedades físico-químicas del tóxico y sus
metabolitos pueden ser muy distintas, a veces incluso entre los metabolitos de un mismo
compuesto. Ello determina una excreción característica según los casos y la conveniencia de
realizar la investigación en una u otra matriz (orina, sangre, bilis, etc.).
Frecuentemente la especie que será analizada está presente en un tejido o un fluido

biológico, unido a proteínas u otros constituyentes celulares. En este caso, puede ser necesario
separar el tóxico (el compuesto madre o sus metabolitos) del resto de los componentes de la
matriz, de modo de obtenerlo en cantidad y pureza suficientes para permitir su identificación y
cuantificación. Sólo recientemente han surgido métodos disponibles que permiten la medida
directa de algunos analitos sin la separación previa de su matriz.
El analista toxicólogo ha experimentado un crecimiento paulatino en el número de técnicas

a su disposición. En la actualidad la clásica metodología convencional ha sido reemplazada por
la introducción de métodos instrumentales más sofisticados, de gran sensibilidad y precisión
pero cuyo costo elevado limita su disponibilidad en la mayoría de los laboratorios de nuestro
medio.
Los TOF tienen en común el uso de metodologías similares para su aislamiento,

caracterización y cuantificación. En este capítulo se describirá someramente el fundamento de
los equipos empleados en su investigación de acuerdo con el siguiente esquema:
Métodos Inmunológicos Métodos Cromatográficos

(RIA, ELISA, FPIA, AMIA) (TLC, HPTLC, GC, HPLC, GC/MS, HPLC/MS)
Se aplican directamente sobre la matriz. Requieren separar previamente el analito

de la matriz, mediante:
extracción líquido – líquido|extracción en fase sólida (ampolla de decantación, columnas
SPE)
tierra de diatomeas)
A)- INMUNOENSAYOS.
Existen en el comercio numerosos tipos de inmunoensayos con aplicaciones en

Toxicología. En su mayoría están diseñados para el análisis de muestras líquidas, como orina,
agua y suero debido a que estas matrices presentan poca cantidad de interferencias. Estas
muestras se emplean en forma directa, evitando por lo tanto el paso previo de extracción o
aislamiento de los analitos y logrando una reducción importantísima en el tiempo de obtención
de los resultados (10 minutos – 1 hora).
Los inmunoensayos se basan en la reacción específica que se produce cuando un

antígeno se enfrenta con un anticuerpo. La técnica tradicional consiste en mezclar un volumen
de muestra conteniendo la droga a ensayar, con una cantidad fija de un anticuerpo específico
(monoclonal o policlonal), y una cantidad fija de la misma droga marcada sintéticamente con un
radioisótopo, una enzima activa o una sustancia fluorescente, por ejemplo. De este modo se
establece una competencia entre la droga marcada (Droga*) y la presente en la muestra (Droga)
por los sitios de unión del anticuerpo. En forma simple se esquematiza esta competencia:
Droga* + Droga + Anticuerpo Droga*-Anticuerpo + Droga –Anticuerpo
La probabilidad de que una molécula marcada o sin marcar se una al anticuerpo depende
de su concentración. Se requieren instrumentos capaces de evaluar el punto final de la reacción
y comparar la respuesta del test contra estándares conocidos. De acuerdo al tipo de marca es el
método analítico de medida empleado.
En algunos casos no puede diferenciarse la señal producida por la droga marcada unida al
anticuerpo y la droga macada libre, siendo necesario separarlas antes de efectuar la medida.
Estos ensayos se conocen como heterogéneos, e involucran principalmente a los
radioinmunoensayos.
Cuando esta separación no es necesaria, porque la señal producida por la droga marcada
se diferencia si está libre o unida, el ensayo se llama homogéneo. Esta diferencia ocurre porque
la señal es suprimida, alterada o producida en la unión con el anticuerpo. Los inmunoensayos
ópticos (donde la señal medida es un cambio óptico, como absorbancia UV, fluorescencia o
luminiscencia) pertenecen a este tipo. Pero esta ventaja se logra a costa de una menor
sensibilidad debido a que la señal óptica es medida en presencia del fluido biológico original.
Para aumentar la sensibilidad se crearon inmunoensayos ópticos heterogéneos.
Es importante definir dos parámetros para los ensayos inmunológicos: la sensibilidad y el

límite de detección. La sensibilidad del ensayo es el cambio en la respuesta por cada cambio
en la cantidad de reactante. En un gráfico de dosis respuesta, la sensibilidad es la pendiente de
la curva en un punto determinado; debido a que muchas veces las curvas dosis-respuesta son
sigmoideas, la sensibilidad no es constante. El límite de detección se define como la mínima
cantidad de inmunorreactante que puede detectar el sistema.
Un elemento esencial es establecer el valor de discriminación entre una muestra positiva y

una muestra negativa. Este valor se denomina valor de corte o “cut-off”. En los inmunoensayos,
los sueros negativos muestran un comportamiento que se asemeja a una distribución normal,
pero presentan un sesgo positivo o tendencia a producir valores de absorbancia o títulos mas
Puede calcularse el desvío standard,
altos que los esperados si siguieran una distribución normal.
DS, como:
(DS)2 =∑(Xi – m)2

n–1
n: nº de sueros negativos analizados

m: media aritmética
Xi: absorbancia de cada suero
Otro aspecto es la confiabilidad de un resultado, ya sea positivo o negativo. Para muestras

positivas se define la sensibilidad como la habilidad de un ensayo de mostrar como positiva a
una muestra que realmente es positiva (este término no debe confundirse con la “sensibilidad
del ensayo “ definida anteriormente). La especificidad es la habilidad del ensayo de mostrar
como negativa a una muestra que realmente es negativa. En términos matemáticos se pueden
escribir como:
Sensibilidad = positivos en el ensayo x 100

positivos en el ensayo + falsos negativos
Especificidad = negativos en el ensayo x 100

negativos en el ensayo + falsos positivos
Los positivos en el ensayo son las muestras positivas que el ensayo detecta como
positivas. Los falsos negativos son las muestras que en realidad son positivas pero que el
ensayo muestra como negativas. Los negativos en el ensayo son las muestras negativas que el
ensayo detecta como negativas y los falsos positivos son las muestras que en realidad son
negativas pero que el ensayo detecta como positivas. Obviamente, es necesario disponer de un
lote de muestras positivas y negativas conocidas para calcular estos parámetros.
La confiabilidad en el positividad: C(+) es la probabilidad de que una muestra detectada

como positiva por el ensayo sea realmente positiva. Del mismo modo la confiabilidad en la
negatividad, C(-) es la probabilidad de que una muestra que el ensayo detecta como negativa
sea realmente negativa. En términos matemáticos se puede escribir como:
Confiabilidad (+)= positivos en el ensayo x 100

positivos en el ensayo + falsos positivos
Confiabilidad (-)= negativos en el ensayo x 100

negativos en el ensayo + falsos negativos
A modo de ejemplo, si en 1000 muestras 20 son positivas, y el ensayo posee una

sensibilidad del 90 % significa que el ensayo detectará como positivas a 18 de las 20 muestras
(2 son falsos negativos). Si además se sabe que la especificidad del ensayo es del 90% significa
que detectará 882 como negativas (98 falsos positivos). Luego la C(+) = 15,5% y la C(-)= 99,8%.
Si en cambio de 1000 muestras 300 fueran positivas, el mismo ensayo tendría una C(+)= 79,4%
y una C(-)=95,5%.
El valor de corte o cut off del sistema debe elegirse de modo tal que minimice los
resultados falsos, ya sean positivos o negativos. En muchos casos existe una zona de
solapamiento en donde no puede establecerse con certeza si una muestra que cae en esa zona
es negativa o positiva; en estos casos se elegirá un valor de corte de manera tal de tener más
falsos positivos o falsos negativos, según que tipo de error produzca consecuencias menos
graves.
Se puede establecer el valor de corte como

la reactividad media de los sueros negativos
(Absorbancia, miliV, etc) más 2 o 3 DS.
Los test de screening empleados para la búsqueda de drogas en Toxicología se
caracterizan por elegir un valor de corte tal que no se produzcan falsos negativos. Es por eso
que los resultados positivos deben ser confirmados por otras técnicas.
Los ensayos inmunológicos de mayor uso en Toxicología son aquellos destinados a la

búsqueda de drogas de abuso y algunos fármacos en orina (opiáceos, cocaína, benodiazepinas,
anfetaminas, dextropropoxifeno, fenciclidina, metadona, barbitúricos, tetrahidrocannabinol, ácido
lisérgico, antidepresivos tricíclicos, etc.). También aquellos que permiten la cuantificación de
etanol en sangre, el monitoreo de algunas drogas terapéuticas en plasma (ciclosporina,
metotrexato, difenilhidantoína, fenobarbital, carbamazepina, ácido valproico, digoxina, teofilina,
paracetamol, etc.) Otros compuestos analizados son ciertos plaguicidas en agua y suelo
(endosulfan, carbofurano, aldicarb, endrin, dieldrin). Se utilizan también para la determinación
semicuantitativa de micotoxinas en alimentos (aflatoxinas, zearalenona y ocratoxina) e incluso
la actividad de algunas enzimas como la acetilcolinesterasa.
La sensibilidad de los inmunoensayos ópticos es comparable a la de Cromatografía

Gaseosa. Sin embargo la especificidad es menor, ya que pueden existir reacciones cruzadas de
los anticuerpos empleados, con sustancias que posean una estructura química similar a la del
analito en cuestión. Además, como ciertos anticuerpos están destinados a la determinación de
familias de fármacos, debe tenerse en cuenta que no todos los compuestos incluidos en la
misma familia tendrán la misma reactividad con el anticuerpo.
Los marcadores generalmente empleados en nuestro medio son:

• Isótopos radiactivos (RIA: Radioimmunoassay)
• Enzimas (ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, EMIT: Enzyme Multiplied
Immunoassay Technique)
• Sustancias Fluorescentes (FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay)
• Oro Coloidal (AMIA: ASCEND MultImmunoassay)
De todos ellos el RIA posee el mayor límite de detección (del orden del picogramo /
mililitro). Sin embargo posee algunas desventajas que han llevado a su reemplazo por alguno de
los demás inmunoensayos (cuyos límites de detección están en el orden de los nanogramos /
mililitro). Los reactivos empleados en el RIA son de corta vida media, por ejemplo un trazador
radiactivo marcado con yodo tiene una vida media de 60 días, mientras que un conjugado
enzimático usado en ELISA suele conservarse en buen estado durante años. Además se corre
el riesgo de contaminación producida por el manejo de isótopos radiactivos.
Los radioinmunoensayos (RIA, RRA) fueron los primeros en desarrollarse. Sin embargo,
son los que presentan más problemas de manipulación ya que se trabaja con isótopos
radiactivos que presentan una serie de riesgos para la salud además de producir una serie de
desechos radiactivos que hay que eliminar apropiadamente. Por ello, a pesar de su gran
sensibilidad se han visto desplazados por los enzimoinmunoensayos y por los inmunoensayos
de fluorescencia.
El fundamento del análisis por radioinmunoensayo (RIA) es la competencia entre el

antígeno sin marcar por el sitio de un anticuerpo que puede estar ocupado por un antígeno
marcado radiactivamente, seguida por la separación de los antígenos unidos y libres y la medida
de sus concentraciones. La probabilidad que una molécula marcada o sin marcar se una al
anticuerpo depende de su concentración. Se puede construir una curva de dilución isotópica
mediante la adición de cantidades cada vez mayores del compuesto sin marcar, manteniendo
constante la concentración del antígeno marcado. La concentración del compuesto se determina
a partir de la curva de calibrado construida. Se trata de un inmunoensayo heterogéneo por lo
que antes de realizar la medida de radiactividad hay que separar el complejo Ag-Ac sin marcar
del Ag libre y del complejo Ag-Ac sin marcar.
Este método se utiliza en la determinación de los metabolitos urinarios de morfina, capaz

de diferenciar entre codeína, morfina glucurónido y morfina, cocaína, buprenorfina y digoxina. La
principal desventaja del RIA es que para realizar el análisis de varias sustancias habría que
realizar tantos análisis como sustancias que se quieran determinar.
Los enzimoinmunoensayos mas difundidos son el ELISA (Enzyme linked inmunosorbent

assay) y el EMIT (Enzyme multiplied inmunoassay technique). El ELISA es un inmunoensayo
enzimático competitivo y heterogéneo. La actividad enzimática se mide por la conversión
catalizada enzimáticamente de un compuesto incoloro o no fluorescente en uno coloreado o
fluorescente. Tiene el mismo fundamento que el RIA pero no utiliza marcadores radiactivos.
Se desarrollaron varios inmunoensayos para la determinación de algunos plaguicidas en

agua y suelo (endosulfan, carbofurano, aldicarb, endrin, dieldrin), para drogas de abuso
(barbitúricos, benzodiazepinas, anfetamina, metanfetamina, morfina, opiáceos, metabolitos de la
cocaína, fenciclidina y LSD) en sangre y suero. La sensibilidad y especificidad de estos
enzimoinmunoensayos son similares a los obtenidos por RIA.
El EMIT es la técnica de inmunoensayo con mayor aplicación en el análisis de fármacos

o drogas de abuso. Los ensayos EMIT están basados en la unión competitiva a proteínas, pero
no requiere el uso de radioisotópos y tampoco la separación de las fracciones libres y unidas
antes de realizar las medidas de actividad enzimática. Se trata, por tanto, de un inmunoensayo
enzimático competitivo homogéneo en el que se mide la absorbancia a 340 nm de la reacción
producida por el paso de NAD a NADH, que es el cofactor necesario para que la enzima
glucosa-6P-deshidrogenasa actúe sobre su sustrato.
Los ensayos de EMIT se diseñaron originalmente para el análisis de muestras de orina,

pero posteriormente se han desarrollado algunos reactivos para suero. No hay que someter a
dichas muestras a ningún tratamiento previo antes de analizarlas mediante este inmunoensayo.
No requiere realizar la hidrólisis previa en muestras de orinas dado que el anticuerpo marcado
reacciona con los glucurónidos de las drogas. Actualmente es un técnica fácil y rápida de
realizar y está automatizada. La sensibilidad de esta técnica es similar a la cromatografía
gaseosa, sin embargo su especificidad es menor ya que pueden aparecer reacciones cruzadas
de los anticuerpos empleados en el análisis con sustancias que posean una estructura química
similar a la del analito en cuestión. Además, como ciertos anticuerpos están destinados a la
determinación de familias de fármacos, hay que tener en cuenta que no todos los compuestos
incluidos en la misma familia tendrán la misma reactividad con el anticuerpo.
La aplicación de los ensayos de ELISA, FPIA y AMIA se describe en detalle en el capítulo

correspondiente a Psicofármacos y otras drogas medicamentosas.
B)- TÉCNICAS CROMATOGRAFICAS
La búsqueda de TOF mediante técnicas cromatográficas, como TLC (Thin Layer

Chromatography), HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography), HPLC (High
Pressure Liquid Chromatography), GC (Gas Chromatography), etc. se caracteriza porque antes
de aplicarlas es necesario separar las drogas de la matriz en la que se encuentran inmersas
mediante alguna técnica de extracción. En la práctica esto se logra siguiendo una serie de
pasos, como los que se describen a continuación.
1- Preparación de la muestra: es un paso crucial en los análisis. Involucra la homogenización

de la muestra, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de hidrólisis (ácida, básica o enzimática),
precipitación, centrifugación, etc. de modo tal que se facilite el aislamiento de la sustancia de
interés.
2- Aislamiento del analito: se puede llevar a cabo mediante extracción líquido-líquido (en
tubos, en ampollas de decantación o en columnas de tierra de diatomeas) o extracción en fase
sólida (columnas de SPE) de acuerdo a las disponibilidades del laboratorio. En este paso se
remueve el analito de su matriz original para obtenerlo en la mayor concentración posible,
estabilizarlo (ya que en su matriz original puede degradarse química o enzimáticamente) y
eliminar interferencias.
3- Concentración del extracto: el objetivo de este paso es colocar el analito en el menor

volumen posible para aumentar la sensibilidad del análisis. Se deben usar condiciones
controladas, idealmente una temperatura menor de 40ºC y corriente de nitrógeno.
Durante las operaciones antes mencionadas se debe tener sumo cuidado para evitar
pérdidas por volatilización, oxidación o absorción en los precipitados, ya que frecuentemente los
productos a identificar están presentes en cantidades menores del µg/ ml. Las pérdidas por
volatilización de sustancias básicas como anfetaminas puede prevenirse cuidando la
temperatura y salificando el extracto con ácido clorhídrico al 1 % en metanol.
4- Identificación del analito: existen diferentes niveles de complejidad dependiendo de las

técnicas que se utilicen para su identificación. Así existe un nivel primario que utiliza técnicas
como Cromatografía en Capa Delgada (TLC), Espectrofotometría UV, además de reacciones de
coloración para la orientación, etc. Un nivel secundario involucra técnicas tales como la
Cromatografía de Gases (GC) y la Líquida de Alta Resolución (HPLC) tanto para Screening
como para la determinación de una droga en particular y un nivel terciario que utiliza la
Espectrometría de Masas acoplada a un a Cromatografía separativa como la de Gases o
Líquida de Alta Resolución (GC/MS o HPLC/MS).
5- Cuantificación del analito: una vez identificado el analito la cuantificación del mismo se
puede realizar por una técnica directa, bien ajustada y utilizando patrones de referencia puros
para análisis. Esta técnica directa generalmente es una técnica cromatográfica gas-líquido o
líquido-líquido y la espectrometría acoplada a estas dos anteriores.
Cada uno de estos pasos merece un capítulo aparte dentro de la Toxicología. Por ende
sólo se pretende citar sus características principales haciendo hincapié en los detalles técnicos
más relevantes.
3.3.2 Acondicionamiento de la Muestra.
El primer paso en las técnicas de análisis de TOF consiste en la homogeneización de la

muestra por simple agitación del recipiente que la contiene. La turbidez que presentan muchas
muestras de orina podría causar una serie de problemas en los pasos posteriores, como el
taponamiento de columnas de extracción o la interferencia en métodos inmunológicos. Es por
ello que, luego de la homogeneización, es conveniente centrifugar o filtrar las muestras. En
general, no se aconseja descartar los precipitados debido a la posibilidad de adsorción de
algunas drogas.
En el caso de muestras de sangre entera o plasma varias técnicas recurren a la

desproteinización de las mismas mediante el empleo de sales (sulfato de amonio y tungstato de
amonio), ácidos (ácido tricloroacético) o solventes orgánicos (acetona, acetonitrilo, metanol y
etanol). La finalidad de este paso es romper la unión proteína – droga y evitar además el
taponamiento de los sistemas de extracción en ampolla o columna, por la formación de
agregados de proteínas desnaturalizadas. En caso de recurrir a cambios drásticos de pH se
debe considerar la estabilidad de algunas drogas (benzodiazepinas e.g).
Luego, el requisito más importante para extraer los analitos con solventes orgánicos es el
ajuste de pH. Es necesario mantener los ácidos y bases débiles en su forma no disociada (no
ionizada) para favorecer su pasaje desde la matriz acuosa, en la que generalmente se
encuentran, a la fase orgánica. Con este fin, para la extracción de ácidos débiles se acidifica la
muestra (con HCl 25% por ejemplo) hasta a un pH: 2-3 mientras que para la extracción de bases
débiles se busca un pH: 8 – 8,5 con bicarbonato de sodio, mientras que las bases fuertes se
extraen a pH mayor de 9 (por ejemplo, con NaOH 30% o NH3 concentrado).
El conocimiento del metabolismo de las drogas permite mejorar el aislamiento de varias

que, se sabe, se eliminan por orina conjugadas con ácidos glucurónico o sulfúrico. Tal es el caso
de las benzodiacepinas, metacualona, fenotiazinas, morfina, codeína y cannabinoides. En la
búsqueda particular de alguna de estas sustancias es imprescindible llevar a cabo una hidrólisis
química (ácida o alcalina) o enzimática (beta glucuronidasa y/o aril sulfatasa) de la orina. En
este último caso es de suma importancia respetar las condiciones de pH, temperatura y tiempo
en el cual la enzima desarrolla su máxima actividad, de acuerdo a la marca comercial utilizada.
3.3.3 Métodos de Extracción.
3.3.3.1 Extracción en Ampolla de Decantación.
La ampolla de decantación es el sistema clásico para realizar extracciones. En ella se

ponen en contacto una muestra (generalmente acuosa) y un solvente de extracción
(generalmente orgánico y liposoluble) elegido de manera tal que los componentes buscados
tengan la máxima solubilidad posible en él. Ambas fases deben ser inmiscibles entre sí y
presentar distinto peso específico para que se separen fácilmente en dos capas. La distribución
(partición) de un analito entre 2 líquidos inmiscibles está representada por el equilibrio:
[A]o [A]aq Donde [A]o : concentración del analito en fase orgánica

y [A]aq : concentración del analito en fase acuosa
La partición está dada por la relación de concentraciones del analito en ambas fases. Es
decir:
P= [A]o
[A]aq
siendo P el coeficiente de partición de actividades de A. Depende del solvente orgánico, de la

temperatura y para solutos ionizables del valor del pH del medio acuoso.
Las sustancias neutras de características no polares pueden extraerse directamente desde

sistemas acuosos a orgánicos, mientras que, las sustancias con características ionizables,
requieren la supresión de su disociación modificando el valor del pH del medio. Por ello los
analitos ácidos se extraen después de la acidificación de la muestra y los básicos después de su
alcalinización.
El proceso consiste simplemente en agitar manualmente durante 30 segundos-1 minuto la

mezcla y luego dejar separar las fases por decantación por efecto de sus pesos específicos.
Este método de extracción en ampolla presenta serias desventajas:

• durante la agitación con disolventes orgánicos se forman fácilmente emulsiones que
dificultan la separación de fases ocasionando considerables pérdidas de las sustancias
buscadas, requiriendo la centrifugación para terminar la emulsión.
• en cada extracción se recupera, aproximadamente, sólo el 70 % del analito buscado. Es
decir, se necesitan tres extracciones para recuperar 97,3% del analito, pero ello significa un
consumo de solvente 3 veces mayor además de aumentar el tiempo de análisis.
• el extracto obtenido debe secarse (con sulfato de sodio anhidro) para eliminar restos de
fase acuosa, antes de proceder a su concentración por evaporación.
• las impurezas presentes en la matriz se reducen, pero no se eliminan totalmente y
permanecen en el extracto final.
En resumen, la pérdida de analitos debido a la pobre recuperación sumado al alto
consumo de solventes de extracción, junto con otras muchas razones como practicidad y
rapidez de operación, hacen que las ampollas de decantación se vean seriamente
reemplazadas por los sistemas de extracción en columna.
3.3.3.2 Columnas de Extracción Líquido – Líquido.
El paso de extracción puede simplificarse usando columnas de tierra silícea. Estas

columnas basan su funcionamiento en la partición líquido-líquido. El relleno consiste en tierra
silícea, de estructura granular y gran volumen de poro. La columna queda cerrada en el extremo
superior por una cestilla provista de una hoja de papel de filtro y en el extremo inferior, por papel
de filtro. La velocidad de elución se controla mediante una cánula colocada sobre la boca cónica
de salida. (Fig. 3.2)
Fig. 3.2
Columnas
Extrelut NT
El procedimiento consiste en aplicar una muestra acuosa en la columna, la cual pasa a ser
la fase estacionaria distribuida dentro los poros del relleno. Aproximadamente el 90 % del
volumen de relleno queda humedecido, mientras que el 10% restante se mantiene seco y activo
en la parte inferior de la columna, destinado a secar el eluato.
Luego de 15 minutos de espera para lograr el acondicionamiento de la columna, se añade

un solvente orgánico inmiscible con el agua. La fase acuosa se mantendrá fija sobre el soporte
mientras que todas las sustancias lipofílicas serán extraídas de la fase acuosa a la orgánica.
Es decir, en la primera parte del relleno (90%) los analitos de interés se solubilizan en la
matriz polar acuosa de la muestra, pero como tienen baja o a lo sumo mediana polaridad, su
retención física en los poros es mucho menos firme que la de moléculas interferentes más
polares del resto de la matriz.
Al añadirse el solvente orgánico, arrastra a los analitos hacia abajo, debido a su afinidad
con ellos. Este flujo enriquecido en las sustancias de interés, encuentra la segunda porción
(10%) de poros de tierra silícea aún secos. Debido a estos poros aún activos, cambia la relación
de velocidades de elución de los distintos componentes: las moléculas polares (entre ellas el
agua y gran parte de las impurezas) son atraídas con gran fuerza, y se adhieren a los poros por
adsorción; mientras que los analitos de interés continúan su avance hacia abajo junto al solvente
de extracción, recuperándose con un rendimiento del 90% o más. Gracias a este último paso, el
eluato obtenido se encuentra libre de humedad y puede evaporarse directamente sin necesidad
de una etapa de secado previa a su concentración.
Esta técnica ofrece importantes ventajas en comparación con la extracción en ampolla de

decantación en la cual, como se mencionó anteriormente, es necesario recurrir a varias
agitaciones para proceder a una extracción cuantitativa, la fase orgánica debe secarse y a
continuación concentrarse. En cambio en estas columnas:
• las muestras no necesitan ser agitadas durante las extracciones evitándose la formación
de emulsiones y por ende la pérdida de analitos.
• el eluato no requiere un secado previo al proceso de concentración,
• el extracto obtenido contienen un bajo número de impurezas, tales como pigmentos
urinarios, lípidos y otros compuestos metabólicos que podrían dificultar el análisis,
especialmente si sólo hay trazas de la sustancia buscada (nanogramos),
• se logra una extracción cuantitativa, con una recuperación del 90% o más, en un solo
paso lo cual implica un importante ahorro de disolventes orgánicos, con reducción de los costos,
• la elución transcurre automática y rápidamente disminuyendo notablemente el tiempo en
los análisis, sobre todo cuando se trabaja con muchas muestras simultáneamente,
• se puede efectuar una extracción secuencial a valores de pH diferentes en dos etapas,
• se admite la posibilidad de automatización o robotización para realizar las extracciones,
• es posible transportar la columna con la muestra aplicada para realizar un análisis diferido.
En resumen, en corto tiempo se obtendrán eluatos de gran pureza con altos porcentajes
de recuperación y por ende muy buena sensibilidad analítica. Sin embargo, el empleo de estas
columnas tiene ciertas limitaciones. Por ejemplo, los interferentes polares son eliminados
fácilmente, pero no pueden eliminarse los componentes de menor polaridad que la de los
analitos de interés, los cuales pasarán indefectiblemente al eluato.
Además, debido a las características de su relleno posee un campo limitado de aplicación
en la búsqueda de drogas de cualquier constitución. Prácticamente, por su funcionamiento, casi
no tiene en cuenta el distinto grado de ionización de los analitos durante las extracciones,
causados por cambio de pH o fuerza iónica, con lo cual se pueden modificar las retenciones a
voluntad en los sistemas de extracción en fases sólida (SPE) que se describen a continuación.
3.3.3.2 Columnas de Extracción en Fase Sólida (SPE).
Las columnas de SPE (Fig. 3.3) permiten aislar compuestos de interés a partir de una
matriz biológica compleja o que contiene sustancias interferentes, en alto grado de pureza y con
un alto porcentaje de recuperación. Sin embargo el principio de extracción es muy diferente al
de las columnas con tierra de diatomeas.
Las columnas de SPE contienen un empaquetamiento de silica químicamente enlazada a

distintos sustituyentes, de modo tal que se aprovechan las interacciones polares, no polares o
basadas en intercambio iónico entre los componentes de la muestra, el adsorbente sólido y el
eluyente apropiado.
Las columnas se elaboran en polipropileno para asegurar su inercia química. En su parte

inferior se coloca el relleno, comprimido suavemente entre dos fritados de micro-fibra de vidrio,
químicamente inertes. En su parte inferior la columna se estrecha, ajustándose en el adaptador
individual que forma parte de la tapa del sistema extractor.
Fig. 3.3
Columnas SPE.
Un sistema extractor clásico (Fig. 3.4) consta de una cámara de vidrio transparente de
forma rectangular, con tapa que permite asegurar el vacío en el interior del sistema. En uno de
los costados lleva un tubo de salida, una válvula de regulación de vacío y un manómetro.
Fig. 3.4:
cámara de
vacío para
SPE.
Cuando toda la muestra se encuentra en el interior de la columna se realiza el lavado para

que termine de eluir la matriz; fuera del relleno se observa sólo el solvente de lavado. La elución
selectiva del primer grupo de analitos se colecta en un vial. Luego se cambia el vial y se procede
a la segunda elución selectiva, con una nueva mezcla de solventes de pH y polaridad
adecuados.
La extracción en fase sólida está cada vez más extendida, pues proporciona una
extracción más rápida y selectiva y requiere menores volúmenes de disolvente orgánico. La
utilización de sílice ligada para la extracción de muestras parte de su empleo en HPLC.
La extracción en fase sólida es una técnica cromatográfica que implica la partición de

compuestos entre una fase sólida y una fase líquida, debiendo el compuesto a extraer tener
mayor afinidad por la fase sólida que por la matriz de la muestra y al mismo tiempo ser
fácilmente extraible por un pequeño volumen de disolvente. Una típica secuencia de extracción
incluye acondicionamiento, aplicación de la muestra, lavado y finalmente elución del analito.
La mayoría de las fases ligadas disponibles comercialmente son tipo siloxano, se

preparan por reacción de los grupos silanoles libres del gel de sílice microparticulado con un
modificador, lo que ha permitido desarrollar distintos tipos de fases estacionarias que pueden
clasificarse según el grupo funcional en apolares, polares o de intercambio iónico.
A finales de los 80 se desarrollaron las llamadas fases de función mixta, en las que parte
de los grupos silanoles se han hecho reaccionar con cadenas alquílicas de longitud intermedia y
otra parte con sustituyentes que permiten el intercambio catiónico, por lo que se pueden dar
interacciones de tipo polar y apolar.
La aparición de este tipo de columnas ha permitido que la extracción en fase sólida, que
en principió se utilizó únicamente para la extracción de compuestos concretos o familias de
compuestos, se esté aplicando de forma generalizada en la sistemática analítica toxicológica de
todo tipo de muestras. Las fases mixtas son capaces de retener a un pH adecuado a las
sustancias ácidas y neutras por interacciones hidrofóbicas con las cadenas alquílicas y a las
sustancias básicas por interacciones con los grupos de intercambio catiónico. La elución
diferencial se lleva a cabo por el ajuste adecuado de pH y la elección correcta del disolvente. En
caso de muestras especialmente sucias se pueden utilizar secuencialmente dos columnas, con
fases iguales o diferentes, para primero eliminar interferencias como grasas o pigmentos biliares
y proceder después a la extracción propiamente dicha.
Los factores críticos a tener en cuenta al afrontar una extracción en fase sólida una vez
establecido el procedimiento son el ajuste del pH, la velocidad de flujo en las distintas etapas y
el control de los tiempos de secado. También hay que tener en cuenta que pueden existir
variaciones en la manufactura de las columnas de un mismo o diferente lote comercial, que
puede ser la causa de variaciones en los rendimientos. De ahí la importancia del empleo de un
estándar interno adecuado (Bogusz y col. 1996).
Recientemente se ha dado un paso más en la extracción en fase sólida, son los discos
de extracción en fase sólida, cuya principal ventaja es la reducción en el volumen de muestra y
de disolvente. Se han publicado los primeros trabajos sobre la aplicación de estos discos a la
sistemática analítica toxicológica de muestras de orina con resultados satisfactorios (de Zeeuw y
col. 2000).
La extracción por head-space consiste en inyectar directamente en el cromatógrafo de

gases la muestra tomada de la cámara de aire de un vial herméticamente cerrado donde se ha
colocado la muestra. Es únicamente aplicable a compuestos volátiles y no consigue concentrar
la muestra, pero es altamente selectiva y la manipulación de la muestra es mínima, requiriendo
sólo un simple calentamiento o la adición de una sustancia que favorezca la volatilización. Esta
es la técnica de elección para el análisis de tóxicos tan importantes como el etanol, metanol o
monóxido de carbono, pero no es aplicable a la sistemática analítica toxicológica.
Una modalidad con grandes perspectivas es la microextracción en fase sólida, que

podría considerarse como una combinación entre el head-space y la extracción en fase sólida.
En un principio se utilizó únicamente para la determinación de compuestos volátiles en aguas,
hoy en día su aplicación se ha extendido a todo tipo de muestras, incluso sólidas, y para
compuestos con distinto grado de volatilidad (Santos y col. 1996, Nagasawa y col. 1996, Jinno y
col.1996, Moder y col. 1997, Chen y col. 1997, Jurado y col. 2000).
En la microextracción en fase sólida los analitos son adsorbidos directamente desde la

muestra a una fibra de sílice fundida ligada químicamente con la fase estacionaria apropiada. La
fibra está incluida en el émbolo de una jeringa especial. Para que se produzca la adsorción la
fibra entra en contacto con la muestra, directamente o con el espacio en cabeza, durante el
tiempo adecuado y a la temperatura que se establezca como óptima. Los analitos se desorben
térmicamente en el bloque de inyección del cromatógrafo de gases o en una interfase que
permita la elución de los analitos por la aplicación de la fase móvil. Esta conexión con la
cromatografía líquida de alta resolución abre el campo de aplicación de este tipo de extracción.
Aunque hoy en día su aplicación se limita a familias concretas de compuestos,

mencionaremos también la extracción por inmunoadsorción. Se basa en la interacción selectiva
entre el anticuerpo y el analito por lo que permite una extracción altamente selectiva,
aumentando la sensibilidad y la recuperación. No es necesario el pretratamiento de la muestra
para la liberación de los conjugados y permite la inyección directa en HPLC
3.3.3.3- Concentración del Extracto.
Los extractos obtenidos por cualquiera de los procedimientos antes descriptos, deben ser
reducidos a un volumen menor, para aumentar la concentración de los analitos presentes, e
incluso llevados a sequedad para redisolverlos posteriormente en un solvente más adecuado
según la técnica de identificación que se seguirá. Esta operación requiere que los analitos sean
estables térmicamente y que no se volatilicen junto con el solvente. El método usual consiste en
colocar los viales en placas calefactoras (temperatura menor de 40 ºC) y bajo corriente de
nitrógeno. El método de elección es la utilización de la evaporación a presión reducida en
rotavapor, lo que permite eliminar el solvente a bajas temperaturas (40 °C).
4- Identificación y Cuantificación mediante Cromatografía.
Según la IUPAC, la cromatografía es un método usado para la separación de los

componentes de una muestra, mediante su distribución en dos fases: estacionaria (FE) y móvil
(FM). La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido retenido sobre un soporte sólido. La
fase móvil puede ser un gas o líquido (o un fluido supercrítico). En base a la FM los sistemas
cromatográficos se dividen en:
• de Fase Gaseosa, internacionalmente GC (Gas Chromatography) y

• de Fase Líquida, denominados LC (Liquid Chromatography)
El principio común a todas ellas es el siguiente: un fluido (fase móvil) circula a través de la
fase estacionaria y cuando una mezcla de sustancias se introduce en el sistema se produce una
serie de equilibrios de distribución entre las dos fases, generalmente de distinta magnitud para cada
componente de la mezcla, por lo que cada uno de ellos se desplazará con diferente velocidad
(dependiendo de sus solubilidades, valores de pKa, capacidad de formar puentes de hidrógeno,
etc.) a lo largo del sistema.
La cromatografía en fase líquida puede llevarse a cabo en columna, donde la mezcla a

separar se desplaza en una dirección preferencial sobre las otras dos o bien, puede tratarse de
una técnica planar, cuando dicho movimiento se realiza sobre un plano donde prevalecen dos
direcciones sobre la tercera. De este modo la Cromatografía Líquida de Alta Presión, HPLC
(High Pressure Liquid Chromatography) es un procedimiento en columna, mientras que las
técnicas de capa fina, CCD o TLC (Thin Layer Chromatography) o capa fina de alta resolución,
HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) son procedimientos planares.
4.1- Cromatografía en Capa Delgada (CCD o TLC).
La CCD es una de las técnicas más ampliamente usadas para la separación e

identificación de drogas. Permite en ciertos casos también, determinar semicuantitativamente
los compuestos de una muestra. Se trata de un procedimiento no destructivo de los
componentes a investigar, accesible a la mayoría de los laboratorios por su simplicidad y bajo
costo.
Las muestras a investigar pueden consistir en soluciones, sólidos disueltos o extractos

obtenidos en los procedimientos de aislamiento ya descriptos. La técnica de CCD involucra
diferentes pasos, denominados: preparación de la placa, aplicación de la muestra, corrida de la
placa y ubicación de las manchas.
Aunque pueden prepararse en el laboratorio, en la actualidad se usan placas comerciales.

Las FE están constituidas por partículas irregulares con poros en su interior. Estos rellenos se
extienden uniformemente en una capa delgada de 250 um (las más usadas), 200 um, 150 um o
100 um sobre un soporte de vidrio de 2 mm, sobre un folio de aluminio de 0.2 mm o sobre un
folio de poliéster de 0.5 mm de espesor. Las placas suelen tener un tamaño de 20 cm x 20 cm
pudiendo cortarse del tamaño elegido (particularmente los folios con una tijera).
Existen varios tipos de FE que se diferencian en su porosidad, espesor, granulometría. Se

describen a continuación las más utilizadas.
SILICA GEL: se trata de ácido silícico hidratado y por lo tanto débilmente ácido. Las placas
tienen una distribución uniforme de tamaño de partícula, normalmente de 20 um de diámetro. La
adherencia a la placa se logra mezclando un agente de unión con la FE. Cuando se usa sulfato
de calcio (gypsum) como ‘”unidor”, las placas se denominan sílica gel G. Las placas más fuertes
usan un unidor orgánico. Las placas pueden almacenarse una sobre otra ya que la capa
adsorbente es muy dura.
ALUMINA: (óxido de aluminio). Es un adsorbente débilmente básico. Tiene menos aplicaciones

que la sílica y necesita ser activado para obtener buenas separaciones.
KIESELGUHR: se trata de ácido silícico amorfo existente en la Naturaleza. Proviene de los

esqueletos de diatomeas (algas microscópicas) y por ello se denomina frecuentemente “tierra de
diatomeas”. Posee menos propiedades adsortivas que la sílica.
FLORISIL: se trata de silicato de magnesio, se usa únicamente para separaciones de

pesticidas o eliminar compuestos altamente polares cuando otros adsorbentes han fallado.
CELULOSA: usa procesos de partición para la separación. Las placas de celulosa

generalmente corren mucho más lentamente que las placas de sílica del mismo espesor.
Para procedimientos de adsorción, las capas deben tener la mayor actividad posible en los
poros. Para ello se someten placas y folios en el momento de su fabricación, a la acción de unos
110 ºC en estufas secadoras continuas, desalojando de este modo humedad, gases y
contaminantes orgánicos.
Para procedimientos de partición en cambio, las capas se inactivan química o físicamente

en sus poros, impregnándolas con diferentes reactivos hidrofobizantes. Los componentes se
separarán de acuerdo a su solubilidad en los hidrofobizantes anclados.
Los sistemas de CCD de partición de FASES REVERSAS están constituidos por placas
cubiertas con partículas de sílica a cuyos grupos hidroxilos se les han unido cadenas
hidrocarbonadas de varias longitudes y utilizan fases móviles conteniendo agua. Poseen un alto
poder de resolución y son comercialmente reproducibles. La fase más popular es aquella unida
con cadenas de C18 (octadecil) de 12% p/p sobre la sílica. Las fases móviles generalmente
empleadas son las mezclas de metanol: agua o acetonitrilo: agua y las propiedades de estas
CCD se correlacionan bien con los sistemas HPLC usando similares FE.
La muestra se aplica dibujando con un lápiz una línea a 1,5 cm del borde inferior de la
placa. Sobre esta línea de origen se aplicarán los extractos separados 1 cm uno de otro. La
muestra, (usualmente 1 – 10 ug) es aplicada en un pequeño volumen de solvente (1 a 10 ul) con
micropipeta o a través de un tubo capilar o una microjeringa. Lo importante es que la mancha no
supere los 4 mm de diámetro, sino se perderá resolución. La superficie de la placa no debe ser
cortada o agujereada por el aplicador.
El solvente usado para aplicar la mancha debe ser volátil y tener baja polaridad de modo
que la mancha no difunda mucho. El solvente puede aplicarse en alícuotas y secar naturalmente
o por aplicación de aire caliente. Es importante que la mancha esté seca al final de la siembra,
especialmente si la solución contenía agua.
La mayoría de los compuestos orgánicos son incoloros, razón por la cual deben hacerse
visibles, preferiblemente con una técnica no destructiva. Es por ello que algunas placas poseen
en su composición de FE un indicador fluorescente. Se trata de metasilicatos de Al, Zn, Co, de
gran polaridad, distribuidos en los poros de todo el absorbente y que no serán eluidos.
La siembra se controla examinando la placa bajo luz de onda corta (254 nm), el indicador
se excita y fluoresce a 561 nm observándose un fondo verde azulado en la placa. Los analitos
presentes en la placa tapan al indicador al cual no le llegará luz, por ende no fluoresce y los
compuestos pueden localizarse como manchas oscuras sobre el fondo verde.
Si se ilumina la placa con luz UV de mayor longitud de onda (366 nm), las drogas con
fluorescencia natural pueden ser vistas, independientemente de la presencia de un indicador.
Es el caso, por ejemplo, de las aflatoxinas.
ELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL Y CORRIDA DE LA PLACA.
La fase móvil esta constituida generalmente, por uno o varios solventes orgánicos. Cuando
las drogas son aniones o cationes fuertes corren mejor si se añade a la FM pequeñas
cantidades de ácidos o álcalis para formar pares iónicos. Como regla, se utilizan solventes
fáciles de obtener en forma pura y de bajo costo, estables al aire o cuando se mezclan con
ácidos y bases. Dichos solventes no deben reaccionar con las sustancias a separar y deben ser
fácilmente removidos de la placa después de la corrida cromatográfica.
Una vez que la FE ha sido elegida, es fundamental tener en cuenta la polaridad de la FM,
porque de ella depende el mayor o menor desplazamiento de un componente de interés, para
separarlo de los demás analitos de una mezcla. Un buen indicador de la polaridad es la
constante dieléctrica de los solventes empleados. Los disolventes menos polares tienen
constante dieléctrica del orden de 2 (hidrocarburos saturados de cadena abierta: n-hexano, n-
heptano). Las constantes dieléctricas de los disolventes orgánicos más polares tienen valores
entre 30 y 40 (metanol, acetonitrilo). El agua tiene una constante dieléctrica de 81 y el agregado
de ácidos, álcalis o sales al agua puede incrementarla por encima de 100.
La corrida cromatográfica se lleva a cabo en una cámara de desarrollo saturada. Esta

cámara consiste en un tanque de vidrio sellado, al cual se añade la FM y se espera 30 minutos
para lograr el equilibrio con su vapor. Luego se coloca la placa en posición vertical de modo que
la línea de aplicación quede por encima del nivel de la FM (100 ml para placas de 20 cm x 20
cm).
Las placas de 20 cm se corren generalmente una distancia de 10 a 15 cm, aunque esto

puede involucrar tener que esperar hasta 2 hs. Dado que el tiempo de desarrollo aumenta
exponencialmente con la distancia recorrida, el mismo puede reducirse si las placas son
corridas sólo 5 cm, con ello se incrementa también la sensibilidad ya que las manchas no
difunden tanto, pero disminuye la resolución.
Otro tipo de cámara es la unidad sandwich en la cual la placa de TLC se coloca

horizontalmente y el solvente de desarrollo en uno de los extremos. La ventaja de este sistema
es que usa menos fase móvil, provee una rápida saturación del sistema y requiere cortos
tiempos de corrida.
Terminada la corrida, la placa es removida del tanque y la posición del frente de solvente
es rápidamente marcada con un lápiz antes de que se evapore. El solvente puede ser luego
evaporado naturalmente o bajo corriente de aire caliente.
UBICACIÓN DE LAS MANCHAS.
Las manchas distribuidas a lo largo de la placa se visualizan mediante luz UV (254 nm y

366 nm), como se mencionó anteriormente y se marcan con un lápiz. Algunas drogas no
absorberán a la luz UV debido a que no están en la forma iónica correcta sobre la placa o por su
estructura. Por ejemplo, los barbitúricos no se ven si la placa es ácida, pero se ven cuando se
rocía la placa con vapores de amoníaco. Similarmente algunas base pueden verse mas
fácilmente cuando se usan vapores de ácido clorhídrico para cambiar el pH de la placa.
Luego puede aplicarse una serie de reactivos para poner de manifiesto las sustancias
separadas en la placa, mediante la observación a simple vista de manchas coloreadas. Estos
reactivos pueden ser de acción muy general, para la visualización de cualquier droga presente,
o muy específicos para una clase de drogas (por ejemplo reactivo FPN para fenotiazinas). Entre
ambos extremos están aquellos que reaccionan con ciertos grupos funcionales y otros que
reaccionan con grupos generales de compuestos (ejemplo, Dragendorff para alcaloides).
Además hay reactivos como Marquis o Mandelin que dan un rango amplio de colores y pueden
ser muy útiles en procedimientos de identificación.
En varios casos, los reactivos pueden rociarse uno a continuación del otro, siempre que las
drogas no sean destruidas o el pH de la placa no se altere demasiado por el spray anterior. Este
procedimiento se conoce como revelado secuencial.
Los reactivos deben aplicarse a la placa como un fino aerosol usando una bomba manual
o una línea de aire comprimido. El rociador debe moverse hacia arriba y hacia abajo y cubrir
rápidamente toda la placa pero sin excederse. Es de gran ayuda anotar el cromatograma
obtenido en un papel, a medida que se avanza en el revelado, indicando la posición y el color
de las manchas.
Valores de Rf
La medida cromatográfica básica de una sustancia en TLC es el valor Rf, definido como:
Rf = la distancia recorrida por la sustancia desde el punto de aplicación
la distancia recorrida por el solvente desde el punto de aplicación
Este valor varía entre 0 y 1, siendo los más útiles entre 0,2 – 0,7. Es más práctico
multiplicar Rfx100 para evitar el uso de decimales. La distancia recorrida por la sustancia se
mide desde el centro de la mancha; en el caso de muestras “con cola” se mide el centro del área
más intensa.
Los valores de Rf son afectados por varios factores. La calidad de la fase estacionaria y la
uniformidad del espesor deben mantenerse para que no ocurran variaciones de lote a lote. El
solvente usado para aplicar las muestras debe ser removido completamente antes de correr la
placa. Además la fase móvil debe preparase con solventes puros y en forma diaria para cada
corrida si hay algún solvente volátil o higroscópico como la acetona y mantener las condiciones
de saturación de la placa durante toda la corrida.
Aunque no es necesario un control preciso de la temperatura, debe evitarse colocar la

cuba cerca de fuentes de calor, de la acción directa de luz solar, o corriente de aire. El aumento
de temperatura evaporara los solventes volátiles mas rápidamente, los solventes correrán más
rápidos y los valores de Rf decrecen ligeramente. Los valores de Rf pueden también variar
cuando se aplican grandes masas de muestra o cuando se cambia la distancia de desarrollo.
Para tener en cuenta todos lo factores que pueden afectar los valores de Rf durante una
corrida, es necesario correr en la misma placa compuestos de referencia cuyos valores de Rf
sean exactamente conocidos y luego corregir el valor de la sustancia de interés. Para concluir
que una determinada mancha coincide con alguno de los testigos empleados en el ensayo, debe
coincidir tanto en el valor de Rf como en los cambios de color en cada paso del revelado. Esto
debe cumplirse en todos los sistemas de FE/FM elegidos para su identificación.
CUANTIFICACIÓN.
Los avances en densitómetros y procesamientos de datos han permitido que la CCD sea
una técnica cuantitativa con gran exactitud (CV: 2-5%). Los densitómetros trabajan en
transmitancia, quenching de fluorescencia o reflectancia para medir absorbancia y a veces
fluorescencia. Las placas pueden leerse con alto grado de resolución y las manchas pueden ser
escaneadas varias veces para mejorar la relación señal/ ruido.
El principal inconveniente es aún la siembra de la muestra. Pero esto se soluciona con el
uso de micropipetas calibradas, o microjeringas y el uso de estándares internos.
4.2 Cromatografía en Capa Fina Bidimensional.
Si fuera necesario separar varios componentes de una mezcla de polaridad muy distinta
resulta difícil elegir una fase móvil adecuada, que permita una buena resolución de todos los
componentes. Por ejemplo dados los compuestos A, B, C y D, tras la corrida con una FM de
baja polaridad puede suceder que A y B queden muy próximos entre si y del punto de siembra.
Mientras que C y D se separan bien.
Si se eligiera como FM un solvente más polar se logrará la separación de A y B pero
probablemente C y D corran próximos a l frente de solvente. Una solución sería cambiar la fase
estacionaria (emplear celulosa, por ejemplo). O bien, se puede recurrir a una cromatografía
bidimensional. En este caso la placa es corrida en una FM de baja polaridad, de modo que se
separen C y D. Luego se seca la placa y se cambia el solvente (mayor polaridad) pero también
la dirección de corrida (giro de 90º).
Ventaja: se amplia el campo de polaridades.

Desventajas: sólo se siembra una muestra por placa y se requiere el doble de tiempo
porque son 2 corridas. (la segunda mas lenta que la primera por la mayor polaridad del solvente
que será retenido en los poros).
En la práctica, se suele llevar a cabo este tipo de CCD para la separación de Aflatoxinas,
aprovechando el sencillo revelado mediante luz UV después de cada corrida.
4.3 Cromatografía en Capa Delgada de Alta Perfomance (HPTLC).
En comparación con las placas de sílica gel de CCD, las placas de HPTLC tienen
partículas mucho más pequeñas y distribuidas en un estrecho rango de tamaño (2-7µm).
Además el espesor de la capa es más delgado (190 um). Estas características hacen que las
corridas en HPTLC sean más rápidas y más reproducibles. Además permiten obtener una
mayor resolución y una disminución del límite de detección. Son especialmente útiles para los
trabajos de cuantificación.
Comparación entre TLC y HPTLC:
Condiciones típicas TLC HPTLC

Dimensiones de la placa (cm) 20x20 10x10
Tamaño de partícula (µm) 5 - 20 2–7
Espesor de la capa (µm) 100-250 150-200
Volumen de muestra (µl) 1-10 < 0.1
Diámetro de la mancha
antes de correr(mm) <4 <1.5
después de correr(mm) 5-10 2-5
Distancia de corrida(cm) 10-15 3-6
Tiempo de corrida (min) 30-120 5-15
Número de muestras por placa 10-15 30-40
Límite de detección (absorción) ng 10-100 0.5-5
Límite de detección (fluorescencia) ng 0.1-1 0.01-0.1
Los límites de detección son para sustancias fuertemente absorbentes o fluorescentes
5- Cromatografía Gaseosa (CG).
La cromatografía gaseosa permite no sólo separar, sino también identificar y cuantificar

cada uno de los componentes de una muestra, debido al riguroso control a que se somete cada
una de las variables que intervienen en el proceso.
En este sistema la fase móvil es un gas (gas carrier o portador) pudiendo ser su fase
estacionaria un sólido o un líquido adsorbidos sobre un soporte inerte que no sean volátiles a la
temperatura de trabajo. Presenta como requisitos que las sustancias a analizar (gases, líquidos
o sólidos) sean volátiles a la temperatura de trabajo (o puedan prepararse sus derivados
volátiles mediante el uso de reactivos “derivatizantes” adecuados), que no se descompongan a
altas temperaturas y posean bajo peso molecular. En el cromatógrafo la muestra se vaporiza en
un inyector que está a elevada temperatura, donde una corriente de gas portador inerte y de alta
pureza lo arrastra por la columna. Allí tiene lugar el proceso de separación bajo condiciones
controladas de temperatura para luego pasar por un detector, cuya señal es registrada en un
cromatograma.
Esquema básico de un cromatógrafo gaseoso.
Como se observa en el esquema anterior los cromatógrafos gaseosos contienen

esencialmente:
1)- Una fuente de gas comprimido: proporciona la fase móvil (gas portador o gas carrier) cuya
finalidad es arrastrar los componentes volátiles de la muestra. Los gases más usados son:
hidrógeno, helio, nitrógeno y argón.
2)- Un regulador de presión o flujo del gas portador, cuya función es mantener constante el flujo
del mismo durante todo el proceso para obtener resultados reproducibles.
3)- Un Inyector: es un dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente del
gas portador y transformarla rápida y uniformemente al estado gaseoso. Existe cierta variedad
de diseño según el tipo de muestra que se trata de analizar. El más común es el inyector de
líquidos, que puede utilizarse para sólidos (en disolución) y gases (mediante jeringas
especiales). Se trata de una cámara situada a la entrada de la columna y calentada
independientemente de ésta (a temperatura superior al punto de ebullición del componente
menos volátil de la muestra, generalmente); suele tener una membrana de caucho a través de la
cual se introduce la muestra, con la ayuda de una microjeringa hipodérmica.
4)- Una Columna Cromatográfica: es un tubo de vidrio o metal (acero inoxidable, cobre,
aluminio, etc.) cuya longitud oscila entre 1 y 200 m, su diámetro interior puede ser desde 0,1 a
50 mm, según el tipo de columna. La separación de la mezcla se realiza en ella, siendo por
tanto, la parte más importante del equipo.
Actualmente se pueden utilizar tres tipos de columnas: empacadas, intermedias y

capilares. En términos generales las columnas empacadas tienen 2-4 m por1/4 a 1/8 pulgada de
diámetro interno. Pueden ser de vidrio o metálicas. Las columnas capilares tienen un diámetro
interno menor de 1 mm y una longitud de 2 a 100 metros. Pueden ser de acero inoxidable, vidrio
borosilicato o de sílice fundida y contienen la fase estacionaria sobre la pared de la columna
quedando la parte central vacía. Con las columnas capilares se pueden obtener resoluciones
semejantes a las columnas empacadas pero en menor tiempo, o de lo contrario se puede
obtener una mayor resolución en el mismo tiempo.
Las fases estacionarias empleadas con mayor frecuencia, debido a su universalidad, son
las relativamente no polares de silicona, como metilsilicona o 2-5% fenilmetilsilicona. También
se ha propuesto el uso de algunas fase moderadamente polares como 14% cianopropil
metilsilicona.
5)- El horno, en cuyo interior se sitúa la columna, debe poseer una buena regulación de
temperatura. Para mejorar la separación el calentamiento del horno se realiza de forma
programada, pudiendo consistir en una única rampa de temperatura o en dos y hasta cuatro
rampas.
6)- El detector. Es un dispositivo que permite medir de una manera continua una propiedad
física del gas portador, que se modifica ampliamente con la presencia de muy pequeñas
concentraciones de la sustancia a analizar (conductividad térmica, corriente de ionización,
afinidad electrónica, etc.). Genera una señal eléctrica proporcional al contenido de cada
componente de la muestra.
Los más usados en Toxicología son el detector de ionización de llama (FID), el detector de
captura electrónica (ECD) y el detector de nitrógeno-fósforo (NPD). El NPD es específico y
sensible para los compuestos que contienen átomos de N o P en su molécula, como las drogas
de abuso y medicamentos, ya que la mayoría contiene átomos de N, así como en el análisis de
plaguicidas organofosforados y carbamatos que contengan átomos de N y/o P. El ECD, es de
gran utilidad para el análisis de compuestos electronegativos con átomos de halógenos o grupos
nitro o carboxilo, como es el caso de los pesticidas organoclorados y piretroides, y el FID es
sensible a compuestos orgánicos que contengan uniones C-H en sus molécula, una de sus
características es que pueden analizarse muestras acuosas, ya que no detecta al agua.
7)- Sistema electrónico de amplificación y medida de la señal eléctrica enviada por el detector y
registrador de la misma.
Un cromatograma está compuesto por una serie de picos. Cada pico determina la
presencia de por lo menos una sustancia, y el área inscripta por debajo del mismo es
proporcional a la cantidad de dicha sustancia en la muestra inyectada.
Para identificar una sustancia se usa un parámetro llamado tiempo de retención (tr) que es
constante para cada sustancia en determinadas condiciones, y se define como el tiempo
transcurrido entre la inyección de la muestra y el momento en que se detecta su mayor
concentración (ápice del pico). También puede usarse el tiempo de retención relativo, que es el
tiempo que tarda en eluir una sustancia de la columna, con respecto al tiempo que tarda una
sustancia x en el mismo sistema. Este valor permite corregir posibles variaciones del tr durante
el desarrollo del programa cromatográfico. Existen parámetros más exactos aún como los
índices de Kovatz, que permiten estandarizar el comportamiento de las sustancias en un
determinado sistema cromatográfico.
Antes de la aplicación de la GC y de la GC/MS, se recurre frecuentemente a la

derivatización de los grupos funcionales polares (átomos de H más activos). El objeto de esta
reacción es aumentar la volatilidad, aumentar la estabilidad térmica o disminuir el limite de
detección debido a la mejora en la simetría del pico, eliminando, además de eliminar las
llamadas colas en los cromatogramas. Se mejora considerablemente la separación de
sustancias conteniendo grupos funcionales tales como –COOH, -NH, -NH2 –OH.
Para que la derivatización sea exitosa, debe ser cuantitativa y formarse un solo derivado
en forma rápida y reproducible. Los procedimientos más utilizados son la acilación, la metilación
y la silanización.
6- Cromatografía Líquida de Alta Perfomance (HPLC).
Como se mencionó anteriormente, en este sistema cromatográfico la fase móvil es un

líquido. Se puede utilizar para la separación de cualquier compuesto orgánico ya que la técnica
por HPLC no está limitada por la volatilidad ni la estabilidad térmica del analito. Se aplica, por
ejemplo, para la separación, identificación y/o cuantificación de productos farmacéuticos,
extractos vegetales, proteínas, ácidos nucleicos, aminoácidos, polisacáridos, pigmentos,
metabolitos animales o humanos, etc.
Las siglas iniciales de HPLC se debieron a “High Pressure Liquid Chromatography” pero
dado que la presión sólo constituye una herramienta que fuerza a la fase móvil a atravesar la
columna, sin constituirse en sí misma una variable del sistema, se buscó darle otro significado a
las ya tan conocidas siglas, resultando en “High Performance Liquid Chromatography”.
Los principales componentes de un cromatografo liquido son la fase móvil contenida en un
reservorio, el cual llega a la bomba que suministra un flujo continuo y constante y alcanza la
columna, pasando previamente por la válvula de inyección. La FM atraviesa la columna y
finalmente llega al detector, luego de lo cual pasa por una válvula que permite su colectado o
bien su descarga.
1)- Reservorio de solventes: es el recipiente que contiene la fase móvil (cualquier frasco de
vidrio o polímero resistente, de buena calidad, con tapa). En general se ubica por encima del
nivel de la bomba para que la fuerza de gravedad dirija el solvente hacia ésta, manteniendo las
conexiones llenas. La FM debe ser de calidad cromatográfica, es decir, libre de sustancias
orgánicas y de partículas mayores de 0,5 um. En el extremo del tubo de salida de solvente se
conecta un filtro de acero (buzo) que impide el ingreso de partículas a la bomba.
2)- Tuberías: la FM empleada en HPLC debe circular por tuberías que conectan los
componentes del equipo. Obviamente estas tuberías deben ser inertes, empleándose tubos de
acero inoxidables para conectar los componentes sometidos a alta presión (entre bomba-
inyector, inyector–columna, columna-detector y detectores entre sí). Además se usan tuberías
poliméricas (polipropileno o teflón) para conectar los componentes donde la presión es
atmosférica o ligeramente superior (reservorio-bomba, detector-frasco de desperdicios).
3)- Bomba: impulsa la fase móvil desde el reservorio de solvente al inyector y de allí a la
columna. Las más usadas son las bombas de pistón.
Para cubrir el amplio rango de compuestos a separar se han propuesto eluciones en
gradiente, es decir, se varía la composición de la FM (porcentajes de los solventes) comenzando
la elución con un solvente débil y aumentando progresivamente la proporción del solvente
“fuerte”. Para formar estos gradientes se emplea generalmente una bomba y válvulas solenoides
que entregan cada solvente en una cámara de mezclado de pequeño volumen; la fase móvil
formada en cada instante es entregada a la bomba.
4) Inyector: es una válvula que permite la introducción de la muestra en solución sin
interrumpir el caudal de solvente a través del sistema. Las proteínas presentes en la matrices
biológicas deben eliminarse antes de inyectar la muestra para evitar que precipiten dentro del
equipo. Además la muestras y estándares a inyectar deben estar totalmente libres de partículas
en suspensión, ya que pueden rayar los sellos del inyector o bloquear tuberías. Para ello se
utilizan filtros desmontables o fijos de 0,45 o 0,22 µm.
5)- Columna Cromatográfica: en general es de acero inoxidables, de 25 a 30 cm de
longitud y 2 - 4 mm de diámetro interno, aunque en la actualidad existe variedad en el tamaño y
material (columnas de acero recubierto con vidrio, plásticas, etc.).
Las FE utilizadas en HPLC tienen un tamaño de partículas muy pequeño (5- 10 um) para
favorecer la interacción entre las moléculas de muestra y la FM y aumentar de este modo la
eficiencia en la separación de los componentes. Además la cantidad de FE es baja, lo que
disminuye el tamaño de las columnas y los tiempos de corrida.
El mecanismo más común, es la cromatografía en fase ligada. Las FE involucradas se
denominan fases químicamente unidas (BPC), tienen sílica como soporte, y diferentes grupos
químicos unidos a sus grupos silanoles. Son muy variables en cuanto a polaridad y selectividad
de acuerdo al “líquido” unido a la silica: C18 (octadecilsilano), C8 (octisilano), C2 (dimetilsilano),
CN (nitrilo), NH2 (aminopropil), diol.
Las más usadas en Toxicolgia son las de C18 y C8, de baja polaridad que utilizan como
fase móvil mezclas de agua (o soluciones salinas, buffers) con solventes orgánicos polares (
por ejemplo, acetonitrilo, metanol)
Existen otros tipos de FE, como las basadas en la adsorción, en el intercambio iónico, y
en la exclusión molecular.
6) Detectores: los detectores generales miden el cambio de alguna propiedad física de la
FM que contiene al analito en comparación con la FM pura, por ejemplo, el detector de índice de
refracción. Los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad del soluto, por
ejemplo, el detector UV que producirá una señal proporcional a la absorbancia del soluto a una
dada longitud de onda; el detector de fluorescencia empleado para la detección de solutos con
fluorescencia natural o conferida por reacción con un reactivo fluorogénico (ya que HPLC
también puede recurrirse a la derivatización) y el detector electroquímico, empleado en la
detección de analitos capaces de oxidarse o reducirse ante la aplicación de un potencial.
7)- Sistema electrónico de amplificación y medida de la señal eléctrica enviada por el
detector y registrador de la misma.
A continuación se muestra un cuadro comparativo entre GC y HPLC.
CG HPLC
Compuestos Gases, líquidos o sólidos volátiles Líquidos o sólidos no volatiles
a analizar o capaces de ser volatilizados, de Compuestos termolábiles, o de alto
bajo peso molecular. peso molecular.
Influencia La FM es un simple carrier del La FM es el parámetro fundamental
de la fase soluto y prácticamente no influye que gobierna la separación. La FM no
móvil en la separación. El gas a usar es inerte.
depende del detector.
Columnas Se requieren muchos tipos de Una sola columna es capaz de separar
columnas para abarcar todas las sustancias polares, iónicas, no polares
separaciones posibles simplemente modificando la FM
Detectores Diferencian fácilmente el soluto de Deben diferenciar el soluto en solución,
la FM (gas inerte). Por ejemplo: de la fase móvil (liquida en alta
captura electrónica, ionización en proporción). Por ejemplo: fluorescencia
llama, etc. UV, electroquímico, etc.
Al igual que en GC, la identificación de una sustancia por HPLC se basa en el tiempo de
retención obtenido, comparado con testigos, con las consecuentes dificultades en cuanto a su
reproducibilidad. Además, a pesar de cuidadosas purificaciones, ciertas interferencias pueden
inducir resultados falsos positivos o impedir una adecuada identificación y cuantificación. Por
otro lado, puede ocurrir que algunas sustancias eluyan juntas o muy próximas. Es decir en
varias oportunidades, el tiempo de retención no es suficiente para proporcionar una información
definitiva, por lo que conviene recurrir a un método de confirmación como la espectrometría de
masas (MS). La separación se realiza con el CG (o el HPLC) de acuerdo a sus tiempos relativos
y la determinación se hace por la fragmentación de los iones característicos del analito: GC-MS
y HPLC-MS.
7- Espectrometría de Masas.
La espectrometría de masas es una poderosa técnica analítica usada para identificar

compuestos desconocidos, cuantificar materiales conocidos y elucidar las propiedades químicas
y estructurales de las moléculas.
La muestra, puede ser un sólido, líquido o vapor pero el espectrómetro de masas, requiere
que la muestra sea transformada en un gas. Por ello en el primer paso la muestra es introducida
dentro de la cámara de vacío y luego ionizada en la fuente de iones. Los iones, los cuales están
en fase gaseosa, son distribuidos en el analizador de masas de acuerdo a su relación masa /
carga (m/z) y luego colectados por el detector.
En el detector, los iones generan una señal eléctrica proporcional a su número. El

sistema de datos registra estas señales eléctricas y luego las convierte en el espectro de masas.
Un espectro de masa es un grafico de la abundancia de iones versus la relación masa-carga.
Los iones y sus abundancias sirven para establecer el peso molecular y la estructura de los
compuestos que están siendo analizados.
Ionización Distribución Detección de

de iones iones
Fuente de ANALIZADOR Detector

ionización de masas
SISTEMA DE
datos
ENTRA
Espectro de Masas
Procesamiento
de datos
Introducción
de la muestra
Esquema de los componentes de un espectrómetro de masas.
Un simple compuesto puede generar varios fragmentos. Dos compuestos ionizados

simultáneamente crean un espectro solapado o superpuesto. Entonces para obtener el espectro
de masa de un compuesto, las mezclas de compuestos deben ser separados en sus
componentes individuales previamente al análisis por espectrometría de masas. La
Cromatografía gaseosa es ampliamente usada con este fin, de modo que los compuestos
separados en fase vapor, entran al espectrómetro y son analizados secuencialmente. Mas
recientemente Cromatógrafos líquidos, Cromatógrafos de fluidos supercríticos y equipos de
electroforesis capilar han sido conectados a un MS.
Como se mencionó anteriormente, los procesos que ocurren en un espectrómetro de

masas son: 1) ionización, 2) distribución de las masas y 3) detección.
1) IONIZACION.
Los dos métodos de ionización más usados son el impacto electrónico y la ionización
química. El impacto electrónico es un proceso físico donde se transfiere energía mediante la
colisión de electrones con las moléculas de la muestra en fase gaseosa. Debido a que la
energía de los electrones de bombardeo es generalmente mucho más grande que la de las
uniones moleculares cuando ocurre la interacción las uniones se rompen y se forman
fragmentos iónicos. Los iones negativos formados y los electrones son atraídos por un cátodo
cargado positivamente o una trampa de electrones. Las moléculas y fragmentos neutros que no
son ionizados son bombeados lejos. Los iones positivos son impulsados dentro del analizador y
enfocados hacia un sistema de lentes.
La energía empleada en la ionización electrónica puede conducir a una fragmentación
excesiva, dejando poca o ninguna traza del ión molecular. En ausencia de un ión molecular, el
peso y la estructura no son fáciles de determinar. Esto ha conducido al desarrollo de técnicas
de ionización de baja energía, como la ionización química. En esta técnica, se producen iones
por un proceso relativamente suave de transferencia de protones cuando la muestra se mezcla
con un exceso de reactivo gaseoso ionizado como metano, isobutano, amoníaco, etc. Los iones
originados tendrán una unidad de masa mayor.
Actualmente existen otras métodos de ionización, conocidas como técnicas de ionización-
desorción, cuya gran ventaja es que pueden aplicarse a moléculas frágiles o no volátiles.
2) DISTRIBUCIÓN DE MASAS.
Los tres analizadores mas ampliamente utilizados son: sectores magnético y eléctrico,
cuadrupolos y trampa de iones. Otros dos están siendo usados con mayor frecuencia en
laboratorios de investigación: fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) y el tiempo de
vuelo (TOF).
2) DETECCIÓN.
Los espectrómetros de masa pueden operar en dos modos diferentes, el registro total o
“full scan” y el de iones seleccionados “selected ion monitoring” (SIM). En la modalidad de
registro total, el espectrómetro barre todos los iones presentes dentro de un rango de valores
masa/carga, que normalmente oscila entre 40 y 650. En la modalidad SIM, el instrumento se
prepara para detectar únicamente un ión (single ion monitoring) o varios iones (multiple ion
monitoring) de abundancia relativamente grande, o de relación masa / carga significativa en el
espectro de masas del compuesto de interés, resultando un cromatograma que responde sólo a
compuestos en cuya fragmentación estén presentes los iones seleccionados.
La ionización mediante impacto electrónico usando la modalidad de full scan es la de

mayor aplicación en el campo toxicológico, ya que el espectro de masa o patrón de
fragmentación obtenido en estas condiciones, es como una huella dactilar, que contiene
suficiente información para caracterizar la molécula, permitiendo confirmar su identidad, o en el
caso que esta se desconozca buscarla en las librerías de espectros de referencia que estén
disponibles.
7.1 Métodos en Tándem.
En algunos casos las concentraciones de los compuestos de interés son tan bajas, como
ocurre con los compuestos cannábicos en el pelo o con algunos análisis de agentes de doping,
que la GC-MS no posee sensibilidad suficiente para detectarlos, por lo que hay que recurrir al
tándem MS-MS, de más reciente aparición. Mediante el acoplamiento de dos etapas de análisis
de masa (MS/MS), se puede generar el espectro de masa de iones individuales.
A partir de mezclas de iones, un ión madre es seleccionado en la primera etapa del

análisis de masas. El ión parental es luego fragmentado y los iones hijos resultantes son
analizados según sus masas en una segundo etapa. Para instrumentos de cuadrupolo o sector
cada etapa de análisis de masa requiere un analizador de masa separado. Para trampa de iones
o ICR, el experimento MS/MS puede ser conducido secuencialmente en tiempo con un único
analizador de masas.
Esta metodología se caracteriza por su gran selectividad y sensibilidad, del orden de los
fentogramos.
8. Interpretación de los resultados.
La interpretación de los resultados es el punto que requiere mayor atención y cuidado a

efectos de asignarle al resultado de un análisis toxicológico el exacto significado que encierra y
transformarlo en un elemento de real utilidad para el caso en cuestión.
Primeramente, debe consignarse claramente las unidades y la forma de expresión de los
resultados. En general los resultados siempre relacionan cantidad de una sustancia en un
determinado volumen de líquido (sangre, orina, etc). Es importante remarcar que la cantidad de
las sustancia investigadas es habitualmente escasa, menores al gramo, por lo tanto es
necesario utilizar fracciones o submúltiplos de la unidad que se utiliza. La validez de un
resultado esta respaldada por la sensibilidad y la especificidad del método analítico empleado.
9. Elaboración del informe.
Los resultados encontrados deben registrarse en una planilla indicando la fecha, el

nombre del paciente y otros datos de información relevantes incluyendo el número y naturaleza
de la muestra recibida para el análisis y el ensayo realizado. Asimismo, es importante considerar
que un análisis en el cual no se detectan compuestos en plasma, suero u orina u otro tipo de
muestra, debe indicarse el límite de detección del método.
El informe deberá consignarse la sensibilidad y especificidad que serán obtenidas de

bibliografía, y la precisión y exactitud de los mismos, es decir, el desenvolvimiento particular de
la metodología, cuando corresponda. Debe ponerse atención entonces en los rangos de
seguridad de los datos entregados y las cifras significativas con que se informan. También se
anotarán posibles interferencias que podrían haber modificado los resultados.
Antes de emitir el informe, todos los datos analíticos deben ser revisados por una
persona con capacidad científica y con experiencia en los métodos analíticos empleados. La
revisión debe incluir, al menos, documentación sobre la cadena de custodia, validez de los datos
analíticos cualitativos y cuantitativos (cromatogramas de la muestra, de patrones y de un blanco)
y datos del control de calidad. Por último se emitirá un informe escrito que presente los
resultados del análisis y toda la información relevante de forma clara, exacta y sin
ambigüedades.
Es necesario disponer de un archivo de registros, que documente las actividades y

operaciones llevadas a cabo y que incluya una copia del informe, datos de la cadena de
custodia, hojas de trabajo, datos de laboratorio y registros de los análisis de garantía de calidad
y de los controles de calidad. Ello debe ser lo más claro posible de manera que permita seguir
todos los pasos del análisis y elaborar conclusiones en caso de desviaciones. Se deben guardar
durante un tiempo, que depende de las normativas gubernamentales, pero que, en general, es
como mínimo de cinco años y tienen, por tanto, un valor potencial a largo plazo, sobre todo en
los análisis toxicológicos que puedan estar envueltos en litigios, especialmente cuando los
juicios se celebran años después de haber emitido el informe.
Tradicionalmente se han usado diferentes tipos de microensayos químicos que de forma

presuntiva y rápida dieran información cualitativa sobre la presencia de tóxicos individuales, o de
grupos y familias de medicamentos y drogas. Los resultados de estos ensayos y
procedimientos, conocidos usualmente como "métodos de screening", debían ser confirmados
por otras técnicas o procedimientos de mayor capacidad identificativa y que posteriormente,
permitieran la correspondiente cuantificación. La evolución de estas técnicas ha llegado al actual
auge de los inmunoensayos, que fundamentalmente están desarrollados para muestras líquidas
con bajas interferencias de la matriz, tales como orina, aguas, sueros, etc.
Bibliografía.
Buonomo et al. Introducción a la Cromatografía Gaseosa. Asociación Química Argentina.

División Cromatografía. 2000.
Bañuls M.V. et al. Cromatografía de Gases I. Ed. Alhambra.1970.
Clarke's Isolation and identification of drugs (in pharmaceuticals, body fluids and post morten
material). 2nd Ed. The Pharmaceutical Society of Great Britain. London, 1986.
Flanagan, R.J. et al., Basic Analytical Toxicology. Ed.(WHO). Geneva,1995.
Clarke’s analysis of drugs and poisons. Moffat, A; Widdop, B; Osselton, D. (Eds), Pharmaceutical
Press, (2004).
Frejaville, J.P. et al. Toxicología Clínica y Analítica. 1ra ed. Ed. JIMS. Barcelona 1979.
Guía de Trabajos Prácticos de Toxicología y Química Legal. Facultad de Ciencias Exactas.

Universidad Nacional de La Plata. 2002
Guía de Trabajos Prácticos de Toxicología y Química Legal. Facultad de Farmacia y Bioquímica.

UBA. 2000.
Keve, N. Curso de Cromatografía Líquida Planar. Asociación Química Argentina. 1999.

Quattrocchi, O.A., Abelaira, S. Y Laba, R., Introducción a la HPLC. Aplicación y Práctica. Buenos
Aires 1992.
Stahr, H.M., Analytical Methods in Toxicology. Ed. John Wiley and Sons, Inc. 1991.
The Supelco Guide to Solis Phase Extraction. Supelco, Inc. 1988.
Basic Gas Chromatography serie Techniques in Analytical Chemistry, Ed. Wiley and Sons, 1998.
Introduction to Modern Liquid Chromatography, Snyder y Kirkland, Ed. Wiley and Sons, 1979.
Static Head Space – Theory and Practice, Kolb and Ettre, Ed. Wiley, 1997.
Liquid Chromatography – Mass Spectrometry: An Introduction. Robert E. Ardrey John Wiley &
Sons, 2003.
Capítulo 4
Tóxicos Volátiles y Gaseosos.
Autores:
Dra. Mabel Tomas.
Jefe de Trabajos Prácticos de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP.
Dr. Luis A. Ferrari.
Perito Químico Judicial. Profesor de Toxicología en la Universidad de Morón
4. Introducción.
Se clasifican como tóxicos volátiles y gaseosos a todas las sustancias que

independientemente de su estado físico, puedan separarse de la matriz que los contienen por
destilación simple, destilación por arrastre con vapor, microdifusión y cromatografía gaseosa
empleando head-space.
En forma general podríamos decir que las vías de entrada de estos tóxicos al organismo es
la digestiva y la pulmonar, siendo también importante la vía cutánea para las sustancias más
lipofílicas. Entre los tóxicos gaseosos más relevantes encontramos: monóxido de carbono, ácido
cianhídrico, ácido sulfhídrico, arsina, estibidina, cloro, óxidos de nitrógeno, bromo, ozono,
amoníaco, fosfina, entre otros.
Entre los tóxicos volátiles más importantes encontramos: ácido acético, cetonas, aldehídos,
benceno, fenol, alcoholes primarios (etanol, metanol), glicoles, nitro y dinitrobenceno, éter,
cloroformo, tetracloruro de carbono, fósforo, plaguicidas organoclorados, carbamatos,
organofosforados, piridina, etc.
La mayoría de los compuestos provocan intoxicación aguda y muerte rápida, por ello, las
investigaciones toxicológicas se realizan en sangre y en muestras obtenidas del tracto
gastrointestinal o respiratorio donde se encuentran estos tóxicos en grandes cantidades. En el
presente capítulo se presentan diversos protocolos de análisis de los tóxicos gaseosos y
volátiles que con mayor frecuencia se presentan en un laboratorio de toxicología.
4.1 Tóxicos gaseosos.
Los tóxicos gaseosos son venenos presentes en el aire que generalmente se encuentran
en estado gaseoso y alcanzan el cuerpo por inhalación. Un adulto inhala una masa de 15 kg de
aire por día y simultáneamente expone una gran superficie de su cuerpo a xenobióticos. Los
efectos tóxicos pueden desarrollarse muy rápidamente ya sea en forma sistémica (ácido
clorhídrico, sulfuro de hidrógeno) o localmente en el tracto respiratorio (cloro o dióxido de
azufre). Por otro lado, la exposición crónica a cloro, dióxido de azufre, dióxido de nitrógeno y
ozono en pequeños niveles encontrados en el aire ambiental puede afectar la función pulmonar.
Altas concentraciones de gases tóxicos como monóxido de carbono y cianhídrico se encuentran
en situaciones de desastre químico debido a fuegos, explosiones pueden rápidamente causar la
muerte a las personas que toman contacto con ellos.
La exposición a gases tóxicos ya sea en la industria o en aire urbano ha sido objeto de

regulaciones. Así la American Conference of Governmental Industrial Hygienist (ACGIH, 1996)
regula la exposición en el ambiente de trabajo. Ha establecido el llamado TLV-TWA (Threshold
Limit Values-Time Weighted Average) para cada tóxico siendo la concentración media de
sustancia química en el aire ambiental tras una exposición repetida de, 8 horas al día, durante 5
días de la semana, durante toda una vida profesional y que no producen efectos nocivos en la
mayoría de los trabajadores. También se encuentra el valor de STEL (Short Time Exposición
Level) referido a la concentración máxima a la cual un individuo puede estar expuesto durante
un período continuo y hasta 15 minutos, sin sufrir efectos adversos, siempre y cuando no
reproduzcan mas de cuatro de estas situaciones por día y estando separadas como mínimo en
60 minutos.
Otros valores de exposición desarrollados y periódicamente revisados son el RELs

(Recommended Exposure Limits) publicados por National Institute of Occupational Safety and
Health (NIOSH, 1994). También el Occupational Safety and Health Administration (OSHA, 1993)
recomienda niveles de exposición dados por (PELs Permisible Exposure Limits como valore
límite de exposición permitido. Estos límites y los valores alemanes MAK (Maximun
Concentration in the Workplace son comparables a los valores TLV-TWA. Estas
concentraciones son dadas en ppm, (ml/m ) o (mg/m3) a 20ºC y presión de 1013 hPa.
3
4.1.1 Investigación de monóxido de carbono en medios biológicos.
4.1.1.1 Características generales y mecanismo de acción.
El monóxido de carbono es un gas incoloro, inodoro, insípido y no irritante que se origina

durante la combustión incompleta del carbón o derivados combustibles con carbono. Las fuentes
productoras más frecuentes son braseros, estufas, calefones, hornos, incineradores, plásticos y
automóviles en mal estado de funcionamiento.
La toxicidad del monóxido de carbono (CO) se debe a su combinación con la

hemoglobina para formar carboxihemoglobina (COHb). En dicha forma la hemoglobina no libera
oxígeno, dado que ambos gases (O2 y CO) reaccionan con el grupo hemo en la molécula
tetramérica de la hemoglobina. Sin embargo, la afinidad del monóxido de carbono por la
hemoglobina es cerca de 240 veces mayor que por el oxígeno, de esta manera, la intoxicación
puede ocurrir aún cuando pequeñas cantidades de CO se encuentren presentes en la
atmósfera.
En el caso de personas intoxicadas, cuando el paciente es removido del ambiente

contaminado, la carboxihemoglobina desaparece rápidamente, particularmente cuando se
administrada oxígeno al 100 %. Sólo trazas pueden ser detectadas cuando el paciente alcanza
el hospital y de esta manera la determinación de carboxihemoglobina es raramente justificada
en la clínica toxicológica. Sin embargo, no deja de ser útil la investigación de la
metahemoglobina sobre todo cuando se ha inhalado sustancias oxidantes (óxidos del nitrógeno,
por ejemplo).
CO + Hb.Fe.O2 <=======> Hb.Fe.CO + O2
La formación de oxihemoglobina (Hb.Fe.O2) como de carboxihemoglobina (Hb.Fe.CO)

son reacciones reversibles y dependen principalmente de la presión parcial de los gases
respirados y del pH sanguíneo aunque otros factores como la temperatura y la concentración
iónica tienen también incidencia.
La toxicidad del CO se manifiesta no sólo en la interferencia en el aporte de oxígeno por

la sangre sino también ejerce efecto directo al unirse a los citocromos celulares como los
presentes en las enzinas respiratorias y la mioglobina.
4.1.1.2 Consideraciones generales en la analítica toxicológica.
En casos de sujetos muertos debido a intoxicación con CO, el aspecto del cadáver y el
color carminado de las vísceras constituyen manifestaciones propias de la intoxicación aguda.
Dicho color resulta visible en los órganos como el cerebro, corazón, pulmones y la musculatura
voluntaria. En los casos en que el sujeto está vivo, la sangre deberá extraerse, a lo sumo hasta
dos horas después de la exposición, puesto que gran parte del monóxido resulta eliminado por
vía pulmonar. Para casos mortales, la muestra de sangre deberá extraerse lo más rápido posible
antes que se inicien los procesos putrefactivos.
Se ha demostrado que el monóxido de carbono no se absorbe post-mortem

constituyendo su determinación un índice del contenido en el momento de la muerte. La
carboxihemoglobina es un derivado muy estable y su presencia en sangre puede demostrarse
después de la descomposición cadavérica así como en cadáveres sometidos a altas
temperaturas. El color carminado típico de la carboxihemoglobina se observa en muestras de
sangre cuando el porcentaje de saturación es del 30% o superior, distinguiéndose fácilmente de
la oxihemoglobina o de la hemoglobina misma.
4.1.1.3 Toma de muestra.
La recolección de la muestra de sangre debe ser obtenida por punción venosa con
anticoagulante (heparina) evitando la formación de burbujas o la entrada de aire a la jeringa. Se
recomienda obtener sangre del corazón o de las venas gruesas como la femoral. El recipiente a
utilizar para la conservación de la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado
en forma hermética.
4.1.1.4 Determinación analítica de carboxihemoglobina.
La determinación cuantitativa de la carboxihemoglogina en sangre puede realizarse por

métodos espectroscópicos que se basan en los diferentes espectros de absorción que presentan la
carboxihemoglobina respecto de la hemoglobina. En todos ellos se realizan medidas de absorción
a distintas longitudes de onda de diluciones adecuadas de la sangre en estudio. Estas longitudes
de onda corresponden a los máximos, mínimos o puntos isosbésticos de absorción de cada una de
las especies de hemoglobina que coexisten en la muestra.
Otra propiedad que es utilizada por estos métodos es la gran estabilidad que presenta la
carboxihemoglobina respecto de la oxihemoglobina frente a reactivos reductores o
metahemoglobinizantes. A ojo desnudo, la sangre con alto contenido de carboxihemoglobina
presenta un marcado tono carmín, mientras que la sangre con alto contenido de metahemoglobina
es chocolate.
Se describen a continuación ensayos de tipo cualitativos que presentan carácter práctico

para su identificación.
a ) Ensayo de dilución:
El ensayo de dilución consiste en preparar soluciones sanguíneas al 1% en agua destilada

de muestra a analizar y de sangre normal. Se observa simultáneamente ambos tubos de ensayo
con luz natural difusa. La sangre normal presenta color rojo amarillento, mientras la muestra, si
contiene carboxihemoglobina, presenta color carminado neto. Este ensayo es seguro y práctico.
b) Ensayo alcalino:
Se basa en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina con respecto a la hemoglobina

en similares condiciones alcalinas.
En un tubo de ensayo colocar 3 a 4 gotas de la sangre a analizar y en otro tubo similar

colocar igual número de gotas de sangre normal, agregar 15 ml de agua destilada y mezclar
bien. Agregar a cada tubo 5 gotas de solución de hidróxido de sodio al 10% y mezclar bien. La
sangre normal adquiere color castaño a castaño verdoso (hematina alcalina), mientras que la
sangre oxicarbonada permanece inalterada (color carminado durante cierto tiempo). El ensayo
ofrece un neto contraste y resulta positivo cuando la concentración de carboxihemoglobina es
superior al 10%.
La sangre fetal interfiere en este ensayo dado que última produce una transformación
retardada frente al hidróxido de sodio. A continuación se describen diferentes métodos para la
cuantificación de carboxihemoglobina en sangre: espectrofotométrico, químico e infra rojo.
4.1.1.5 Determinación cuantitativa de la carboxihemoglobina por el método

espectrofotométrico.
Algunos métodos espectrofotométricos emplean el sistema oxihemoglobina-

carboxihemoglobina. El siguiente método se basa en que la sangre normal contiene varias formas
de hemoglobina (la forma reducida, la forma oxidada, y pequeña cantidades de metahemoglobina),
y si un agente reductor como el ditionito de sodio es agregado a la sangre, la forma oxigenada y la
metahemoglobina son cuantitativamente convertidas a la forma reducida que presenta un espectro
como se presenta en la Fig.4.1. Debe recordarse que en caso de que la persona haya estado
expuesta a sustancias metahemoglobinizantes esta determinación es poco recomendada.
El monóxido de carbono presenta mayor afinidad por la hemoglobina que el oxígeno

mientras que la carboxihemoglobina no es reducida por el ditionito de sodio.
Así, la carboxihemoglobina permanece sin modificarse como se muestra en la curva A del

espectro en la Fig.4.1 aún cuando se ha realizado un tratamiento con ditionito de sodio.
En la Fig. 4.1 se observa que la máxima diferencia de absorbancia para los espectros de
carboxihemoglobina (A) y hemoglobina reducida (B) se presenta a 540 nm, mientras que 579 nm
presenta la misma absorbancia (punto isosbéstico). El porcentaje de saturación de monóxido de
carbono en una muestra de sangre puede calcularse de la medida de la absorbancia a esa longitud
de onda de la muestra saturada con monóxido de carbono (A), la muestra libre de monóxido de
carbono (B) y la muestra sin tratar (C) luego de la reducción con ditionito de sodio.
Fig. 4.1: Espectros de absorción

de (A) carboxihemoglobina, (B)
Abs.
hemoglobina reducida y (C)

muestra de sangre de paciente
intoxicado con monóxido de
carbono.
Reactivos.
Solución 0,1% de hidróxido de amonio.
Equipo
Espectrofotómetro UV visible
Procedimiento.
Diluir 0,2 ml de la muestra de sangre homogenizada con 25 ml de solución 0,1% de

hidróxido de amonio y dividir la solución resultante en tres parte iguales A, B, y C. Saturar la
solución A con monóxido de carbono mediante el burbujeo de gas a una velocidad que minimice la
formación de espuma. Unos pocos minutos de burbujeo resultan suficientes. Por otra parte, la
solución B se trata con oxígeno puro durante 10 minutos a los efectos de desplazar completamente
el monóxido de carbono unido a la muestra.
Agregar una pequeña cantidad de ditionito a cada una de las soluciones A, B y C y también
a 10 ml de la solución de amonio 0,1% y mezclar bien. Medir la absorbancia de cada solución a
540 y a 579 nm para cada solución A, B, y C. Se calcula la de relación de absorbancias a 540 a
579 para cada solución.
El porcentaje de saturación de carboxihemoglobina se calcula por la siguiente fórmula

( A 540 /A 579 ) C - (A 540 /A 579 ) B
%saturación = 100
( A 540 / A 579 ) A − ( A 540 − A 579 ) B
Los valores normales aproximados para la relación de absorbancia son:

carboxihemoglobina saturada 1,5 y hemoglobina reducida 1,1%. Considerando que el contenido de
hemoglobina en sangre puede variar, el volumen de diluyente también debe ser modificado. La
dilución que arroje un valor máximo de absorbancia cercano a 1 es la ideal.
4.1.1.6 Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina mediante separación

física de la carboxihemoglobina de otras hemoglobinas.
El método se basa en la alta resistencia relativa de HbCO al calor mientras que las otras
formas de hemoglobina sufren coagulación. Esta técnica es simple de realizar y permite ser
aplicada con resultados reproducibles si se mantienen estrictamente las condiciones indicadas:
calentamiento a 55 ± 0,5°C durante 5 minutos y pH 5,05 ± 0,05.
Reactivos.
1. Buffer acetato. Mezclar 1 volumen de solución 1 (300 ml de ácido acético glacial en 1 litro de
agua destilada) mas 3 volúmenes de solución 2 (408 gr de acetato de sodio trihidratado disuelto en
1 litro de agua). El pH no debe variar de 5,05 ± 0,05.
2. Antiespumante. Mezclar el antiespumante con agua al 1% y se agita vigorosamente con
algunas perlas de vidrio.
Equipos.
Baño termostático de agua a 55 ± 0,05°C

Centrífuga a 5000 rpm. Capacidad 4 o más tubos de 10-15 ml. Especrofotómetro UV- visible.
Procedimiento.
1) 5 ml de sangre a analizar previamente homogenizada se mezclan con 15 ml de agua

destilada y 1 ml de antiespumante por inversión. La mitad de esta solución es separada en un
tubo, rotulada y guardada en oscuridad. La otra mitad es saturada con CO durante 30 minutos
asegurándose que el volumen de la solución sanguínea no cambie.
2) De las soluciones, aquella sin tratar y la tratada con CO se toma dos alícuotas de 1,0 ml son
ubicadas en 4 tubos de centrífuga conteniendo 4,0 ml de buffer acetato.
3) Después de mezclar por inmersión dos veces cada tubo, los tubos se ubican en un baño
termostático de agua a 55,0 ± 0,5°C exactamente por 5 minutos.
4) Luego los tubos se enfrían en agua fría durante otros 5 minutos y centrifugados a 5000 rpm
durante 5 minutos.
5) 2,0 ml de cada uno de los cuatro sobrenadantes se diluyen con 10,0 ml de agua destilada y
se mezclan 2 o 3 veces por inmersión en el tubo.
6) Para la lectura se requieren tres cubetas: la cubeta 1 (blanco) emplea agua destilada, la
cubeta 2 es llenada con la solución de sangre sin tratar y la cubeta 3 con solución de sangre
saturada con CO. La absorbancia de las dos soluciones se leen contra agua a 570 mn y 630 nm.
Luego de la lectura, la cubeta 2 es vaciada y llenada con el duplicado de la solución de sangre
sin tratar. La cubeta 3 también luego de la lectura es vaciada y llenada con el duplicado de la
solución de sangre saturada con CO. Se repite la lectura a 570 y 630 nm. Los cálculos se
realizan mediante la siguiente relación
( A 570 /A 630 ) solucion sin tratar

%COHb = 100
( A 570 / A 630 ) sulucionconCO
7) Los valores duplicados no deben variar mas de 2 a 3 % de saturación de COHb. Con valores
de saturación de COHb menores a 20% dos tipos de dificultades pueden presentarse: primero,
la lectura en el espectrofotómetro de muestra sin tratar es baja e incierta. Segundo, la
coprecipitación de COHb con el precipitado de los derivados de hemoglobina puede ser un
factor importante que tiende a disminuir la cantidad residual de COHb en el sobrenadante. El
método arroja resultados reproducibles cuando la saturación de COHb es superior al 20%.
Asimismo, el método es moderadamente sensible a los cambios que ocurren en la sangre luego
del proceso postmortem.
4.1.1.7 Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina por el método de

Cromatografía gaseosa (CG).
La cromatografía gaseosa (CG) se considera una metodología universal para la

determinación de compuestos con una presión de vapor lo suficientemente alta, por lo que en
general se considera adecuada para tóxicos volátiles y gaseosos. Sin embargo, la
determinación de monóxído de carbono por CG presenta diversos inconvenientes que es
necesario tomar en cuenta en el momento de optar o no por la utilización de esta metodología.
Por un lado la elevada presión de vapor del monóxido de carbono requiere de columnas
y/o de programas que sean capaces de separar al analito de los gases utilizados como carrier,
generalmente helio o nitrógeno, de otros gases que pudiesen coexistir con el monóxido de
carbono como el dióxido de carbono. Este inconveniente se subsana utilizando columnas
capilares y programas de corrida cromatográfica que trabajan comenzando a temperaturas
subambiente, típicamente a -20°C. Los equipos requeridos para estas condiciones
cromatográficas son muy poco frecuentes en laboratorios de toxicología.
Por otro lado, la detección de la señal del monóxido de carbono a la salida de la columna
CG se realiza mediante dos metodologías posibles. Una forma es la utilización de una post
columna con un catalizador y condiciones de hidrogenación adecuadas para transformar al
monóxido de carbono cuantitativamente en metano, luego de lo cual se mide con un detector
común iónico de llama (FID). La otra forma es la utilización de un detector de conductividad
térmica. Ni el detector de conductividad térmica, ni el catalizador post columna son elementos
comunes en un laboratorio dedicado a la toxicología.
Finalmente, se ha informado que la cromatografía gaseosa de monóxido de carbono

tiene una adecuada respuesta señal vs concentración sólo para niveles de monóxido por encima
del 20% en sangre, de manera que no es adecuado para medidas en individuos con
intoxicaciones subclínicas o para comparar individuos con niveles normales de CO en sangre.
4.1.1.8 Determinación cuantitativa de carboxihemoglobina por el método de

Espectrofotometría Infrarroja.
En la determinación de monóxido de carbono en sangre y aire espirado, la

espectrofotometría infrarroja confiere adecuada especificidad, condición que no presentan otros
recursos analíticos depurados tales como cromatografía gaseosa. El procedimiento comienza con
una extracción de los gases totales físicamente disueltos o combinados con la hemoglobina. El
monóxido de carbono presenta al infrarrojo dos picos de absorción a 2120 y 2170 cm-1 (4,6-4,7 m) y
no presenta otra absorción en el rango comprendido entre 700-4000 cm-1.
Los gases que absorben en esta región del espectro y que por lo tanto interfieren, son el
diazometano, cloruro de nitrosilo y propano que muy difícilmente pueden hallarse en muestras de
sangre. El dióxido de carbono puede mostrar interferencias cuantitativas por su elevada
concentración relativa aún si su absorción máxima difiere de la del monóxido de carbono. Estas
interferencias quedan excluidas con la adopción de sistemas de compensación o filtros adecuados.
Los equipos permiten determinar monóxido de carbono en un rango de 0 a 1000 ppm. En el

análisis de sangre, la espectrofotometría infrarroja utiliza un volumen total de 1 a 5 ml. El mismo se
trata con ferrricianuro ácido y los gases liberados se analizan en el espectrofotómetro infrarojo.
Para establecer el porcentaje de saturación o el coeficiente de intoxicación debe saturarse

otra fracción de la muestra con monóxido de carbono y analizarse en la misma forma, efectuando la
pertinente corrección por el monóxido de carbono físicamente disuelto. Con adecuadas
modificaciones, la espectrofotometría infrarroja posibilita el registro continuo de monóxido de
carbono en aire (detectores o registradores continuos).
Por otra parte, los ensayos en aire espirado permitieron revelar su presencia en forma
inmediata así como después de 30 minutos de haber fumado un cigarrillo.
4.1.1.9 Determinación de monóxido de carbono por cooximetría
De todos los métodos que se disponen hoy día para la determinación de monóxido de carbono,
el método instrumental co-oximétrico es el de mayor uso en laboratorios toxicológicos clínicos y
forenses. Ello resulta comprensible dada la facilidad de operación del instrumental que,
prácticamente requiere de personal no muy entrenado para su manejo, poca muestra sanguínea
(alrededor de 0.1 mililitros) y resultados rápidos.
La muestra es tomada de sangre arterial o grandes vasos, con anticoagulante (heparina o
EDTA), luego hemolizada con una solución surfactante y posteriormente introducida en el
instrumental por aspiración.
Los equipos actuales poseen una lámpara de cátodo hueco de Talio/Neón que emite luz a la
longitud de onda conveniente. Generalmente son aisladas seis líneas espectrales en el rango de
530 nm a 670 nm, utilizando filtros de interferencia. El haz luminoso emerge del aislador
reflectivo como onda partida donde un haz se dirige al detector de referencia y el otro en el
detector de la muestra. Dado que el sistema trabaja con seis longitudes deonda, se obtendrán
seis registros de blanco y seis registros de muestra.
En la figura anterior puede observarse los espectros de absorción al UV de la hemoglobina

reducida (HHb), oxihemoglobina (O2Hb methahemoglobina (MetHb), carboxihemoglobina (COHb)
y sulfohemoglobina (SHb). Estos tipos de hemoglobinas son analizadas e informadas por el
instrumental, al igual que otros parámetros, como la hemoglobina total y el contenido de
oxígeno.
Interpretación y factores de error en los resultados:

Existen circunstancias propias de las muestras o del contexto de la intoxicación, que deben ser
tenidos en cuenta a la hora de interpretar el resultado final. Lee et al. (2003), han comprobado
que la putrefacción de las muestras sanguíneas procedentes de casos postmortem poseen
bajos niveles de hemoglobina total (tHb) y muy alta turbidéz debida a la presencia de aceites y
otros desechos de tejidos biológicos. Esto provoca errores en las medidas producidas por el
cooximetro. Asimismo, la metahemoglobina (en concentarciones superiores al 10%) y la sulfo-
hemoglobina generada por acción bacteriana constituyen factores de perturbación de los
resultados analíticos.
Generalmente las muestras con tHb mayor a 3-4 g/dl son aptas para el ensayo de
carboxihemoglobina.
Algunos autores han propuesto se efectúe un tratamiento previo de la muestra hemática
sometiéndola a evaporación en centrífuga y/o uso de agregados estándar de carboxi-
hemoglobina, para mejorar la precisión del análisis.
En cuanto al contexto de la intoxicación. Hemos observado que en muestras sanguíneas
conteniendo significativa concentración de ácido cianhídrico, provenientes de incendios de
materiales plásticos de tipo poliuretano, el tenor de metahemoglobina no posee correlación con
la concentración de hemoglobina total y con las concentraciones de HCN y CO.
4.1.1.10 Determinación de monoxido de carbono en sangre por métodos

químicos.
Los métodos químicos emplean la propiedad del monóxido de carbono de reducir diversas
sales metálicas. Uno de los elementos metálicos de mayor aceptación es el paladio (II). La
capacidad reductora del monóxido de carbono se observa en la siguiente ecuación:
Pd+2 + CO + H2O Pd° + CO2 + 2H+

Este principio se emplea de diversas formas, una de ellas es el método de Gettler y
Freimuth y mediante la microdifusión en cámaras de Conway.
4.1.1.10.1 Método de Gettler y Freimuth.
El monóxido de carbono liberado de la carboxihemoglobina por el ferrocianuro de potasio es

arrastrado por aireación y pasado a través de un disco de papel embebido con Cl2Pd. El CO
produce una mancha oscura sobre el papel de filtro debido a la reacción del paladio que se reduce
a Pdo. Por comparación de la intensidad de la mancha con muestras patrones, se puede obtener
una concentración aproximada a la cantidad de CO presente en la muestra.
Técnica.
a) Reactivos.
• Solución de cloruro de paladio (0,5 g de cloruro de paladio, 0,5 ml de ácido clorhídrico

concentrado que se llevan a 50 ml con agua destilada).
• Solución de ferricianuro de potasio-saponina: ferricianuro de potasio 32 g, saponina 0,8 g ,
agua bidestilada c.s.p 100 ml.
• Solución de ácido láctico (D:1,20) y llevar a 100 ml.
• Solución de acetato de plomo al 10%.
• Alcohol caprílico.
• Solución de cloruro cuproso amoniacal.
b) Procedimiento.
El dispositivo se presenta en la Figura 4.2. El tubo A contiene 5 ml de solución de cloruro

cuproso amoniacal para retener el monóxido de carbono del aire e interferencias del medio del
laboratorio. El tubo B contiene 2,0 ml de sangre, se añaden 4 ml de ferricianuro-saponina y 2 ml de
solución de ácido láctico junto con 2 gotas de alcohol caprílico. El tubo C contiene perlas de vidrio
en cantidad que alcancen 4 cm de altura y 5 ml de acetato de plomo. Entre los discos del flange se
coloca un disco de papel de filtro Whatman N°3 cortado en forma circular humectado con la
solución de cloruro de paladio y sujetado en forma segura mediante un pinza metálica para lograr el
cierre hermético.
Se hace burbujear aire a través del dispositivo A aflojando la llave del frasco de Mariotte. La
velocidad de flujo del aire debe ser de 26 ml/minuto. Después de 15 minutos, se detiene el burbujeo
y se retira el papel reactivo, se lava con agua destilada para eliminar el exceso de solución de
cloruro de paladio y la mancha obtenida. Finalmente se compara con la escala obteniéndose el
grado de saturación de la sangre con respecto al monóxido de carbono.
La preparación de la escala se realiza saturando 10 ml de sangre oxalatada con un

contenido de carboxihemoglobina de 80%-90% con monóxido de carbono puro, el cual se obtiene
por descomposición del ácido fórmico por acción del ácido sulfúrico concentrado. Se hace
burbujear el gas en la muestra de sangre durante 15 minutos.
Mezclando volúmenes iguales de la muestra saturada con sangre normal, se obtiene un

grado de saturación equivalente al 50%, el cual se utiliza para la preparación de la escala
mezclando diferentes volúmenes de sangre normal y sangre saturada con monóxido de carbono
(Tabla 4.1). Cada muestra diluida en la forma expresada se somete al procedimiento señalado a fin
de obtener las manchas testigo. La preparación de manchas para grados de saturación mayores al
50% no es necesaria en la práctica debido a que nunca se alcanzan valores superiores al 50% de
saturación.
Dado que la capacidad de saturación de la sangre para el monóxido de carbono reside en

el contenido de hemoglobina debe aplicarse el factor de corrección correspondiente para cada
caso, debiendo valorarse el contenido de hemoglobina total del mismo.
Fig. 4.2: Dispositivo empleado en la determinación de monóxido de carbono en sangre

Tres tubos de vidrio grueso con borde de 13 a 15 cm de largo y 2 cm diámetro.
Flange (dos discos de vidrio enfrentados para retención de papel de filtro)
Trampa de vacío, o bomba de extracción de ¼ HP.
Pinzas de Hoffman.
Perlas de vidrio.
Tabla 4.1: Preparación de la escala de saturación de monóxido de carbono
Volumen de sangre con 50% Volumen de sangre Porcentaje de

saturación CO (ml) normal (ml) saturación
obtenido
4 1 40%
3 2 30%
2 3 20%
1 4 10%
1 5 5%
4.1.1.10.2 Método de Microdifusión.
Se basa en el poder reductor del monóxido de carbono que al actuar sobre una solución de
Cl2Pd lo transforma en Pd°. La reacción se realiza en cámaras de Conway que posen en el
compartimiento externo la muestra de sangre y el agente liberador (ácido sulfúrico) y en el interno
el agente atrapante (Cl2Pd). En este caso se produce la captación y la oxidación del monóxido de
carbono forzándose la remoción completa del mismo al cabo de un tiempo y temperatura
determinado. El exceso de Cl2Pd se valora espectrofotométricamente con IK en presencia de goma
arábiga.
Reactivos:
• Solución de cloruro de paladio: disolver 0,222 g de cloruro de paladio en 25 ml. de ácido
clorhídrico 0,01N y completar a 250 ml con ácido clorhídrico. Se prepara en el momento.
• Acido sulfúrico 10% (p/v)
• Goma arábiga al 0,1%
• Solución de ioduro de potasio al 15% (p/v)
Equipos:
Centrífuga a 5000 rpm.

Especrofotómetro UV visible
Procedimiento:
En el centro de la cámara de Conway colocar 0,5 ml de Cl2Pd (0,01N), en la periferia y

separados se colocan 0,25 ml de H2SO4 y 0,25 ml de la muestra (sangre entera). Cubrir con la tapa
sellando con grasa siliconada para evitar posibles pérdidas.
Mezclar la sangre con el ácido sulfúrico mediante un suave movimiento de balanceo. Dejar
difundir 1 hora a temperatura ambiente. La existencia de monóxido de carbono se evidencia en
forma indirecta a través de la aparición de una pátina platina de paladio metálico en el
compartimento interno. Con una pipeta capilar se extrae la totalidad de la solución del
compartimento interno (Pd° y exceso de cloruro de paladio).
Luego se centrifuga con el objeto de separar el precipitado de Pd y se transfiere 0,1 ml del

sobrenadante a un matraz de 10ml. En otro matraz de 10 ml, se coloca 0,1 ml de solución de Pd
(blanco). A cada matraz se agrega 1,0 ml de solución de goma arábiga al 0,1% y 1,0 ml de IK al 15
%, se mezcla bien y se lleva a volumen. Se realiza la determinación de la densidad óptica a 500 nm
llevando a cero con agua destilada. El exceso de sal de Pd origina con el ion ioduro el complejo
I4Pd-2. En forma paralela se trabaja con una solución de Cl2Pd no difundida de manera de tener un
punto de referencia de absorbancia. Luego se lee la absorbancia a 500 nm.
Expresión de resultados:
Con el punto de referencia se calcula la concentración de CO en la muestra inicial.
DO t - DO D
mgCO% = 0,05335 * 520
DOt
Donde DOt y DOD representan la densidad óptica del testigo y la muestra desconocida,
respectivamente. El valor 0,053 corresponde a 0,1 ml de la solución de paladio 0,01N con peso
equivalente de 106,7/2 = 53,35. El factor 520 corresponde al factor de conversión (CO/Pd)
provenientes de 0,1 ml solución expresados en los 2,0 ml de muestra de sangre analizada y
multiplicada por 100 para expresar el resultado en porcentaje mgCO% (28/106,7).
(2/0,1).100=520).
El resultado puede expresarse en ml % aplicando el factor 0,8. Para expresar el resultado

en porcentaje (saturación de la hemoglobina), es necesario conocer la concentración de la misma y
teniendo en cuenta que 1g de hemoglobina fija 1,34 ml de CO, se puede calcular el valor
correspondiente de saturación.
4.1.2 Interpretación de Resultados.
El monóxido de carbono es el producto endógeno del catabolismo del hemo con un valor de
saturación de carboxihemoglobina entre 0,4-0,7%. El valor promedio de carboxihemoglobina
encontrada en sangre de individuos no fumadores que habitan zonas urbanas es del 1-2%. Dicho
valor llega a 5-6% en individuos fumadores.
El valor TWA es de 25 y 30 ppm dado por American Conference of Governmental Industrial

Hygienist (ACGIH) y Maximun Concentration in the Workplace (DFG, 1996) (MAK) con un valor
máximo de 6% de HbCO para una persona que trabaja 8 hs. en condiciones de actividad física
normal. El Occupational Safety and Health Administration (OSHA) recomienda un valor de 50 ppm
y National Institute of Occupational Safety and Health (NIOSH) de 35 ppm con un valor de (Short
exposición) referido a 15 minutos de exposición (STEL) de 200 ppm. Estos valores deben ser
menores para personas de mayor riesgo como son mujeres embarazadas cuyo valor de HbCO no
debe exceder 2,7%.
Los valores encontrados en los casos de envenenamiento fatales registrados representan

valores superiores a 50% de saturación. En víctimas de incendios se han registrado niveles de
carboxihemoglobina entre 25-55% con un valor medio de 40%. Sin embargo, también se ha
informado que la carboxihemoglobina en víctimas de incendio puede no ser significativamente alta,
en especial si el cuerpo está parcialmente carbonizado o si el episodio involucra polímeros que
liberan rápidamente ácido cianhídrico.
4.1.3 Identificación y dosaje de ácido cianhídrico en medios biológicos.
El ácido cianhídrico (HCN) es un líquido volátil, incoloro de olor característico a

almendras amargas que presenta gran difusibilidad debido su elevada presión de vapor. Las
sales de cianuro (sodio o potasio) son de interés toxicológico. El cianuro de sodio es más tóxico
que el de potasio porque desprende más HCN por gramo de compuesto.
El mecanismo de acción tóxica lo ejerce inhibiendo la citocromo c oxidasa bloqueando
de este modo la respiración celular generando hipoxia o anoxia citotóxica. También se combina
con proteínas que posean hierro en su máximo estado de oxidación (III) como la
metahemoglobina. Existe una enzima cuyo funcionamiento depende de la provisión de
aminoácidos azufrados, la cianuro azufre transferasa, que degrada el cianuro a tiocianato.
La exposición de grandes cantidades de cianuro puede ser mortal. La severidad de los

efectos depende en parte de la forma química del cianuro, la cual puede ser cianuro de
hidrógeno gaseoso o sus sales. La exposición a elevados niveles de cianuro durante corto
tiempo daña el cerebro y el corazón, y puede causar coma y muerte.
Personas que han respirado cianuro de hidrógeno en concentraciones de 546 ppm han
muerto después de 10 minutos de exposición, mientras que 110 ppm fueron un riesgo cierto de
muerte después de una hora de exposición.
Estos síntomas se desarrollan rápidamente, dependiendo de la cantidad ingeridad. Los

efectos son similares si grandes cantidades de cianuro son ingeridos, bebidos, respirados o
tocados. El contacto de la piel con sales de cianuro produce irritación. La exposición crónica a
cianuro produce daños en la glándula tiroidea.
La sintomatología puede ser de tipo superaguda con pérdida inmediata del conocimiento,
convulsiones, rigidez muscular y la muerte ocurre en pocos minutos (alrededor de 10). La
intoxicación aguda presenta tres períodos. En el primero se presenta ardor y anestesia en la
boca estómago, luego vértigos y zumbidos. En el segundo período se manifiesta pérdida del
conocimiento con convulsiones, contractura espasmódica de maxilares, pulso irregular, cianosis.
En el tercer período se presenta relajación muscular y muerte por parálisis del centro respiratorio
bulbar y paro cardíaco.
La etiología de la intoxicación con ácido cianhídrico (HCN) descripta es muy variada. Las
principales fuentes de compuestos cianurados son ciertas industrias en las cuales el HCN presenta
aplicaciones comerciales como son la galvanoplastia, extracción de metales preciosos (oro y plata),
producción de gomas sintéticas como resinas acrílicas, poliuretano, manufactura de plásticos, así
como el empleo de HCN para desinfección como insecticida y raticida.
Otra fuente de compuestos cianurados son los alimentos, como algunos productos
vegetales que contienen glucósidos cianogenéticos que por hidrólisis (ácida, alcalina o enzimática)
dan origen al HCN. Entre estos se encuentran especies de porotos, semillas de lino, sorgo,
almendras amargas, mandioca, habas, así como en semillas de manzanas y peras y en bebidas
fermentadas como el “Kirsh”, el aguardiente de cerezas.
El uso de raíces de cassava como fuente primaria de alimento en países tropicales produce
niveles elevados de cianuro en sangre. Se ha observado daños al sistema nervioso central,
debilidad en las extremidades, caminar dificultoso y sordera. La exposición crónica a las raíces de
cassava también se ha vinculado a función tiroidea disminuída.
Debe recordarse que la combustión de plásticos conteniendo nitrógeno (uretanos) es una

fuerte de cianhídrico gaseoso en incendios. La presencia de plásticos en los ambientes modernos
obliga, en casos de muertes por incendio, a determinar no sólo el monóxido de carbono sino el
cianuro, debido a que por su elevada toxicidad suele ser el responsable real de la muerte.
También se ha descripto otra fuente de compuestos cianurados en el uso farmacológico

como en antiguos antitusígenos como agua de laurel cerezo. Se lo ha empleado en ejecuciones
en la llamada cámara de gas y se han registrado muchos casos de intoxicaciones voluntarias y
homicidas.
Todos los análisis de cualquier material sospechoso de contener cianuro deben realizarse
bajo campana de extracción. Resulta útil tener a mano hipoclorito de sodio para fijar y destruir el
cianuro en casos de derrames.
4.1.3.1 Consideraciones generales de la analítica toxicológica.
La investigación de ácido cianhídrico puede realizarse con diferentes tipos de muestra:

vísceras (que necesitarán de una previa homogenización), líquidos biológicos, sangre u orina,
alimentos (productos vegetales o animales) y medicamentos.
La sangre venosa presenta un color rojo vivo característico. En cadáveres frescos se

observa color rojo cereza así como manchas de color rojo más o menos intenso. Junto al olor
típico de almendras amargas que desprenden los órganos se observan numerosas hemorragias
pequeñas en las serosas.
Se debe prestar especial cuidado en casos de suicidio con cianuro al realizar la autopsia,
en especial al retirar o manipular el contenido gástrico, dado que por su pH puede liberar
cantidades peligrosas de cianhídrico. Cualquier envase obtenido del lugar del hecho debe ser
analizado bajo campana de extracción de gases.
El recipiente que contiene la muestra debe estar escrupulosamente limpio, seco y cerrado
herméticamente para evitar pérdidas. Si el material son vísceras, no deben conservarse en formol
porque este reacciona con el ácido cianhídrico formando cianhidrinas de las que no se puede
liberar HCN. Las muestras deben conservarse en frío para evitar la acción enzimática y bacteriana
sin agregado de conservantes.
Existen tres tipos de determinaciones del ácido cianhídrico: los ensayos inmediatos o
preliminares, los ensayos mediatos y los ensayos cuantitativos.
4.1.3.2 Ensayos cualitativos o inmediatos.
La identificación directa del HCN en el recipiente que contiene el material es posible gracias
a su elevada presión de vapor a temperatura ambiente y procesos hidrolíticos que ocurren con
cierta rapidez por las condiciones del medio, pH, temperatura, etc.
Guatelli, M.A ha revisado en detalle las reacciones y métodos analíticos para cianuros y
ácido cianhídrico.
En la atmósfera del recipiente se libera CNH que puede deberse a dos tipos de procesos:
hidrolíticos y putrefactivos
Hidrolíticos
CN- + H2O HCN + OH-
El equilibrio se desplaza hacia la derecha. En vísceras en estado putrefactivo se libera CNH

de acuerdo con
CN- + CO2 + H2O HCN + H CO3-

Los ensayos inmediatos son técnicas que se realizan en la atmósfera del recipiente que
contiene la muestra mediante el empleo de los llamados papeles sensibles. Se utilizan papeles
impregnados en diferentes reactivos:
4.1.3.2.1 Utilización de papel de guayaco.
El ensayo se fundamenta en el aumento del potencial de oxidación de las sales cúpricas al

pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas. El sistema Cu(II)-cianuro se acopla a un
compuesto reductor (resina de guayaco) que por oxidación origina un derivado coloreado (de color
castaño vira al azul).
Reactivos:
• Solución acuosa de sulfato de cobre al 0,2%
• Solución alcohólica de resina de guayaco al 10% recién preparada.
Procedimiento..
En el momento de su uso, se embebe una franja de papel de filtro en una solución de

SO4Cu al 0,2 % dejando escurrir el exceso. Luego se embebe en una solución alcohólica de resina
de guayaco al 10% de reciente preparación. El reactivo del papel de guayaco colocado en la boca
del recipiente que contiene el material a analizar y el O2 producido en la reacción forman un
compuesto de color azul en forma inmediata.
8 HCN + 8 SO4Cu + 4 H2O 2 (CN Cu)2(CN Cu)2 + 8 SO4H2 + 2 O2
Un ensayo negativo permite descartar la presencia de HCN dada su sensibilidad. Un ensayo

positivo no entrega mayores datos y requiere confirmación con ensayos específicos. El ensayo
presenta interferencias de tipo oxidantes directos de la resina de guayaco y reductores que actúan
de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre.
Es un ensayo clásico, sensible pero inespecífico, pudiendo detectarse hasta 0,25 µg de ácido
cianhídrico.
4.1.3.2.2 Ensayo con o-tolidina.

Presenta igual fundamento que la reacción anterior pero la visualización se realiza con o-
tolidina. También se puede usar bencidina, fenoftaleína o cualquier sustancia que al oxidarse forme
un complejo coloreado. Esta reacción es altamente sensible pero inespecífica.
Reactivos.
• Solución acuosa de sulfato de cobre al 0,2%
• Solución alcohólica de o-tolidina al 1%.
Procedimiento
El ensayo es similar al anterior. En presencia de ácido cianhídrico se observa en forma

inmediata color azul verdoso que rápidamente vira al azul neto. Presenta mayor sensibilidad que el
ensayo guayaco-cúprico.
4.1.3.2.3 Ensayo de Grignard.
El ensayo se fundamenta en que el ácido pícrico en presencia del HCN, liberado de la

muestra ácida, forma isopurpurato alcalino, de color rojo al rojo naranja en el transcurso de cinco
minutos.
Reactivos
• Solución acuosa de ácido pícrico 1% caliente que antes del enfriamiento se agregan 10 gr
de CO3Na2.
Procedimiento.
Embeber tiras de papel filtro con solución acuosa de ácido pícrico y escurrir el exceso. Si el
papel se prepara en el momento, el ensayo presenta su máxima sensibilidad. El reactivo dura
indefinidamente. El papel es puesto en la boca del recipiente que contiene la muestra a analizar.
Un color rojo naranja indica resultado positivo.
4.1.3.2.4 Ensayo de Magnin.
Se basa en la formación de azul de Prusia.

HCN + OH- CN- + H2O
Luego
6CN- + Fe+2 [Fe(CN)6] - 4
Fe+2 + 2OH- Fe(OH)2 precipitado verde
2Fe(OH)2 + 1/2O2 + H2O 2Fe(OH)3
en medio HCl
Fe(OH)3 + [Fe(CN)6] - 4 + 3H + + Na+ Fe(CN)6FeNa + 3H2O

azul de prusia
Reactivos
• Solución acuosa de hidróxido de sodio al 2%
• Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% recientemente preparada.
Procedimiento.
Se impregna una tira de papel con hidróxido de sodio al 2% y se expone en el interior del
recipiente unos minutos. Se retira y se extiende sobre una cápsula de porcelana. Se distribuyen
sobre la superficie expuesta 4 gotas de solución de sulfato ferroso 2%. Se observa un precipitado
verdoso que luego pasa a castaño (hidróxido férrico). Finalmente por agregado de unas gotas de
ácido clorhídrico concentrado se observa color azul por formación azul de Prusia. Es una reacción
poco sensible pero muy específica
Siempre se efectúan por lo menos dos reacciones: una muy sensible y otra muy específica.
Si las dos reacciones arrojan resultados positivos se realiza el aislamiento.
4.1.4 Ensayos mediatos.
4.1.4.1 Aislamiento e identificación del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos.
Aislamiento.
Cuando se sospecha la presencia de ácido cianhídrico mediante los ensayos antes
especificados, se procede al aislamiento y posterior identificación. Para la realización de los
ensayos mediatos, se requiere de una separación previa del HCN de la muestra. Son adecuadas
una destilación simple o una microdifusión.
En la destilación simple se agrega al material ácido tartárico. El destilado se recoge en

hidróxido de sodio para evitar pérdidas del ácido cianhídrico liberado. En el caso de muestras en
estado de putrefacción se debe agregar al material a destilar acetato básico de plomo para retener
el ácido sulfhídrico.
Reactivos:
• Acido tartárico al 10%.
• Hidróxido de sodio al 10%.
Equipos
Aparato de destilación simple.
Procedimiento
Colocar 10 gr del material biológico en un matraz de destilación y cubrir con agua

(aproximadamente 60 ml). Agregar 10 ml de ácido tartárico al 10% y destilar recogiendo sobre 5 ml
de NaOH 10%. Se calienta al principio suavemente para evitar la formación de espuma y una vez
alcanzado el punto de ebullición se eleva lentamente la temperatura. Es importante que la
extremidad del tubo de desprendimiento conectado al extremo del refrigerante tome contacto con la
solución alcalina. Suspender la destilación cuando hayan pasado alrededor de 1/3 del volumen
inicial. Medir el volumen destilado para realizar posteriormente determinaciones cuantitativas.
4.1.4.2 Técnica del Azul de Prusia modificada o técnica de Chellen-Klassen.
El ensayo se fundamenta en la formación de un precipitado azul por formación de azul de

prusia (ferricianuro férrico) a partir del destilado, afectuando un ajuste previo del pH a un valor de 8
para favorecer la precipitación.
Reactivos
• Solución alcohólica de fenoftaleína al 1%.
• Acido sulfúrico 0,1N.
• Solución acuosa de carbonato de sodio al 10%.
• Solución de sulfato ferroso al 1% recientemente preparada.
• Acido clorhídrico concentrado.
• Solución acuosa de hidróxido de bario al 10%.
Procedimiento.
A 1ml de destilado se le agrega 2 gotas de solución de fenolftaleína (medio básico rosada),

y luego lentamente solución diluida de ácido sulfúrico hasta vivar el indicador a incolora. Luego se
lleva a pH alcalino con solución de carbonato de sodio al 20% gota a gota hasta viraje al rojo.
Agregar 3 gotas de solución de sulfato ferroso al 2% y dejar reposar 3 minutos. Acidificar con
clorhídrico concentrado. Color azul indica HCN. Si aparece color verde suave agregar gotas de
ácido fosfórico. Si aún no se observa color azul, se puede aumentar la sensibilidad de la reacción y
agregar gotas de solución de cloruro de bario al 10% y dejar reposar unas horas. Si se observan
puntos azules sobre fondo blanco, indica presencia de HCN.
Las reacciones correspondientes son las siguientes:
2 CNK + Fe(OH)2 Fe(CN)2 + KOH

Fe(CN)2 + CNK [Fe(CN)6K]4
Se agrega HCl y se agita:
[Fe(CN)6]K4 + Fe(OH)3 [Fe(CN)6]FeK + H2O

[Fe(CN)6]FeK + FeCl3 [Fe(CN6]3Fe4 (Azul de Prusia ) + KCl
Se intensifica con H3PO4 o Cl2Ba, pues forman sales insolubles de SO4Ba que sedimentan
arrastrando el Azul de Prusia al fondo del tubo, donde se observará un botón blanco azulado.
La sensibilidad de la reacción es de hasta 10 µg de ión cianuro. Con el agregado de cloruro
de bario se puede revelar hasta 5 µg de ión cianuro.
4.1.4.3 Reacción sulfociánica o de Von Liebig.

El método consiste en el agregado de un exceso de polisulfuro al destilado y posterior
calentamiento para formar sulfocianuro. Luego se acidifica la solución formándose ácido
sulfocianhídrico que con cloruro férrico aparece color rojo.
Reactivos
• Solución de sulfuro de amonio amarillo (polisulfuro).

• Acido clorhídrico concentrado.
• Solución rojo Congo.
• Solución acuosa de cloruro férrico al 0,5%.
• Eter etílico.
Procedimiento
Unos 5 ml de destilado se colocan en una cápsula de porcelana y se agregan unas gotas de

polisulfuro de amonio (amarillo). Se procede calentando suavemente durante 5 minutos sobre tela
metálica, agitando el líquido con varilla y agregando sulfurente a medida que la solución se
decolora. Cuando el contenido se haya concentrado (1 ml) y se observe persistencia de color
amarillo se considera prácticamente realizada la transferencia en sulfocianuro. Se deja enfriar y se
acidifica con solución concentrada de HCl hasta reacción ácida frente al rojo congo. El compuesto
puede aislarse por tratamiento con éter etílico realizando tres extracciones con 20, 10 y 10 ml de
éter cada una. Los extractos etéreos se evaporan en cápsula de porcelana y dejar evaporar el eter
a temperatura ambiente. Luego se trata el residuo con 2 o 3 gotas de cloruro férrico al 0.5% y
aparece color rojo intenso de intensidad variable (50 µg de HCN transformado en SCN- el color
aparece rápidamente)
CN - + (S)m- 2 SCN - + (S)n-1- 2
2SCN- + Fe+3 [Fe(SCN)2]+ (complejo color rojo)
El ensayo es altamente sensible y específico. Algunos autores estiman que es posible

revelar ión cianuro en la proporción de 100 µg/L.
4.1.5 Ensayos cuantitativos.
4.1.5.1 Método de Denigés.

Constituye una valoración en donde se forma una sal estable de AgCN y el exceso de Ag+
en el punto final forma un compuesto de color amarillo con el ión ioduro de acuerdo con las
siguientes reacciones. Este procedimiento es apto para concentraciones elevadas.
CN- + AgNO3 AgCN +NO3 -
AgCN + CN- [Ag(CN)2]- (complejo soluble)
[Ag(CN)2]- + Ag+ Ag(CN)2Ag (se forma antes del pto. final)
Se corrige con NH3
Ag(CN)2- + NH3 Ag(NH3)2+ + 2 Ag(CN)2
Ag+(exceso) + I- AgI amarillo
Reactivos
• Amoníaco concentrado.
• Ioduro de potasio al 10%.
• Solución de nitrato de plata 0,01N.
Procedimiento.
Tomar 10 ml de destilado y agregar 10 ml de amoníaco concentrado y 1 ml de KI al 10%.

Titular con solución de nitrato de plata 0.01N hasta aparición de turbiedad permanente.
Cálculos = 1 ml de NO3Ag (0.01 N) = 5.4 10-4 gr HCN = 0.54 mgr de HCN.
4.1.5.2 Determinación de cianuro en alimentos, sangre e hígado. Método de

formación de manchas de azul de prusia.
El método se fundamenta en que el cianuro de la muestra es liberado por acción del ácido
sulfúrico o ácido tricloroacético y aspirado a través de un disco de papel impregnado en sulfato
ferroso dentro de un flange y se forma ion férrico visualizado como manchas de ferrocianuro ferrico
(azul de Prusia). El disco es luego sumergido en ácido clorhídrico hasta que toda la porción sin
reaccionar sea eliminada. La intensidad de la mancha es proporcional a la cantidad de cianuro
presente en la muestra.
Reactivos.
• β glucosidasa.
• Agente antiespumante.
• Solución acuosa al 11% de cloruro férrico: pesar 11g de cloruro férrico y llevar a 100 ml con
agua destilada.
• Solución acuosa de sulfato ferroso amónico al 19%: pesar 19 g de (NH4)2Fe(SO4)2) y llevar
a 100 ml con agua destilada.
• Solución acuosa al 10% de hidróxido de sodio: pesar 10 g de NaOH y llevar a 100 ml con
agua destilada.
• Solución acuosa de 1N de hidróxido de sodio: pesar 40 g de NaOH y llevar a 1000 ml con
agua destilada.
• Solución stock de cianhídrico (1000 µg/ml): pesar 0,2503 g de cianuro de potasio y transferir
en un matraz de 100 ml agregar 10 ml de NaOH 1N y diluir al volumen con agua destilada.
• Solución standard intermedia de cianhídrico (100 µg/ml): diluir 1 ml de la solución stock de
cianhídrico en 10 ml de agua destilada. Preparar diariamente.
• Solución de trabajo de cianhídrico (10 µg/ml): diluir 5 ml de la solución intermedia standard
de cianhídrico en 50 ml de agua destilada. Preparar diariamente.
• Solución acuosa al 20% de ácido sulfúrico: agregar 50 ml de agua a un frasco graduado de
100 ml. Agregar 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y llevar al volumen con agua
destilada.
• Solución de ácido clorhídrico 25%: agregar 50 ml de agua en una probeta de 100 ml,
agregar 25 ml de HCl concentrado y llevar a volumen con agua destilada.
• Papel de filtro Watman Nº 40 cortado en forma de discos 16 mm diámetro.
Aparatos y equipos.
• Aparato para cianhídrico
• Baño de agua a 75°C.
• Bomba de aire
• Baño de vapor o evaporador.
Procedimiento
Pretratamiento de alimentos.
1. Pesar cerca de 10 g de alimento y transferir a un homogeneizador

2. Agregar 200 ml de agua y 0,02g de β glucosidasa
3. Homogenizar durante 4 minutos.
4. Dejar decantar 1 hora.
5. Proceder al paso 10 del análisis.
Pretratamiento en muestras de sangre.
1. Agregar 300 ml de agua, 5 ml de sangre y 2 ml de antiespumante a un probeta de 500 ml.

2. Reemplace el tapón de goma en el aparato de cianhídrico con el tapón ajustado en la probeta de
500 ml.
3. Prepare suficiente cantidad de agua caliente (paso 5 del análisis) que pueda contener la probeta
de 500 ml.
Procedimiento.
1) Agregar aproximadamente 20 ml de agua al tubo muestra. Pipetear 0,5 ml de solución standard

de trabajo en el tubo.
2) Agregar 20 µl de cada uno de los siguientes reactivos FeCl3 11%, (NH4)2Fe(SO4)2) 19%, y
NaOH 10% en el centro del papel de filtro de 16 mm de diámetro.
3) Ubicar el papel de filtro en el aparato de cianhídrico mientras esté húmedo y ensamble el
aparato.
4) Agregar 1,0 ml de ácido sulfúrico/g de estándar con una jeringa a través de la entrada del tubo
de aire al tubo muestra.
5) Ubicar el tubo en baño de agua a 75°C.
6) Aplicar succión durante 4 minutos. Menor tiempo de succión puede dar incompleta recuperación
y mayor tiempo puede condensar agua arriba del disco.
7) Revelar el papel con HCl al 25% caliente (en baño de vapor o en plancha calefactora) hasta que
el papel es vea blanco con manchas azul.
8) Enjuagar el disco con agua destilada y secar. Alinear las manchas standard en línea sobre un
fondo blanco. Si las manchas son de color oscuro excesivo, puede deberse a sulfuros que tienden
a desaparecer al ubicar el papel en HCl.
9) Repetir los pasos 2-8 con standard de 10 µg, 20 µg y 50 µg standard.
10) Colocar una porción de la muestra homogeneizada (1-5g) estimando que contiene un total de 5
– 20 µg de cianuro en el tubo muestra. Agregue 20 ml de agua al tubo de la muestra.
11) Agregue 1ml de ácido sulfúrico por gramo de muestra. Como mínimo de 1 ml, pudiendo
agregarse más volumen si la muestra es básica.
12) Repetir los paso 5-8.
13) Repetir el análisis de la muestra con un sobreagregado de 5 µg.
14) Puede usarse una comparación visual o cuantificar en un densitómetro.
15) Construir la curva de calibración usando los estándares de cianuro y determinar los niveles en
la muestra por comparación de absorbancia. Informar en ppm.
Consideraciones generales: Medir el pH del contenido estomacal. Si el pH es ácido, el ión cianuro
es probable que se haya perdido.
• Precauciones: Este método emplea soluciones de HCN siendo importante realizar
esta preparación y manipuleo con sumo cuidado y siempre bajo campana de
extracción de gases.
4.1.5.3 Método de microdifusión de Feldstein-Klendshoj.
Fundamento.
En la cápsula de Conway el ácido cianhídrico difunde del compartimiento externo al interno

siendo fijado como cianuro en la solución alcalina. Se toma una alícuota del compartimiento interno
y se agrega cloramina T, formándose cloruro de cianógeno. Luego por el agregado de piridina se
forma cloruro de cianopiridina.
La acción hidrolítica determina la apertura del anillo piridínico, para dar lugar a la formación
del ácido glutacónico. Si este derivado se hace reaccionar con ácido barbitúrico se forma un
complejo rojo que se lee a 580 nm.
Muestra: sangre entera con heparina, orina u homogenato de vísceras.
Reactivos.
• Hidróxido de sodio 0,1N
• Acido sulfúrico 10% en volumen
• Lubricante: a base de siliconas o mezclar 2 partes de vaselina sólida y 1 parte de parafina.
• Fosfato monosódico 1M.
• Cloramina T al 0,25%. Se guarda en heladera hasta el momento de usar.
• Reactivo piridina-barbitúrico: en un matraz aforado de 50 ml colocar 3 g. de ácido
barbitúrico, 15 ml de piridina purísima y 3 ml de ácido clorhídrico concentrado. Mezclar
hasta disolución total, llevar a volumen con agua destilada y filtrar.
Instrumental.
• Espectrofotómetro.
• Cubetas de sección cuadrada de 1 cm de paso de luz.
• Cámaras de Conway.
Procedimiento.
1. Colocar en el compartimiento interno de la unidad de microdifusión de Conway 3,3 ml de

hidróxido de sodio 0,1N y en el compartimiento externo 2 a 4 ml de sangre total u orina, o 5 ml de
homogenato de tejido (equivalente a 1 g de tejido). Como reactivo liberador se agregan 2 a 3 gotas
de ácido sulfúrico al 10% en el compartimiento externo.
2. Tapar inmediatamente y homogenizar por rotación. Sellar perfectamente las cámaras con
vaselina. El tiempo de difusión es de 3 a 4 horas a temperatura ambiente.
3. Transcurrido el tiempo indicado se toma 1 ml de la solución alcalina del compartimiento

interno y se coloca en un tubo de ensayo. Se prepara un blanco colocando en otro tubo 1 ml de
hidróxido de sodio 0,1N. A cada tubo agregar 2 ml de fosato monosódico 1M y 1 ml de cloramina T
al 0,25%. Mezclar y dejar en reposo 2 a 3 minutos, agregar por último 3 ml de reactivo piridina-
barbitúrico, mezclar y dejar en reposo 10 minutos. En presencia de ión cianuro aparece color
rosado cuya absorbancia se mide a 580 nm.
Se compara la absorbancia con testigos de cianuro en concentraciones comprendidas entre

0,1 a 2,0 g/ml de solución de hidróxico de sodio 0,1N.
4.1.6 Valores normales de cianuro en individuo adulto.
El cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeñas cantidades. Hasta
15 µg/100 ml sangre es considerado como valor normal.
4.1.5 Interpretación de los resultados.
El valor de TWA es de 10 ppm (OSHA, MAK) mientras que ACGIH y NIOSG recomienda
un valor de STEL de 4,7 ppm. En una intoxicación por inhalación de ácido cianhídrico valores
mayores de 100 µg/100 ml suelen ser fatales pero puede variar de un individuo a otro.
La ingestión de 150- 200 mg de NaCN puede provocar la muerte en un individuo adulto de
70 Kg pudiendo llegar la concentración sanguínea a valores 1 –2 mg/100 ml o superiores.
En muestras de sangre cadavérica, el cianuro desaparece rápidamente por acción
enzimática y bacteriana. Hasta 15 µg/100 ml de sangre en cianuro aparece como producto del
catabolismo normal en pequeñas cantidades. En sangre, niveles de cianuro mayores de 1 mg/L es
asociado con casos fatales.
Dosis tóxica: una concentración de 1 mg/Kg de peso corporal es mortal.
4.1.6. Generación de monóxido de carbono y ácido cianhídrico en Incendios de polímeros
Actualmente se pone especial énfasis en la investigación de ácido cinahídrico (HCN) junto al

monóxido de carbono (CO) en personas expuestas a incendios de materias plásticas que
contienen nitrógeno en su estructura. En nuestro país, han sucedido episodios trágicos durante
los últimos años que tuvieron como desenlace la muerte masiva de personas (Por ejemplo:
incendio en unidades penitenciarias en 1990 y 2005 y la denominada “tragedia de Once” en
2004).
En un episodio de incendio de colchones de poliurteno con 35 víctimas fatales, Ferrari et al
(2001, 2005) consignaron que el CO oscilaba entre un 4%-18% con un promedio de 9%,
expresado como % de saturació de COHb (carboxihemoglobina); mientras que el HCN
mostraba un intervalo de 2.0-7.2 mg/L, con un promedio de 3.5 mg/L. Estos últimos valores
exceden ampliamente los valores letales, mayores a 1 mg/L, consignados en bibliografía para el
gas cianhídrico en sangre (Ballantyne, 1974; Baselt, 2000; Moffat et al, 2004).
Repetto y Martínez (1976) informaron que en víctimas fatales de un incendio en un “night club”,
se observaba altos niveles de CO y dosis sub-letales de ácido cianhídrico en 4 de los 6 occisos.
Elkius y Coleman, citado por Guatelli (1992), señalaron que se obtiene una mayor proporción de
CO con respecto a HCN en la descomposición pirogenada de plásticos nitrogenados, mientras
que Montgomery (1986) consigna que el HCN en forma masiva es desprendido en ambientes
con muy poco oxígeno.
Guatelli (1964, 1992), con autoridad reconocida en el tema, comenta detalladamente ensayos
experimentales y accidentes provocados por incendios en los que se generaron el HCN.
Si bien existe un considerable número de trabajos que mencionan la posible producción de HCN
en incendios de plásticos nitrogenados, poco en cambio se ha informado sobre el rol del HCN
como agente letal respecto del CO, especialmente en combustiones de plásticos o espumas
como las de poliuretano.
La producción de HCN en diversos procesos, según los materiales involucrados, ha sido
demostrada por diversos investigadores (Terril et al, 1978; Symington et al, 1978; Birky y Clarke,
1981; Montgomery, 1986; Lundquist et al, 1989; Alarie, 2002; Walsh et al, 2004; Yeoh y
Braitberg, 2004). Se observa no obstante, una tendencia a atribuir un papel más relevante al CO
generado que al HCN. Inclusive algunos autores sostienen que la producción de distintos
compuestos nitrogenados (derivados nitrilos), podrían competir con el HCN limitando los efectos
tóxicos de este último (Guatelli, 1992).
Estos estudios sugerirían que el HCN podría provocar una rápida inhibición inicial sobreviniendo
posteriormente la muerte por intoxicación con CO (Purser et al, 1984). Nuestros hallazgos para
el poliuretano, se contraponen a esta postura.
La combustión inicial descompone al poliuretano entre 150-300ºC, liberando entre otros
productos HCN y CO. Montgomery (1986) basado en experimentos animales consignó que la
temperatura en la que se formaría el temido HCN puede variar según los distintos tipos de
polímero, notándose una diferencia relevante en las espumas rígidas y las espumas flexibles.
Además, parecería que estas diferencias se equlibran cuando se alcanzan o sobrepasan los
800ºC. Por otro lado Kimmerle (cit. por Montgomery, 1986) encontró que la temperatura de
descomposición de una espuma flexible de poliuretano a la cual producía una atmósfera letal en
ratas era menor a 300ºC, mientras que las espumas rígidas lo hacían por sobre los 650ºC.
Al escindirse en una combustión más fácilmente el grupo CN- del polímero con el aumento de la
temperatura, teniendo en cuenta que esta puede alcanzar entre 500-1000ºC en un tiempo de 2
a 5 minutos, se deduce la rápida liberación masiva de HCN.
Cabe señalar que la propagación de la combustión en este caso es significativamente más
rápida que la observada en un incendio con cantidad equivalente de madera.
La descripción de incendios incontrolables con poliuretanos sin retardantes de ignición, indica
que existe una rápida diseminación de fuego y humo que puede contribuir en forma relevante al
potencial letal de estos sucesos.
Guatelli (1992) en nuestro medio, nota que en unidades carcelarias se han producido incendios
intencionales de colchones, con relleno de goma espuma, señalando que la muerte de muchos
internos se habría producido por intoxicación oxicarbonada, sin practicar la determinación de
HCN. Manifiesta además, que la incorporación de agentes retardantes de la combustión en este
tipo de polímeros puede modificar los productos de degradación. Expresa también que la
adición de cobre a la espuma flexible de poliuretano redundaría en una significativa reducción
del HCN generado en incendios, como también otros productos de combustión.
Nosotros opinamos que se debe realizar la determinación de ambos tóxicos volátiles, con el
objeto de alcanzar una idea más acabada sobre la presunta influencia de ambos venenos en el
proceso de intoxicación. Esta opinión se encuentra en línea con una publicación muy reciente
de Walsh et al. (2004) que enfatiza seriamente la importancia del ácido cianhídrico en incendios
de materiales diversos, consignando que entre 5,000 y 10,000 personas mueren cada año en
Estados Unidos por motivo de intoxicación cianhídrica proveniente de la inhalación de gases en
incendios.
Aunque el efecto letal del gas cianhídrico es bien conocido en el hombre, poca es la información
disponible acerca del curso y severidad en la acción incapacitante para huída en situaciones de
incendio, durante los estadios tempranos de la exposición.
También debe tenerse en cuenta que la disminución de la concentración de oxígeno en el
ambiente en combustión puede ser causa de incpacitación y muerte, especialmente si
disminuye en niveles inferiores al 10% (Alarie, 2002).
Por último, es muy importante realizar ensayos sobre muestras de materiales combustionados
con el objeto de verificar la formación o no del HCN.
4.2 Tóxicos volátiles.
Se denominan tóxicos volátIles a todas aquellas sustancias que independientemente de

su estado físico pueden separarse del material que las contiene a través de los siguientes
métodos: destilación simple destilación por arrastre con vapor, microdifusión, espacio cabeza.
Comprenden, entre otros, a compuestos tales como alcoholes primarios, aldehídos, cetonas,
fenoles y solventes orgánicos como éter, cloroformo, tetracloruro de carbono, etc.
Es necesario tener en cuenta que los tóxicos volátiles al ingresar al organismo pueden
sufrir una serie de modificaciones en su estructura de manera tal que, dichas sustancias pueden
convertirse en metabolitos atóxicos o bien aumentar notablemente su toxicidad.
En los casos de intoxicaciones, para realizar la correspondiente investigación se emplea

una alícuota acorde con el volumen total de la muestra recogida. En muestras destinadas a la
peritación, generalmente se utiliza un octavo de la cantidad total de la muestra disponible. En las
pericias se emplean vómitos, restos de medicamentos, alimentos, vísceras (estómago, hígado,
bazo, riñones, cerebro), sangre u orina. Se procede entonces a tomar una porción reducida de
ellos sobre la que se efectúan reacciones preliminares con papeles reactivos previo al
aislamiento del o de los tóxicos, tratando de analizar la sección del tracto digestivo donde
presumiblemente, se encuentre la mayor concentración de los sustancias de interés.
Las condiciones de recolección de las muestras deben contemplar no utilizar alcohol

como antiséptico local ni otras soluciones constituidas por sustancias reductoras que puedan
interferir en la determinación posterior. Se recomienda usar solución jabonosa o solución acuosa
de bicloruro de mercurio 0,5%.
La conservación de las muestras requiere el empleo de recipientes de plástico con tapa

hermética (no usar tapones de goma) conteniendo 2 - 5 mg de fluoruro de sodio (anticoagulante
y conservador) o bien oxalato y citrato. Asimismo, se deben realizar rápidamente las
determinaciones o en su defecto, someter a las mismas a un almacenamiento refrigerado a 4°C,
sellando el recipiente y se deben tener contramuestras.
Es importante el aislamiento de dichos compuestos separables del material que lo

contienen a través de los distintos métodos citados previamente, los cuales se desarrollarán a
continuación. Posteriormente al aislamiento, se realiza la cuantificación de las sustancias en
estudio mediante el empleo de diversas metodologías como cromatografía gaseosa (CG),
cromatografía gaseosa de alta resolución (HRCG) con empleo de columnas capilares, métodos
enzimáticos, métodos acoplados, etc.
4.2.1 Etanol.
4.2.1.1 Introducción.
Dentro de los tóxicos volátiles, los alcoholes Etanol y Metanol son sustancias de
importancia toxicológica dada su acción farmacológica depresora del sistema nervioso central
(SNC) y el abuso creciente del consumo de bebidas alcohólicas. Esto último presenta
importancia médico - social debido a que los individuos alcoholizados pueden ser causantes de
trastornos y accidentes de los cuales son imputables.
Las vías de penetración posibles de los alcoholes son la digestiva, la respiratoria, y la

absorción a través de la piel. En el caso del etanol, la intoxicación más frecuente ocurre cuando
el individuo ingiere cantidades excesivas de esta sustancia por el consumo de bebidas
alcohólicas fermentadas y/o destiladas.
Los tipos de muestras generalmente usados para estas determinaciones son: sangre
(alcoholemia), orina, otros fluidos biológicos, vísceras, alimentos, etc. A continuación se describen
los métodos de determinación de etanol mas frecuentemente empleados en un laboratorio de
toxicología.
4.2.1.2 Determinación de etanol en sangre por el método de microdifusión.
La microdifusión se realiza en cámaras de Conway que poseen en el compartimiento

externo muestra y agente liberador (CO3K2) y en el interno el agente atrapante Cr2O7K2 + H2SO4
0,01N. En este caso, se produce la captación y oxidación del etanol hacia ácido acético,
forzándose la remoción completa del primer compuesto al cabo de un tiempo y temperatura
previamente determinados.
Las muestras sobre las que se utiliza esta técnica son sangre, orina, saliva y otros fluidos
biológicos.
Reactivos
• Solución de K2Cr2O7 0.106 N en H2SO4 22,08 N (Pesar 5,2 gr de K2Cr2O7 en 400 ml de

H2O (d) y llevar a 1 L con H2SO4 (c).
• Solución saturada de K2CO3 .
Curva de calibración.
Soluciones de sangre con concentraciones conocidas de alcohol etílico: 0,25 g/L; 0,50 g/L,
1,0 g/L ; 2, 0 g/L ; 3,0 y 4.00 g/L.
Procedimiento.
Se colocan en el compartimento interno de la cámara de Conway (tamaño pequeño), 0,5

ml de la solución ácida de Cr2O7K2. En un extremo del compartimento externo, se agregan 0,2
ml de sangre y en el otro extremo del mismo 0,2 ml de la solución saturada de CO3K2, Tapar la
cámara y hacerla girar cuidadosamente (en forma horizontal) sobre la mesa de trabajo, para
poner en contacto los reactivos colocados en el compartimento externo.
Dejar difundir 1 hora a temperatura ambiente. Luego, destapar la cámara y recoger la

solución del compartimento interno.
Proceder a la lectura espectrofotométrica a 620 nm. En el caso de utilizar cámaras de

Conway (tamaño grande) los volúmenes de los reactivos a utilizar serían los siguientes: 3 ml de
la solución ácida de Cr2O7K2, 1 ml de sangre y 1 ml de la solución saturada de CO3K2.
Resultados
Valores de alcoholemia superiores a 0,5 g/ L, tienen importancia médico-legal en nuestro país.
4.2.1.3 Determinación de etanol en sangre por el método de Cromatografía

Gaseosa (CG) y Head Space.
A fin de proceder a la identificación y cuantificación de etanol en muestras de sangre se

utiliza la cromatografía gaseosa, implementando la técnica del “head space” para separar los
analitos de la matriz, previo a la inyección en el cromatógrafo.
Materiales y reactivos.
a) Solución estándar de etanol al 10 gr/L .

b) Sangre libre de etanol con agregado de la solución de etanol para alcanzar concentraciones
de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/L.
c) Agente liberante: solución saturada de carbonato de potasio.
d) Butanol 1 por mil en sangre no putrefacta .
e) Viales de vidrio de 10 ml de capacidad, cerrados con tapón de goma
y arandela de aluminio con sellador manual.
Condiciones del head-space (HP 7694E).

Incubación a 60°C de los viales cerradoos durante 10 minutos, presurización carrier N2
14,4 psi, presión en vial 14,0 psi. Tiempo presurización: 0,2 min, tiempo loop: 0,01 min, tiempo
inyección: 0,2 min. Temperatura loop: 102°C, temperatura líneal 100°C.
Condiciones cromatográficas (PE 8000)
Columna de vidrio empacada (1,80 m largo, diámetro externo 1/8 de pulgada con relleno
de Carbowax 1500 al 0,2% fase estacionaria soporte: Graphapac GC malla 60/80, temperatura
columna 100°C, detector de ionización de llama (temperatura = 150°C), temperatura de
inyección = 150°C. Tiempo de retención etanol: 2.31 min, tiempo de retención standard interno:
4.88.
Elaboración de la curva patrón
Se preparan viales con 1 ml de sangre con agregado de la solución tipo de etanol para
alcanzar concentraciones de 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 g/L. Se agregan a cada uno 0.5 ml de solución
del patrón interno y 1 ml de la solución del agente liberador. Se tapan herméticamente.
A partir del cromatograma resultante se obtienen las áreas bajo la curva del etanol y del
patrón interno. Se grafica concentración de etanol en sangre vs. AEtOH/API, en donde AEtOH es el
área bajo la curva del pico de etanol y API es el área bajo la curva del patrón interno.
Procedimiento
Se prepara un vial de 10 ml con 1 ml de sangre a analizar, 1 ml de la solución del

standard interno y 1 ml del agente liberador, agregados en ese orden. Se sella rápidamente el
vial para su disposición en el equipo.
Los cálculos se realizan por interpolación a partir de los datos obtenidos para la curva
patrón, considerando siempre la relación AEtOH / AS. Se expresan los resultados en gramos de
etanol/l de sangre o en mg/100 ml.
4.2.1.4 Determinación de etanol en sangre por métodos bioquímicos.
Los métodos bioquímicos permiten la dosificación del alcohol en la sangre u otros fluidos
biológicos a efectos de inferir la impregnación alcohólica del organismo. Entre ellos se
encuentran los métodos enzimáticos (método de la alcohol deshidrogenasa ADH) y métodos
acoplados (enzimático – electroquímicos) (biosensores).
Método-Enzimático /UV.
Fundamento.
El etanol es oxidado a acetaldehído en presencia de la enzima alcohol

deshidrogenasa (ADH) por nicotinamida / adenina dinucleótido (NAD).
Etanol + NAD+ acetaldehido+ NADH + H+
El acetaldehido formado puede ser desplazado totalmente hacia la derecha en

condiciones alcalinas atrapando el acetaldehido formado.
El acetaldehido es oxidado en presencia de aldehído dehidrogenasa (Al-DH)

cuantitativamente a ácido acético
Acetaldehído + NAD++ H2O ácido acético + NADH + H*
NADH es determinado por la medida de su absorbancia a 334, 340 ó 345 nm.
Ensayo.
• 100 ml de buffer difosfato de potasio pH 9
• 30 tabletas, cada tableta contiene NAD 4 mg, aldehido dehidrogenasa estabilizada.
• 1,5 ml de suspensión ADH de 7000 U. Etanol estándar: usar sin diluir. Se utiliza para el
control del proceso.
Se preparan de las soluciones según las indicaciones del fabricante.
Condiciones de trabajo.
• Longitud de onda 340nm ó 365 nm ó 334 nm

• Cubetas de vidrio: 1 cm paso óptico
• Temperatura > 20 / 25°C
• Volumen final: 3,15 ml. Leer contra aire (sin cubeta en el paso de luz, contra agua o
contra blanco (cuando se usa fotómetro de doble haz).
• Solución de muestra: 0.3 - 12 µl etanol /cubeta (en 0,100-0,500 ml de volumen de
muestra)
Procedimiento
Pipetear en la cubeta blanco

Reacción mezcla 3,000 ml 3,000 ml
Agua redestilada 0,100 ml ----------
Solución muestra -------- 0,100 ml
Mezclar aproximadamente 3 minutos y leer la absorbancia de la solución (A1)
Solución 3 0,050 ml 0,050 ml
Mezclar, después de completa reacción (5 a 10 minutos) leer la absorbancia de la

solución inmediatamente una después de la otra. (A2)
Es absolutamente necesario tapar la cubeta con parafilm durante la medida
Determinar la diferencia de absorbancia (A2- A1) para ambos, blanco muestra.
A = (A2-AI) muestra - (Á2-AI) blanco
La medidas de absorbancia deben arrojar como regla, una diferencia de al

menos 0,100 unidades de absorbancia para obtener resultados suficientemente precisos.
Cálculos
De acuerdo a la ecuación general para calcular la concentración en la reacción en la cual

la cantidad de NADH formado es estequiométricamente igual a la mitad de la cantidad de
sustrato:
V .PM .ΛA
C(g / L ) =
E.d.v.2.1000
V: volumen final, 3.150 mI.

v: volumen de muestra, 0.100 ml
PM: peso molecular del etanol (g/mol). 46.07
d: paso óptico, 1.00 cm
E: coeficiente de extinción molar del NADH
340 mn: 6.3 (l.mol-1. cm)
365mm: 3.4 (l.mol-1. cm)
334 nm: 6.18 (l.mol-1. cm)
Si la muestra ha sido diluida considerar aplicar a los resultados el correspondiente factor

de dilución
Sí se analiza un sólido y/o muestra semisólida, la cual es pesada para la preparación, los
resultados se expresan por cantidad de muestra pesada.
contenido etanol = etanol (g/l sol. muestra) x 100 (g/100)

peso muestra (g/l sol. muestra)
4.2.1.5 Interpretación de resultados.
La relación entre alcoholemia y los efectos farmacológicos producidos presenta

variaciones según factores individuales tales como edad, hábito, sexo, etc.
Dada su acción farmacológica depresora del sistema nervioso central (SNC), el etanol
produce una parálisis descendente del mismo, luego la depresión continúa sobre los centros
subcorticales y el cerebelo, después sobre la médula espinal y finalmente sobre el bulbo, con
depresión de los centros vitales, respiratorio y vasomotor llevando a la muerte al individuo.
La acción farmacológica del etanol comprende 4 períodos, cuyas manifestaciones están

en relación con su concentración en sangre (alcoholemia).
Período I: (50 - 150) mg/100 cm3 sangre. Alteraciones funcionales de la corteza cerebral
(memoria, atención, asociación de ideas están perturbadas). Liberación del tono emocional,
malhumor, exceso de confianza.
Período II: (150 - 250) mg/100 cm3 sangre. Ebriedad manifiesta. Trastornos de la palabra,
postura y marcha, pérdida de la coordinación, depresión de los centros posturales, incluyendo el
cerebelo.
Período III: (250 350) mg/100 cm3 sangre'. Sueño profundo, inconsciencia, estupor, coma. Se
afectan los centros espinales.
Período IV: (350 - 450) mg/100 cm3 sangre. Depresión de centros bulbares, vasomotor,
respiratorio. Existe peligro de muerte. Coma profundo. Piel húmeda y fría, pulso acelerado,
pupilas dilatadas y respiraciones lentas. La muerte se produce por parálisis respiratoria
principalmente con concentraciones mayores a 500 mg/100 cm3 sangre.
El alcohol produce o constituye un caso típico de Toxicomanía (dependencia física, psíquica y

tolerancia).
Desde el punto de vista forense interesa su cuantificación a efectos de aplicarse cuando
corresponda la determinación de alcolemia retrospectiva.
4.2.1.6 Curvas de absorción-eliminación de etanol en sangre y Cálculos de

Alcoholemia Retrospectiva.
Widmark en 1932 había enunciado que el metabolismo del alcohol transcurría a

velocidad constante, pero lentamente.
El alcohol contenido en las bebidas alcohólicas se absorbe preferentemente por el

yeyuno ileon, alcanzando en breve el torrente sanguíneo dada su fácil difusión por las
membranas biológicas. La ingestión anterior o simultánea de alimentos sólidos hace más lenta
la absorción mientras que el ayuno la acelera. La desintoxicación bioquímica es progresiva y
dura aproximadamente unas 12-16 horas. El ritmo de eliminación depende del coeficiente de
etiloxidación, que expresa la cantidad de alcohol eliminado por minuto y por kilogramo de peso
en un sujeto dado, cualquiera sea su concentración: este coeficiente es llamado “constante β de
Widmark”. La figura 4.3 ilustra una curva típica de absorción - eliminación, mediante las
determinaciones de etanol en sangre (alcoholemia) y el tiempo transcurrido desde el acto de
ingesta.
La primer parte indica una alcoholemia ascendente, que se manifiesta en la etapa de

absorción de alcohol desde el tracto gastrointestinal a la sangre. Si la absorción es rápida (como
sucede con las bebidas de alta graduación alcohólica o ingesta en estado de ayuno) la curva de
absorción semejará más una vertical (línea trazos cortados). Caso contrario, por ejemplo cuando
se encuentran alimentos en el estómago al momento de la libación, poseerá menor pendiente
(línea de puntos). La zona de meseta indica un equilibrio entre el ingreso por difusión y
eliminación oxidativa.
2,4
concentración de etanol en sangre
2,0
1,6
1,2
Ct Ψ
0,8
∆C
0,4 Cm
0,0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (horas)
Fig. 4.3: Curva de alcoholemia.
Prolongando la recta hacia la ordenada observamos la concentración correspondiente a

Co, siendo esta la alcoholemia máxima teórica, suponiendo absorción inmediata y total de todo
el etanol. Experimentalmente se comprobó que la relación D/Co es 0,7 para el hombre y 0,6
para la mujer, debido a la desigual distribución del etanol en los diferentes tejidos corporales.
Esta relación D/Co suele definirse como Volumen de Distribución.
El coeficiente β (en el gráfico) puede obtenerse mediante la relación: ∆C / ∆t, es decir, β

= ∆C/ ∆t. La importancia del coeficiente β radica en que permite efectuar cálculos retrospectivos
de alcoholemia y determinar el alcohol ingerido por un individuo. El Profesor Manuel Repetto
considera que para aplicar los cálculos de alcoholemia retrospectiva, conforme al espíritu del
Derecho y no perjudicar al acusado se puede tomar el valor mínimo de β = 0,1 gr por mil, si esta
expresado en horas; o bien 0.002, si esta expresado en minutos.
En un principio se creyó que β era constante, pero con el tiempo, los estudios
experimentales arrojaron nueva luz, en relación a la verdadera cinética que presenta el alcohol
etílico. Hoy se admite que algunos factores individuales, como por ejemplo, sudoración,
habituación y algunas patologías hepáticas y renales, pueden modificar el valor de la constante
β.
Es importante tener en cuenta que los cálculos en que involucramos β, sólo tienen
validez en la etapa de eliminación, es decir, en la rama descendente de la curva absorción -
eliminación. Existe discrepancia entre los autores sobre la exactitud de los cálculos
retrospectivos. Algunos indican que los numerosos factores que influyen en β, no proporcionan
datos fidedignos para aplicarlos matemáticamente y con exactitud. En cambio otros apoyan la
validez del cálculo pero advierten la necesidad de efectuar dos determinaciones de alcoholemia,
sucesivas, para asegurar que se está en la etapa neta de eliminación.
Antes de entrar en las expresiones matemáticas y los procedimientos que se realizan

para obtener el resultado de una alcoholemia un tiempo “t” anterior a la toma de muestra, cabe
señalar que en realidad la eliminación no sigue una cinética lineal de orden “0” o lineal sino solo
para concentraciones de etanol en sangre superior a 0,5 g/l de alcohol etílico.
En este caso la concentración a tiempo “t” estará dada por:
Ct = Cm - kt
Siendo Ct: alcoholemia al tiempo t, con Cm: alcoholemia al momento de la toma de muestra y k
constante. (Para una información más extensa consultar Manual de Toxicologìa Avanzada del
Prof. Manuel Repetto, Ed. Diaz de Santos, España, 1997)
En juicios por homicidio, lesiones graves, etc. el magistrado (en la provincia de Buenos Aires el
Fiscal dirige la investigación preliminar preparatoria antes de su elevación a juicio) suele requerir
del Perito el cálculo de alcoholemia retrospectiva al momento del hecho. Esto evidentemente por
una circunstancia que se da con mucha frecuencia: el imputado es detenido varias horas
después del hecho delictivo por lo que las muestras sanguíneas no reflejarán el tenor real de
alcohol al momento del hecho.
Si la alcoholemia supera el valor de 1 por mil, bien puede simplificarse el cálculo

aplicando la ecuación correspondiente a una eliminación de orden “0”, es decir, lineal. Si
observamos la curva de eliminación podemos aplicar el concepto geométrico de la tangente del
ángulo ψ (cateto opuesto / cateto adyacente) es decir:
Ct - Cm
= tg ψ = β
t2 - t1
despejando:
Ct = Cm + β · t
siendo Ct: alcoholemia en el momento del hecho, Cm: alcoholemia en el momento de la toma de
muestra y t: tiempo transcurrido desde el momento del hecho al de la toma de muestra (t2 - t1).
Respecto de la cantidad de alcohol “A” en el organismo al momento del hecho:
A= Ct · P · r
siendo P: peso del individuo, r: constante que relaciona la concentración de etanol en el cuerpo /
concentración en sangre. Sustituyendo en la ecuación la expresión correspondiente a Ct,
hallada más arriba:
A = (Cm + β · t ) · P · r
A continuación, mediante un ejemplo hipotético, procederemos a calcular la alcoholemia

retrospectiva y la cantidad de alcohol en el cuerpo, que nos permitirá inferir cuanta bebida
alcohólica de una graduación determinada pudo haber tenido el imputado en el momento del
hecho delictivo.
Supongamos que se trata de un caso de Lesiones graves. El imputado es detenido y la

muestra sanguínea extraída seis horas después del hecho. El informe de Laboratorio arroja el
siguiente valor: 1,2 gr de alcohol etílico por 1000 ml de sangre. Aplicando la fórmula para
obtener la alcoholemia en un tiempo t de seis horas:
Ct= Cm + β · t
Cm: en gr. / 1000

β: 0,0025 en gr / min. Kg
t: tiempo en minutos.
Ct= 1,20 + 0,0025 · 360

Ct= 1,20 + 0,90
Ct= 2,10 gr por 1000 gr de sangre
Este valor de 2,10 gr por 1000 será la alcoholemia teórica en el momento del hecho, si
aseguramos que estamos en la etapa de eliminación, mediante una segunda extracción
sanguínea a la hora aproximadamente. Si ahora aplicamos la ecuación para A (cantidad de
alcohol), sabiendo que el imputado pesa 70 Kg y posee una constitución atlética (r = 0.67 ):
At = 2,10 · 70 · 0,67
At = 98,49 gramos de alcohol etílico absoluto o 123 ml (pasando a ml por la densidad de Etanol
= 0,8 )
Este último dato es interesante cuando queremos referir la cantidad de bebida que
supuestamente habría ingerido. Si se tratara de vino (considerando una graduación para vinos
de 10 grados) implica que debió haber ingerido 1,230 ml, es decir casi una botella y cuarto de
vino común. Debe recordarse que el modelo es aproximado, algunos autores han expresado
que el error con que se trabaja en la práctica es de +/-20%. No obstante si la alcoholemia es
superior a 1.5 gr / 1000, a los efectos de la interpretación, el guarismo no será controvertido.
4.2.1.7 Factores involucrados en la pérdida y generación de Etanol en tejidos y

humores humanos.
En todas las estimaciones y cálculos de alcoholemia, hay que considerar las pérdidas de
etanol que pueden operarse por la indebida preservación de la sangre. Se ha podido comprobar,
que las mayores pérdidas se deben a la existencia de una importante cámara de aire entre la
muestra contenida en el recipiente y la capacidad de éste. Es decir, matrices hemáticas escasas
en recipientes de gran volumen, pierden etanol por evaporación.
En la actualidad, un respetable número de publicaciones indican que las pérdidas de

etanol con el transcurrir de días, incluso semanas, no son relevantes, si las muestras son
convenientemente extraídas y colocadas en recipientes adecuados y bien sellados. El uso de
sustancias como preservantes (v.g: fluoruro de sodio ) en sangre de individuos vivos no mejora
mucho los resultados, más aún si la muestra fue tomada con jeringa estéril y mantenida a bajas
temperaturas. En estas condiciones las sangres de personas vivas pueden analizarse aún
después de dos semanas sin variaciones apreciables respecto de la alcoholemia que se hubiera
obtenido en el primer día.
Winek (1996 ), efectuó estudios en muestras de sangre entera y suero que habían sido
mantenidas por varias semanas a temperaturas bajas y altas, notando que las muestras
resguardadas a temperatura más alta, mostraban pérdidas significativas a partir de treinta días y
particularmente en las de sangre entera, no observando pérdida considerable en muestras de
suero.
En relación a la producción de alcohol etílico post-mortem, O’Neal & Poklis (1996)

observan que existen unas 58 especies de bacterias que son capaces de producir alcohol in vivo
e in vitro. Si bien es cierto que la preservación de las muestras a temperaturas inferiores a los
4ºC y la incorporación de Fluoruro de Sodio inhiben la producción de etanol de la mayoría de las
bacterias no sucede así con la levadura Candida albicans, que ha demostrado ser una
importante especie productora de alcohol.
Muchos productos volátiles han sido reportados como producidos por fenómenos
postmortales (n-propanol, butanol, feniletanol, etc) por lo que se deberá poner especial atención
en el estandar interno utilizado en los métodos de valoración por cromatografía gasesosa. Sería
deseable la utilización de t-butanol, por ser un compuesto no generado en los fenómenos
postmortales.
Algunos autores opinan que no debería informarse alcoholemias postmortem inferiores a

0,3 g/L con el objeto de evitar conclusiones sujetas a discusiones controvertidas sobre el origen
del Etanol hallado.
Por otro lado, Garriot (1996) consigna que los procesos putrefactivos que generan
Etanol llevan entre 3 y 10 días en desarrollarse. Cuando los valores hallados son superiores a
0,5 g/L y habiendo mantenido las muestras en condiciones apropiadas de resguardo, puede
tenerse una mayor certeza que el alcohol detectado provenga de una ingesta.
Hoy día se esta considerando al humor vítreo, como matriz complementaria o bien
suplementaria, cuando no se dispone de sangre o esta posee un alto grado de putrefacción.
Por otro lado los controles de calidad son aconsejables y una forma de validar los
resultados emitidos. En éste sentido, el ejercicio de intercomparación de Etanol que se realiza
anualmente y por períodos de tres meses en el Instituto Nacional de Toxicología de España, ha
resultado útil para evaluar la calidad de trabajo en los centros que participan regularmente.
4.2.1.8 Biomarcadores de ingesta aguda y crónica de alcohol
En cuanto a los nuevos aportes de la comunidad científica internacional relacionados a

sustancias producidas en baja concentración y que podrían ser utilizadas, eventualmente como
biomarcadores de ingesta aguda o crónica, Ferrari LA (Tesis de doctorado, 2005) efectuó una
reseña sobre algunas publicaciones en este sentido.
Ha sido posible verificar que una pequeña fracción del etanol consumido (<0.1%) sufre
reacciones de conjugación de Fase II, mediante el ácido glucurónico activado, catalizadas por
UDP-glucuroniltransferasa unida a la membrana mitocondrial, para producir etilglucurónido
(EtG), hallados en niveles similares al acetaldehído en orina y sangre de pacientes
alcoholizados (Shmitt et al, 1997; Baselt, 2000; Feldman et al, 2004).
El EtG es producido en un 0.02-0.06% aproximadamente de la dosis ingerida. Este
compuesto es estable, soluble en agua, pudiendo ser detectado en orina hasta tres días
posteriores al consumo de bebida alcohólica, con la importante consecuencia que ello adquiere
en el ámbito jurídico. Recordemos que el alcohol etílico solo puede ser detectado en sangre
hasta las 12-16 horas posterior a la última libación.
Asimismo el EtG podría ser utilizado, como marcador para monitoreo de abstinencia en
pacientes que efectúan programas de rehabilitación alcohólica.
Respecto de su investigación analítica, las técnicas publicadas hasta la fecha no consignan
pretratamientos extractivos en orina, estableciéndose un valor de corte de 0.1 µg/ml.
Una publicación reciente informó sobre el hallazgo de etilsulfato (EtS), propuesto como
nuevo biomarcador para ingestas agudas de etanol (Helander y Beck, 2004).
Se detecta el EtS aproximadamente pasada una hora desde la ingesta, obteniéndose un
máximo a las 4 hs, permaneciendo detectable hasta las 29 horas. Resulta entonces un buen
marcador en casos donde se desea confirmar consumos recientes como en los controles de
conductores de vehículos con sospecha de encontrase bajo los efectos del alcohol y en los
lugares de trabajo, para aquellos operarios que conducen vehículos o maquinarias o bien para
determinar si el alcohol etílico analizado en etapa postmortem provino de una incorporación
activa o fue producido por microorganismos, posterior a la toma de muestra.
Para ilustrar estas últimas consideraciones resulta interesante consignar la contribución de
Schmitt et al (1997) donde se estudió el caso de un individuo que conducía un vehículo y sufrió
un severo accidente produciendo la muerte de uno de los ocupantes. Tres horas y media
posteriores al hecho se le extrajo sangre y se determinó una alcoholemia de 1.44 g/L, dejando
este guarismo la convicción de que el conductor del vehículo público se hallaba bajo los efectos
del alcohol con la consecuente negligencia imputada. Sin embargo, el análisis de EtG arrojó
resultados negativos. Los autores cuestionaron entonces el modus operandi de la toma de
muestra poniendo en entredicho la posibilidad de una contaminación con un desinfectante
conteniendo alcohol etílico, utilizado en el proceso de extracción de la muestra hemática.
Posteriores estudios en la misma persona demostraron que a concentraciones de etanol en
sangre menores al valor indicado, se formaba EtG en su organismo. Asimismo pudo
demostrarse que el resguardo de la muestra sanguínea durante un largo período (más de un
año) permitía la detección del EtG, de lo que se dedujo que el EtG en suero, es bastante estable
resguardado a temperaturas de congelación.
4.2.3 Metanol.
4.2.3.1 Introducción.
El metanol es el principal componente del destilado destructivo de la madera. Es uno de

los disolventes más universales y encuentra aplicación, tanto en el campo industrial como en
diversos productos de uso doméstico. Dentro de los productos que lo pueden contener se
encuentra el denominado “alcohol de quemar” constituido por alcoholes metílico y etílico,
solvente en barnices, tintura de zapatos, limpiavidrios, líquido anticongelante, solvente para
lacas etc. Además, los combustibles sólidos envasados también contienen metanol.
Este alcohol se utiliza también para desnaturalizar soluciones de alcohol etílico, lo que ha
dado lugar a numerosas intoxicaciones de carácter masivo dado el uso fraudulento de estas
mezclas en bebidas alcohólicas.
La fermentación de jugos azucarados implementada para la obtención de bebidas

alcohólicas, además de etanol, produce también cantidades variables de metanol y otros
compuestos volátiles. El contenido de metanol en vino tinto es de 43-122 mg metanol/L, en vino
blanco 38-118 mg/mL, en brandy 1500 mg/L, en wisky 1000 mg/L y en ron 800 mg/L.
La intoxicación por metanol ocurre entonces frecuentemente por vía digestiva en el caso
de bebidas alcohólicas adulteradas con alcohol desnaturalizado o por vía respiratoria, digestiva
o a través de la piel intacta en el caso de exposición en ambientes laborales, desde donde se
pueden originar intoxicaciones graves y aún mortales. El o los individuos pueden sobrevivir
dejando como secuela la ceguera irreversible pues la retina, es el sitio de manifestación de la
toxicidad del metanol.
La mayor parte de los métodos usados en la determinación de metanol se basan en su

oxidación a formaldehído y la posterior determinación de éste último.
4.2.3.2 Muestras.
En general se trabaja con sangre de pacientes intoxicados con metanol o bien con
sangre cadavérica de personas fallecidas por intoxicación metanólica. El método se puede
aplicar también tanto a otros fluidos biológicos como a homogenatos de vísceras.
Sangre: no se debe usar alcohol corno antiséptico, se recomienda cloruro mercúrico al 0,5%.
Usar fluoruro de sodio 1% como anticoagulante para inhibir el desarrollo microbiano dado que al
inhibir la glicólisis se evita la formación de sustancias oxidantes que podrían actuar sobre el
metanol. Tampoco debe usarse EDTA ni heparina. Transvasar a un tubo plástico, llenar
completamente el tubo y cerrar. Conservar en heladera ( 4°C).
Orina, Líquido Cefalorraquídeo: recoger sobre fluoruro de sodio 1%. Conservar en heladera a
4°C en recipiente similar al de la muestra de sangre.
Investigación.
La mayor parte de los métodos usados en la determinación de metanol se basan en su

oxidación a formaldehído y una posterior determinación de este último. Para evitar interferencias
se trabaja con destilados de las muestras.
4.2.3.3 Identificación de metanol en fluidos biológicos.
4.2.3.3.1 Técnica del ácido cromotrópico.
Sobre 2 ml de destilado se agrega gota a gota permanganato de potasio 5% acidificado

hasta color rosado (ligero exceso). Agitar y esperar diez minutos.
Decolorar con ácido oxálico al 10%. Esperar unos minutos.
Agregar 0,2 ml de ácido cromotrópico al 0,5% en solución acuosa. Luego agregar 2 ml de
ácido sulfúrico concentrado por las paredes del tubo. Un anillo de separación púrpura indica
presencia de alcohol metílico. Calentar a 60°C.
Interferencias: gliceraldehído, arabinosa, fructosa y sacarosa dan un color amarillo para la

reacción. Concentraciones considerables de furfural dan lugar a la aparición de un color rojizo.
Cuantificación de metanol.
Técnica
Reactivos.
Solución patrón de metanol: 0,801 g/ml

Permanganato de potasio al 5%.
Bisulfito de sodio solución saturada
Acido cromotrópico al 0,5%.
Acido sulfúrico concentrado
Equipos.
Espectrofotómetro visible
Procedimiento.
La solución patrón de metanol, se prepara tomando 0,25 ml de metanol (concentración:

0,801 g/ml) y llevando a 100 ml con agua destilada. De este modo, se obtiene una solución de
2000 γ/ml. Luego, mediante una dilución 1/10 se obtiene la solución tipo requerida de 200 γ/ml.
A partir de la solución tipo de metanol, se preparan soluciones patrón de metanol de las

siguientes concentraciones: 200, 150, 100, 50 y 25 γ/ml, empleándose alrededor de 10 ml de
cada una. Se dispondrá también de 10 ml de agua destilada, la cual se utilizará como blanco.
Metanol (200 γ/ml) Agua destilada Dilución Concentración final

2,5 ml 7,5 ml ¼ 50 γ/ml
5,0 ml 5,0 ml ½ 100 γ/ml
7,5 ml 2,5 ml ¾ 150 γ/ml
Reacción Colorimétrica:
Colocar 0,5 ml de destilado en un tubo de ensayo. Agregar una gota de permanganato

de potasio al 5%. Dejar en reposo 10 minutos, agregar una gota de solución saturada de bisulfito
de sodio para decolorar. Luego, añadir 0.1 ml de ácido cromotrópico al 0,5%. Colocar el tubo en
un baño de hielo y agregar agitando 2 ml de ácido sulfúrico concentrado. Colocar el tubo en
baño de agua a ebullición durante 15 minutos, enfriar y diluir con agua a un volumen de 5 ml
empleando el baño de hielo.
Proceder en forma equivalente y simultánea con los patrones. Leer en el
espectrofotómetro a 580 nm contra el blanco.
Expresión de los resultados: en mg/l de sangre ó en µ/ml de sangre.
4.2.3.3.2 Método del reactivo de Schiff.
Reactivos.
• Etanol 96°
• Solución patrón de metanol : 0,801 g/ml
• Permanganato de potasio al 5%.
• Acido Oxálico 10%
• Reactivo de Schiff
• Acido sulfúrico concentrado.
A 4 ml de destilados se agregan 2 ml de etanol, 2 ml de permanganato de potasio al 5%

y 0,5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Dejar 10 minutos.
Agregar luego 2 ml de ácido oxálico al 10%, dejando reposar otros 5 minutos.
Agregar 4 ml del reactivo de Schiff y mezclar. Al cabo de 1 hora medir a 510 nm. Se
realiza una curva de calibración con soluciones de concentración conocida de metanol en forma
similar a lo descrito anteriormente.
Interferencias: cuerpos cetónicos arrojan resultados falsos positivos.
Interpretación de resultados: Una concentración de 80 mg/100 ml (800

gamas/ml) es peligrosa para la vida. Conversión de unidades: 1gramo = 106 gammas.
4.2.3.3.3 Cuantificación de metanol mediante CG/ head space.
Muestras: sangre, vísceras, bebidas alcohólicas
Preparación de las muestras:

A partir de 1 ml de sangre, 1 g de vísceras o bien 1 ml de la bebida a investigar, se
adiciona 1 ml de solución saturada de CO3K2 y 1 ml de alcohol isopropílico al 1‰, éste último
como standard interno. Las muestras se colocan en viales de vidrio con tapas de goma, los
cuales son sellados. Se realiza una primera incubación a 30°C durante 30 min. y luego un
segundo tratamiento a 60°C por 45 min. A continuación, se procede a la inyección de 0.4 – 0.6
ml de la cámara de aire empleando jeringas descartables (Edge Needle – PC5100).
Equipo y condiciones operativas:
Cromatógrafo gaseoso; columna de de acero (2m longitud, 3mm diámetro interno), relleno 0.3%
carbowax 1500- graphapack 60/80, régimen isotérmico a 100°C, detector de ionización de llama
conectado a un integrador. La temperatura de inyector y del detector es de 150°C, el gas carrier
N2 a flujo constante (40ml / min) siendo la presión de aire y de H2 en el detector de 5 psi. El
equipo debe ser calibrado mediante la obtención de una curva de calibración a partir de
soluciones standard de metanol en el rango 0 – 4 g‰.
Preparación de las muestras:
Su investigación se realiza previa transformación en formiato de metilo de acuerdo a

Abolin y col. (1980).
En este caso, 500 µl de sangre ó 0.5 g de tejido se colocan en un tubo con 250 µl de
H2SO4 (c). Dicho tubo es sellado con un film, agitado, incubado durante 20 minutos y enfriado a
temperatura ambiente evitando el contacto del ácido con el film. Luego se agregan 15 µl de
acetonitrilo como standard interno y 15 µl de metanol. Luego de su mezcla, la preparación es
incubada con agitación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, 0.4 – 0.6 ml de
la respectiva cámara de aire son inyectados en el cromatógrafo gaseoso.
Equipo y condiciones operativas:
Se requiere un equipamiento similar al descripto para la determinación cromatográfica de

metanol, excepto Columna Columnax megabore DB – WAX, 30 m longitud, 0.53 mm diámetro
interno; temperatura inicial 35°C, 1 min. Gradiente 10°C/ min hasta 100°C.
4.2.3.3.4 Determinación de ácido fórmico.

Preparación de las muestras.
Su investigación se realiza previa transformación en formiato de metilo de acuerdo a

Abolin y col. (1980) modificado.
En este caso, 500 µl de sangre ó 0,5 g de tejido se colocan en un tubo con 250 µl de
H2SO4 (c). Dicho tubo es sellado con un film, agitado, incubado durante 20 minutos y enfriado a
temperatura ambiente evitando el contacto del ácido con el film. Luego se agregan 15 µl de
acetonitrilo como standard interno y 15 µl de metanol. Luego de su mezcla, la preparación es
incubada con agitación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, 0,4 – 0,6 ml de
la respectiva cámara de aire son inyectados en el cromatógrafo gaseoso.
Equipo y condiciones operativas.
Se requiere un equipamiento similar al descripto para la determinación cromatográfica de

metanol, excepto Columna Columnax megabore DB – WAX, J y W 30 m longitud, 0.53 mm
diámetro interno; temperatura inicial 35°C, 1 min. gradiente 10°C/ min hasta 100°C.
Estas condiciones permiten mejor resolución de la señal en el cromatógrafo gaseoso respecto
de las obtenidas en el trabajo de Abolin y col (1980).
4.2.4 Glicoles.
Desde el punto de vista químico son dioles, siendo el más conocido el etilenglicol o 1-2
etanodiol. Presenta un peso molecular de 62,07; punto de ebullición: 197,4 °C y densidad:1,11
g/L. Se prepara por hidrólisis del óxido de etileno con ácido sulfúrico diluido en agua a 200 °C.
Se lo separa por destilación siendo los subproductos dietilenglicol y trietilenglicol de interés
debido a su toxicidad.
Este tipo de sustancia es comúnmente utilizada como solvente a nivel industrial como
líquido anticongelante para radiadores, como líquido refrigerante para motores de aviones en
adhesivos y en la síntesis de fibras poliester. Se polimeriza en agua dando poliglicoles utilizados
como disolventes en barnices y medicamentos. Por otra parte, el dietilenglicol (DEG) es un
aditivo ilícito en vinos dulces.
Se han registrado muy pocos casos de intoxicación con etiología suicida o accidental a
nivel doméstico a nivel mundial, salvo episodios a nivel masivo en EEUU y Nigeria y
recientemente en Argentina en 1992, por consumo de jarabe de propóleo, una epidemia que
afectó alrededor de 50 personas con 29 casos fatales caracterizada por la falla a nivel renal con
oliguria seguida de anuria 24 – 48 hs. más tarde. Otros síntomas registrados consistían en
náuseas, vómitos, cefaleas con daño a nivel hepático con altos niveles en sus enzimas (GPT,
GOT, gamma-GT y LDH) y acidosis metabólica.
4.2.4.1 Investigación de Dietilenglicol (DEG).
Muestras: sangre, vísceras, jarabes
Ensayo en jarabes.
(Stoichevich S, 1992)
Muestras de jarabe son diluidas con metanol (1:10) y analizadas mediante cromatografía
gaseosa y detector de ionización de llama (CG-FID). Columna DB –Wax (0.53 mm diámetro
interno, 30 m de longitud, 1.5µ). Inyector y detector FID a 250°C. Temperatura inicial: 120°C, 1
min. Gradiente 15°C/ min; temperatura final 200°C, gas carrier N2 (12 cm3/ min).
La identificación de los compuestos se realiza mediante la determinación y comparación

de los tiempos de retención de los constituyentes de la muestra con respecto a drogas estándar
por ejemplo propilenglicol (PG), dietilenglicol (DEG) y etilenglicol (EG) u otros glicoles.
Ensayo en sangre y vísceras.

(Stoichevich de Suñol, M y Wamba Z, 1992)
Para este tipo de muestras pueden llevarse a cabo distintos procedimientos para lograr su
aislamiento.
1) Homogenatos de tejido o sangre son tratados con ácido perclórico 1.2 M. El sobrenadante
obtenido luego de su posterior centrifugación es neutralizado con carbonato de sodio.
2) Homogenatos de tejido son tratados con agua destilada, centrifugados y posteriormente

sometidos a extracción con metanol. Seguidamente, se evaporan y resuspenden con
metanol.
3) Homogenatos de tejido son tratados con sulfato de sodio anhidro durante 24 hs. a 40°C.
Muestras de hígado y riñón (≅ 10 g) procesadas individualmente en estado de polvo son
colocadas en cartuchos de extracción a fin de efectuar una extracción tipo Soxhlet con
metanol durante 12 hs. Una alícuota se concentra a baja temperatura en un evaporador a
presión reducida. Otra alícuota se almacena a 4 °C. La sangre tratada con metanol (1:10) es
homogeneizada y centrifugada. El sobrenadante claro es acondicionado agregándole EG y
posteriormente empleado como standard interno.
Condiciones operativas para extractos de vísceras.
Cromatógrafo gaseoso, seleccionado una temperatura inicial de 110°C durante 2

minutos; gradiente de 8°C/ min hacia una temperatura final de 210°C.
Bibliografía.
Guide to Occupational Expossures Values-1996 ACGIH, Cincinnati, OH. 1996.
Carboxihemoglobine and oxihemoglobine in Hemoglobine: molecular, genetic and clinical aspects.

Bunn, H. F. And Forget B. G., W. B. Saunders, Philadelphia. pp 663-675. 1986.
Gases In Toxicology, Eyer P. Ed. Marquardt, Schäfer, McClellan and Welsch. Academic Press.
1999.
Isolation and identification of Drugs. Clarcke´s Moffat. Edit. Acadmic Press (1986).
Intoxicación oxicarbonada. Estudio bioquímico y metodología analítica. Guatelli, Manuel. EUDEBA

.1971.
Guía de Trabajos Prácticos de Toxicología y Química Legal Universidad de Buenos Aires.

Facultad de Farmacia y Bioquímica, 2000
Analytical Methods in toxicology. Stahr H. M. John Wiley & Sonas, Inc .1991.
Detection of small amounts of cyanide. Bark, L. S. and Higson H. G. Analyst 88: 751. 1963.
Toxicity of fire smoke. Alarie Y. Crit. Rev. Toxicol. 32 (4) 259-289, 2002
Detection of cyanide in forensic samples. Gettler, A. O and Golbaum L. Anal. Chem. 19:270.
1947.
Factores físicos, químicos y biológicos que inciden en la estabilidad y distribución post mortem
de drogas de relevancia toxicológica. Ferrari L.A. Tesis de doctorado. Facultad de Ciencias
Exactas, Universidad Nacional de La Plata, 2005
Acido cianhidrico y cianuros alcalinos. Analítica Toxicológica. Guatelli M. Facultad de Farmacia

y Bioquímica, 1992
Toxicology, the basic science of poisons. Casarett and Doull´s. Klaassen (eds.), Pergamon Press,
Sixth edition, cap 24 y 31. 2001.
Clinical Toxicology. Rumack K. L. and Levejoy, F. H. In M.O. Amdur, J. Doull and C.D.
Analytical methods in toxicology. Sthar H. M. 1990.
Medicina Legal y Toxicología. Gisbert Calabuig, J.A. 4ta. Edición. Ediciones Científicas y
Técnicas S.A – Masson- Salvat, Barcelona (España). 1991.
In “Microdiffusion Analysis as Applied to Toxicology”, Milton Feldstein. pp. 641

Steward –Stolman. Toxicology Vol.II, 1967
Bioactivation of Cyanide to Cyanate in Sulfur Amino Deficiency: Relevance to Neurological

Disease in Humans Subsisting on Cassava. Tor-Agbidye John et al, Toxicological Sciences 50,
228-235, 1999.
Cyanide and Thiocyanate Levels in Blood and Saliva of Healthy Adult Volunteers, Kouichiro Tsuge,
Mieko Kataoka, and Yasuo Seto, Journal of Health Science, 46(5) 343–350,2000.
Rapid Determination of Cyanides in Biological Material by HS-GC/MS, Analysenmethode aus

dem Arbeitskreis Klinische Toxikologie, G. Asselborn and R. Wennig.
Hydrogen cyanide: method 6010, Issue 2, NIOSH Manual of Analytical Methods (NMAM), Fourth
Edition, 1994.
Hydrogen cyanide and carbon monoxide in blood of convicted dead in a polyurethane

combustion: a proposition for the data analysis, Ferrari LA., Arado M.G, Giannuzzi L.,
Mastrantonio G. y Guatelli M. Forensic Sci. Int. 121, 140-143, 2001.
Methodologic considerations in the interpretation of postmortem carboxyhemoglobin

concentration, Levine B., D´Nicuola J., Kunsman G., Smith M., Stahl. Toxicology 115, 129-134,
1996.
Public Health Goal for CYANIDE in Drinking Water, prepared by Pesticide and Environmental
Toxicology Section Office of Environmental Health Hazard Assessment
California Environmental Protection Agency, December 1997.
Semi-Quantitative “Spot-test” of Cyanide. Favero J., Tubino M., Analytical Sciences vol. 19,
August 2003.
Toxicological profile for cyanide, prepared by: research triangle institute

under contract no. 205-93-0606 prepared for: u.s. department of health and human services,
public health service agency for toxic substances and disease registry, september 1998.
Gas Chromatographic Head –space assay of formic acid and methyl formate in biologic fluids:
Potential application to methanol poisoning. Abolin, C.; Mc Rae, J.A.; Tozer T.M., Takki, S
Biochem. Med. 23, 209 - 218 1980.
Formic acid distribution in accute metanol intoxication. Ferrari L. A., Arado M. G., Nardo C. y
Giannuzzi L. Forensic.Sci. Int. 133 (3) 152-158. 2003
Validity of co-oximetric determination of carboxyhaemoglobin in putrefying blood and body cavity

fluid. Lee, C.W, Yim, L.K, Chan, D.T and Tam J. Forensic Sci. Int. 132, 153-156, 2003
Manual of Co oximeter System 682 IL. Instrumetation Laboratory, 2003.

Capítulo 5
Abuso de Sustancias Volátiles.
Autor:
Perito de la Sección de Toxicología del Laboratorio Químico Pericial de la Dirección General de
Policía Cinetífica de la Policía de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción.
El abuso de sustancias volátiles resulta una práctica de consumo tan antigua como la
civilización, con antecedentes como el consumo de tabaco y alcohol etílico, así como de
sustancias alucinógenas inhaladas. Esta clase de adicción se observa principalmente en niños
y adolescentes, siendo rara entre adultos.
El abuso de sustancias volátiles consiste en la inhalación de productos orgánicos

volátiles con fines de alterar el estado de conciencia, los cuales al hallarse presentes en gran
número de productos domésticos resultan de fácil acceso. Los volátiles pueden constituir el
primer paso hacia otras formas de adicción como el alcoholismo y las drogas de abuso. Los
usuarios de estas sustancias usualmente desconocen sus peligros y no las consideran
sustancias peligrosas, aún cuando el riesgo de muerte por depresión respiratoria es grande.
En la sociedad induestrial, una gran cantidad de productos contienen solventes orgánicos

de alguna clase y pueden ser hallados fácilmente en el hogar o en comercios, muchos de ellos
con poco o nula restricción para su venta. Entre estos productos podemos encontrar cosméticos,
limpiadores, pinturas, adhesivos, removedores de pintura y combustibles, sólo por citar los mas
comunes (Tabla 5.1).
La administración de estas sustancias con fines de provocar intoxicación producen

efectos similares sobre el sistema nervioso central a los depresores clásicos como el etanol y los
barbituratos. El abuso de estas sustancias pueden producir dependencia y efectos permanentes
a largo plazo.
El uso de esta clase de sustancias originalmente se encontraba restringida al uso de

gases como el óxido nitroso, mientras que el “glue sniffing” – inhalar pegamento en idioma inglés
– ha sido reportado prácticamente en cada región del mundo. La disponibilidad de estas
sustancias en productos de bajo costo y fácil adquisición hace que esta particular forma de
toxicomanía sea dificil de controlar y resulta especialmente atractiva para los adolescentes que
no necesitan exponerse a las consecuencias de la compra ilegal de tóxicos.
El uso con fines recreacionales data aproximadamente de 1.800 en el caso del éter y el
cloroformo. En el siglo veinte se ha informado del uso con este fin de naftas y compuestos
clorados. En la actualidad se utilizan los solventes presentes en los adhesivos, especialmente el
tolueno, en los líquidos correctores (usualmente 1,1,1, tricloroetileno) y productos para aflojar
pinturas (thinners), los hidrocarburos presentes en los encendedores y hasta los propelentes de
los aerosoles desodorantes. En los países en desarrollo resulta muy común el uso de las naftas
por su fácil adquisición y bajo costo.
A diferencia del análisis toxicológico de drogas de abuso o productos farmaceúticos, el

análisis químico resulta relevante sólo en el contexto de un envenenamiento suicida o en casos
de violencia sexual.
El laboratorio de toxicología puede ser consultado en las siguientes situaciones: a)

diagnóstico de intoxicación aguda, b) confirmación de la adicción de un paciente que niega su
uso, c) investigación de la causal de muerte cuando se sospecha que las sustancias volátiles
puedan estar involucradas, d) investigación de conductas peligrosas mientras se maneja
maquinaria peligrosa bajo la influencia de drogas y otros agentes, e) investigación de asalto
sexual cuando a la víctima se le pudo haber administrado alguno de estos compuestos y f)
toxicología laboral.
Alifáticos Acetileno
Butano
Hexanos
Hidrocarburos
Isobutano
Propano
Aromáticos Tolueno
Xileno
Mezclas Eteres de petróleo, naftas.
Bromoclorodifluorometano
Tetracloruro de carbono
Clorodifluorometano
Cloroformo
Diclorodifluorometano
Diclorometano
Halogenados
1,2-Dicloropropano
Cloruro de etilo
Fluorotriclorometano
Halotano (2-bromo-2-cloro-1,1,1-
trifluoroetano)
Tetracloroetileno
1,1,1-Tricloroetano
1,1,2-Triclorotrifluoroetano
Tricloroetileno
Butanona
Alifáticos Acetileno
Butano
Hexanos
Hidrocarburos
Isobutano
Propano
n-butil nitritos
Enflurano, CFC
Acetato deetilo
Eter etílico
Compuestos
Dimetil eter
Oxigenados
Isoflurano, CFC
Nitrito de isopentilo “nitrito de amilo”
Acetato de metilo
Metil isobutil cetona
Metil t.-butil eter
Oxido nitroso “ gas hilarante”
Sevoflurano, FC
Tabla 5.1. Substancias utilizadas para su inhalación.
5.1 Distintas Formas de Abuso de Sustancias Volátiles.
El abuso de sustancias volátiles involucra la aspiración profunda de vapores a través de

la nariz o la boca, usualmente utilizando bolsas plásticas o de papel conteniendo el producto
diseminado sobre su superficie interna. Es virtualmente imposible dosar la exposición por cuanto
esta puede ser continua hasta obtener los efectos farmacológicos deseados o bien una sucesión
de inspiraciones para mantener ese estado.
En general, la forma física en que se presenta un producto determina cómo es utilizado.

Los adhesivos de contacto se utilizan colocándolos en recipientes cerrados como bolsas de
papel o plásticas, tubos de cartón y envases tipo tetrabrik. Todos estos envases tienen como
característica en común una buena superficie interna sobre la cual dispersar el producto y un
extremo abierto de pequeño tamaño que resulta apto para colocarlo sobre la boca. Cuando esta
práctica se lleva a cabo en el hogar, no resulta raro que el recipiente se caliente para aumentar
la producción de vapores, con el consiguiente riesgo de quemaduras e incendios.
Los vapores de la nafta y otros solventes son lo suficientemente volátiles para ser
inhalados directamente de sus envases o después de colocarlo sobre trapos o pañuelos y de
estos sobre la boca y nariz del adicto. Los aerosoles o extinguidores de incendios basados en
halones pueden inhalarse directamente o después de haberse rociado sobre bolsas plásticas o
debajo de las sábanas.
Los aerosoles contienen un gas impulsor licuado, el cual a temperatura ambiente

produce a partir de un volumen de líquido propelente de 200 a 300 volúmenes de vapor.
Usualmente se prefieren los productos con una alta proporción de propelente como los
desodorantes y los sprays analgésicos. Si algún componente no es respirable tal como el
clorhidrato de aluminio en algunos desodorantes el producto se burbujea en agua y se respiran
los vapores resultantes o bien se filtra a través de un pañuelo apoyado sobre la boca.
El gas de la red doméstica, el cual está formado principalmente por metano, no suele
utilizarse debido a que este no posee los resultados farmacológicos. Sí en cambio resultan muy
atractivos para los adictos el uso de encendedores de cigarrillos (contienen butano, isobutano y
propano). Los encendedores pueden utilizarse sujetándolos con los dientes y apretando la
válvula para liberar el gas.
Una característica común a este grupo de sustancias es que los efectos comienzan
rápido y desaparecen de la misma forma, de esta forma un niño puede intoxicarse después de
clase y llegar a su casa perfectamente sobrio.
5.2 Características Clínicas del Abuso de Sustancias Volátiles.
En general, los efectos depresores sobre el SNC y el corazón son similares, estando
relacionadas más con las características físicas de estas substancias que con su estructura
química. Puede existir daño neurológico y hepato-renal dependiendo del metabolismo particular
de cada sustancia.
El abuso de estas sustancias se caracteriza por una rápida aparición de síntomas de

euforia, desinhibición y sensación de invulnerabilidad. Estas sensaciones se pueden mantener
por horas con inhalaciones repetidas, lo cual conduce a la inhalación de grandes dosis con la
consecuente aparición de efectos tóxicos severos, tales como tinitus, ataxia, agitación,
confusión, así como alucinaciones peligrosas como creer que se puede nadar o volar.
Cualquiera sea la dosis, el peligro de que sucedan accidentes o de broncoaspiración del

vómito existe siempre. Otros síntomas clínicos comunes son el enrojecimiento de la piel,
náuseas y salivación. El coma, la depresión respiratoria y aún las convulsiones pueden ocurrir
en casos severos.
Las oportunidades de intervenir en la intoxicación aguda son muy raras. En caso de

presentarse la oportunidad, el paciente debe ser tratado de forma de no estresarlo aún más o de
excitarlo debido a que puede provocarse una arritmia cardíaca. La sintomatología
gastrointestinal puede predominar después de la ingestión pero las fases posteriores son
similares a las anteriores.
Las secuelas crónicas descriptas incluyen epistaxis recurrentes, alitosis, ulceraciones

bucales y nasales, conjuntivitis, rinitis crónica y aumento en la expectoración bronquial. Se ha
reportado también pérdida de concentración, depresión, irritabilidad, hostilidad y paranoia.
Entre los daños sistémicos luego del abuso crónico se pueden citar la neuropatía
periférica, disfunción cerebelar, encefalopatía crónica y la demencia. La esquizofrenia ha sido
asociada con el abuso de bencina. El abuso crónico de tolueno y 1,1,1 tricloroetano han sido
ambos asociados con el daño permanente a riñones, hígado y al corazón.
5.3 El riesgo de muerte súbita.
Resulta importante destacar que la muerte súbita es uno de los mayores riesgos
asociados al abuso de volatiles. Esta circunstancia es independiente de clases sociales y edad,
siendo provocada en forma indirecta por el trauma, aspiración del vómito y asfixia asociada al
uso de adhesivos dentro de bolsas plásticas.
Los estudios realizados sugieren cuatro modos posibles de muerte asociados

directamente con el abuso de volátiles: anoxia, estimulación vagal que lleva a bradicardia y paro
cardíaco, depresión respiratoria y la arritmia cardíaca. Se presume que el paro
cardiorrespiratorio y la arritmia cardíaca son los responsables de la mayoría de las muertes. Un
estado de alarma súbita, ejercicio físico o actividad sexual pueden precipitar una arritmia debido
a que estas sustancias sensibilizan el corazón a las catecolaminas circulantes. La mayoría de
las muertes súbitas se producen después de situaciones de alarma o fuga.
5.4 Farmacocinética de las Sustancias Volátiles.
La comprensión de la farmacocinética de estas sustancias resulta de interés cuando se

intenta comprender los resultados del análisis toxicológico en muestras biológicas,
especialmente la rapidez con que los síntomas aparecen y desaparecen.
5.4.1 Absorción, distribución y eliminación.
Las sustancias que se inhalan alcanzan concentraciones elevadas en órganos bien

irrigados como el corazón y el cerebro, mientras que en el músculo y el tejido adiposo sucede lo
contrario. Si la muerte se produce, este es el cuadro que se observa, pero si la exposición ha
sido continua el compuesto también se acumula en órganos mal irrigados, los cuales lo liberan
lentamente cuando la exposición termina.
Esto se observa en las curvas concentración-tiempo en sangre, donde algunos

compuestos muestran decaimientos monoexponenciales y otros muestran dos o más máximos
dependiendo del número de compartimentos corporales.
5.4.2 Metabolismo.
La gran mayoría de estas sustancias se eliminan sin modificaciones en el aire exhalado.

Otras son eliminadas en forma parcial por vía aérea y el resto sufre metabolismo hepático,
siendo estos eliminados por la respiración o la orina.
Al igual que con muchas sustancias, las reacciones de Fase I (oxidación, reducción o
hidrólisis) y de Fase II (conjugación con ácido glucurónico, sulfúrico, acetato o aminoácidos) se
producen con algunos solventes. La velocidad y extensión del metabolismo depende de factores
como edad, enfermedades, dosis y exposición a otros solventes o drogas. Se ha reportado, por
ejemplo, que la co-ingestión de paracetamol aumenta las concentraciones de tolueno en sangre.
En algunos casos la metabolización es la responsable de un aumento en la toxicidad:
esto se observa en solventes como acetonitrilo, hexanos, tetracloruro de carbono, cloroformo,
diclorometano, metanol, tricloroetileno y posiblemente los fluorocarbonos.
5.5 Identificación de Compuestos Volátiles.
El abuso de estas sustancias debería esperarse en niños o adolescentes que muestran

un comportamiento similar a la embriaguez, abandono o anorexia. Su pelo, aliento y ropa puede
oler a solventes y se suelen encontrar entre sus pertenencias tubos de pegamento y distintos
tipos de envases que funcionan como contenedores del tipo de bolsas de papas fritas,
encendores descartables o aerosoles. El olor a solvente en el aliento está relacionado con la
dosis y la duración de la exposición, pudiendo durar varias horas. Puede llegar a observarse
manchas de pinturas en las fosas nasales o ropas.
Resulta relativamente infrecuente el llamado “glue-sniffer´s rash“ que podríamos traducir

como eczema perioral, el cual es causado por el contacto repetido de los labios con el
pegamento colocado en una bolsa plástica. Este síntoma aparece aproximadamente en 2 de
300 niños que inhalan pegamento. Debido a que el análisis toxicológico no puede detectar todos
los casos donde estas sustancias están involucradas resulta importante recolectar todos los
datos y circunstancias posibles en suicidios y homicidios de adolescentes poco claros.
El análisis de laboratorio presenta algunos problemas particulares. En primer lugar,

muchos de estos compuestos existen en el laboratorio debiéndose tener precauciones
especiales para evitar contaminaciones cruzadas. En segundo lugar, la recolección, transporte y
almacenamiento de las muestras.
Las metodologías asociadas a la identificación de compuestos volátiles son las mismas

utilizadas para la determinación de metanol o etanol. El método de elección es la cromatografía
gaseosa con head-space sobre muestras de sangre u otros especímenes biológicos como
tejidos sometidos a digestión enzimáticas. También se ha aplicado con éxito la espectrometría
de masas directamente sobre aire expirado, pudiéndose detectar estos compuestos varios días
después haber sido inhalados. También resulta útil la espectrofotometría infrarroja en fase
gaseosa.
El análisis toxicológico debería ser obligatorio en todos los casos de intoxicaciones de

origen desconocido en niños y adolescentes, así como en casos donde estos hayan
manifestado conductas similares a las anteriormente descriptas. El diagnóstico de intoxicación
por volátiles debe ser una combinación de evidencia analítica, clínica y circunstancial más que
uno solo de estos factores.
Debe recordarse que la probabilidad de detectar la exposición a sustancias volatiles por

head-space en muestras de sangre está influenciada por la dosis y el tiempo de exposición, el
tiempo transcurrido entre la toma de muestra y la exposición y el almacenamiento de la muestra
hasta su análisis.
Siempre existe la posibilidad de la pérdida de analitos sumamente volátiles como el

propano, butano y los halones.
5.6 Recolección y Almacenamiento de la muestra.
La mayoría de estos compuestos son estables en muestras de sangre si se observan

algunas precauciones tales como utilizar tubos de vidrio al máximo de su capacidad y no dejar
cámaras de aire. La tapa debe ser a rosca y con sello metálico en su parte interna. Una opción
adecuada son las tapas metálicas a presión como las presentes en las frascos de
medicamentos inyectables. El tubo debe mantenerse a 4 ªC adicionado con heparina de litio
como anticoagulante.
Si se sospechan compuestos como ésteres (ej. acetato de etilo) se recomienda el uso de

fluoruro de sodio al 1 % p/v y el almacenamiento a -5 ª C. Aún si no se cumplen las condiciones
ideales se pueden obtener al menos resultados cualitativos útiles.
En el caso de haberse recolectado en el lugar del hecho objetos utilizados como

recipientes para la inhalación, estos deben enviarse al laboratorio sellados y separados de las
muestras biológicas para evitar la contaminación cruzada. El análisis de muestras de tejidos
también resulta útil, sobre todo los tejidos grasos como el cerebro, debido a que se detectan
altas concentraciones de compuestos volátiles.
Las muestras de tejidos deben enviarse en frío, preferentemente a temperaturas de

freezer y descongelarlas directamente dentro del vial de head-space. La muestra de orina
resulta útil sólo si ha pasado suficiente tiempo y si el compuesto metabolizado es soluble en
agua.
5.6.1 Cromatografía Gaseosa en muestras biológicas.
El equipamiento necesario para aplicar esta técnica es un cromatógrafo gaseoso provisto

de una columna preferentemente de tipo capilar, programación de temperatura y detectores de
tipo FID y/o de captura electrónica. La fase estacionaria más utilizada es el Carbowax 20 M
aunque en la actualidad de prefiere desde hace tiempo las columnas con fases químicamente
unida como el dimetilpolisiloxano (SPB-1). Un gradiente de temperaturas de 35 a 175 ªC permite
analizar la mayoría de los compuestos volátiles. La inyección en columna requiere de
volúmenes de fase gaseosa relativamente grandes - unos 400 µlts - aunque una inyección de
200 tambien permite buenos resultados .
Se debe ser particularmente cuidadoso con la presencia de compuestos volátiles

normalmente presentes en muestras biológicas, especialmente si existe putrefacción, incluyendo
el dióxido de carbono. A pesar de que estas son condiciones para un screening amplio, se
observa que la mayoría de los compuestos de interés no requieren de temperaturas por debajo
de la ambiente para ser retenidas, por lo que se puede trabajar a temperaturas mayores e
incluso con programas isotérmicos obteniéndose buenos resultados. En estos casos, el único
problema es la pérdida de resolución de compuestos muy volátiles y los largos tiempos de
análisis.
Evidentemente, el uso de detectores inespecíficos como el FID y el ECD no bastan por sí

solos para asignar identidad a un pico en un sólo cromatograma, sobre todo en muestras
biológicas. Muchos autores recomiendan el uso de datos de retención de al menos dos
columnas diferentes, aunque en la actualidad los detectores de masa se encuentran al alcance
de la mayoría de los laboratorios forenses y sólo requieren del agregado de un testigo para
confirmar la identidad.
Aún con las ventajas de la espectrometría de masas en cuanto a sensibilidad y

especificidad, debe destacarse que resulta díficil obtener buenos espectros de masa para
fragmentos de m/z menores de 40 y esto complica especialmente la identificación de alcanos de
bajo peso molecular. Una posibilidad extra es añadir la espectrofotometría infrarroja con
transformada de Fourier (FTIR) a la cromatografía gaseosa aunque la sensibilidad es menor.
Los detalles de la técnica se muestran en la tabla 5.2. La tabla 5.3 muestra algunos de los
productos que pueden encontrarse en muestras de sangre asociados al producto principal.
Tabla 5.2. Cromatografía gaseosa: condiciones de análisis.
Operación del cromatógrafo (“arranque en frío”).
1. Iniciar con un programa de temperaturas altas que elimine compuestos retenidos en la

columna.
2. Analizar una alícuota (1-5 µl) de una mezcla cualitativa de estándares preparada en un bulbo
de muestreo gaseoso de 125 ml.
Análisis de muestras biológicas y líquidos.
1. Analizar una alícuota (100-300 µl) de fase gaseosa obtenida luego de incubar el vial cerrado
(65 °C, 15 min) con 200 µl del estándar interno.
2. Agregar la muestra líquida (200 µl) al vial sin destapar a través de la septa y reincubar (65 °C,
15 min). Analizar una alícuota (100-300 µl) de la fase gaseosa.
3. Identificar cualquier compuesto en base a al cromatograma obtenido en el análisis de la
mezcla de estándares.
Tejidos.
1. Diseccionar 20-50 mg (peso húmedo) de tejido desde el centro del espécimen mientras se
halla congelado y agregarlo a un vial de headdspace conteniendo PBS. Agregar Subtilisina A
(aproximadamente 1 mg) e incubar (65 °C, 15 min).
2. Analizar una alícuota (100-300 µl) de fase gaseosa. Analizar el estándar interno en un vial
separado.
Condiciones de Análisis Cromatográfico.

• Columna: de tipo capilar SPB-1 (Supelco) de 60 m x 0.53 mm d.i, 5 µm film).
• Gas Carrier: helio (flujo 8-9 ml/min);
• Temperatura del injector y detector: 150 y 275 °C, respectivamente.
• Programa de temperatura: 6 min isotérmico, 40 a 80°C a 5 °C/min, y luego hasta 200 °C a 10
°C/min (tiempo total de análisis 26 min);
• Detección: detector dual FID / ECD a una relación de split aproximadamente de 5:1);
• Presión de entrada de hidrógeno y aire (FID): 15 y 22 p.s.i., respectivamente;
• Purga del ECD (nitrógeno) flujo: aproximadamente 35 ml/min;
• Captura de datos estación de trabajo según el modelo y marca del equipo;
• Acondicionamiento de la columna: correr un programa desde 30 a 260 °C con pasaje de gas
y un gradiente de 2 °C/min y mantenerlo por 16 h.
Tabla 5.3. Compuestos Volátiles que pueden hallarse en la sangre.
COMPUESTO COMPUESTO ASOCIADO

Acetona Butanona y cetonas superiores en cetoacidosis isopropanol
(metabolito raro)
Bromoclorodifluorometano Fluorotriclorometano
Butano Butanona, 2-butanol (metabolitos raros) isobutano, propano
Ciclohexanona Ciclohexanol (metabolito)
Eter etílico Clorodifluorometano
Etanol Propanoles y alcoholes superiores si la fermentación tuvo
lugar
Acetato de etilo Etanol (metabolito)
Etilbenceno Tolueno y xilenos
Fluorotriclorometano Bromoclorodifluorometano diclorodifluorometane
Diclorodifluorometano Fluorotriclorometano
Clorodifluorometano Eter etílico
Halotano 2-Cloro-1,1-difluoroetileno, 2-cloro-1,1,1-trifluoroetano
(metabolitos, raros)
Nitrito de isobutilo 2-Metil-1-propanol (producto de degradación)

Nitrito de isopentilo 3-Metil-1-butanol (producto de degradación)
Acetato de metilo Metanol (metabolito)
Propano Acetona (metabolito, raro), butano, isobutano, isopropanol
(metabolito, raro)
Isopropanol Acetona (metabolito)
Tricloroetileno 2,2,2-Tricloroetanol (metabolito), cloroformo (en headspace-

CG puede resulta de la descomposición térmica del ácido
tricloroacético (metabolito) in vitro)
Xilenos o-, m- y p-xileno existen juntos en mezclas de grado técnico,

predominando el m-xileno. Puede hallarse presene el
etillbenceno
5.7 Preparación de las muestras.
El primer análisis siempre debería ser el de la solución de estándares para verificar que
no exista interferencia con la atmósfera del laboratorio. Cuando se analizan especímenes
líquidos este debe inyectarse dentro del vial de head-space a través de la septa de goma del vial
ya cerrado, incubado a temperatura y la atmósfera del vial inyectada en el cromatógrafo.
5.7.1 Muestras de Sangre y Orina.

Mientras el vial de head-space se halla abierto, (vial de vidrio de 10 ml) se agregan 200
µlts de estándar interno. El vial queda sellado por una septa en su cara interior formada por un
disco de goma siliconada y recubierta esta con una menbrana de teflón.
El vial es incubado a 65 °C en un baño termostático durante 15 minutos y luego una

alícuota de la atmósfera del vial (100 a 300 µlts) con una jeringa de vidrio especial para transferir
gases. Esta jeringa debe ser precalentada al menos 10 minutos antes en lugar seco. Luego 200
µlts de la muestra (que puede ser sangre, plasma, suero u orina) se agregan al vial utilizando
una jeringa descartable de plástico provista de una aguja Luer descartable tipo 25G y después
de 15 minutos de incubación se inyectan el mismo volumen que el estándar.
5.7.2 Muestras de tejidos.
Las muestras de tejidos deberían analizarse agregando previamente una enzima

proteolítica a la mezcla de incubación dentro del vial. Se obtienen de 20 a 50 mg (en peso
húmedo) del centro del espécimen mientras aún se halla congelado. Resulta preferible que se
remitan al laboratorio trozos de órganos relativamente grandes para que no se descongelen de
inmediato mientras se pesan.
Las porciones obtenidas por duplicado se incuban durante 15 minutos a 65 °C con la

solución del estándar interno (200 µlts) y aproximadamente 1 mg de Subtilisina A o equivalente
antes de inyectar de 100 a 300 µlts de fase gaseosa. El blanco debe realizarse en un vial
separado.
5.7.3 Envases y Productos Comerciales enviados al Laboratorio.
Es muy importante que todos los envases y productos sean enviados al laboratorio por
separado de las muestras biológicas. Los aerosoles y vapores de combustibles se pueden
analizar directamente liberando una porción dentro del vial y inyectando unos µlts de los vapores
en el cromatógrafo.
Los líquidos pueden analizarse con facilidad extrayendo algunos µlts (5-50) de la
atmósfera del contenedor. Los adhesivos y otros productos semi-líquidos se transfieren a un vial
de head-space y se incuban durante 15 minutos a °C 65. Una alícuota de la atmósfera de este
vial se transfiere a un segundo vial sellado y precalentado a 65 °C conteniendo de antemano la
solución del estándar. Una alicuota de 100 µlts se analizan por cromatografía gaseosa.
5.8 Interpretación cualitativa de los resultados.
La posibilidad de detectar la exposición a sustancias volátiles por la técnica de

headspace-CG en una muestra de sangre depende del tipo de compuesto, el grado de
exposición, el momento en que se realizó el muestreo y las precauciones tomadas cuando se
obtuvo la muestra.
El análisis de metabolitos urinarios puede extender la ventana de tiempo para realizar la

detección, pero debe tenerse en cuenta que de la sustancias utilizadas, sólo el tolueno, xilenos y
algunos clorados producen metabolitos adecuados para su medición. El abuso crónico de naftas
ha sido diagnosticado por el contenido de plomo en sangre o la detección de compuestos
aromáticos como tolueno y etilbenceno.
La detección de compuestos volátiles en sangre no implica automáticamente el abuso de

estas, sino que puede mostrar la exposición laboral o ambiental a estas. La presencia de
acetona y butanona en grandes cantidades es normal en la sangre y orina de niños con
deficiencia en la enzima aacetilcoenzima A tiolasa. Además, la acetona es el metabolito normal
del isopropanol y este a su vez ha sido encontrado en la sangre de pacientes cetósicos. Otras
cetonas pueden originar a su vez los correspondientes alcoholes.
Se debe recordar cuando se obtienen las muestras que el uso de desinfectantes en

aerosol pueden contaminar la muestra con el gas propelente. El uso de tubos separadores de
suero (tubos con un gel separador) debe evitarse pues la bibliografía muestra contaminaciones
en estos tubos con tolueno, xilenos y n-butanol. Se ha encontrado que tubos comerciales
cargados con EDTA estaban contaminados con n-butanol y 2-metil-2-propanol.
Un problema forense clásico es el etanol producido post-mortem. Este se produce debido

a la acción de la flora microbiana sobre muestras biológicas y ha sido tratado con detalle en
capítulos anteriores.
Los nitritos de alquilo usualmente abusados por inhalación (nitrito de isobutlo e

isopentilo) son un caso especial por cuanto son extremadamente inestables y se descomponen
rápidamente en vivo para producir los correspondientes alcoholes y algunos isómeros (n-butil, n-
pentil).
Como puede observarse, la posibilidad de éxito en la determinación deestos compuestos

es función de varios parámetros, entre los cuáles adquiere preponderancia la posibilidad de
reconocer previamente a la toma de muestra que la causa sea el abuso de volátiles. De lo
contrario, la toma y conservación de la muestra conducirá a resultados de poco o nulo valor
cuantitativo, además de la posibilidad e un falso negativo.
Bibliografía.
VOLATILE ABUSE SUBSTANCE, Practical Guidelines for Analytical Investigation of Suspected

Cases and Interpretation of Results, R.J. Flanagan, P.J. Streete, J.D. Ramsey, United Nation
monograph, 1997.
National Institute on Drug Abuse RESEARCH MONOGRAPH SERIES Nª 15: Review of

Inhalants: Euphorya to Dysfunction, U.S Department of Health and Human Services, Editors:
Charles Wm. Sharp, Ph.D., Fred Beauvais, Ph.D., Richard Spence, Ph.D., 1992.
National Institute on Drug Abuse RESEARCH MONOGRAPH SERIES Nª 129, U.S Department
of Health and Human Services, Editors: Charles Wm. Sharp, Ph.D., Fred Beauvais, Ph.D.,
Richard Spence, Ph.D., 1992.
Ministerio de Salud de la Nación, MANUAL DE ATENCIÓN PRIMARIA DE INTOXICACIONES,

Tomo II, Parte Especial, 2002.
PARLIAMENT OF VICTORIA, DRUGS AND CRIME PREVENTION COMMITTEE, Inquiry into

the Inhalation of Volatile Substances, DISCUSSION PAPER, January 2002.
National Institute on Drug Abuse RESEARCH MONOGRAPH SERIES Nª 52, Testing Drugs for
Physical Dependence Potential and Abuse Liability, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN
SERVICES Public Health Service Alcohol. Drug Abuse, and Mental Health Administration,
Editors:
Joseph V. Brady, Ph.D. The Johns Hopkins University School of Medicine Scott E. Lukas, Ph.D.
Addiction Research Center National Institute on Drug Abuse, 1984.
WHO/MSD/MSB/00.3, Guide to Drug Abuse Epidemiology, World Health Organization, 2000.
AUSTRALIAN INSTITUTE OF CRIMINOLOGY, INHALANT ABUSE BY YOUNG PEOPLE,

Simon Cleary, Paper presented at The Character, Impact and Prevention of Crime in Regional
Australia Conference convened by the Australian Institute of Criminology and held in Townsville
2-3 August 2001.
Health Hazards of Nitrite Inhalants, Editors:Harry W. Haverkos, M.D., Division of Clinical

Research
National Institute on Drug Abuse, John A. Dougherty, Ph.D. , NIDA Research Monograph 83,
U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, Public Health Service Alcohol, Drug
Abuse, and Mental Health Administration, 1988.
Chapter 5.14 Toluene Air Quality Guidelines - Second Edition, WHO Regional Office for Europe,
Copenhagen, Denmark, 2000.
Epidemiology of Inhalant Abuse: An Update, Editors: Raquel A. Crider, Ph.D. Beatrice A. Rouse,
Ph.D. Division of Epidemiology and Statistical Analysis, National Institute on Drug Abuse,
U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, Public Health Service Alcohol, Drug
Abuse, and Mental Health Administration NIDA Research Monograph 85, 1988.
GUIDE TO DRUG ABUSE EPIDEMIOLOGY, WHO Programme on Substance Abuse, Geneva,

Switzerland, 2000.
Capítulo 6
Detección de sustancias no permitidas en equinos.
Autores:
Bioq. Angeles de Cristófano.
Profesional del Laboratorio de Control Antidóping dependiente de Lotería de la Provincia de
Buenos Aires.
Bioq. Aníbal Ramos
Profesional del Laboratorio de Control Antidóping dependiente de Lotería de la Provincia de
Buenos Aires.
Introducción.
El término “Doping” apareció por vez primera en un diccionario inglés de alrededor de

1899 y se lo definía como la mezcla de opio y narcóticos usado en caballos, pero la raíz de la
palabra no se origina del inglés sino del lenguaje alemán donde la palabra “Doop” que significa
droga. Fue incorporado desde el alemán a un dialecto hablado por los trabajadores nativos del
sudeste del Africa, donde la palabra “Dop” significa licor casero ó licor fuerte usado
antiguamente como un estimulante en rituales. La palabra está aún vigente en esa parte del
mundo, refieriéndose a la ración de vino dado a los nativos por sus capataces. De acuerdo a
Crosier, la palabra toma su forma de la jerga Americana donde fue usada para describir un
hábito gitano de usar tabaco adulterado con las semillas de Datura stramonium para atontar a
los caminantes antes de robarlos.
Su significado básico en el mundo de los equinos de carrera, se refiere a cualquier droga

que afecte la performance o conducta del animal, en particular a los efectos estimulantes.
Cuando un propietario, jinete o preparador, dopa lo hace porque pretende, por medios
artificiales, y a veces peligrosos, preparar mejor una determinada prueba, lograr un mayor e
incluso a veces un menor rendimiento durante la misma o conseguir una recuperación rápida
después de competir.
Hoy en día "doping" se define como la administración o uso de sustancias en cualquier

forma ajena al cuerpo, o de sustancias fisiológicas en métodos anormales, con el propósito
exclusivo de lograr un aumento artificial y falso de la performance de competición. Por otro lado,
varias medidas fisiológicas para aumentar la performance en el deporte deben ser registradas
como doping. El uso de concentrados de hematíes en atletas humanos es un caso de dóping
biológico.
Para la especie equina en el código de carrera o reglamentos se indica que ningún

caballo declarado participante debe poseer en sus tejidos, fluidos corporales o excreciones,
ninguna sustancia o metabolito de sustancias prohibidas, o ninguna sustancia que aunque de
origen endógeno se encuentre en una concentración más elevada de los niveles considerados
como habituales.
En este capítulo se presenta un listado resumido de las sustancias prohibidas en

caballos de carrera SPC (SANGRE PURA DE CARRERA) y AT (AMERICAN TROTERS), las
características farmacocinéticas y farmacodinámicas de las drogas halladas con mayor
frecuencia y finalmente, la metodología habitual para su investigación en muestras de sangre y
orina.
6.1 Detección de sustancias no permitidas.
6.1.1 Muestras.
En los Hipódromos, al finalizar cada carrera, se obtienen muestras de los ejemplares que
llegaron en primer y segundo puesto y, en algunas carreras especiales, se le pide también al
tercer puesto. Este procedimiento está supervisado por personal del Hipódromo y de Lotería y
Casinos en la Provincia de Buenos Aires.
La muestra se divide en dos alícuotas iguales (Figura 6.1). Una de ellas se identifica con la
mitad de una clave en la que se asientan los datos del animal y del responsable. A la otra
alícuota se le asigna la otra mitad de la clave sin identificación (muestra ciega). Estas claves son
guardadas por la Comisión de Carreras en sobres separados y cerrados. Las orinas
identificadas se guardan en freezer separados cerrados bajo llaves en el Laboratorio Químico
del Hipódromo. El día del análisis, las muestras sin identificar se numeran al azar (frasco junto
con su mitad de clave correspondiente), luego, las claves se guardan en sobre cerrado y lacrado
y los frascos con un número como única identificación, se llevan al Laboratorio donde se
realizarán los análisis de control doping.
6.2.2 Tipos de sustancias a investigar.
Los tipos de sustancia a buscar están incluidos en un listado de sustancias prohibidas

extraído del Reglamento General de Carreras (Capítulo IV, artículo 25), acordado entre la
Nación y la Provincia de Buenos Aires, el cual rige la actividad hípica de los Hipódromos de La
Plata, San Isidro y Palermo.
Extracto del Artículo 25 del Reglamento General de Carreras.
Se divide el listado en cuatro categorías:

...”(a) Drogas estimulantes y depresivas con el más alto potencial para afectar la performance,
que no sean generalmente aceptadas como medicamentos en el caballo de carrera”...
...”(b) Drogas con alto potencial para afectar la performance, que no sean generalmente
aceptadas como agentes terapéuticos para el caballo de carrera, ó agentes terapéuticos que
tengan un alto potencial por abuso ó sobredosis”...
...”(c) Fármacos de uso terapéutico generalmente aceptados como medicamento para el caballo
de carrera que afectan la performance, tales como los broncodilatadores, y otros fármacos con
efectos primarios sobre el sistema nervioso”...
...”(d) Fármacos de uso terapéutico generalmente aceptados como medicamento para el caballo
de carrera, tales como los diuréticos, anabólicos esteroides, corticosteroides, antihistamínicos,
relajantes musculares”...
Datos del
caballo y
cuidador

Las claves se guardan en la comisión de
carreras en sobres cerrados y separados.
Se
numeran el
Numero día del
Datos del de
caballo y análisis
muestra
cuidador
Muestra
Datos del ciega.
caballo y Número
cuidador
Las muestras ciegas

van al Laboratorio para
control de Doping.
Las muestras se
Se numeran el día del
guardan en freezer en el
análisis.
Servicio Químico del
Hipódromo bajo llave.
Figura 6.1: Esquema de obtención de muestras para control de doping en caballos de carrera
SPC y AT.
”En caso de que la droga hallada por el laboratorio químico no se encuentre tabulada, se
considerará la clasificación contemplada en el INDEX MERCK y en las leyes 17518, 19303, las
que se dicten al efecto, y en su defecto en la lista de sustancias estupefacientes y psicotrópicos
publicada por la Junta Internacional de Fiscalización de Estupefacientes.”...
Para los caballos “Sangre Pura de Carrera” (SPC), se permite como tratamiento
terapéutico, fenilbutazona (analgésico y antiinflamatorio) y furosemida (diurético). Para caballos
“American Troter” (AT), las sustancias permitidas son: meglumina de flumixin, fenilbutazona,
ácido aminocaproico, glicopirrolato, glicoflavonoides, ciclonamina, diacepóxidos, vitamínicos
minerales (incluyendo oligoelementos y fosforados), aminoácidos esenciales, aspartatos,
clenbuterol, hexametilentetramina, ácido tióctico, furosemida, corticosteroides y clorsoxasona.
Cuando un medicamento permitido es administrado al animal, este debe ser declarado

antes de la carrera, caso contrario, si aparece en el control, se considera una infracción. A los
ejemplares menores de tres años, no se les permite la administración de ningún tipo de
sustancia.
A continuación se presenta el listado resumido de sustancias no permitidas:
Drogas de abuso en caballos de carrera (clase “a”)
Alfentanilo Efedrina Morfina

Anfetamina Levorfanol Niquetamida
Anileridina Mazindol Oxicodona
Apomorfina Meperidina Oximorfona
Carfentanilo Mefentermina Pemolina
Cocaina Dipirona Pentilentetrazol
Endorfina Metadona Fenazocina
Encefalina Metamfetamina Fenclidina
Etilmorfina Metacualona Fendimetrazina
Etorfina Metilfenidato Fenmetrazina
Fentanilo Metopon Picrotoxina
Hidromorfona Midazolam Estricnina
Sufentanilo
Drogas de abuso en caballos de carrera (clase “b”)
Alfaprodina Dihidrocodeina Fentermina

Bupivacaina Doxapram Piminodina
Buprenorfina Efedrina Piperocaina
Butorfanol Etamivan Pipradol
Cafeina Etilisobutrazina Prilocaina
Clordiazepoxido Hidrocodona Propanidid
Clormezanona Isometadona Propionilpromazina
Cloroprocaina Isoproterenol Propiram
Clorpromazina Lobalina Propexicaina
Clobazam Metazocina Tetracaina
Clorazepato Metohexital Tebaina
Codeina Metotrimeprazina Tiamilal
Crotetamida Nalbufina Tribromoethanol
Dietiltiambuteno Norepinefrina Yohimbina
Drogas de abuso en caballos de carrera (clase “c”)
Acepromazina Detomidina Guanadrel

Albuterol Dextropropoxifeno Guanetidina
Aminofilina Diazepam Heptaminol
Atropina Diazoxido Hornatropina
Bitolterol Dimeflina Hidrazalina
Bromazepan Difenhidramina Ipratropium
Bromodifenhidramina Dipiridamol Isostarina
Bumetanida Dolbutamina Isosorbide dinitrato
Butacaina Doxilamina Ketorolac
Captotril Difylina Labetalol
Carbamazepina Edrofonium Lidocaina
Carbinoxamina Enalapril Metaproterenol
Clenbuterol Etamifilina Metacolina
Clonidina Etacrinico acido Metixeno
Cromolyn Etilnorepinefrina Metoxamina
Ciclandelato Glicopirrolato Etoxifenamina
Cycrimina Guanabenz Metilatropina
Metilldopa Testolactona
Metolazona Timolol
Minoxidil Tolazolina
Muscarina Trihexilfenidil
Nefopam Trimetadiona
Neostigmina Trimetafan
Nitroglicerina Tripelennamina
Nordazepam Xilazina
Oxazepam
Oxprenolol
Papaverina
p-hidroxiefedrina
Parametadiona
Pargilina
Pentazocina
Pentoxifilina
Fenoxibenzamina
Fentolamina
FeniIefrina
Fenilpropanolamina
Fisostigmina
Pindolol
Piretanida
Prazosin
Primidona
Procaina
Procaterol
Prociclidina
Promazina
Prometazina
Propanolol
Protokilol
Pseudoefedrina
Piridostigmina
Pirilamina
Ritodrina
Escopolamina
Terbutaline
Sustancias halladas con mayor frecuencia
CLASE
a b c d
Mefentermina Cafeina Clenbuterol Dipirona
Fenmetrazina Efedrina p-hidroxiephedrina Paracetamol
Cocaina Norefedrina Teofilina Acetanilida
Amfetamina Buprenorfina Diazepam Ambroxol
Niquetamida Butorfanol Oxazepam Teobromina
Fentanilo Clordiazepoxido Lidocaina Diclofenaco
Pemolina Nalbufina Pseudo-efedrina Ibuprofeno
Acepromazina Orfenadrina
Nordazepam Flunixina
Procaina Bromhexina
Xilazina Metocarbamol
6- Características farmacocinéticas y farmacodinámicas de las

sustancias halladas con mayor frecuencia.
6.1 Antipiréticos analgésicos antiinflamatorios.
6.1.1 Salicilatos:
6.1.1.1 Acción farmacológica.
Acción analgésica: efectiva para dolores de carácter leve a moderado de cualquier origen.
Sistema nervioso central: A dosis elevadas, posee acción estimulante, en particular sobre el
centro respiratorio (aumento de la frecuencia y amplitud de la respiración).
Acción antiinflamatoria: por inhibición de la ciclo-oxigenasa produce disminución de la
inflamación. En animales es capaz de inhibir total o parcialmente los procesos experimentales
agudos (eritema, edema, exudación) y crónicos (granuloma).
Acción antipirética: actúa en el hipotálamo para producir antipiresis, produciendo la
pérdida de calor por vasodilatación periférica.
6.1.1.2 Farmacocinética.
En el organismo, los ésteres del ácido salicílico (Acido Acetil Salicílico), en parte
hidrolizados en el intestino, lo son totalmente por esterasas plasmáticas y tisulares, y la
concentración sanguínea es muy baja a la hora y media de ingesta, mientras que el ácido
salicílico libre permanece en ella en alta concentración por más de 24 horas, y se excreta en
orina en mayor cantidad que sus metabolitos. La excreción renal, se realiza por filtración
glomerular, reabsorción y secreción tubular. Depende del pH urinario (aumenta con la
alcalinidad; a pH ácido hay intensa reabsorción tubular).
6.1.2 No salicilatos.
Pirazolonas:
Dipirona (Metamizol, Novalgina)
Fenilbutazona
Aminopirina o aminofenazona (poco usado)
Derivados del p-aminofenol:

Acetanilida (en desuso por tóxica)
Acetaminofeno (paracetamol)
Indoles e Indazoles:
Indometacina
Bencidamina

Acción analgésica: similar a las de los salicilatos.

Acción antiinflamatoria: similar a las de los salicílicos y es su propiedad fundamental
6.1.2.2 Absorción.
Todos se absorben perfectamente en el tracto gastrointestinal y por vía parenteral. La

absorción de fenilbutazona por vía intramuscular es mucho más lenta que la bucal, por fijación
en el lugar de inyección.
6.1.3 Distribución.
Pirazolonas.
Aminopirina:
Pasa a sangre y su pico máximo de concentración es a las dos horas cayendo luego
a una velocidad de 10 – 30% por hora. Un 15% se combina con proteínas plasmáticas (vida
media 3 horas).
Fenilbutazona:
Pico máximo de concentración plasmática a las dos horas. La caída es muy lenta
(20% por día), vida media 72 horas. Tiene efecto acumulativo. Se combina un 98% con
proteínas plasmáticas (albúmina).
Derivados del p-aminofenol.
Acetaminofeno:
Pico máximo de concentración plasmática a las 2 horas. Vida media 3-4 horas.
Indoles e indazoles:
Indometacina: Pico máximo de concentración plasmática a las 2 horas. Vida media 2 horas.
Bencidamina: No muy estudiado.
6.1.4 Metabolismo y excreción.

Pirazolonas.
Antipirina y dipirona se desmetilan formando 4-aminoantipirina (la cual conserva

propiedades antipiréticas y analgésicas); luego se acetilan dando 4 acetil aminoantipirina
(inerte); se forma además 4-hidroxiantipirina. Todos estos procesos ocurren en el hígado,
apareciendo los metablitos en orina. La 4-hidroxiantipirina se conjuga con ácido glucurónico y
sulfúrico, así como el ácido rubazónico (rojo que colorea la orina, derivado de la aminopirina).
La Fenilbutazona se convierte en oxifenbutazona y se hidroxila en la cadena lateral

butilo en posición γ. Ambos metabolitos son lentos en formarse, por estar la droga unida a
proteínas plasmáticas. Se excretan en orina lentamente, encontrándose hasta después de 4 a
5 días de una sola toma.
Derivados del p-aminofenol.
Acetaminofeno.
Aparece en la orina en forma libre en un 5% y conjugado (con ácido sulfúrico y
glucurónico) cerca del 85 %. Las biotransformaciones y excreción urinaria son rápidas y
pueden impartir a la orina un color amarillo parduzco.
Indoles e indazoles.
Indometacina.
Sufre demetilación y deacilación produciendo demetil-indometacina y demetil-dicloro-
bencilindometacina, todos combinados con acido glucurónico. Las biotransformaciones se
realizan en el hígado y los metabolitos se excretan en la orina y en la bilis.
Benzidamina.
Al parecer no sufre ninguna transformación y se excreta como tal.
6.2 Anestésicos.
El primer anestésico local empleado fue la cocaína. Químicamente esta es la

benzoilmetilecgonina, es decir, un éster de un ácido aromático (benzoico) y una base
nitrogenada con la estructura de amina terciaria (ecgonina), unidas por una cadena
hidrocarbonada (metileno). Esta estructura fundamental, ácido aromático-cadena intermedia-
amina terciaria, es la responsable de las propiedades anestésicas locales. A partir de este
principio, se han sintetizado gran número de drogas anestésicas. Aquí se considera:
Esteres amínicos terciarios del ácido benzoico:

Cocaína.
Esteres amínicos terciarios del ácido para-aminobenzoico:
Procaína (novocaína).
Tetracaína (pantocaina).
Amidas:
Lidocaína ó lignocaína (xilocaína).
Prilocaína.
Dibucaína o cincocaína
6.2.1 Acción farmacológica.
6.2.1.1 Sistema nervioso periférico.
Producen anestesia local. Puede lograrse por varios procedimientos, entre ellos
infiltración o tópica. Ciertas fibras nerviosas son más susceptibles que otras a la acción de los
anestésicos locales. En un nervio mixto, las fibras sensitivas se bloquean antes que las
motoras. Dentro de las sensitivas, existe un orden en los efectos de dichos fármacos; en
general, primero se bloquean los impulsos de la sensibilidad dolorosa, luego los de la
temperatura, tacto y presión. A altas concentraciones, se bloquean los impulsos motores. Las
diferencias entre dichos efectos, son cuantitativas.
6.2.1.1 Sistema nervioso central.
Los anestésicos locales, una vez absorbidos, producen fenómenos de estimulación seguidos
de depresión central ya sea por agotamiento de los centros nerviosos como por acción de las
mismas drogas.
Esteres amínicos terciarios del ácido benzoico.
Cocaína.
Sus acciones estimulantes se realizan desde la corteza cerebral a la médula espinal.

Provoca inquietud y actividad motora continua y coordinada (acción cortical) luego temblor,
hiperreflexia, convulsiones tónicas y clónicas (acción cerebral y espinal) seguidas de depresión
y muerte por parálisis respiratoria.
Esteres amínicos terciarios del ácido p-aminobenzoico.
Procaína.
La inyección subcutánea y sobretodo la intravenosa, produce analgesia sistémica. La

inyección intravenosa lenta a altas dosis, provoca anestesia general.
Amidas.
Lidocaína (xilocaína).
Sus acciones son semejantes a los de la procaína, siendo frecuente una acción sedante con
dosis no muy elevadas.
6.2.1.2 Sistema cardiovascular.
Cocaína.
A dosis medianas a altas, provoca depresión y puede llegar a paro cardíaco
Esteres amínicos terciarios del ácido para-aminobenzoico.

Procaína (novocaina). Se comporta como droga antifibrilante y antiarrítmica. Es capaz de

provocar depresión cardíaca. En vasos posee acción vasodilatadora.
Amidas.
Lidocaína (xilocaína). Sus acciones antiarrítmicas son semejantes a los de la procaína pero
muy poco depresora y muy poco hipotensora.
6.2.2 Farmacocinética.
Ningún anestésico local se absorbe en piel intacta. Si está lesionada con la capa córnea
removida, la absorción se produce tanto con solución de las sales como con pomadas que
llevan bases libres o anestésicos locales poco solubles, en cuyo caso se obtiene la máxima
concentración sanguínea en 6 a 10 minutos.
La absorción a través de mucosas es rápida en faringe, tráquea, pulmones, conjuntiva y
uretra para cocaína, tetracaína y lidocaína. Para procaína siempre es escasa.
Por ingestión se observan niveles sanguíneos muy bajos.
Por vías parenterales, la absorción es rápida. Para cocaína es más lenta por la
vasoconstricción que produce.
Una vez absorbidos pasan a sangre y se distribuyen en todos los órganos.
Cocaína.
Es metabolizada especialmente en hígado y se excreta rápidamente (en menos de 24

hs.) por riñón, parte en estado libre y la mayor parte como metabolitos.
Esteres amínicos terciarios del ácido para-aminobenzoico.
Procaína (novocaína).
Es hidrolizada rápidamente por la pseudocolinesterasa. Se desdobla en p-

aminobenzoico y dietilaminoetanol y estos metabolitos son excretados por riñón.
Amidas.
Lidocaína (xilocaína).
La biotransformación se produce en hígado (oxidación, hidrólisis y sulfoconjugación).

Todos los metabolitos se excretan por orina.
6.3 Drogas tranquilizantes.
Neurolépticos (tranquilizantes mayores):

Fenotiazinas y análogos
Butiferonas
Alcaloides de la Rauwolfia
Anisamidas
Ansiolíticos (tranquilizantes menores):

Benzodiazepinas
Propanodioles
Dibenzobiciclooctadienos
6.3.1.1 Neurolépticos (tranquilizantes mayores).
Fenotiazinas y sus derivados (todos sintéticos):
Este grupo se comprende de un grupo farmacológico muy amplio. Son aminas terciarias
(bases fuertes). Se toma como estándar o prototipo a la clorpromazina.
A nivel del Sistema Nervioso Central ejercen una acción tranquilizante neuroléptica.
Se produce un estado de quietud, con disminución de la actividad motora espontánea e
inercia. Con dosis pequeñas o medianas no se llega al sueño. El animal pierde agresividad e
interés por el ambiente. A dosis elevadas puede producir la muerte por parálisis respiratoria.
La clopromazina no es analgésica de por sí, pero es capaz de aumentar el efecto de
drogas que lo producen (morfina, meperidina, AAS etc.) aumentando duración y potencia.
A nivel del Sistema Nervioso Autónomo anula e invierte los efectos hipertensores de
la adrenalina (acción bloqueante α adrenérgica) produciendo taquicardia secundaria a la
caída de presión.
Butiferonas.
Son compuestos sintéticos. Los principales son el haloperidol, trifuperidol y

droperidol. Su actividad es semejante a las fenotiazinas, aunque más potente.
Alcaloides de la Rauwolfia:.
Son drogas hipotensoras. La más importante es la reserpina. A nivel del Sistema

Nervioso Central provoca un estado de tranquilización, quietud y calma. Las acciones en
general son similares a las fenotiazinas.
Anisamidas.
El principal representante es la sulpirida (sintético). Los efectos son similares a las

fenotiazinas pero de menor potencia.
6.3.1.2 Tranquilizantes menores o ansiolíticos.
Benzodiazepinas.
Los derivados principales todos (sintéticos) son: clordiazepóxido, diazepan,

oxazepan, medazepan, lorazepan, clorazepato. Las benzodiazepinas en el caballo pueden
actuar como drogas estimulantes ó depresoras, dependiendo del temperamento del equino y
de la dosis de tranquilizante administrado. Sobre el músculo esquelético actúa como
relajante musculares, disminuyendo la espasticidad muscular secundaria a trauma o
inflamación. En el sistema respiratorio cardiovascular pueden producir depresión respiratoria
e hipotensió. Aún cuando son consideradas drogas seguras pueden producir paro
cardiorespiratorio cuando se asocian al alcohol etílico.
Propanodioles.
Son relajantes musculares y tranquilizantes. La droga tipo es el meprobamatocon

potentes efectos depresores centrales. A nivel del Sistema Nervioso Central, produce
disminución de la actividad motora permitiendo el fácil manejo del animal con pérdida del
temor. A diferencia de fenotiazinas y reserpina, el animal no muestra indiferencia sino que
coopera. Con dosis elevadas puede llegar a parálisis fláccida.
Dibenzobiciclooctadienos.
Son compuestos sintéticos, siendo el exponente principal la benzoctamina. Son

agentes tranquilizantes. A nivel del Sistema Nervioso Centra posee acción tranquilizante con
reducción de la actividad motora y sobre todo de agresividad. La benzoctamina posee
también acción relajante muscular.
Neurolépticos (tranquilizantes mayores).
Las fenotiazinas se absorben fácilmente por vía oral, rectal y paranteral. Pasan a
sangre y a todos los tejidos con máxima concentración en pulmón, hígado y cerebro. Se
acumulan en pelo. Las vías metabólicas son cuatro; hidroxilación, demetilación, oxidación y
conjugación (como glucurónidos especialmente). Son excretados principalmente por orina y
bilis, especialmente glucurónidos (5% sulfóxidos y derivados y 5% libre).
La excreción urinaria continúa mucho tiempo despúes de suprimir su

administración (hasta 6 meses) pero se trata de metabolitos poco activos, por lo que los
efectos duran apenas unas 6 horas.
Las butiferonas se absorben rápida y completamente por todas las vías.

Prácticamente no se metabolizan en el organismo y se excretan por bilis y especialmente
por riñón (aparecen en orina a las dos horas y hasta 28 días despúes).
Tranquilizantes menores o ansiolíticos.
Se absorben con facilidad por todas las vías. Su concentración en sangre llega al
máximo a las 2 - 3 horas y desaparece a los 3 - 4 días. La biotransformación varía para las
distintas benzodiazepinas.
Clordiazepóxido: sufre dos oxidaxiones sucesivas, probablemente en el hígado,

para transformarse en un derivado lactámico y en un aminoácido farmacológicamente
inactivos.
Diazepan y medazepan sufren procesos de demetilación y oxidación por dos
caminos diferentes, el segundo da diazepan y ambos llegan a oxazepan y lorazepan, se
conjugan con ácido glucurónico, principal transformación de esas drogas.
Las drogas y su metabolitos se excretan en su mayor parte en la orina (70 - 90%)
y el resto en las heces. Esta excreción no es muy rápida y en sangre la vida media es de
aproximadamente 52 horas. La presencia de rutas de metabolización interconectadas.
Meprobramato: se absorbe con facilidad cuando se administra por vía bucal,

rectal y parenteral. La absorción gastrointestinal es muy completa. La concentración
sanguínea máxima se observa a las 2 horas y declina lentamente. Se distribuye a todos los
órganos en especial en hígado, riñón y pulmón.
En el organismo la biotransformación más importante consiste en la oxidación que

se realiza a nivel de la cadena lateral metilo y en la cadena propilo, con formación de los
alcoholes respectivos, prácticamente inactivos. Los metabolitos así como el meprobamato
se conjugan con el ácido glucurónico y son excretados por riñon (10 % como meprobamato
libre).
La excreción urinaria comienza dentro de los 30 minutos de ingerida la droga,
llegando a un máximo a las 2 horas para terminar a las 24 horas. La vida media es de 11
horas.
Dibenzobiciclooctadienos.
La benzoctamina se absorbe bien por todas las vías incluida la digestiva y parenteral.
Su destino y excreción no es muy bien estudiado.
6.4 Broncodilatadores.
Son drogas capaces de relajar la musculatura lisa de los bronquíolos ensanchando así
su luz.
Drogas adrenérgicas simpaticomiméticas: catecolaminas y fenilaminas:

Adrenalina (epinefrina): principio activo principal de la médula suprarrenal. Se extrae
de la glándula suprarrenal bovina o por síntesis (ésta es pura).
Noradrenalina (norepinefrina): principal trasmisor químico simpático. Existe en las
suprarrenales en pequeñas cantidades. Se obtiene por síntesis.
Isoproterenol, isoetarina, salbutamol, clenbuterol, orciprenalina, terbutalina. Todas de
origen sintético.
Drogas anticolinergicas o parasimpaticolíticas:

Alcaloides de las solanáceas. Atropina.
Brocodilatadores musculotrópicos:
Xantinas, especialmente la teofilina.
Las catecolaminas representan las drogas adrenérgicas simpaticomiméticas por

excelencia.
6.4.1.2 Sistema cardiovascular:

La adrenalina aumenta tanto la presión sistólica como la diastólica (más la primera)

por lo tanto la presión diferencial aumenta. Esto se debe a la vasoconstricción de las
arteriolas (esplácnica y cutánea) y a la estimulación cardíaca. Los efectos presores son
fugaces (aproximadamente 3 minutos) debido a captación rápida e inactivación de la droga.
Es un potente estimulante cardíaco por acción directa sobre el miocardio. Produce
aumento de la fuerza de contracción sistólica y de la frecuencia cardíaca.
Noradrenalina: acciones similares a la adrenalina.
Isoproterenol y derivados: producen esencialmente efectos beta y muy pocos o ninguno

alfa. Provoca descenso en la presión arterial por vasodilatación en todos los territorios
(incluso músculo). Produce estimulación cardíaca.
Isoetarina y salbutamol: poseen poca acción estimulante cardíaca y taquicardizante a

pesar de poseer acción vasodilatadora periférica.
Orciprenalina y derivados: idem a isoproterenol.
Terbutalina: en forma similar a salbutamol.
Clenbuterol: estimulante selectivo de los receptores beta-2. En el sistema cardiovascular:

provoca descenso de la presión arterial por disminución de la resistencia periférica como
consecuencia de vasodilatación en todos los órganos, inclusive el músculo. Ha sido utilizado
como pseudo anabólico en animales.
Toxicidad: se describieron síntomas como sudoración, taquicardia y excitación luego de la
administración endovenosa.
6.4.1.3 Sistema respiratorio.
Adrenalina: por inyección lenta aumenta de frecuencia y amplitud respiratoria por

estimulación del centro respiratorio.
Noradrenalina: menos potente que adrenalina.

Isoproterol y derivados: isoproterenol, isoetarina y salbutamol poseen una prominente

acción relajadora de la musculatura bronquial.
Ociprenalina y terbutalina: acciones broncodilatadora menores que isoproterenol.
Clenbuterol: posee acción relajante de la musculatura bronquial y bronquiolar y ayuda a la

limpieza del mucus de los pulmones (secretolítico), reduciendo la tos y previniendo la
liberación de mediadores de la inflamación.
Orfenadrina: es un agente anticolinérgico antiparkinsoniano sintético derivado de la

etanolamina. Posee acción estimulante del Sistema Nervioso Central, en forma semejante a
la atropina (puede producir aumento de actividad motora; en dosis elevadas, puede llegar a
coma y muerte por parálisis respiratoria). Es relajante muscular de acción central sin afectar
la capacidad de contracción. Posee efectos sedativos.
También ejerce una acción anticolinérgica periférica, pudiendo en dosis elevadas, inhibir los
efectos de la estimulación del vago y de la acetilcolina a nivel del corazón llevando a
bradicardia y paro cardíaco.
6.5- Estimulantes cardíacos y respiratorios.
Cardiotónicos.
Glucósidos cardiotónicos o digitales: Se encuentran en diversos vegetales,

siendo los más importantes la digital, el estrofanto y la escilia.
Digital: contiene 1 % de glucósidos carditónicos:
Digitoxina o digitalina cristalizada.
Gitoxina
Digoxina
Estrofanto:
Estrofantidina
Ouabagenina
Escilia
Escilarenina
Es cuantitativamente la misma para todos. Se ejerce fundamentalmente sobre el

músculo cardíaco. Aumentan la fuerza de contracción (inotropismo positivo) y la presión
arterial. Disminuyen la frecuencia cardíaca (cronotropismo negativo) y la vitalidad
(batmotropismo positivo).
La absorción difiere entre los distintos glucósidos:
Digital: los glucósidos de la digital se absorben esencialmente en intestino delgado.

Estrofanto y escilia: se absorben mucho menos debido a la poca liposolubulidad de
sus glucósidos.
Una vez absorbidos, pasan a sangre y se fijan a proteínas (albúmina), y luego en el

músculo cardíaco, además de otros tejidos. La fijación es mucho mayor para la digitoxina
que para al resto. La fijación al corazón es directamente proporcional a la liposolubilidad.
Se metabolizan parcialmente en el organismo especialmente en hígado. La excreción

se realiza principalmente por riñón, por filtración glomerular y reabsorción tubular siendo
esta última extensa para digitoxina (liposoluble). También ocurre cierta excreción biliar para
los dos primeros, que se reabsorben en intestino, y algo se pierde por heces.
Digitoxina: es metabolizada parcialmente en hígado. La droga y sus metabolitos

(digoxina, pequeñas porciones de digitoxigenina, digoxigenina, digitoxosa y otros) son
excretados por orina y por bilis al intestino donde se reabsorben (circulación
enterohepática). En esta forma se excreta aproximadamente un 80 % de la dosis y el resto
por las heces. La excreción es rápida en las primeras 48 horas, pero continúa por mucho
tiempo, pudiendo hallarse pequeñas cantidades en orina hasta 50 días después de una
dosis.
6.6 Estimulantes del sistema nervioso central.
6.6.1 Xantinas.
Este grupo consiste básicamente de tres compuestos emparentados, las

metilxantinas:
Teofilina
Cafeína
Teobromina
Cafeína: (1,3,7 trimetilxantina).
Sistema cardiovascular.
Produce elevación de la presión arterial y vasodilatación con aumento del caudal

sanguíneo coronario. En concentraciones bajas produce disminución muy leve de la
frecuencia cardíaca, y en altas da taquicardia. En equinos mejora la performance de
carrera. También aumenta la frecuencia de arritmias cardíacas.
Sistema nervioso central.
Es considerada la xantina más potente como estimulante del SNC a través de la

liberación de norepinefrina. Aumenta la capacidad motora. Contrarresta hasta cierto punto
la acción de drogas depresoras centrales como el alcohol etílico.
Sistema respiratorio.
Posee acción relajante de la musculatura lisa de los bronquiolos con acción

broncodilatadora.
Sistema esquelético:.
Produce aumento de la contracción muscular, disminuyendo la fatiga.
Toxicidad: incluye inquietud, excitación, temblores hasta llegar a convulsiones. También

taquicardia, taquipnea y extrasístoles.
Teofilina: (1,3 dimetilxantina).
Sistema cardiovascular:
Es estimulante cardíaco aumentando fuerza y frecuencia por acción vagal, con dosis
muy altas puede llegar al paro cardíaco. Provoca vasodilatación coronaria.
Sistema respiratorio:
Es la xantina más eficaz en la relajación del músculo liso. Actúa a nivel de centros
bulbares produciendo aumento de volumen y frecuencia respiratoria.
Sistema nervioso central:
De todas las xantinas, es la que produce estimulación más profunda y peligrosa,

actuando a nivel de corteza, aumentando la actividad motora espontánea, produciendo
excitación. A nivel bulbar estimula el centro respiratorio, vasomotor y vagal.
Sistema urinario: actúa como diurético.
Músculo esquelético:
Mejora la capacidad funcional del músculo, haciendo más potente la contracción

mientras disminuye la fatiga, fundamentalmente por estimulación del SNC. Aumenta la
contractilidad del diafragma contribuyendo a disminuir el trabajo respiratorio.
Intoxicación: a dosis elevadas produce taquicardia, extrasístoles, inquietud, excitación,

temblores, hiperreflexia, y pudiendo llegar a convulsiones tónico-clónicas.
Teobromina: (3,7-dimetilxantina).
Sistema cardiovascular: actúa como un débil estimulante cardíaco.
Sistema respiratorio: es estimulante de centros respiratorios bulbares. Relaja la

musculatura lisa de los bronquios.
Sistema urinario: principal acción, actuando como diurético.
Sistema nervioso central: prácticamente inactiva como estimulante del SNC.
Se absorben cuando se administran por todas las vías (bucal, rectal, intramuscular,
etc)
Con respecto a la absorción digestiva, las xantinas liberadas a nivel del estómago, se
comportan como bases sumamente débiles. (pKa 0,7 para teofilina y 0,8 para cafeína) por lo
cual se encuentran parcialmente ionizadas y se absorben parcialmente (sólo la parte no
ionizada).
Una vez absorbidas se distribuyen por todos los órganos sufriendo luego
biotransformación, sobre todo en hígado. Se demetilan y oxidan parcialmente. Todos los
metabolitos son excretados por riñón, junto con un 10 % de xantinas no transformadas.
6.6.2 Compuestos piperidínicos.
Son de origen sintético y derivados de la piperidina. Entre ellos se encuentran el

metilfenidato, un estimulante del SNC a predominio cortical, similar a las aminas
despertadoras y a la cafeína.
Se absorbe bien cuando se administra por vía bucal o parental. Se desmetila en el
organismo y se elimina por el riñón en 24 hs. como droga y su metabolito.
6.6.3 Aminas despertadoras o psicotónicas.
Fenil-isopropilaminas y derivados. Son todas de origen sintético. Las

fenilisopropilaminas constituyen la estructura fundamental de estas aminas. El compuesto
madre de esta familia es la anfetamina o bencedrina.
Otros derivados:
Metanfetamina o desoxiefedrina
Efedrina
Fentermina
Clorfentermina
Mefenorex
Fennmetrazina
6.6.3.1 Accion farmacológica general.
Sistema Nervioso Central:
Hay aumento de la actividad motora, inquietud, temblores e insomnio. También son

estimulados los centros bulbares, especialmente el centro respiratorio (aumento de amplitud
y frecuencia respiratoria).
Sistema cardiovascular:
Producen respuesta derivada de la actividad sobre receptores α (vasoconstricción) y

β (estimulación cardíaca). Provocan aumento de la frecuencia y fuerza de contraccion
cardíaca, y elevación de la presion arterial. Las de mayor potencia son la anfetamina y
metanfetamina.
Efedrina:
Alcaloide natural encontrado en plantas del género Ephedra. También se obtiene por
síntesis. Provoca estimulación (efecto β) -acciones inotrópicas, cronotrópica y batmotrópica
positivas sobre el corazón.
Vasos sanguíneos: producen elevación de presión arterial, menos potente pero mas
duradero que adrenalina, por su estabilidad.
Aumenta la contractilidad del músculo esquelético.
Sistema respiratorio: estimula el centro respiratorio aún cuando se encuentre

deprimido por morfina o barbitúricos. Relaja la musculatura bronquial, produciendo un efecto
antiespasmódico, lo cual alivia la disnea.
Toxicidad: En equinos posee efectos estimulantes en la performance pero menos

marcado que la cafeína, e induce arritmias cardíacas. Produce aumento de la frecuencia
respiratoria en reposo e inquietud, tornando al equino inmanejable.
Anfetamina y metanfetamina.
Sistema cardiovascular: provoca elevacion prolongada de la presión arterial por

estimulacion cardíaca y vasoconstricción periférica.
Sistema respiratorio: análogo a efedrina, estimulan el centro respiratorio.
Se absorben perfectamente en el tracto gastrointestinal y por vía parental. Se

excretan en la orina en forma no modificada y como metabolitos demetilados o
desaminados.
Efedrina: sufre en el organismo una N-demetilación parcial transformándose en

norefedrina, (con acción simpaticomimética similar). Se oxida a su vez dando p-
hidroxinorefedrina
La Anfetamina sufre desaminación oxidativa transformándose parcialmente en

fenilpropanona.
6.7 Estimulantes bulbares.

Son conocidos como analépticos. Poseen una acción selectiva sobre centros bulbares, en
especial el centro respiratorio y secundariamente el centro vasomotor. Los principales
analépticos sintéticos son:
Niquetamida
Pentetrazol.
6.7.1.Accion farmacológica.
Sistema nervioso central: estimulan en forma selectiva los centros bulbares,

especialmente el respiratorio. Aumentan frecuencia y amplitud y por lo tanto mejoran la
ventilación pulmonar.
Sistema cardiovascular: no se observa efecto de importancia.
Vasos: estimulan el centro vasomotor bulbar entoces se produce aumento de presión
arterial por vasoconstriccion.
Se absorben fácilmente por cualquier vía.
Pentetrazol: se transforma poco en el organismo, y se excreta casi totalmente como tal.
Niketamida: es la dietilamida del ácido nicotínico. Se transforma en nicotinamida y luego en

N-metil-nicotinamida, excretándose dichas sustancias por orina conjugadas con ácido
glucurónico.
6.8 Andrógenos y esteroides anabólicos.
Los andrógenos pertenecen al grupo de los esteroides, derivados del

ciclopentanoperhidrofenantreno (específicamente androstano o etiocolano).
Todos se pueden preparar por síntesis. Los principales son:
Androsterona (escasa actividad)

Testosterona
Derivados de la testosterona:
Metiltestosterona
Fluoximecterona
Mesterolona
Esteroides anabólicos: son sustancias sintéticas derivados de andrógenos (la

mayoria de la testosterona) con propiedades anabólicas preponderantes y escasas acciones
androgénicas:
Metenolona
Oximesterona
Metandrostenolona (metandienona)
Oximetalona
Estanozolol (anabólico muy potente)
6.8.1 Accion farmacológica.
Los andrógenos ejercen sus acciones sobre los órganos y caracteres sexuales
secundarios, tanto en el macho como en la hembra, y además poseen potentes acciones
metabólicas.
Promueven el anabolismo proteico, disminuyendo la excreción de N2 urinario, con
balance positivo del mismo, lo que se manifiesta por aumento de peso, en especial del
músculo esquelético que aumenta de tamaño y fuerza.
Tiene acción estimulante sobre la proliferación ósea.
Son liposolubles por lo que se absorben bien, aunque lentamente, cuando se

administran en solución oleosa por vía intramuscular.
La esterificación de las drogas disminuyen la velocidad de esta absorción (por mayor
liposolubilidad) aumentando la duración de acción y la eficacia de la misma.
Una vez absorbidos, los andrógenos pasan a sangre donde son transportados unidos
a proteínas, se biotransforman en hígado y se eliminan conjugados con ácido glucurónico y
sulfúrico.
6.9 Metodologías empleadas.
Las muestras (orina o sangre) se obtienen en los Servicios veterinarios de los

Hipódromos. Las mismas son sometidas a diversas técnicas de screening. De acuerdo a la
complejidad con que se cuentelas mismas constan de:
- utilizar kits de ELISA para grupos de drogas: ej. benzodiazepinas, morfínicos, cocaína.
- realizar una cromatografía en capa fina convencional o de alta resolución.
- screening en cromatografía gaseosa.
Luego el resultado se confirma por Cromatografía Gaseosa- Espectrometría de Masas.
Para todos estos métodos (excepto ELISA), lo más importante es la etapa de

extracción. Para ello se pueden realizar diversas técnicas:
- Extracción líquido-líquido convencional.

- Extracción líquido-líquido en columna.
- Extracción sólido-líquido en diversos rellenos.
El fundamento de estas técnicas se describe en capítulos previos.
A continuación, se explica la metodología utilzada en el análisis de sustancias de

abuso.
6.9.1 Técnicas generales utilizando columnas de extracción en fase

sólida.
1. Columnas DAU (WORLDWIDE MONITORING).

(Usando clean screen ® volumen de solvente reducido, csdaua83 / zsdaua08)
- Preparacion de la muestra.
1 ml de orina, (se puede agregar standard interno, preferible deuterado) agregar 0,4 ml de
Buffer Fosfato 100 mM (pH 6,0). Agitar con vórtex. Verificar pH 6,0 ± 0,5.
- Acondicionamiento de la columna.
(use vacío mínimo o sin vacío).
0,5 ml metanol; aspirar.
0,5 ml agua destilada; aspirar.
0,25 ml Buffer Fosfato 100 mM (ph 6.0); aspirar.
No dejar secar la columna.
- Adicionar la muestra.
Agregar la misma a un caudal de 1 a 2 ml/minuto.
- Lavar la columna.
0,5 ml HCl 100mM; aspirar.
Secar la columna (3 minutos a 10 mm Hg).
0,1 ml hexano; aspirar.
- Elución de drogas acidas y neutras.

2 x 0,75 ml hexano/acetato de etilo (50/50); recoger usando vacío mínimo.
- Secado del eluato.

Evaporar a 40° C.
Reconstituir con 0,1 ml acetato de etilo. Agitar con vórtex.
- Lavado de la columna.
(Cambiar la gradilla de colección y colovar un reservorio para desechos).
- Elución de drogas básicas.

(Cambiar el reservorio para desechos y colocar la gradilla de colección).
2 x 0,75 ml diclorometano /isopropanol/amoníaco (78/20/2); recoja el eluido usando

mínima presión.
Nota: preparar el solvente de elución en el momento de usar. Agregar
isopropanol/amoniaco, mezcle bien, luego agregue diclorometano (pH 11-12).
- Secado de drogas básicas.

Evaporar a 40° C.
Reconstituir con 100 ml metanol. Agitar con vórtex.
- Derivatización.
Derivatizar si es necesario con el derivatizante adecuado. Inyectar 3 µl en GC/MS.
- Preparación de la muestra.
10 ml de orina.
Sustancias Ácidas y Neutras: Hidrólisis con NaOH .
Sustancias Básicas (conjugados con ácido glucurónico, esteroides, etc.)
Hidrólisis enzimática con glucuronidasa. Llevar a pH=5,0 con 2 ml de Buffer Acetato
(pH=5,0 , 0,1 M).
Tratar con Glucuronidasa por dos horas a 60°C.
Llevar la orina a pH=6,0 (con buffer fosfato 0,1M pH=6,0)
PREPARAR LA COLUMNA:
4 ml de metanol
4 ml de agua destilada
4 ml de ácido acético 1,0 M.
1 a 2 ml/minuto.
- Lavar la columna.
5 ML DE H2O.
5 ML DE ÁCIDO ACÉTICO 1N.
Secar la columna ( minutos bajo máximo vacío).
5 ml de hexano.
- Elución de drogas acidas y neutras.

Eluir con 10 ml de diclorometano.
- Elución de esteroides.
Fluir con 10 ml de Acetato de Etilo.
- Lavar la columna.
Lavar la columna con 10 ml de Metanol.
- ELUCIÓN DE DROGAS BÁSICAS.

4 ml de Diclorometano-Isopropanol (3:1) (NH3 2%)

Evaporar con N2
SEMBRAR EN CAPA FINA RETOMANDO CON ACETATO DE ETILO.
SOLVENTE DE CORRIDA CLOROFORMO: METANOL:ACIDO PROPIÓNICO
(72:18:10)
REVELAR CON DRAGGENDORF.
- Derivatizacion
Derivatizar con BSTFA ((Bis (trimetillsilil) trifluoroacetamida) 100 µl a 60°C 20
minutos); retomar con Acetato de Etilo e Inyectar en el CG/MS.
- Preparacion de la muestra
10 ml de orina .Llevar a pH = 5,0 con 2 ml de Buffer acetato (pH=5,0, 0,1 M)
TRATAR CON β-GLUCURONIDASA POR DOS HORAS A 60°C
Llevar la orina a pH=6.0 (5,5-6,5) con 2 ml de buffer fosfato 0,1M pH = 6.0.
- Acondicionamiento de la columna
Fluir 2 veces con 1 ml de metanol.
Fluir con 2 ml de agua destilada.
Fluir con 1 ml de ácido acético 1,0 M.
- Adicionar la muestra
Velocidad de flujo: 1 a 2 ml/minuto.
- Lavar la columna
CON 1 ML DE BUFFER FOSFATO PH = 6,0.
LAVAR 2 VECES CON 0.5 ML DE ÁCIDO ACÉTICO 1N.
Secar la columna (5 minutos bajo máximo vacío).
- ELUCIÓN DE DROGAS BÁSICAS.

Eluir 4 veces con 1ml de Diclorometano.
- Secado del eluido

Evaporar con N2 .
Retomar con Acetato de Etilo. Inyectar en el CG/MS.
4. Columnas NARC-2 (BAKER).
5 ml de ORINA + 5 ml de buffer fosfato 0,1 M; pH=6,0. Llevar a pH~ 4 - 6 con HCl
0,1N. Saturar con NaCl. Centrifugar.
Hacer vacío~ 5 mmHg.
Hacer pasar secuencialmente:
2 ml de metanol.
2 ml de buffer fosfato pH= 6,0
Velocidad de flujo: 1 a 2 ml/minuto.
- Lavar la columna.
3 ml de H2O desionizada
3 ml de HCl 0,1 N.
9 ml de metanol.
- Elución
Eluir la muestra en tubo, pasando dos veces 1ml de mezcla 80:20 recién preparada.
Diclorometano-isopropanol (80:20) con 4% de NH3. Preparar en el momento.

Evaporar el eluente bajo N2 a temperatura no mayor de 40ºC.
Reconstituir con 100 µl de ClCH3.
Pasar la muestra por el GC/MS.
4. Columnas C18 (BAKER)
5 ml de ORINA llevar a pH deseado con HCl 0,1 N ó NaOH 1 N.
Hacer vacío ~ 5 mmHg. Hacer pasar secuencialmente:
2 ml de metanol.
2ml de buffer fosfato pH= 6,0.
Velocidad de elución: 1 a 2 ml/minuto.
- Lavar la columna.

3 ml de H2O desionizada.
3 ml de HCl 0,1 N.
9 ml de metanol.
- Elución.
Eluir la muestra en tubo. El solvente a utilizar se debe elegir de acuerdo a las
características de la sustancia a extraer.
- Secado del eluido.

Evaporar el eluente bajo N2 a temperatura no mayor de 40ºC.
Reconstituir con 100 µl de solvente elegido. Pasar por el GC-MS.
6.9.2 Técnicas especiales utilizando columnas de extracción en fase

sólida.
1. Extracción de Benzoilecgonina de orina.
(Usando Clean Screen ® volumen de solvente reducido) Columna de extracción (csdaua83 /

zsdaua08)
1. Preparación de la muestra
1 ml de orina, (se puede agregar standard interno, preferible deuterado) agregar 0,4
ml de Buffer Fosfato 100 mM (pH 6.0). Agitar en vortex. Verificar pH 6.0 ± 0.5.
2. Acondicionamiento de la columna
(Aplicar vacío mínimo o sin vacío)
Hacer pasar secuencialmente
0,25 ml Buffer Fosfato 100 mM (pH 6.0); aspirar.
3. Adicionar la muestra.
4. Lavar la columna.
0,5 ml HCl 100mM; aspirar.
0,1 ml metanol; aspirar
5. Elución.
Eluir 2 veces con 0,75 ml metanol/isopropanol/amoniaco (78/20/2); recoger usando
mínimo vacío.
Nota: preparar el solvente de elución en el momento de usar. Agregar
isopropanol/amoníaco, mezclar bien, luego agregar diclorometano (pH 11-12).
6. Secado del eluido.

Evaporar a 40°C.
7. Derivatización.
Agregar 50 µl de acetato de etilo y 50 µl BSTFA ((Bis (trimetilsilil) trifluoro
acetamida con 1% TMCS (trimetilclorosilano).
Sopletear con N2 y tapar. Agitar con Vortex.
Dejar reaccionar 20 minutos a 70°C. Enfriar.
Nota: no evapore la solución de BSTFA.
Inyectar 1 to 3 µl en GC/MS.
Monitorear los siguientes iones (GC/MS):
TMS-benzoilecgonina: 240**, 256, 361
TMS-d3-benzoilecgonina: 243**, 259, 364
*se sugiere standard interno: d3-benzoilecgonina para cuantificar
2. Extracción de opiáceos de orina.

1. Preparación de la muestra.
(Método A ó B).
A. Hidrólisis enzimática de glucurónidos:

1 ml de orina (se puede agregar standard interno, preferible deuterado) agregar 0,5
ml de ß-glucuronidasa. Agitar con vórtex. Hidrolizar 3 horas a 65°C. Enfriar. Ajustar el
pH a 6,0 ± 0,5 con 0,7 ml de NaOH 1,0 N.
B. Hidrólisis ácida de glucurónidos:

1 ml de orina (se puede agregar estándar interno, preferiblemente deuterado)
agregar 0,1 ml HCl concentrado. Agitar con vórtex. Hidrolizar 1 hora a 100°C. Enfriar.
Agregar 0,2 ml de NaOH 7,4 M. Agitar con vórtex. Ajustar el pH a 6,0 ± 0.5 con 0,2 ml
de ácido fosfórico 500 mM.
(Aplicar vacío mínimo o sin vacío)
3. Adicionar la muestra
Velocidad de elusión: 1 a 2 ml/minuto.
0,5 ml buffer acetato 100mM (pH 4,5); aspirar.
0,5 ml metanol; aspirar
5. Elución.
Eluir 2 veces con 0,75 ml metanol/isopropanol/amoníaco (78/20/2); recoger usando
mínimo vacío.
Nota: preparar el solvente de elución en el momento de usar. Agregar isopropanol /
amoniaco, mezclar bien, luego agregar diclorometano (pH 11-12).
6. Secado del eluido

Evaporar a 40°C.
7. Derivatizacion
Agregar 50 ml de acetato de etilo y 50 ml BSTFA (con 1% TMCS). (Bis (trimetilsilil)
trifluoro acetamida con 1 % trimetilclorosilano),
Dejar reaccionar 20 minutos a 70°C. Enfriar.
Nota: no evaporar la solución de BSTFA.

Injectar 1 to 3 µl en GC/MS.
Monitorear los siguientes iones (GC/MS):
TMS-codeina: 371**, 234, 343 TMS-d3-codeina: 374*, 237, 346
TMS-morfina: 429**, 287, 324 TMS-d3-morfina: 432**, 290, 327
*se sugiere estándar interno: d3-codeina, d3-morfina para cuantificar.
3. Extracción de Anfetaminas de orina.
(Usando Clean Screen ® volumen de solvente reducido). Columna de extracción (csdaua83

/ zsdaua08)
Un ml de orina, (se puede agregar estándar interno, preferible deuterado) agregar
0,4 ml de Buffer Fosfato 100 mM (pH 6,0). Agitar con vórtex. Verificar pH 6,0 ± 0,5.
(Aplicar vacío mínimo o sin vacío).
No dejar secar la columna
4. Lavar la columna
0,5 ml acido acético; aspirar.
5. Elución.
Eluir 2 veces con 0,75 ml metanol/isopropanol/amoníaco (78/20/2); recoger usando
mínimo vacío.
Nota: preparar el solvente de elución en el momento de usar. Mezclar bien
isopropanol/amoníaco y luego agregar diclorometano (pH 11-12).
6. Secado del eluido.

Evaporar a 40°C.
7. Concentrado del eluido.

Agregar 30 µl DMF (Dimetilformamida) para silanizar al eluato. Evaporar los 30 ml a
40°C.
8. Derivatizacion.
Agregar 50 µl de PFPA (anihídrido pentafluoropropiónico).
Dejar reaccionar 20 minutos a 70°C.
Evaporar a seco a 40°C.
Reconstituir con 100 µl de acetato de etilo.
Injectar 1 to 3 µl en GC/MS.
Nota: Monitorear los siguientes iones (GC/MS):

Anfetamina: 190**, 91, 118
D5-anfetamina: 194**, 92, 123
Metanfetamina: 204**, 118 (or 91), 160
D5-metanfetamina: 208**, 119 (or 92), 163
*se sugiere estándar interno: d5-amfetamina, d5-metanfetamina para cuantificar.
4. Procedimiento de extraccion de Estanozolol de muestras de orina,

usando columnas SPE C18 (BAKER).
En equinos, el estanozolol sufre hidroxilación en posiciones 3´y 16. El modo primario de

conjugación es la sulfatación. Para el análisis es esencial la hidrólisis de grupos
glucurónidos ácidos y sulfatos. Para cromatografía gaseosa, se debe hacer una
derivatización de grupos OH-. Para derivatizar se usa una mezcla de MSTFA/TMSI (1000:2).
1. Preparacion de la muestra
Hidrólisis enzimática: Llevar 10 ml de orina a pH=5 con buffer acetato; agregar β-
glucuronidasa (Helix pomatia); incubar a 37°C durante 18 horas.
Agregar 5 ml de acetato de amonio 0,024 M (llevar a pH=5.5 con ácido acético
glacial)
Acondicionar la columna eluyendo 2 veces con 3 ml de metanol y 2 veces con 3 ml
de H2O destilada.
Lavar con 2 ml de H2O.
DEJAR SECAR TRES MINUTOS BAJO VACÍO.
5. Elución
Eluir 3 veces con 1 ml de metanol.
Eluir 3veces con 2 ml de éter etílico.

Eluir con 3 veces con 2 ml de Acetato de Etilo:Metanol:H2SO4 50:10:2 gotas.)
Dejar a 37°C toda la noche ó 50°C 2 horas.
Lavar 2veces con 2 ml de NaOH 2M.
6. Secado del eluato.

Secar bajo N2.
7. Derivatización.
Adicionar al residuo 100 µl de N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida y 20 µl
de trimetiliodosilano; calentar por 15-20 minutos a 70-75°C.
Inyectar en el CG-MS 1-2 µl del remanente.
5. Procedimiento de extraccion de Prednisona, Deoxicoticosterona y

Progesterona de muestras de orina, usando columnas SPE C18 (BAKER).
5 ml de orina. Hidrolizar con ácido fórmico.
2. Acondicionamiento de la columna.
Acondicionar la columna eluyendo 2 veces con 3 ml de metanol y 2veces con 3 ml
de H2O destilada.
2 ml de H2O:Acetonitrilo (80:20).
DEJAR SECAR TRES MINUTOS BAJO VACÍO.
5. Elución.
Eluir 2 veces con 1 ml de metanol.
6. Secado del eluido

Secar bajo N2 .
7. Hidrólisis
Hidrólisis ácida: Disolver el residuo en 0,1 ml de metanol.

Adicionar 5 ml de acetato de etilo (con 0,1 ml de H2SO4).
Calentar a 50°C por 5 minutos, ó 37°C 18 horas.
Lavar con dos porciones de 5 ml de NaOH 2M, luego hacer un lavado con solución
saturada de NaCl.
Evaporar.
8. Derivatización.
Disolver el residuo el residuo en 100 µl de cloroformo; adicionar 100 µl de N,O-
bis(trimetilsilil) acetamida y 20 µl de trimetilclorosilano; calentar por 2 horas a 60°C.
Disolver en undecano ó dodecano.
6. Procedimiento de extraccion de Boldenona (B), 19-Nortestosterona (NT),

Testosterona (T), de muestras de orina, usando columnas SPE C18 (BAKER).
A 5 ml de orina agregar:
(B)-(NT): 5 ml de metanol:acetato de amonio 0,65 M (pH=5,4 con ácido acético
glacial) 20:80.
(T): 5 ml de acetato de amonio 0,024 M (pH=5,5 con ácido acético glacial)
2. Acondicionamiento de la columna.
Acondicionar la columna con 2 ml de metanol y 1 ml de acetato de amonio 0,024 M
pH= 5.5.
Eluir a una velocidad de : 1 a 2 ml/minuto.
1 ml de acetato de amonio 0.024 M, pH=5.5; seguido de:
(B)-(NT): 2 ml de metanol:acetato de amonio 0,024 M, pH=5,5 (40:60).
(T): 2 ml de metanol:acetato de amonio 0,024 M, pH=5,5 (45:55).
5. Elucion de drogas ácidas y neutras.

(B)-(NT): Eluir con 5 ml de metanol: H2O (35:65).

(T): Eluir con 5 ml de metanol: H2O (40:60).
6. Secado del eluato.

Secar bajo N2 .
7. Hidrólisis
Hidrólisis ácida
Diluir el eluato con 2 ml de metanol y evaporar bajo N2 a 60°C.
Disolver el residuo en 0.1 ml de metanol.
Adicionar 5 ml de acetato de etilo (con 0,1 ml de H2SO4).
Calentar a 50°C por 5 minutos, ó 37°C 18 horas.
Lavar con dos porciones de 5 ml de NaOH 2M, luego hacer un lavado con solución
saturada de NaCl.
Evaporar.
8. Derivatización.
Disolver el residuo el residuo en 100 µl de cloroformo; adicionar 100 µl de N,O-
bis(trimetilsilil) acetamida y 20 µl de trimetilclorosilano; calentar por 2 horas a 60°C.
Disolver en ciclohexano.
6.9.3 Consideraciones prácticas durante la extracción en fase

sólida.
Verificar el pH de la muestra. Los analitos que no estén en forma apropiada (es

decir, neutro o cargado), no se unirán en forma efectiva al adsorbente y darán como
resultado recuperaciones erráticas.
El relleno no debe secarse entre los pasos de acondicionamiento o antes del agregado
de la muestra.
Asegurarse de solvatar correctamente las columnas. Se debe aplicar cada solvente
inmediatamente despues del agregado del anterior (no debe haber espacio entre solventes).
Los cartuchos acondicionados incorrectamente, darán lugar a recuperaciones
erráticas.
Antes de la elución es necesario que los cartuchos esten perfectamente secos. Así se
asegurará una recuperación óptima del analito.
Para confirmar la sequedad de la columna, presionar los lados del cartucho en el nivel
del relleno durante la etapa de vacío máximo. Las columnas se deben sentir a temperatura
ambiente, no fresca, ya que en este caso, puede haber agua todavia.
Utilizar siempre NH4OH recién preparado en el caso de usar solventes básicos en la
elución. El pH de elución (11-12) es crítico para alcanzar la óptima recuperación de drogas
básicas con altos pKa (anfetaminas, algunos tricícliclos, morfina, etc.). el NH4OH pierde
rápidamente su título cuando esta expuesto al aire y puede conducir a bajas recuperaciones.
El NH4OH es más soluble en iso-propanol que en CH2Cl2 .Para asegurar la mezcla
completa de los solventes de elución agregue NH4OH en isopropanol y luego el CH2Cl2.
Algunas drogas son lábiles al calor, por lo que pueden degradarse si son calentadas.
Supervisar de cerca que la elución sea a seco, para evitar pérdidas del analito.
Cuando el ensayo está a niveles de sub-nanogramos, se recomienda el
preacondicionado del cartucho de extracción con el solvente de elución. Aspirar luego el
solvente de elución antes de continuar con el acondicionamiento normal de la columna.
Guía rápida para seleccionar un metodo de derivatización.
Grupo funcional
Derivatización
-OH :oxhidrilo en alcoholes primarios, Sililación

secundarios y terciarios; fenoles; Acilación
carbohidratos. Benzoilación
Alquilación
Dansilación
Formación de par iónico
-COOH :ácido carboxílico. Esterificación
Sililación
-C=O : carbonilo en aldehildos y cetonas Formacion de oxima
Formacion y silación de oxima
Formación de cetal/acetal
Formación de hidrazona
Formación de base de Schiff
Sililación
-NH2 : amino en aminas primarias, Acilación

aminoácidos, azúcares amino. Benzoilación
Sililación
tratamiento con CS2
Formación de tiourea
Formación de base de Schiff
2,4-dinitrofenilación
Formación de sulfamida
Formación de carbamato
Tratamiento con piridoxal
Alquilación
-NH-R : amino en aminas secundarias, Acilación
ácidos del imino, azúcares amino Benzoilación
sustituídos. Sililación
2,4-dinitrofenilación
Formación de sulfamida
-NH2 y –COOH : en aminoácidos Sililación
Esterificación + acilación
-NO2 : compuestos nitro No necesita derivatizar
6.10 Técnicas de extraccion Líquido- Líquido.
6.10.1 Procedimiento de extracción líquido líquido convencional para la

investigacion de p- hidroxiefedrina de muestras de orina.
50 ml de orina. Llevar a pH=9 con NaOH 30%.
2. Extracción.
Agregar 100 ml de Cloroformo: Eter Etílico (2:1)
Agitar enérgicamente.
CENTRIFUGAR.
Separar y desechar la fase acuosa.
3. Secado.
Evaporar el solvente con corriente de N2.
4. Siembra y corrida cromatografica

Retomar con Etanol: Cloroformo (50:50) + 3 gotas de HCl.
Sembrar en Placa de Sílica Gel (junto a un testigo) y correr con:
Mezcla de corrida 1 Mezcla de corrida 2

Etanol: 60 Cloroformo: 90
Cloroformo: 10 Metanol: 10
HCl: 3 gotas
Saturado con H2O
5. Revelado.
Secar la Placa.
Asperjar con:
Ninhidrina al 1% en acetona. Calentar bajo corriente de aire caliente 10
minutos.
2,6-dicloroquinona-4-cloroimida 5% en etanol.
Solución de Carbonato de sodio 5% en agua
Manchas azules: probable positivo
6.10.2 Procedimiento de extracción líquido líquido convencional para la

investigación de Clenbuterol en muestras de orina.
50 ml de orina. Llevar a pH=12 con NaOH 30%.
2. Extracción.
Agregar 100 ml de éter de petróleo.
Agitar en un extractor rotatorio durante una hora.
3. Secado.
Transvasar la fase orgánica a un matraz y evaporar en rotavapor cuidando que la
temperatura del baño no supere los 40 ºC.
3. Siembra y corrida cromatografica.
Retomar para sembrar con Acetato de Etilo
Sembrar en Placa y correr con:
Mezcla de corrida 1 Mezcla de corrida 2

Acetato de Etilo: 80 Acetato de Etilo: 80
Metanol: 10 Metanol: 10
Acido Acético Glacial 5 NH3 5
5. Revelado.
Secar la placa y derivatizar:
Colocar la placa sobre un soporte, en una cuba que contiene HClc, de modo que
quede expuesta a los vapores del ácido. Añadir a la cuba una pequeña cantidad de
NaNO2, dejar expuesta la placa a los vapores durantes 4-5 minutos.
Retirar la placa con una pinza. Asperjar con N-( 1 –naftil) etilendiamina (0.5% en
Metanol)
Manchas fucsia:probable positivo
6.10.3. Procedimiento de extracción líquido líquido convencional para la

investigación de Fenilbutazona en muestras de orina.
Colocar en tubo de ensayo 5 ml de orina. Llevar a pH: 2 – 3 con acido fosfórico.

2. Extracción.
Agregar 5 ml de la mezcla de extracción Hexano: Eter etílico (60:40). Agitar.

Centrifugar.
3. Secado.
Transvasar la fase orgánica a un vaso de precipitados y evaporar a sequedad.
4. Siembra y corrida cromatografica.

Retomar para sembrar con Cloroformo y sembrar en banda en una placa de Silicagel
F254 junto con testigo.
Solvente de corrida: Tolueno: Metanol: Acido acético glacial (42: 7: 1)
5. Revelado.
Observar bajo luz UV 254 nm y 366 nm.
Rociar con cloruro férrico y exponer al calor. Manchas rosas indican probable
positivo.
6.10.4 Extracción de Xantinas de muestras de orina usando columnas de tierra

de diatomeas (tipo EXTRELUT®MERCK).
20 ml de orina, (se puede agregar estándar interno, preferible deuterado) llevar a
pH=6 con NaOH 30%. Verificar pH 6,0 ± 0,5.
2. Preparación de la columna.
Cargar un cartucho con la tierra de diatomeas ó sílice (100 gramos).
Adición de la muestra.
Agregar la muestra (no más de 20 ml).
Dejar 20 minutos.
5. Extracción.
Agregar 100 ml de Cloroformo : metanol (60:40).
Recoger el eluído en forma lenta.
6. Secado.
Pasar a matraz y evaporar en rotavapor
7. Siembra y corrida cromatográfica.

Retomar con metanol.
Inyectar en el GC-MS.
Las técnicas de extracción líquido líquido convencional, se pueden adaptar y poner a punto
con técnicas de extraccion líquido-líquido sobre soporte silíceo inerte (probando distintos
solventes y mezclas de extracción)
Bibliografía.
Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica. Goodman and Gilman McGraw-Hill

Interamericana Editores, 1996.
Isolation and Identification of Drugs. Clarke´s Editorial Staff, 1986.
Farmacología y Terapéutica Veterinaria. Booth McDonald. Editorial Acribia, S. A. 1987.
American Hospital Formulary Service 98. Drug Information. 1998.
Proceeding of the 9th International Conference of Racing Analysts and

Veterinarians. New Orleans 1992.
Forty First Yeneb Pty Ltd, Dr. Philip Swann. Australia. 1990
Drugs and The Performance Horse. Thomas Tobin . Charles Thomas Publisher. Illinois,
USA. 1981.
Clínicas Veterinarias de Norteamérica. Practica Equina. Gordon W. Brumbaugh y Lloyd E.

Davis. Editorial Intermédica 1995.
The Merck Index. Twelfth Edition. 1996.
Screening and confirmation of drugs in horse urine by using a simple column extraction
procedure. Ashok K. Singh, M. Ashraf, K. Granley, U. Mishra and M. Madhusudana Rao.
Journal of Chromatogrphy, 473 (1989) 215-226.
Capítulo 7
Pesticidas.
Autor:
Cristian Oliver.
Perito de la Sección de Toxicología del Laboratorio Químico Pericial de la Dirección General
de Policía Cinetífica de la Policía de la Provincia de Buenos Aires.
7. Introducción.
La exposición a los pesticidas constituye un problema de importancia creciente.

Estas sustancias se hallan por doquier, en nuestros alimentos, en el hogar y virtualmente en
cualquier ambiente desde que comenzó su utilización. Las estadísticas del uso a nivel
mundial son relevantes a este respecto: según la Organización Mundial de la Salud (OMS)
el 45 % de los pesticidas son herbicidas, 32 % insecticidas (10 % de ellos
organofosforados), el 18 % fungicidas y el 5% a otros, siendo su consumo de millones de
toneladas por año.
En dos informes de la Organización Mundial de la Salud (OMS, 1985 y 1990) se

afirma que durante los años 80 se han producido en el mundo entre uno y tres millones de
intoxicación agudas por plaguicidas cada año, con un resultado en más de 20000 muertes,
el 99% de éstos hechos ocurren en países en desarrollo. Muchas de estas intoxicaciones
afectan simultáneamente un número variable de individuos, por lo que pueden clasificarse
como epidémicas. La OMS (1990) estimó que la incidencia anual por envenenamiento
agudo no intencional fue cercana a 1 millón de personas con una mortalidad de
aproximadamente 1%. La mayoría de los envenenamientos no intencionales son de tipo
ocupacional. Estudios poblacionales realizados en 17 países arrojan una incidencia de
intoxicación no intencional de 0,3 a 18 por 100.000. Según la OMS un plaguicida se define
como “cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir o controlar toda
especie de plantas o animales indeseables, abarcando también cualquier sustancia o
mezcla de sustancias destinadas a ser utilizadas como reguladoras del crecimiento vegetal,
como defoliantes o desecantes”.
Como podrá observarse a partir de la introducción, el término pesticida involucra una

compleja familia de compuestos, de origen químico diverso, por lo cual resulta difícil
sistematizar su análisis, existiendo numerosas técnicas específicas para el aislamiento e
identificación de cada compuesto en particular. Una clasificación sencilla mostrará la
diversidad de sustancias involucradas, como puede verse en la Tabla 7.I. Las tablas de
compuestos no son exhaustivas, con sustancias que se han dejado de utilizar pero que aún
existen en cantidades residuales en el ámbito doméstico como la estricnina o los
organoclorados. Debido a sus diferentes características físicas y químicas se tratarán en
forma separada. Los plaguicidas se dividen en compuestos de síntesis, naturales,
inorgánicos y organometálicos.
Tabla 7.I: Clasificación Química de los Plaguicidas más utilizados.
Organoclorados
Halogenuros de Bromuro de metilo,
hidrocarburos cloropicrina.
alifáticos
Hidrocarburos
aromáticos
halogenados
Grupo del DDT DDT, Metoxicloro
Grupo del Isómeros alfa, gama
Hexaclorobenceno (lindano)
Grupo del Aldrín Derivados del Aldrín, Dieldrín, Isodrín
(ciclodienos) dimetanonaftaleno
Derivados del Clordano, Heptacloro
indano
Der. del biciclo- Endosulfán. Bromodán
heptano
Terpenos Clorados Toxafeno, PCB (No

son plaguicidas
sino productos
técnicos.
Fenoxiácidos Utilizados como MCPA. 2,4-D, 2,4,5-T

herbicidas
Policloruros Herbicidas. DCA, TCA, Dalapon
Acidos Compuestos 2,3,6-TBA

Policlorobenzoicos activos sobre
Raíces.
Organofosforados
O X = grupo saliente. Es el
principal responsable de la
R O P O X
O toxicidad.
Grupo O=S Tionofosfatos R= Alcano Malatión, Dimetoato,

Forato.
R= Alqueno
Diclorvos (DDVP).
R= Aromáticos
Paratión, Diazinón.
R= Pirofosfatos
TEPP
Grupo OR = SR Tiolfosfatos
Grupo P = S y OR = SR
Ditiofosfatos
Grupos OR donde R es un radical
alquilo = fosfonatos
Grupos OR donde R = halógeno
= Halogenofosfoidatos
Grupo OH = NH2 Amidofosfatos
7.2 Pesticidas Organoclorados.
Estos compuestos son básicamente hidrocarburos cíclicos, generalmente poco

volátiles y caracterizados por una gran persistencia en el medio ambiente. Su estructura
química basada en uniones C-C y C-Cl resulta químicamente inerte, excepto en forma muy
lenta por acción de la luz UV y algunos pocos microoganismos.
Son poco solubles en agua y marcadamente liposolubles, acumulándose en

ambientes hidrofóbicos como tejidos grasos y la materia orgánica del suelo. Algunos de los
compuestos clásicos se observan en la Fig 1.
Fig 7.1. Compuestos organoclorados
En el hombre, al igual que en el medio ambiente, se degradan lentamente y tienen

una gran afinidad por los tejidos grasos, como el tejido adiposo y el sistema nervioso. Esto
resulta de importancia médica en caso de adelgazamiento brusco debido a que pasaban a la
circulación general y producían síntomas de intoxicación aguda. Asimismo, cantidades
considerables se transfieren de la grasa corporal a la leche, quedando los recién nacidos
expuestos al recibir la leche materna, siendo capaces además de atravesar la placenta.
Estos compuestos son absorbidos por vía digestiva, inhalatoria y dérmica. La

eficiencia de la absorción dérmica es variable, dependiendo del vehículo en que se hallan
disueltos. Compuestos como el hexaclorociclohexano (HCH) y su isómero ϒ el lindano, los

ciclodienos (aldrin, dieldrin, endrin, clordano, heptacloro) y endosulfan son absorbidos
eficientemente a través de la piel, mientras que compuestos tales como dicloro-difenil-
tricloroetano (DDT), dicofol, marlato, toxafeno y mirex son absorbidos significativamente
menos.
La presencia de abrasiones en la piel resulta importante pues aumenta la absorción,

especialmente en el caso de niños afectados de pediculosis. La grasa y los solventes
hidrocarbonados aumentan la absorción gastrointestinal y dérmica de los clorados. Si bien
no son compuestos altamente volátiles, los aerosoles y polvos particulados contribuyen a
una incorporación significativa por vía respiratoria. Luego de la exposición (resulta notable
en el caso del DDT) una parte importante de la dosis absorbida se almacena en el tejido
graso sin modificaciones metabólicas del compuesto de origen.
La mayoría de los clorados sufren un proceso de deshalogenación, oxidación y

posterior conjugación. La ruta principal de excreción es por la vía biliar, aunque
prácticamente todos producen metabolitos urinarios medibles. Desafortunadamente muchos
de estos pesticidas se reabsorben por circulación enterohepática sin metabolizarse,
retardando la excreción fecal.
La metabolización del DDT y DDE (un producto de degradación del DDT), el

hexaclorociclohexano, dieldrin, el epóxido del heptacloro y el mirex tiende a ser lenta,
conduciendo al almacenamiento en la grasa corporal.
El caso opuesto lo representan el lindano, metoxicloro, aldrin, endrin, clorobenzilato,

dicofol, toxafeno, pertano y endosulfán, los cuales son metabolizados rápidamente
resultando menos probable detectar sus residuos en la grasa corporal, sangre o leche.
La principal acción tóxica de los organoclorados se desarrolla sobre el sistema

nervioso, donde producen un estado de hiperexcitabilidad en el cerebro. Se sabe que los
clorados actúan sobre el SNC alterando la cinética de los iones Na, K y Ca a través de la
membrana del axón. En el caso particular del DDT y análogos, estos prolongan el tiempo de
apertura de los canales de Na, mientras que el lindano, toxafeno y ciclodienos inhiben el
flujo de cloruro regulado por el neurotransmisor GABA.
Existen cuatro mecanismos propuestos de acción sobre la membrana neuronal para

el DDT:
1. Afectando la permeabilidad del ión K+ disminuyendo su transporte a través de los poros.
2. Interfiriendo el transporte activo de Na+ dejando el canal abierto durante la
repolarización.
3. Inhibiendo la enzima ATPasa neuronal, en particular las Na-K-ATPasa y Ca-ATPasa, las
cuales desarrollan un rol vital en la repolarización.
4. Inhibe la habilidad de la calmodulina para transportar iones Ca.
La inhibición de estas funciones reduce el tiempo en que ocurre la repolarización y

aumenta la sensibilidad de las neuronas a pequeños estímulos.
En el caso de los ciclodienos estos bloquean la actividad gabaérgica, resultando en un

repolarización parcial de la neurona y un estado de excitación no controlada. También son
potentes inhibidores de la Na-K-ATPasa, la cual es esencial para el transporte de de Ca a
través de la membrana.
La elevada concentración de clorados en los tejidos incrementan la irritabilidad

miocárdica, predisponiendo a la arritmia cardíaca. Existe considerable interés en la
interacción de los clorados con receptores endocrinos, especialmente los receptores de
estrógenos y andrógenos.
Los síntomas más comunes son convulsiones de tipo mioclónico y a menudo temblores
violentos. Otros síntomas más leves pueden ser parestesias, temblores, ataxia e
hiperrreflexia.
Actualmente se hallan en desuso, si bien debido a que son químicamente muy

estables, no es raro encontrar casos de suicidio con productos que han sido almacenados
en el ámbito doméstico por décadas.
7.3 Organofosforados.
En 1932 el desarrollo de los insecticidas organofosforados se inició con las

observaciones de Lange y Kreuger en Alemania. Ellos demostraron que los vapores de
ciertos compuestos fosforados eran capaces de producir intensos efectos colinérgicos en los
seres humanos. Durante la Segunda Guerra Mundial, tanto los Aliados como Alemania
dedicaron un considerable esfuerzo al desarrollo de estos compuestos para su utilización en
la guerra química, generando una serie de compuestos conocidos genéricamente como
gases nerviosos.
Estos compuestos son ésteres del ácido fosfórico o tiofosfórico, lo que permite varias
combinaciones en forma de ésteres y sustituciones de O por S (Fig 7.2). Son poco solubles
en agua y solubles en hidrocarburos. A diferencia de los clorados, estos compuestos
muestran una marcada tendencia a la hidrólisis en medio acuoso, siendo esta
descomposición fuertemente influenciada por el pH. Si bien pueden ser bastante estables a
pH neutro, casi todos son hidrolizados en medio alcalino y a pH menor de 2. En promedio,
desde el punto de vista de su extracción, conviene considerar un rango óptimo de
estabilidad entre 5 y 7. En el caso de los amidofosfatos estos se hidrolizan a pH menor de
cinco.
Su acción tóxica se ejerce inhibiendo en forma irreversible la enzima

acetilcolinesterasa, pero se cree que no es la única responsable de los efectos tóxicos.
Los fosforados afectan a los insectos y mamíferos específicamente por la

fosforilación de la enzima acetilcolinesterasa en las terminales nerviosas. El resultado es
una pérdida de la acetilcolinesterasa disponible por lo que la terminal permanece
hiperestimulada por un exceso de acetilcolina (AC). La enzima tiene una función crítica en la
trasmisión del impulso nervioso desde la fibra nerviosa hacia el músculo liso y esqueletico,
células glandulares y ganglios autonómicos, así como dentro del SNC. Los organofosfatos
son absorbidos eficientemente por inhalación, ingestión y por vía dérmica.
La exposición a insecticidas organofosforados y carbamatos resultan en inhibición de
la colinesterasa, siendo irreversible en el caso de los fosforados y reversible para los
carbamatos. Estos pesticidas se combinan con la acetilcolinesterasa en las terminales
nerviosas del cerebro y el sistema nervioso, al igual que con otras colinesterasas
encontradas en la sangre. La disminución de la actividad de la colinesterasa produce
finalmente los síntomas de intoxicación.
Los seres humanos poseen tres tipos de colinesterasas: la colinesterasa eritrocitaria,

la plasmática (llamada pseudocolinesterasa) y la cerebral. Las enzimas eritrocitaria y
cerebral son idénticas, mientras que la variante plasmática se sintetiza en el hígado. Al

realizar una prueba de actividad colinesterásica en una muestra de sangre se detectan dos
tipos de colinesterasas, la plasmática y la eritrocitaria. Se considera que la colinesterasa
plasmática es un indicador útil para detectar exposiciones a organosfosforados en forma
temprana, mientras que la enzima eritrocitaria evalúa mejor la exposición crónica.
S S
H3C O P O NO2 C2H5 O P O NO2
O O
CH3 C2H5
Metilparation Paration
CH3
S
O
C2H5 O P O N
O N H3C O P O C
H
CCl2
CH3 O
C2H5
H3C CH3
Diazinon Diclorvos
Fig 7.2. Compuestos organofosforados.
En dosis suficientes, la pérdida de la función enzimática permite la acumulación de

AC en los nervios periféricos y centrales, específicamente en las uniones colinérgicas
neuroefectoras, uniones nerviosas en músculo esquelético y en los ganglios autonómicos
(efectos nicotínicos).
En las uniones nerviosas colinérgicas entre el músculo liso y las células gandulares,
la elevada concentración de AC provoca la contracción del músculo y aumento en las
secreciones (broncorrea y salivación excesiva). El exceso de AC en las uniones nerviosas
del músculo esquelético tiene efecto excitatorio (provocando la contractura del músculo), sin
embargo, también puede producir finalmente el debilitamiento o parálisis de la célula
muscular despolarizando la placa terminal. En el SNC las elevadas concentraciones de ACH
producen alteraciones sensoriales y en el comportamiento, incoordinación, depresión en la
función motriz y depresión respiratoria. El incremento en las secreciones pulmonares unidas
a la falla respiratoria suelen ser la causa de muerte. La recuperación depende en definitiva
de la generación de enzimas nuevas en los tejidos críticos.
Los organofosforados que se hidrolizan en el organismo para dar fosfatos de alquilo

y fenoles, con frecuencia pueden detectarse en la orina durante la absorción del pesticida y
hasta 48 horas después. En ocasiones, estos análisis resultan útiles para identificar con
certeza el pesticida al cual han estado expuestos. Estos análisis pueden demostrar la
absorción de organofosfatos en dosificaciones menores a las requeridas para disminuir las
actividades de la colinesterasa y mucho más bajas que las necesarias para causar señales y
síntomas; sin embargo, su presencia podría ser simplemente el resultado de organofosfatos
en la cadena alimenticia.
La metabolización del fosforado ocurre principalmente en el hígado variando el grado

de hidrólisis de un compuesto a otro. En el caso de ciertos organofosfatos cuya degradación
es relativamente lenta, puede ocurrir un almacenamiento temporal significativo en el tejido
graso. Compuestos tales como el diazinón y el metilparatión poseen una solubilidad
significativa en lípidos, lo cual permite el almacenamiento en tejidos grasos con una
toxicidad retrasada debido a la liberación tardía. Este efecto tardío puede ocurrir
atípicamente con otros organofosfatos, específicamente con la dicolorofentiona y con el
metildemeton.
Los siguientes compuestos producen una mayor inhibición de la

pseudocolinesterasa: clorpirifós, demetón, diazinón, diclorvós, malatión, mipafox y triclorfón;
una mayor inhibición de la colinesterasa eritrocitaria la producen el dimefós, mevinfós,
paratión y metilparatión. Cuando la acetilcolinesterasa es inhibida en forma irreversible por
un organofosforado, la restauración de la actividad enzimática depende del tipo de derivado
del ácido fosfórico y de la síntesis de nuevas moléculas de enzima.
Muchos organofosfatos se convierten con facilidad de tiones (P=S) a oxones (P=O).

La conversión ocurre en el ambiente bajo la influencia del oxígeno, la luz, y en el cuerpo,
principalmente por la acción de los microsomas hepáticos. Los oxones son mucho más
tóxicos que los tiones, pero se inactivan con más facilidad que éstos. Por último, tanto los
tiones como los oxones se hidrolizan en la unión éster para producir fosfatos de alquilo y
grupos salientes, los cuales son de relativa baja toxicidad. Estos se excretan o sufren una
transformación posterior antes de que el cuerpo los elimine.
Debe tenerse en mente que los fosforados sólo permanecen en sangre pocas horas
después de su entrada al torrente sanguíneo.
7.4 Carbamatos.
Los carbamatos son ésteres del ácido carbámico. El grupo amino puede estar
sustituído por grupos alquilo mientras que el oxhidrilo se esterifica con alcoholes alquílicos o
aromáticos. En los N-alquilcarbamatos (R-NH-CO-OAr) el grupo R puede ser uno o dos
grupos alquilos mientras que Ar suele ser un grupo fenilo. La acción suele ser
fundamentalmente insecticida mientras que N-arilcarbamatos poseen además una acción
herbicida.
Estos compuestos, al igual que la mayoría de los ésteres orgánicos, presentan

hidrólisis alcalina y ácida. Ingresan por todas las vías, incluyendo la piel. En general se
inactivan rápidamente en el organismo mediante reacciones de hidrólisis, desalquilación y
conjugación, eliminándose estos metabolitos por vía urinaria. La acción tóxica se desarrolla
al igual que en los fosforados, sobre la acetilcolinesterasa aunque la inhibición en este caso
es reversible y puede ocurrir in vitro en la muestra de sangre.
Los ésteres de carbamato de N-metilo causan carbamilación reversible de la enzima

acetilcolinesterasa, lo que permite la acumulación de acetilcolina. La combinación carbamil-
acetilcolinesterasa se disocia más rápidamente que el complejo fosforil-acetilcolinesterasa
producido por los compuestos organofosfatados. Esta labilidad tiene varias consecuencias
importantes: (1) tiende a limitar la duración del envenenamiento con insecticidas del tipo
carbamato N-metilo; (2) es responsable que el intervalo que existe entre la dosis que genera
los síntomas y la dosis letal sea mayor que el existente en la mayoría de los compuestos
organofosforados; y, (3) con frecuencia invalida la medición de la actividad de la
colinesterasa en la sangre como indicador diagnóstico del envenenamiento.
Debido a que la reactivación de la colinesterasa puede producirse dentro de la

muestra mientras se espera su análisis, este debe realizarse de inmediato o puede
obtenerse un valor menor que el real. Los carbamatos no atraviesan la barrera
hematocefálica por lo que no producen síntomas centrales. La determinación de
colinesterasa cuando se sospecha una intoxicación con carbamatos debe ser rápida, antes
de una o dos horas.
7.5 Piretrinas y Piretroides.
En su forma natural, las piretrinas se hallan presentes en las flores del

Chrysanthemum cinerariefolium. Estos compuestos han sido mejorados por síntesis
química, confiriéndoles mayor estabilidad química y se los denomina genéricamente
piretroides. Se conocen dos grupos diferentes de piretroides:
- Tipo I: Piretroides que conservan la estructura que contiene el anillo ciclopropano

(característico de las piretrinas naturales y carece del grupo alfa-ciano en su molécula),
por ejemplo la permetrina, cipermetrina, deltametrina, etc.(Fig. 7.3).
- Tipo II: Piretroides en los que el anillo del ciclopropano ha desaparecido, contando con
un grupo ciano como el fenvalerato, fluvalinato, flucitrinato, etc.
Es muy importante la isomería cis-trans debida a la presencia del doble enlace del
grupo vinilo en cuanto a su toxicidad y metabolización. Estos compuestos son capaces de
penetrar por todas las vías, pero los efectos tóxicos sólo son posibles de observarse luego
de una considerable absorción por vía inhalatoria y digestiva.
La toxicidad sistémica por inhalación y por vía dérmica es baja. Aunque se observa
una absorción limitada por vía oral, ocurre una rápida biodegradación por las enzimas
hepáticas en mamíferos a través de la hidrólisis del grupo éster y la oxidación. La mayoría
de los metabolitos de los piretroides son rápidamente excretadas a través del riñón. Los
síntomas más severos de toxicidad ocurren a nivel de SNC, con convulsiones,
especialmente con los miembros más tóxicos del grupo, los ciano-piretroides (ej:
fenvalerato, flucitrinato, cipermetrina, deltametrina y fluvalinato).
R1 H H
O
H3C
CH3
H3C
O R2
CH3
H O
H
Fig. 7.3 Piretrina.
Los piretroides se metabolizan por hidrólisis del enlace éster formándose dos
mitades que se degradan y eliminan conjugados con ácido glucurónico y sulfúrico a través
de la orina. En las piretrinas se producen ataques oxidativos en varias posiciones de la
molécula en lugar de escindir el enlace éster. Los productos se pueden encontrar en la orina
y las heces.
El mecanismo de acción de los piretroides es bastante complejo, si bien se limita

fundamentalmente a las células nerviosas excitables (aquellas con sus canales iónicos
abiertos). A grandes dosis son capaces de despolarizar completamente la membrana
neuronal y bloquear su excitabilidad; a dosis menores retrasan el cierre de los canales de
sodio de la membrana del axón, con los cuales presentan gran afinidad. La unión produce
una corriente residual o cola, motivada por una lenta entrada de sodio durante los momentos
dinales de la despolarización, lo que se manifiesta como hiperexcitación del sistema
nervioso.
Los efectos se observan después de algunos minutos de la exposición, pero un

período de una a dos horas es lo más común. Suelen aparecer parestesias, acompañadas
de reacciones inflamatorias, posiblemente por contacto con las terminaciones nerviosas en
la piel. Las personas tratadas con permetrina por infestación con pulgas o moscas suelen
experimentar sensaciones de ardor o quemazón en el sitio de la aplicación.
Otros signos y síntomas de toxicidad incluyen sensaciones anormal en la cara,

salivación, atontamiento, fatiga, vómitos, diarrea e irritabilidad al sonido y al tacto. En casos
más severos, puede desarrollarse edema pulmonar y fasciculaciones musculares.
Los piretroides no son inhibidores de la colinesterasa, sin embargo, no es difícil

confundir el diagnóstico con la intoxicación por fosforados debido a su similitud con los
síntomas.
La ventaja de estos compuestos es que son relativamente no tóxicos para los

mamíferos, sin embargo esto depende de la vía de administración, debido a que por vía
sanguínea producen efectos similares a los clorados. La baja toxicidad se debe a que son
objeto de una rápida hidrólisis por estearasas y eliminados como productos inactivos. Debe
tenerse en claro que no es raro encontrarlos debido a que se utilizan en forma combinada
con carbamatos y fosforados.
7.6 Herbicidas.
Los derivados de la urea utilizados como herbicidas poseen una estructura básica
R1-NH-CO-R2. Los compuestos obtenidos utilizando dos nitrógenos en el anillo se
denominan diazínicos y triázinico con tres. Se consideran poco tóxicos, aunque son
utilizados con fines suicidas. Otro grupo importante de herbicidas lo componen las sales de
bipiridilo, las cuales están formadas por compuestos de amonio cuaternario, el paraquat y el
diquat.
7.6.1 Paraquat (Fig. 7.4).
+ +
Cl- H3C N N CH3 Cl-
Fig. 7.4: Paraquat.
Cuando se ingiere una dosis adecuada (LD50 en humanos es de 3-5 mg/kg) el

paraquat tiene efectos sobre el tracto gastrointestinal, riñón, corazón y otros órganos. La piel
ulcerada también constituye una vía de entrada. El órgano blanco del paraquat es el pulmón,
y los efectos sobre este son los responsables de sus efectos letales. La toxicidad por
inhalación, sin embargo, es rara. El mecanismo primario de daño se produce por la
generación de radicales libres y daño oxidativo en el tejido pulmonar.
El daño causado por el Paraquat se debe principalmente a la peroxidación lipídica de

la membrana y a la depleción del NADP. Este nucleótido es el encargado del transporte de
electrones hacia la fosforilación oxidativa, por lo que al estar disminuída su concentración,
prácticamente no hay síntesis de ATP. En otras palabras, el Paraquat actúa reduciendo al
transportador de electrones NADP y luego este nucleótido es reducido por el oxígeno
molecular con la formación de superóxidos que luego, por un proceso de oxidorreducción
(en donde participan grupos metálicos) se convierten en peróxidos; estos peróxidos al
descomponerse en grupos oxihidrilo (por acción de una enzima peróxido dismutasa) van a
oxidar a los ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos de la membrana de los
diferentes organelos celulares, perdiendo con ello la permeabilidad de la membrana con el
consiguiente cese de transporte de membrana y luego, muerte celular. Este proceso se
conoce con el nombre de peroxidación lipídica de las membranas, y se muestra
esquemáticamente en la Fig. 7.5.
Fig. 7.5: Formación de especies de oxígeno reactivas y peroxidación de lípidos

insaturados.
Normalmente, en el metabolismo celular se están produciendo diferentes radicales

libres y la célula tiene su propio sistema de defensa ante los radicales superóxidos y
peróxidos: la enzima superóxido dismutasa y el ciclo del glutatión permiten convertir estos
radicales en agua; pero en la intoxicación, estos radicales están extremadamente
aumentados y debido a ellos, estos mecanismos fisiológicos se agotan.
La molécula de paraquat tiene mucho parecido con un receptor de membrana a nivel

alveolar. Por dicha razón, se considera que ocupa ese receptor y de allí su especificidad por
ese tipo de tejido, pero en general tiene predilección por aquellos tejidos con mayor
saturación de oxígeno como son los de los pulmones, el hígado y los riñones.
En las etapas tempranas, los principales síntomas son el edema pulmonar dentro de
las pocas horas luego de una exposición severa. El daño a largo plazo incluye fibrosis
pulmonar (usualmente de una a dos semanas después de la ingestión), siendo la causa más
común de la muerte.
Los neumocitos de tipo I y II parecen acumular selectivamente el paraquat,

produciendo a continuación la formación de radicales libres, peroxidación lipídica y daño
celular. La aparición de edema y tejido conectivo fibroso de cicatrización produce una severa
restricción al intercambio gaseoso, la que conduce a la muerte por asfixia.
Entre los síntomas más comunes asociados al paraquat se halla el dolor de cabeza,
fiebre, mialgia, letargia y coma. Suele observarse proteinuria y pancreatitis. La principal vía
de eliminación la constituye el riñón, por los que suele observarse además como
complicación la necrosis tubular y la falla renal.
7.6.2 Diquat.
+ +
N N
2 Br-
Fig. 7.6: Diquat.
La intoxicación con diquat (Fig. 7.6) es mucho menos común que aquella con
paraquat, por lo que se halla menos estudiada. A diferencia de aquel, el diquat absorbido
sistémicamente no es concentrado selectivamente en el tejido pulmonar, donde no se
observa en el tiempo fibrosis pulmonar. Otra diferencia importante es que el diquat tiene
efectos tóxicos severos sobre el SNC
Los casos de intoxicación aguda involucran nerviosismo, irritabilidad, combatividad
incapacidad para reconocer amigos o familiares y disminución en los reflejos. Estos
síntomas neurológicos pueden terminar en un coma, acompañado por convulsiones tónicas-
clónicas y la muerte. Los síntomas iniciales, igual que para el paraquat, indican daño
corrosivo a los tejidos, con sensación de quemazón en la boca, dolor en el pecho y
abdomen, náuseas intensas y diarrea. La principal vía de eliminación es la urinaria,
produciendo además daño renal con proteinuria y hematuria.
7.7 Clorofenoxiácidos.
El grupo conocido como clorofenoxiácidos, del cual el compuesto base es el ácido 2,4
diclorofenoxiacético (2,4 D) (Fig. 7.7), resultan moderadamete irritantes a la piel, ojos, tracto
respiratorio y gastrointestinal. Son bien absorbidos por el sistema digestivo y en menor
extensión por los pulmones. No se almacenan significativamente en la grasa corporal. La
ruta principal de excreción es la orina, con algo de conjugación de los ácidos, observándose
fuerte unión a proteínas plasmáticas. La vida media en humanos del 2,4 D varía entre 13 a
40 hs, comparada a las 24 hs del 2,4,5 triclorofenoxiacético.
Cl
O
O OH
Cl
Fig. 7.7 Acido 2,4 diclorofenoxiacético.
Las manifestaciones habituales de toxicidad sistémica se conocen a partir de la

clínica observada en casos de ingestión con fines suicidas. En estas situaciones, cuando el
desenlace es fatal, se observa falla renal, desbalance electrolítico y finalmente falla orgánica
total. La sintomatología inicial de la intoxicación a las pocas horas de ingestión consta
principalmente de vómitos y diarrea.
7.8 Rodenticidas Anticoagulantes.
Los rodenticidas anticoagulantes fueron desarrollado en 1940 como un agente para

el control de las poblaciones de ratas. Estas sustancias se dividen en tres generaciones: los
derivados de la 4-hidroxicumarina (warfarina), los derivados de la indanodiona y los
llamados superwarfarínicos.
El mecanismo de acción de todos los anticoagulantes es a través de la inhibición

competitiva la enzima vitamina K-epóxido reductasa. Esta enzima es responsable de la
regeneración de la vitamina K activa, la cual es esencial para la formación de los factores de
coagulación II, VII, IX y X.
La tabla 7.II y Fig 7.8 muestran un listado y fórmulas de algunos de estos

compuestos. Estos compuestos son absorbidos rápidamente a través del sistema
gastrointestinal aunque también pueden pasar a través de la piel. Estos agentes también
incrementan la permeabilidad capilar en todo el organismo, predisponiendo a una
hemorragia corporal diseminada.
La degradación metabólica de la warfarina y las indanodionas en ratas ocurre

principalmente por hidroxilación. En el caso de los superwarfarínicos la eliminación ocurre
principalmente como compuestos inalterados en bilis y heces. Se acumulan en hígado y

tejido graso. Las heces constituyen la principal vía de excreción.
Tabla 7.II: Rodenticidas
Rodenticidas anticoagulantes
Cumarinas de 1ra generación Warfarina
Cumarinas de 2da generación Brodifacoum
Bromadiolona
Coumaclor
Coumatetralil
Difenacoum
Indanodionas Fenidiona
Difendiona
Anisindiona
OH
H
H H
O
O
O CH3
Warfarina
O
R
R Alquil
Fenil
Clorodifenilacetil
Fig 7.8. Rodenticidas derivados de la warfarina y las indanodionas.
7.9 Selección de Muestras.
El toxicólogo se ve en la necesidad de investigar la presencia de pesticidas en las

más diversas matrices y situaciones: desde los recipientes utilizados en un suicidio, comida
envenenada, aire, aguas y suelos contaminados o muestras de fluidos biológicos.
Desde el punto de vista de la Toxicología, es importante señalar que las

formulaciones de plaguicidas además del principio activo incluyen sustancias que actúan
como vehículos, diluyentes como agua o solventes orgánicos, aditivos e impurezas de
síntesis, que poseen acción tóxica por sí mismas. En particular, debe cuidarse en el caso de
la ingestión de pesticidas, que durante el reflejo del vómito es usual que se produzca bronco
aspiración del mismo, produciendo los disolventes orgánicos depresión respiratoria a nivel
central y neumonía por aspiración. La búsqueda de estos compuestos se trata en el
capítulo 5.
El análisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas áreas:
-Forense
-Diagnóstico de urgencia
-Control de poblaciones expuestas y no expuestas.
-Contaminación ambiental.
Si el plaguicida fue causa de muerte, estará en alta concentración, al igual que en

una intoxicación aguda grave. En las dos últimas áreas se trabaja con muestras con niveles
muy bajos de plaguicidas (menores de 0,1 ppm), se habla de “residuos” de plaguicidas.
A continuación se detallan diversas muestras biológicas que se requieren para el
análisis de los pesticidas más importantes encontrados en nuestro medio. En el caso de
muestras ambientales, existen protocolos específicos dependiendo de la Legislación.
7.9.1 Pesticidas organoclorados.
En el caso de los pesticidas organoclorados, es posible identificar los compuestos

madre y/o sus metabolitos en la sangre mediante el análisis por cromatografía gas-líquido,
de muestras tomadas pocos días después de una absorción importante del pesticida.
Algunos pesticidas o sus productos (en particular el DDT, dieldrín, mirex, heptacloro,
epóxido, clordecona) persisten en los tejidos y en la sangre durante semanas y hasta meses
después de la absorción, pero otros pueden ser excretados en unos cuantos días, lo que
reduce la posibilidad de su detección. Los niveles sanguíneos tienden a correlacionarse más
con la toxicidad aguda, mientras que los niveles encontrados en el tejido adiposo y la leche
materna generalmente reflejan una exposición a largo plazo.
En el caso de los pesticidas organo clorados, la sangre es la muestra más adecuada

para la búsqueda ya que por su gran liposolubilidad rara vez aparecen en orina. Se obtienen
de 8-10 ml de sangre en tubo de centrífuga heparinizado. También pueden realizarse
determinaciones analíticas en muestras de contenido gástrico en los casos en que se
sospecha intoxicación aguda por la ingesta de este tipo de plaguicida.
También es importante recolectar los recipientes encontrados en el lugar del hecho

que pudieran contener restos de plaguicidas. No empaquetar los recipientes juntos para
evitar la contaminación cruzada por la volatilidad de los componentes.
Los métodos cromatográficos hacen posible la detección de la mayoría de los

cloruros orgánicos a concentraciones mucho más bajas que las que se asocian con un
envenenamiento agudo; por consiguiente, un hallazgo positivo sin la correspondiente
cuantificación en una muestra de tejido no justifica, por sí mismo, un diagnóstico de

envenenamiento.
7.9.2 Pesticidas organofosforados.
La muestra de sangre no resulta útil para identificar al fosforado responsable de una

intoxicación, por cuanto al exponerse a la sangre desaparecen relativamente rápido en
cuestión de horas según el compuesto. En este aspecto, los tiempos procesales para
analizar las muestras forenses no colaboran, resultando la muestra de orina más adecuada
para identificar los grupos salientes. La medición cuantitativa de la colinesterasa sólo puede
hacerse en muestras de personas vivas.
La distinción entre las diferentes clases químicas se torna importante cuando el

médico interpreta los exámenes de laboratorio. Esto podría ser especialmente importante
cuando el laboratorio hace un análisis del compuesto madre (e.j. clorpirifos en su forma
tiofosfato) en vez de en su forma metabolito (el clorpirifos será completamente metabolizado
a oxón después de la primer circulación hepática) debido a que se observaría un falso
negativo.
La muestra mas utilizada para la determinación de órganofosforados y sus

metabolitos es orina de 24 hs, obtenida en envase de vidrio y conservada en heladera.
Debido a la inestabilidad química de los fosforados ante los cambios de pH esta es una
variable que debe controlarse especialmente, entre 5 y 7. Los valores de pH extremo
producen la hidrólisis de muchos fosforados. Estas precauciones resultan más significativas
en el análisis cuantitativo de trazas.
La determinación de residuos se realiza, por un lado, en distintos tipos de alimentos,

principalmente de origen vegetal, productos cárnicos y aguas, y por otro lado en muestras
ambientales como aire, aguas superficiales y suelos.
También, como índice de la intoxicación, puede determinarse la actividad de las

colinesterasas sanguíneas: plasmática o eritrocitaria. Las pruebas de laboratorio para la
colinesterasa difieren entre sí, y los resultados obtenidos no pueden compararse
directamente, presentando incluso una fuerte variación en los valores hallados por un mismo
método entre distintos laboratorios, lo que implica que resulta conveniente realizar el
monitoreo en un mismo laboratorio. Los métodos aprobados son los siguientes: Michel,
micro-Michel, pH stat, Ellman, micro Ellman y algunas variaciones de estos.
La toma de muestra resulta esencial para una determinación correcta. Las

condiciones para obtener la muestra sanguínea tendiente a determinar la actividad de la
enzima acetilcolinesterasa son: recolectar en un tubo de 5 ml con EDTA o Heparina
(mínimo 3 mL), transportar en forma separada el plasma de las células a 2-8°C. Para el caso
de muestras pediátricas, se utiliza 2,0 mL de plasma separadas de las células y transportar
ambas refrigeradas a 2-8°C. Resulta importante no congelar las muestras. Las muestras
congeladas, refrigeradas durante 7 días, almacenadas a temperatura ambiente o
bemolizada resultan ser condiciones de rechazo de muestras.
Las siguientes personas deberían ser controladas regularmente con respecto a los
niveles de colinesterasa:
a) Personal que mezcla, carga, aplica, maneja o esta en contacto con pesticidas del tipo de
los organofosforados o carbamatos.
b) Cualquier persona que este en contacto con estos compuestos más de 30 horas a la vez
de un período de 30 días.
Con respecto a los niveles de colinesterasa, cada persona tiene su propia línea de
base a lo largo de su vida, y aún los valores normales varían sustancialmente dentro de un
individuo y entre individuos. El grado de exposición potencial a un pesticida se evalúa
adecuadamente cuando el ensayo se realiza comparando el valor obtenido después la
intoxicación con el valor de la línea de base del individuo. Este tipo de estudio sólo puede
realizarse efectivamente en personal que se halla expuesto constantemente por motivos
ocupacionales, debido a que puede obtenerse muestras basales antes de la exposición. La
determinación de valores de actividad excesivamente deprimidos pueden realizarse sin
pruebas de la línea de base, en general, una caída del 30 % es motivo de alarma.
Con respecto a la frecuencia de muestreo de la colinesterasa, el ensayo inicial

debería ser seguido por un muestreo regular al menos en forma mensual. En el caso de
trabajadores expuestos, la determinación debería hacerse cada vez que el trabajador en
contacto con fosforados enferme dentro de las 12 hs de la última exposición.
Entre los factores que deberían ser considerados para determinar la frecuencia de
muestreo se pueden hacer las siguientes consideraciones:
a) La extensión y severidad de la posible exposición. Esto varía con la toxicidad de los
pesticidas utilizados y la frecuencia de uso.
b) El tipo de trabajo realizado y la clase de equipamiento utilizado involucran diferentes
riesgos de exposición.
c) El equipamiento tiene importantes efectos sobre la seguridad del trabajador. Algunas
buenas prácticas de protección incluyen: uso de ropa y equipo de protección, ducha con
agua después de cada aplicación, evitar beber, comer o fumar en áreas contaminadas con
pesticidas y una rápida descontaminación despues de un derrame.
Las muestras de sangre utilizadas para establecer la línea de base deben obtenerse
de personas no expuestas fosforados durante al menos por 30 días. Para establecer una
línea de base estable se requiere al menos 2 muestras pre-exposición obtenidas en los
últimos 3 días pero a no más de 14 días. Si estos dos test difieren más de un 20 % es
necesario obtener una tercera muestra y promediar los dos valores más cercanos.
7.9.3 Pesticidas carbámicos.
La absorción de algunos insecticidas de carbamatos de N-metilo puede confirmarse

a través del análisis de la orina para buscar metabolitos específicos: alfa-naftol para el
carbarilo, isopropoxifenol para el propoxur, carbofurán-fenol para el carbofurán, aldicarb-
sulfona y aldicarb-nitrilo para el aldicarb. Estos análisis complejos, cuando están disponibles,
pueden ser útiles en la identificación del agente responsable y pueden ser utilizados para
seguir el curso de la excreción de carbamatos. Estos pesticidas presentan inestabilidad
química ante los cambios de pH siendo el mismo una variable que debe controlarse entre 5
y 7. Los valores de pH extremo producen la hidrólisis de muchos pesticidas carbámicos.
Los carbamatos se encuentran en orina de 24 hs, resultando también útil la

determinación de colinesterasa. La técnica de Ellman es considerada la mejor para detectar
la inhibición originada por los carbamatos.
También, los carbamatos se los halla en distintos tipos de alimentos contaminados,
principalmente de origen vegetal.
7.9.4 Rodenticidas.
La base de la detección del efecto de los anticoagulantes de los rodenticidas es la

prueba de la protrombina, aunque puede realizarse la determinación toxicológica en sangre,
hígado y heces. El aumento en los tiempos de protombina después de una dosis tóxica de
cumarinas o indanodionas resulta evidente dentro de las 24 hs, alcanzando un máximo en
los primeros 5 días. El pico plasmático después de una dosis de 1,5 mg/kg de warfarina se
alcanza entre las 2 a 12 hs, mientras que la depresión máxima del tiempo de protrombina
ocurre a las 36 o 72 hs posterior a la exposición. Los efectos farmacológicos fueron mayores
cuanto más lenta es la disminución en la caída de la concentración de warfarina plasmática,
con vidas medias en plasma de 42 hs (15-58 hs).
La absorción a nivel gastrointestinal es completa, no hallándose residuos en

contenido gástrico aún después de dosis masivas. Los metabolitos en animales incluyen 4-,
6-, 7- y 8-hidroxicumarina. La toma de muestra requiere del uso de una relación de 1:9 de
citrato de sodio al 3,8 % a sangre entera.
La determinación del tiempo de protrombina es el único parámetro útil para el evaluar

al intoxicado con rodenticidas warfarínicos. Las etapas iniciales se monitorean cada 6 a 12
hs cada 6 a 12 hs hasta recuperar el tiempo de protrombina, no obstante, los valores
pueden seguir bajos durante 3 o 4 meses. La determinación química del compuesto
involucrado sólo aporta alguna información con respecto al tratamiento con vitamina K.
7.9.5 Herbicidas.
Las muestras biológicas de elección para la detección de compuestos del tipo de los
clorofenoxiácidos lo constituye las muestras de sangre y orina empleando cromatografía
gaseosa. Estos análisis resultan útiles para confirmar y medir la magnitud de la absorción.
En el caso de envenenamiento por clorofenoxiácidos con síntomas de inconciencia la
concentración inicial en sangre alcanza valores de 1000 mg/L, debiendo recolectarse las
muestras de orina tan pronto como sea posible.
La magnitud de la eliminación urinaria depende del pH de esta, aumentando

significativamente a pH alcalino. En general la muestra de orina debe obtenerse dentro de
las 24-72 hs de exposición pues se eliminan en forma prácticamente completa dentro de ese
lapso. Los casos de trabajadores expuestos pero asintomáticos la concentración urinaria

raramente sobrepasa valores de 1-2 mg/Lt.
La determinación puede realizarse tanto sobre muestras biológicas (sangre, orina)

como sobre muestras de agua, suelos y vegetales. Existe un gran número de aplicaciones
disponbles en la bibliografía para grupos de herbicidas y compuestos en particular. Los
procedimientos de extracción líquido líquido citados como screening general son utilizables
también aquí.
En el caso del paraquat y diquat se halla disponible un test colorimétrico sobre las
muestras de orina, el test del ditionito. El ensayo se realiza de la siguiente manera: a un
volumen de orina, se agrega 0,5 ml de una solución al 1 % ditionito de sodio preparado en
hidróxido de sodio 1,0 N. Esperar un minuto. Un color azul indica la presencia de paraquat
en cantidad superior a 0,5 mg/l. Se debe acompañar de controles positivos y negativos. La
muestra de orina debe ser recolectada dentro de las 24 hs de la ingestión. El diquat produce
color verde.
7.10 Aislamiento y purificación de pesticidas.
Las técnicas aquí descriptas son genéricas, es decir, pueden considerarse un punto
de inicio. El cuerpo de bibliografía existente referido al tema es tan extenso que justifica de
por sí varios volúmenes de una obra especializada. En la práctica, pueden hallarse métodos
normatizados para cualquiera de estos compuestos en forma individual o como grupo
químico en los métodos publicados por la EPA (Environmental Protection Agency, USA), el
NIOSH (National Institute Organization of Safety Health) o la AOAC (Association of
Analytical Chemistry).
Las técnicas son aplicables en general para muestras de sangre, orina,

preparaciones comerciales y bebidas. Requiere de algunas modificaciones en el caso de
tejidos y contenido estomacal, debido al elevado contenido graso y proteico de estas
muestras. Debe tenerse en cuenta que la búsqueda de productos metabólicos suele quedar
relegada a centros de referencia, siendo más útil la evaluación de la intoxicación el ensayo
de colinesterasa para la intoxicación aguda.
El aislamiento y purificación de losa diferentes tipos de plaguicidas pueden resumirse

de la siguiente manera.
• Extracción líquido-líquido para Fosforados y Carbamatos: tratar la muestra de

sangre con dos volúmenes de acetona, homogenizar, centrifugar y utilizar el
sobrenadante para la extracción con n-hexano. Combinar los extractos y dejar
evaporar a temperatura ambiente. La metodología de extracción líquido-líquido
basada en tierras de diatomeas se utiliza con los mismos solventes. Estos extractos
son adecuados para un screening de Cromatografía en capa delgada (CCD).
• Extracción líquido – líquido para Clorados: agregar la muestra una solución de

ácido sulfúrico al 5 % v/v y tungstato de sodio al 10 % p/v. Filtrar el sobrenadante y
lavar el residuo con agua. Extraer con n-hexano y filtrar por sulfato de sodio para
eliminar el agua del extracto. Concentrar a temperatura ambiente y redisolver en
acetona. Estos extractos son adecuados para un screening de Cromatografía en
capa delgada (CCD).
• Extracción en columnas Extrelut NT: estas columnas contienen un relleno de ácido

silícico purificado poroso. El relleno actúa como soporte de la fase líquida, por lo que
formalmente es una extracción líquido- líquido y se aplican los mismos criterios y
solventes.
• Extracción en fase sólida: la muestra requiere algunos pasos adicionales de

preparación. En el caso de las muestras de sangre precipitar las proteínas
adicionando un solvente orgánico como acetonitrilo o metanol (usualmente dos
partes de solvente por cada parte de fluido biológico). No precipitar utilizando ácidos
o bases fuertes. La sonicación es una alternativa recomendable que no modifica el
analito. Sonicar la muestra de sangre por 15 minutos, agregar agua o buffer,
centrifugar y utilizar el sobrenadante para la extracción. Las columnas a utilizar
pueden ser basadas en C-18 si la muestra esta disuelta en una fase
predominantemente acuosa o en Florisil si es orgánica. El acondicionamiento de la
columna dependerá del fabricante.
A continuación se describen los protocolos de aislamiento y purificación de diferentes
tipos de muestras (biológicas y ambientales) a efectos de obtener un extracto purificado.
7.10.1 Muestras biológicas.
• Contenido Estomacal y Tejidos:
Existen dos variantes utilizadas comúnmente:
1. Método General:
Si la muestra es sólida o semisólida tratar con un volumen de agua, homogenizar

mecánicamente con ayuda de mortero o de un homogenizador de tejidos y agregar un
volumen igual de solución saturada de cloruro de calcio, o de cloruro de calcio sólido para
muestras muy diluidas. Controlar el pH y dejar al menos 12 horas en heladera a 4ºC y filtrar
por Whatman Nº 1. Utilizar el filtrado en cualquiera de los procedimientos anteriores.
2. Método de Fassi adaptado:
Extracción: En un vaso de precipitados se colocan 50 gr. de papilla de vísceras, bien

trituradas, se le agrega ácido tartárico sólido (como desproteinizante) hasta pH ácido y luego
sulfato de sodio anhidro mezclando hasta consistencia pastosa. La mezcla se seca bajo una
corriente de aire caliente.
El contenido del vaso se transvasa a un erlenmeyer con tapa esmerilada. El material

se extrae con 50 ml de éter de petróleo (punto de ebullición 40-60ºC) agregándolo hasta
cubrir la papilla. Agitar enérgicamente durante 60 segundos, repitiéndose el proceso dos
veces más. Dejar en reposo hasta una neta separación de las fases. Reservar la fracción
etérea para la investigación de plaguicidas.
Purificación: El extracto de éter de petróleo se trata con acetonitrilo saturado en éter

de petróleo; se lava y reextrae con agua (200 ml de agua destilada con 10 ml de solución
saturada de cloruro de sodio); la fase acuosa se descarta. Si el extracto permanece impuro
se realiza una purificación en columna con Celite 545. para ello, se prepara una columna (de
0,8 x 16 cm) y colocando en ella la muestra absorbida en el Celite a través de un embudo y
compactando el polvo tanto como sea posible con una varilla. Se prepara una segunda
columna (de 1,4 x 16 cm) con llave, llenándola con éter de petróleo. Posteriormente se
agregan 5 g de alúmina y luego 5 g de florisil, cubriendo finalmente con una capa de arena
limpia (lavada con ácido nítrico) de 2 a 2,5 cm de espesor, drenándose el solvente hasta que
el nivel del mismo alcance la parte inferior de la capa de arena.
Se inserta el extremo inferior de la columna de 0,8 cm en el extremo superior de la

columna de 1,4 cm. La columna pequeña que contiene los plaguicidas se eluye con 3-4 ml
de dimetilsulfóxido (DMSO) aplicando presión positiva. Abriendo la llave de la columna
pequeña se permite la entrada del DMSO en el Florisil, retirándose luego la columna
superior y comenzando la elución con 100 ml de éter de petróleo. Recoger el eluído en un
vaso de precipitado y evaporar suavemente a temperatura ambiente.
• Muestras de Tejido Adiposo.
Esta tipo de muestra se recomienda para estudios de exposición crónica a efectos de

detectar la acumulación de pesticidas clorados, aunque no es de uso común. Una vez
obtenida la muestra por biopsia se trata de la siguiente manera:
1. Obtener con jeringa calibre 18 una muestra de tejido graso subcutáneo de no menos
de 50 mg.
2. Homogenizar la muestra con acetona.
3. Saturar con NaCl sólido.
4. Extraer dos veces con cloruro de metileno.
5. Secar el extracto con sulfato de sodio.
6. El extracto orgánico puede someterse a una mayor purificación utilizando una
columna de Florisil.
• Muestras de Hígado
Mezclar 5 gr de material, homogenizar y extraer con cloruro de metileno:metanol 9:1

y luego filtrar. Sobre este filtrado se recomienda realizar una purificación posterior sobre
SPE o Florisil.
7.10.2 Muestras ambientales.
• Muestras vegetales por Cromatografía en capa delgada (CCD).
El material vegetal es macerado con el solvente hexano:isopropanol 70:30. Separar

la fase orgánica y remover los pigmentos utilizando una columna para realizar un clean-up
de los pigmentos. Esta columna consta de alúmina básica y sulfato de sodio anhidro en la
parte superior. El extracto se siembra directamente sobre la placa de sílica gel. Si existe
demasiada cera, tratar primero con acetonitrilo y filtrar el extracto nuevamente. La
sensibilidad es de aproximadamente 2 – 6 µg de cada sustancia activa. Realizar la
cromatografía empleando los solventes usuales.
• Muestras vegetales y alimentos (método A.O.A.C)
Preparación de la muestra:
Pesar 50 grs. de muestra sólida de forma tal que sea representativa de su totalidad.
En caso de ser una muestra líquida pasar a la extracción con acetonitrilo. Reducir las
cantidades según el tamaño de muestra y la concentración inicial supuesta. Picar la muestra
mediante el uso de dispositivos mecánicos de forma de reducir la muestra a trozos
pequeños. Recuperar la muestra en la forma lo más cuantitativa posible. No utilizar
recipientes de plástico sensible al acetonitrilo. Introducir la muestra en un erlenmeyer de 500
ml con tapa y agregar 200 ml de acetonitrilo y 10 grs. de Celite. Colocar sobre un agitador
magnético, agregar un buzo magnético y colocar todo bajo campana. Dejar agitando al
máximo durante 10 minutos. El extracto se filtra por succión en embudo Büchner de 12 cm
de diámetro provisto de un Kittasato de 500 ml. Medir en probeta el volumen final de este
filtrado. Una vez medido, transferir a una ampolla de decantación de 500 ml de capacidad.
Extracción:
La extracción se realiza con éter de petróleo. Medir 100 ml de éter de petróleo y

agregarlo a la ampolla. Agitar vigorosamente durante 5 minutos, cuidando en liberar el
exceso de presión cada tanto. Agregar entonces 10 ml de solución saturada de NaCl más
100 ml de agua. Extraer durante 1 minuto. Descartar la fase acuosa y lavar (extraer otra vez)
dos veces la fase orgánica con dos porciones de 100 ml de agua cada una. Descartar los
lavados y transferir la fase orgánica a una probeta de 100 ml con tapa. Agregar 15 grs. de
sulfato de sodio anhidro granular. No dejar la muestra en contacto con el sulfato más de una
hora o comenzará a ocurrir una significativa pérdida de pesticidas clorados por adsorción.
Purificación (Clean-up) por columna de Florisil:
El procedimiento que sigue consiste en pasar la muestra obtenida en el

procedimiento anterior por una columna rellena de Florisil, para luego hacer una elución
seriada con solventes de polaridad creciente. El Florisil (silicato de magnesio) debe ser
activado previo a su uso, calcinándolo en mufla a 675ºC durante 3 horas. No debe dejarse
expuesto a la humedad y se debe retirar del desecador el menor tiempo posible. En general,
el Florisil actúa reteniendo compuestos polares como pigmentos vegetales.
Preparar una columna de Florisil de diámetro interno 22 mm (aprox.), hasta una

altura de 10 cm. Colocar en la porción superior 1 cm de Na2SO4. Cargar la columna con 40 -
50 ml de éter de petróleo. Tener preparados erlenmeyer de 250 ml con tapa esmerilada (de
esa forma luego se podrá concentrar en rotavapor o baño maría). Cargar la muestra,
primero con pipeta de 10 ml, hasta obtener una columna de líquido de 2-3 cm. Eluir la
columna con:
1) 50 ml de una mezcla de éter etílico al 6% en éter de petróleo 30-60 0C. Tener

preparado con anterioridad erlenmeyers con tapa previamente lavados con acetona y
secados. Reservar uno como blanco de reactivos.
2) Cambiar el erlenmeyer y eluir con una mezcla 50 mL de éter etílico al 150 % en
éter de petróleo.
3) Ídem anterior pero con éter etílico al 50% en éter de petróleo.
La concentración de las muestras se realiza con rotavapor o plancha calefaccionada.
Cuando el volumen del extracto sea de menos de 5 mL detener la evaporación, y transferir a
matraces aforados de 10 mL. Lavar el erlenmeyer con pequeñas porciones de éter etílico
hasta alcanzar el aforo.
A) El primer eluato (6%) contiene los pesticidas organoclorados (Aldrin, BHC, DDE,
DDD, DDT, heptaclor, lindano, etc).
B) El segundo eluato (15%) contiene algunos pesticidas organoclorados (Dieldrin y
Endrin) y los pesticidas organofosforados como el diazinón, paratión y metilparatión.
C) El tercer eluato contiene el organofosforado malatión.
7.10.3 Muestras de Suelos.
Las muestras de suelos, si bien son comunes en el contexto de la toxicología

ambiental, suelen presentarse también en el caso de intentos de daño a la propiedad. Los
procedimientos son variados, pero involucran en general los siguientes pasos: suspender la
muestra en acetonitrilo-agua, sonicación, filtración y un procedimiento de aislamiento y
clean-up. Este puede constar de una etapa de extracción líquido-líquido con diclorometano
o, con mayor frecuencia de extracción en fase sólida.
Un procedimiento típico para el aislamiento en suelos consta de los siguientes pasos:
1. Pesar 5 gr de suelo.
2. Extraer durante 6 hs con 35 ml de metanol. La extracción se acelera sonicando
durante 30 minutos.
3. Después de la extracción agregar agua para llegar a un 75 % de metanol.
4. Acondicionar las columnas Si-RP18 con dos volúmenes de metanol puro.
5. Cargar 2 ml de muestra.
6. Eluir interferencias con 1% de metanol en agua.
7. Vaciar el metanol con aire a presión y eluir con n-hexano grado HPLC.
7.10.4 Muestras de Aguas.
• Método General de Extracción Líquido-Líquido:
Se colocan 750 ml de agua (muestra) en una ampolla de decantación de 1 litro. Se

agrega 25 ml de n-hexano. Se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se separan las fases y
se recoge la capa de n-hexano. Se efectúan 2 extracciones más con n-hexano y se reúnen
los extractos. Secar la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro. Filtrar y concentrar a baja
temperatura. Generalmente se hallan trazas de plaguicidas en agua, requiriendo un gran
volumen de muestra.de partida.
• Método de extracción empleando extracción en Fase Sólida:

Esta técnica se utiliza para muestras ambientales. La extracción se realiza utilizando

cartuchos descartables rellenos con el material presente en las columnas de extracción C18.
Se recomienda utilizar sólo conexiones de vidrio. Debido a que se requiere el pasaje de
grandes volúmenes de agua para concentrar los pesticidas (presentes en el orden de
trazas), es necesario utilizar bombas peristálticas en el lado de salida del cartucho (Fig 7.9).
El cartucho se acondiciona de la siguiente forma (según el tamaño y el fabricante):
- Acondicionar el cartucho con 3 mL de n-hexano, luego 3 mL de diclorometano y finalmente
3 mL de metanol.
- Acidificar 1000 mL de la muestra de agua con HCl a pH 2.
- Conectar la entrada del cartucho a la muestra de agua. Ajustar el caudal según el
fabricante.
- Después de 700 mL secar el cartucho con corriente de nitrógeno a 35°C durante 2 hs.
- Eluir con 2 mL de diclorometano, luego con 3 mL de metanol.
- Evaporar los eluatos combinados a sequedad bajo corriente de nitrógeno a 35°C.
- Disolver el residuo en 250 µL de acetonitrilo - n-hexano 95:5.
- Para obtener una solución blanco, eluir un cartucho sin utilizar y proceder según lo
indicado.
Separación e Identificación de los diferentes pesticidas.
Una vez obtenido el extracto orgánico purificado, este debe ser sometido a un
proceso de separación. Invariablemente, este resulta ser alguna de las formas de la
cromatografía: Planar (CCD), Líquida de alta perfomance (HPLC) o gaseosa (CG).
7.11.1 Cromatografía en capa delgada.
La determinación de fosforados, carbamatos y clorados en situaciones de

intoxicación aguda o suicida por cromatografía en capa delgada resulta adecuada en la
mayoría de los casos cuando se acompaña de la clínica. La determinación por medios más
sofisticados aporta poco para el tratamiento excepto cuando se carece de orientación en
casos de suicidio o intoxicación crónica.
La Cromatografía en placa delgada (CCD) resulta ser uno de los métodos de

tamizado más versátiles y económicos para analizar gran número de muestras de origen
diverso. Se utilizan a tal fin cromatoplacas de sílica gel con indicador fluorescente
utilizándose como solvente el sistema hexano:acetona 100:20 o
Ciclohexano:Cloroformo:Acetona (70:15:15). Resultan igualmente útiles para determinar la
posible presencia de fosforados, carbamatos, clorados y piretroides.
Una vez realizada la cromatografía planar, se somete la placa cromatografica al
proceso de revelado que permite diferenciar los distintos tipos de plaguicidas presentes en
la muestra por el valor de Rf y el color que se genera. Para ello existen diferentes tipos de
reveladores según el tipo de pesticida.
Fig. 7.9 Mecanismo para concentrar pesticidas presentes en agua por SPE.
• Revelado empleado para pesticidas Fosforados.
Los organofosforados reaccionan con el cloruro de paladio formando máculas de

color amarillo. La visualización se logra con luz UV de 254 nm y asperjando con una
solución débilmente clorhídrica al 0,5 % de cloruro de paladio (II). Se obtienen manchas
grisáceas sobre fondo débilmente parduzco. La sensibilidad es del orden de los µg.
Otra manera de revelar la presencia de pesticida
organofosforado es mediante el revelado empleando la Inhibición de la Colinesterasa. Para
ello, una vez corrida la placa, se la expone a vapores de bromo dentro de una cuba. El
bromo oxidará el azufre de la molécula de OP a oxígeno.
E tO S E tO O
P Br P
E tO O NO2 2 E tO NO2
O
Paration Paraoxón
En el hígado también ocurre la oxidación del plaguicida por las oxidasas

microsomales hepáticas, aumentando su potencial tóxico.
Luego de exponer la placa al aire para evaporar el exceso de bromo que interfiere en
el resto de la reacción, se hace una aspersión con la enzima Colinesterasa y se lleva a
estufa a 37ºC durante 30 minutos. La enzima se obtiene a partir de un homogenato de
hígado (lugar donde se sintetiza) o bien puede utilizarse suero o plasma fresco.
Resulta sin embargo más seguro y cómodo colocar la placa dentro de una cubeta
con la suspensión enzimática.
O
O C OH
CH3
O
Colinesterasa
HO C
CH3
acetato de α naftilo naftol
Luego de asperjar, la enzima se inhibirá en los sitios donde se encuentra el

plaguicida. Para evidenciarlo se pulveriza con acetato de alfa-naftilo/Fast Blue. El acetato de
alfa naftilo actúa como sustrato de la enzima y liberá el naftol. Luego este copula con Fast
Blue obteniéndose una mácula de color lila donde la enzima permanece aún activa.
O
+ N
N
+
N
OCH3 N
OCH
3
+
+ OH
N az oene fast b lue N
N
N H CO H CO
3 3
O (color lila)
Donde la enzima se inhibe debido al plaguicida no se produce la reacción, quedando

blanco. La placa se ve lila con manchas blancas.
Sensibilidad: 0,1 a 1 ng.
Interferencias: fenotiazinas, cocaína producen reacción positiva. Cuando es negativa se

puede descartar la presencia de OP; si es positiva debe confirmarse con otros revelados.
Esta técnica permite una identificación presuntiva del compuesto, y requiere al menos un
segundo solvente de corrida para una mejor identificación, así como un segundo reactivo de
revelado.
Revelado empleado para pesticidas Organoclorados:
Sembrar a partir de patrones de 0,5 µgr/µL una mácula de 10 µgr. La visualización se a

través de la aspersión con varios reactivos por ejemplo:
a) Difenilamina: por aspersión con una solución etanólica al 0,5 % de difenilamina y se

coloca aproximadamente 1 minuto bajo lámpara UV a 254 nm. Las sustancias
organocloradas presentes forman manchas de color violáceo o verdoso. La sensibilidad es
de 5 µgr.
b) Nitrato de Plata – Formaldehído: (dieldrin, aldrin y lindano).

Solución I: Nitrato de Plata 0,05M.
Solución II: Formaldeído 35%.
Solución III: solución de hidróxido de potasio en metanol 2 M.
Solución IV: preparar en momento una mezcla de partes iguales de peróxido de hidrógeno al
30 volúmenes a ácido nítrico al 65 % v/v.
Procedimiento: asperjar con I, dejar secar a temperatura ambiente 30 minutos, asperjar con
II y dejar secar 30 minutos. Asperjar con III y calentar 30 minutos a 130°C. Rociar con IV, y
dejar el cromatograma en la oscuridad 12 horas, y exponerlo a la luz del sol. Los
compuestos clorados aparecen como máculas verde oscuro sobre fondo gris claro.
c) Difenilamina: Cloruro de N,N-dimetil-1,4-fenilendiamonio.

Disolver 0,5 g de cloruro de N,N-dimetil-1.4-fenilendiamonio en 100 ml de etóxido de sodio
(1 g de sodio en 100 ml de etanol).
Procedimiento: luego de rociar con el reactivo sumergir la placa en agua destilada e irradiar
con luz UV. Esto provoca la liberación de halógeno el cual oxida el reactivo a un pigmento
llamado Rojo Wurster.
Revelado empleado para pesticidas carbámicos.
El revelado se realiza utilizando el reactivo tetrafluoroborato de p-

nitrobencenodiazonio, el cual produce máculas rojizas o azules.
7.11.2 Cromatografía Gaseosa (GC).
Para la investigación de los diversos plaguicidas el objetivo básico es la

determinación de la presencia e identidad del compuesto analizado. La técnica más
confiable es la cromatografía gaseosa con detector de masa, aunque el detector nitrógeno-
fósforo (NPD) y de captura electrónica (CE) son ampliamente utilizados. Las figuras 7.10a y
7.10b muestran los resultados de esta técnica en un caso de envenenamiento de canes con
un carbamato, utilizando un cromatográfo gaseoso Hewlett-Packard Serie II 5890 Plus con
detector de masa 5972 y una columa HP5.
La derivatización de los pesticidas es una técnica estándar para la determinación del

compuesto de origen y de sus metabolitos más polares, mejorando la calidad de los
cromatogramas y su límite de detección. Las condiciones operativas más comunes para el
análisis de Clorados y Fosforados por Cromatografía Gaseosa son:
Fig 7.10a. Cromatograma obtenido en la Sección de Cromatografía del Laboratorio

Químico Pericial La Plata empleando un Cromatógrafo gaseoso con espectrometría
de masa a partir de un alimento contaminado con carbofurano. El espectro obtenido
de uno de los componentes en el cromatograma fue comparado contra la biblioteca
que acompaña al software. El porcentaje de similitud es del 99 %.
Equipo: HP 6890 Series II Plus con MS.
Columna: HP-5, 30 m x 0,53 mm x 0,88 µm (Part no. 19095J-023).
Detector: MS.
Recolección de Datos: 3365 ChemStation con PC 486/33.
Condiciones Experimentales: Injección: Splitless, 1 µl, Purga delay, 3 min,
temperatura del inyector 240°C. Carrier Gas: helio, caudal 1,0 ml/min. Horno: 1) 100°C
(1 min) a 175°C con un gradiente de 20°C/min, 2) 235°C a 7°C/min, 3) 280°C (1 min) a
25°C/min.
Fig 7.10b. Espectro de masa correspondiente al carbofuran.
7.11.3 Cromatografía Líquida de Alta Perfomance (HPLC).
La técnica de cromatografía líquida de alta perfomance se aplica exitosamente a la

separación y cuantificación de pesticidas de todo tipo, siendo especialmente útil cuando se
trata de insecticidas termolábiles y de rodenticidas cumarínicos, de difícil resolución por los

otros métodos. La muestra suele purificarse por cualquiera de los métodos de aislamiento y
purificación antes descriptos, pero se recomienda utilizar la extracción en fase sólida, por
cuanto produce extractos más limpios y se alarga la sobrevida de la columna.
La utilización de la cromatografía líquida ha resultado invaluable en la determinación

de los derivados de la cumarina (rodenticidas de la familia de los warfarínicos y
superwarfarínicos) debido a que estos compuestos son poco estables durante el proceso de
extracción.
7.11.4 Determinación de pesticidas organofosforados y carbámicos

mediante la actividad Enzimática de la Acetil-Colinesterasa.
El método se fundamenta en que la enzima acetilcolinesterasa provoca la hidrólisis

de la acetilcolina en colina y ácido acético. Existen diversas variables en el mercado
• Ensayo de Michel.
Este método estima la actividad de la enzima, midiendo el cambio de pH a través del

empleo de un electrodo de vidrio. Otros métodos como el de W. Caraway, registra el cambio
de pH usando un indicador colorimétrico.
Tipo de muestras: Se trabaja con sangre heparinizada, aproximadamente 8 ml de

sangre, obtenida por venipunción (evitar la hemólisis), transferirla a un tubo heparinizado
(con una gota de heparina), tapar y agitar cuidadosamente por inversión.
Es conveniente separar el plasma de las células lo más pronto posible, cuando esto
no se pueda llevar a cabo, se debe refrigerar la muestra a 4ºC durante 2-3 horas (no es
conveniente por más tiempo).
• Procedimiento para la determinación de acetilcolinesterasa eritrocitaria.
Si la muestra fue refrigerada esperar a que alcance la temperatura ambiente.

Transferir 0,04 ml exactos de glóbulos rojos sedimentados a un matraz de 5 ml conteniendo
2 ml de saponina al 0,01 %, enjuagando la pipeta con la mezcla de saponina y glóbulos
rojos, hasta que todas las células se desprendan de la pipeta. Mezclar mediante vortex.
Una vez preparadas las muestras, añadir a cada tubo 2 ml de solución tampón
(para eritrocitos) y esperar 10 minutos. Determinar el pH de la solución hasta 0,01 de unidad
y anotarlo como pH1, (si la lectura es menor de 7,97 desechar la prueba y comenzar otro
ensayo con una solución tampón recién preparada).
Añadir 0,4 ml de solución 0,1 M de yoduro de acetil colina para eritrocitos, mezclar
con vortex y anotar como T1 el momento en que se añadió el yoduro , dejar reaccionar
durante 1 hora a temperatura ambiente, cumplido este tiempo determinar el pH de la
mezcla, se tomará como pH2 y el momento que se mide como T2. Los reactivos necesarios
se detallan a continuación:.
Solución tampón para globulos rojos:
Barbital sódico 0,2 N (4,1236 gr), fosfato de postasio diácido, 0,004 N (0,5444 gr) y
cloruro de potasio 0,6 N (44,736 gr). Disolver los reactivos en 950 ml de agua. Ajustar el pH:
8,10 exactamente a 25º C, con ClH 0,1 N (se requieren alrededor de 28 ml). Agregar gotas
de tolueno y guardar en refrigerador. Deberá comprobarse el pH y la capacidad de la
solución tampón cada vez que se va a usar ya que éstos valores tienden a variar con el
tiempo.
Dietilbarbiturato de sodio = Barbital sódico = Veronal sódico.
Ioduro de acetilcolina: Disolver 3,004 gr de Ioduro de acetilcolina en agua y llevar a 100 ml.
Agregar gotas de tolueno y guardar en heladera.
Saponina al 0,01%: Disolver 10 mg de saponina en agua y llevar a 100 ml.
Heparina:10000 U/ml.
CALCULO: El ∆pH/hora se determina siguiendo el siguiente esquema:
( pH1− pH2−b)× f
∆pH/ hora =
treacción
b: corrección para la hidrólisis no enzimática (ver tabla)

f: corrección para la variación de pH/hora con el pH.
treacción: T2-T1, expresado en horas.
Los factores de corrección para la hidrólisis no enzimática, no son lineales con respecto al
tiempo y se indican en la tabla III..
Valor de referencia: La cifra promedio de la actividad de la colinesterasa en un grupo de

individuos normales de acuerdo a Michel, es de Delta de pH/hora: 0,75 para GR.
• Ensayo del Reactivo de Ellman.
El test de la colinesterasa se basa la medición de su actividad enzimática. Esta es

inhibida por un amplio rango de insecticidas del tipo de los organofosforados y carbamatos.
Un gran variedad de organofosfatos son en realidad fosforotioatos – básicamente pro-
insecticidas – y requieren la oxidación a la forma activa “oxon” para una detección óptima de
la inhibición. En el caso de ausencia de un inhibidor en la muestra, la acción de la
colinesterasa sobre su sustrato libera tiocolina la cual reacciona con el reactivo de Ellman
(5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzoato, DTNB), formando un producto amarillo fácilmente
determinable. La inhibición de la colinesterasa por un pesticida en la muestra produce una
disminución de la intensidad de color final.
La interpretación de los resultados debería ser realizada por un médico. En general,

una disminución de entre el 15 al 25 % de la actividad significa una exposición ligera, una
depresión de 25 al 35 % una exposición de grado medio mientras que lecturas de entre un
35 al 50 % son compatibles con una exposición severa.
Debe tenerse en cuenta que un cambio en el nivel individual de la colinesterasa

puede ser resultado de otros factores además de la exposición a pesticidas. En el caso de
un cambio del 20 % en la línea de base (por ejemplo de un trabajador) debería obligar a
repetir los análisis.
Se considera que una caída del 30 % en la línea de base de la colinesterasa

plasmática es suficiente para provocar que la persona sea removida de toda exposición a
fosforados y carbamatos hasta que los valores no retornen a la línea de base.
• Procedimiento para la determinación de colinesterasa plasmática.
La colinesterasa sérica o plasmática (Pseudocolinesterasa o Butirilcolina esterasa)

cataliza la reacción de hidrólisis de los ésteres de la colina, tal como la S-butirilcolina, con
máxima actividad a pH 7,7. La tiocolina liberada reacciona con el ácido 5,5’-ditiobis-2-
nitrobenzoico (DTNB) produciendo un compuesto amarillo de acuerdo al siguiente esquema
de reacción.
Butirilcolina + agua Colinesterasa Tiocolina + Butirato
Tiocolina + DNTB 2-nitro-5-mercaptobenzoato.
La velocidad de aparición de color es directamente proporcional a la actividad

enzimática y se mide a 405 nm.
Los valores normales promedio según el método se pueden comparar en la Tabla

7.III.
Tabla 7.III. Valores de Acetilcolinesterasa.
Métodos Plasma Eritrocitos Sangre Unidades

pH (Michel) 0,45 0,55 ∆pH por mL por hr
pH Stat (Nabb- 2,3 8,0 mM por mL por

Whitfield) min
BMC Reagent Set 1,8 3000 mU por mL por

(Ellman-Boehringer) min
Garry-Routh (Micro) Hombres mM-SH por 3mL

7,8 por min
Mujeres
5,8
La interpretación de los resultados obtenidos en la determinación de la colinesterasa, si bien

es importante y útil, tiene sus limitaciones por las siguientes razones:
(a) No todos los hospitales tienen los medios necesarios, causando retrasos en el envio a
los centros de diagnóstico.
(b) El amplio error estadístico de los métodos disponibles hacen difícil detectar con exactitud
una intoxicación leve.
(c) El test es más efectivo en la detección de la depresión de la exposición a
organofosforados que a carbamatos.
Con respecto a los carbamatos, los niveles de enzima pueden retornar a la línea de
base en pocas horas, siendo recomendable que no transcurra más de 4 horas. El motivo de
esto es que puede ocurrir una reactivación parcial de la enzima en la sangre, haciendo difícil
para el médico hacer un diagnóstico exacto.
Bibliografía.
Toxicología Avanzada, M. Repetto, Ed. Diaz de Santos, 1995, Cap.5 y Cap.14.

Las bases farmacológicas de la terapeútica, Goodman and Gillman 9na Edición, Cap. 67, p
1781, 1996.
Cholinesterase, Smith, William G., Chemicals Pesticide Program. Cornell Cooperative

Extension Information. New York State College of Agriculture and Life Sciences, Cornell
University, Ithaca, NY. 1983.
Clarke´s Isolation and Identification of Drugs in pharmaceutical, body fluids, and post-mortme
material, Second Edition, The Pharmaceutical Press, London, 1986.
Manual de Toxicología Clínica, prevención, diagnóstico y tratamiento, Robert H.

Dreisbach y William O. Robertson 6ta Edición.Editorial El Manual Moderno1999.
Glossary of Pesticide Chemicals, FDA October 2001.
Cholinesterase testing information. Pesticide Facts, Van Driesche, R G. 1985. Cooperative

Extension Service, University of Massachusetts, Amherst, MA. June 7, 1985.
Determination of Chlorinated Pesticides in Soil by Solid Phase Extraction – Gas

Chromatography. Mohammad A. Mottaleb and Mohammad Z. Abedin. Analytical Sciences,
Vol 15, The Japan Society for Analytical Chemistry, March 1999.
Use of Solid-Phase Microextraction Analysis of Pesticides Soil, Acta Chim. Slov. 45(1), pp. 1-
17, 1998.
Organophosphorus Pesticides 5600, Issue 1: 15 NIOSH Manual of Analytical Methods

(NMAM), Fourth Edition, 8/15/94, August 1994.
Application of high-performance thin-layer chromatography and automated multiple

development for the identification and determination of pesticides in water, De la Vigne, U.,
Jänchen, D.E., Weber, W.H, J. Chromatogr, 489-496, 1991.
Automated online solid-phase enrichment and analysis by high-performance liquid

chromatography of pesticides in water, Renner, T; Unger, KK GIT-Fachz-Lab, 40 (8) 756-
758, 760-761 Aug 1996.
Use of extraction disks for trace enrichment of various pesticides from river water and
simulated sea-water samples followed by liquid chromatography - rapid-scanning UV-visible
and thermospray - mass spectrometry detection, Barcelo, D.; Durand, G.; Bouvot, V, Nielen,
M. Environ. Sci. Technol., 27(2),271-277 Feb 1993.
Risk assessment for pesticides and their metabolites in water, Galassi, S; Provini, A;
Halfon, E. Int-J-Environ-Anal-Chem, 65(1-4), 331-344, 1996
Single-step multi-cartridge clean-up for organophosphaten pesticide residue determination

in vegetable oil extracts by gas chromatography, Di Muccio, A. Aussili, A. Vergori, L.
Camoni, I. Dommarco, R. Gambetti, L. Santilio, A. Vergori, F, Analyst,. 1990, 115

(9), 1167-1169, 1990
Pesticide monitoring of drinking water with the help of solid-phase extraction and high-
performance liquid chromatography. Junker-Buchheit, A; Witzenbacher, J-Chromatogr, A. ;
737(1): 67-74. 14 Jun 1996.
Multicolumn solid-phase extraction clean up of organophosphorus and organochlorine

pesticide residues in vegetable oils and butterfat, Gillespie, A.M. Daly, S.L. Gilvydis, D.M.
Schneider, F. Walters, S.M. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., Mar.-Apr. 1995, 78
(2), 431-437, 1995
Determination of cholinesterase-inhibiting pesticides and some of their metabolites in cases

of animal poisoning using thin-layer , Zoun, P.E.F., Spierenburg, T.J J. Chromatogr, 448 -
453, 1995
Optimization, automation and validation of the solid-phase extraction cleanup and online
liquid-chromatographic determination of N-methylcarbamate pesticides in fruits and
vegetables, De-Kok, A.; Hiemstra, M. J. AOAC-Int., 75 (6), 1063-1072, Nov-Dec 1992
Oxime Reactivation of Acetylcholinesterase inhibited by enantiomeric organophosphates,

Roger J. M. Brüggemann, Havikstraat 28 bis, 3514 TR Utrecht, The Netherlands, August
1997-April 1998
Determination of Carbofuran and Its Toxic Metabolites in Animal Tissue by Gas

Chromatography of Their N-Tribluoracetyl Derivatives. Wong, Lyle and Frank M. Fisher. J.
Agric. Food Chem, 23(2):315-318. (ERL,GB X137), 1975.
Fatal overdose of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Keller T, Skopp G, Wu M, et al.

Forensic Sci Int; 65:13-8, 1994
Chlorinated and Organonitrogen Herbicides (Air Sampling) 5602 NIOSH Manual of Analytical
Methods (NMAM), Fourth Edition,1994.
Bromoxynil and Bromoxynil Octanoate 5010 NIOSH Manual of Analytical Methods (NMAM),
Fourth Edition, 1994.
Fast Dual-Column GC/ECD Analysis of Chlorinated Phenoxy Herbicides—EPA Methods 515

and 8150.Alan D. Broske, Ph.D., Agilent Technologies Printed in USA 03/00 5963-7299E.
1995.
Warfarin 5002 NIOSH Manual of Analytical Methods (NMAM), Fourth Edition, 8/15/94.
Reversed-Phase HPLC Determination of Eight Anticoagulant Rodenticides in Animal Liver V.

Fauconnet, H. Pouliquen, and L. Pinault, Journal of Analytical Toxicology, Volume 21,
Number 7, November/December, p 548–553,1997
Pyrethrum 5008, NIOSH Manual of Analytical Methods (NMAM), Fourth Edition, 8/15/94.
Solid Phase Extraction and HPLC Determination of 33 Selected Pesticides in Drinking Water,
Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany.
Prevention, Pesticides and Toxic Substances: OPPTS 835.1210 Soil Thin Layer
Chromatography EPA 712-C-98-047 January 1998.
A Compendium of Unofficial Methods for Rapid Screening of Pharmaceuticals by Thin-Layer

Chromatography, A. S. Kenyon and T. P. Layloff , Food and Drug Administration
Division of Testing and Applied Analytical Development, St. Louis, MO. 63101, Journal of
AOAC International, 78(1),41-49,1995.
Detection of poisoning by substances other than drugs: a neglected art, Neil R Badcock,
Review Article, Ann Clin Biochem, 37: 146-1572000.
Fatal brodifacoum rodenticide poisoning: autopsy and toxicological findings, Palmer RB,
Alakija P, Nolte KB, Vol 44, Issue 4, 851-855, 1999.
Anticoagulant rodenticides in stoats (Mustela erminea) and weasels (Mustela nivalis) in

England R.A. McDonalda, S. Harris a, G. Turnbull b, P. Brownb, M. Fletcher b Environmental
Pollution, 103, 17-23 ,1998.
GLC Determination of Warfarin in Human Plasma, David G. Kaiser and Robert S. Martin,
Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 63, N° 10, October 1974.
Thin-layer chromatography of some coumarin derivatives, M. Trkvnik, M. Kules, I. Tabakovic

and M. Zecevic, Journal of Chromatography, 128, 227-230, 1976.
Detection and Determination of Organophosphorus Insecticides in Tissues by Thin-layer

Chromatography, S. N. Tewari and S. P. Harpalani, Journal of Chromatography, 130, 229-
236, 1977
Determination of Chlorinated Pesticides in Soil by Solid Phase Extraction-Gas

Chromatography, Mohammad A. Mottaleb and Mohammad Z. Abedin, Analytical Sciences,
Vol 15, March 1999.
L.C. Mitchell, J. Assoc. Off. Agr. Chemists 35 , 920 (1952).
Determination of cholinesterase-inhibiting pesticides and some of their metabolites in cases

of animal poisoning using thin-layer chromatography, Zoun, P.E.F., Spierenburg, T.J. ,
Journal: J. Chromatogr., 448 – 453,1989.
Development of a semi-automated high-performance liquid-chromatographic - diode-array

detection system for screening pesticides at trace levels in aquatic systems of the Axios
River basin, Papadopoulou-Mourkidou, E; Patsias, J., Journal: J-Chromatogr, A. 1; 726(1-2):
99-113, Mar 1996.
Optimization, automation and validation of the solid-phase extraction cleanup and online
liquid-chromatographic determination of N-methylcarbamate pesticides in fruits and
vegetables, De-Kok, A.; Hiemstra, M. Journal: J. AOAC-Int., 75 (6), 1063-1072, Nov-Dec
1992
Capítulo 8
Tóxicos Metálicos.
Autores:
Bioq. Fernando Rainoldi.

Perito de la Sección de Toxicología del Laboratorio Químico Pericial de la Dirección General
de Policía Cinetífica de la Policía de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción.
Resulta bien conocido que los metales cumplen un doble papel en los seres vivos:
son varios de ellos nutrientes esenciales mientras que en función de su dosis pueden
resultar extremadamente tóxicos. La lista de los metales toxicológicamente importantes se
va ampliando al descubrirse nuevas funciones bioquímicas, dado que algunos de ellos son
considerados esenciales tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, cromo, molibdeno,
manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, zinc, selenio y flúor. A esta lista podrían
incorporarse el estaño y el silicio.
Si bien se suele unir en un solo grupo a los así llamados “metales tóxicos” esta
distinción no hace referencia a las propiedades metálicas – de hecho incluye metaloides
como el selenio y el arsénico – ni a la forma de metal elemental como la especie tóxica, ya
que usualmente las formas iónicas solubles son las más activas.
Los metales, especialmente los denominados metales pesados, constituyen una

importante fuente de riesgo para la salud y el medio ambiente tanto bajo la forma de
intoxicaciones agudas o crónicas. La actividad antropogénica es la principal fuente de
riesgo, pues actúa concentrando los metales y produciendo múltiples ocasiones de
exposición en la vida diaria a través de los alimentos, aire, agua e incluso en nuestros
hogares. En este capítulo veremos los distintos metales de mayor importancia en nuestro
medio y los distintos métodos de análisis.
8.1 Toxicocinética.
A los efectos de realizar los monitoreos correspondientes y seleccionar las muestras,

resulta útil realizar una síntesis de las vías de entrada, depósito y eliminación de los
metales.
8.1.1 Vías de absorción.
Se conocen como vías de entrada posibles a la inhalatoria, dérmica, oral, mediada

por prótesis metálicas y la transferencia madre-hijo por la placenta o la leche materna. De
estas, especialmente en personal expuesto en industrias, la vía inhalatoria se considera una
de la más importantes y habituales, observándose en la mayoría de las legislaciones
laborales una especial preocupación por la protección de los empleados y la medición en el
aire.
En los ambientes fabriles o talleres metalúrgicos la forma de exposición más habitual

es a través de material particulado, vapores o gases, siendo estos últimos generalmente
compuestos organometálicos (carbonilos de níquel, cobalto). Estas combinaciones son
mucho más tóxicas que las formas elementales. La vía dérmica, ya sea para la forma
elemental o en forma de polvos o gases, resulta otra ruta de exposición importante en
ambientes industriales, provocando dermatitis, alergias y distintos tipos de cáncer.
La toxicidad de un metal se halla estrechamente relacionada con la vía de entrada y

su especie química. Uno de los mejores ejemplos lo constituye el mercurio, el cual al ser
ingerido en su forma elemental resulta prácticamente atóxica, mientras que una sal de
mercurio soluble o el metil mercurio son absorbidos casi en su totalidad. El mismo metal
muestra las mismas diferencia en la vía inhalatoria, donde tanto el metil mercurio como el
vapor de mercurio atómico se absorben un 80 %.
8.1.2 Biotransformación.
La mayoría de los metales circula unidos a la fracción proteica del plasma, mediante
la unión a grupos funcionales como sulfihidrilos, amino, fosfato, imidazol e hidroxilo. La
distribución refleja la diferente capacidad para atravesar membranas y para permanecer
unidos a los diferentes componentes de los tejidos u órganos. Debido a que los organismos
no pueden destruir a los metales a diferencia de lo que ocurre con las moléculas orgánicas
existe una larga permanencia en el organismo. A pesar de esto se conocen mecanismos
especializados de quelación y oxidorreducción, que pueden modificar su excreción y

toxicidad.
8.1.3 Eliminación.
Debido a sus características químicas, la vía principale de eliminación es a través de

quelatos hidrosolubles por vía renal y gastrointestinal. La vía renal requiere previamente que
los metales circulen en forma soluble unidos a proteínas como la albúmina o las
metalotioneínas, siendo estas últimas las preferidas por su pequeño tamaño (5-6 kDa), lo
que permite atravesar libremente por los glomérulos y llegar de esta forma a la orina. Si bien
son rutas de poca importancia desde el punto de vista de la detoxificación, el sudor, el
aliento y las fanegas constituyen rutas conocidas desde hace tiempo (ej. Talio en pelo y
uñas).
Resulta importante hacer una breve referencia a un tema de por sí de inmensa

complejidad, el de las especies químicas. El contenido total de un elemento presente en una
muestra no es el factor principal para determinar su toxicidad sino la proporción de las
distintas especies químicas presentes una matriz determinada. Existen dos ejemplos
clásicos que ilustran este concepto: el As(III) resulta mucho más tóxicos que el As(V), pues
sólo el arsénico trivalente puede unirse a los tioles; el Cr (VI) resulta más tóxico que el Cr(III)
pues es mas soluble en agua que el trivalente, una vez en el interior de la célula pasa a
varios estadios intermedios de reducción – Cr(V), Cr (IV) – todos ellos capaces de unirse al
ADN y provocar mutagénesis.
En lo que respecta a los metales de transición, basta recordar la especiación química

del Fe en solución acuosa para tener una idea de las complejidades posibles. A la fecha, si
bien los modelos de predicción incorporan la especiación dentro de sus parámetros la
medición de esta resulta aún extremadamente compleja.
8.2 Tipos de muestras.
A efectos de establecer una relación dosis-respuesta es necesario conocer tanto la

concentración del metal como el tiempo de exposición. La definición más precisa de dosis
es la cantidad de metal dentro de las células del órgano que manifiesta efectos tóxicos. Sin
embargo la cuantificación de metales dentro de los órganos no es posible en sujetos vivos.
Se pueden hacer estimaciones indirectas a partir de modelos metabólicos derivados de las

autopsias.
La sangre, orina y pelos son los tejidos más accesibles para realizar las medidas.
Los resultados de dichas determinaciones reflejan exposición reciente, pasada ó de larga
data, dependiendo del tiempo de retención y del tejido en particular.
La muestra de sangre y orina refleja exposiciones recientes y se correlacionan muy

bien con los efectos agudos. Una excepción es el cadmio en orina: su presencia en alta
concentración en orina implica un daño renal relacionado con la acumulación del metal en el
riñón.
Las muestras pilosas pueden usarse en asociación a variaciones en la exposición a

los metales durante largo tiempo. Los análisis pueden realizarse sobre distintos segmentos
del cabello de modo tal que el contenido del metal del nuevo crecimiento puede compararse
con exposiciones pasadas. Se debe tener la precaución de lavar el pelo previamente al
análisis para remover el depósito de metal por la contaminación externa.
Otro tipo importante de muestras es el agua. Las aguas de bebidas libres de materia
en suspensión pueden ser analizadas directamente, mientras que las que presentan materia
orgánica requieren un procedimiento para solubilizar el material suspendido. Los barros,
sedimentos y otros tipos de muestras sólidas pueden ser analizadas después de un
tratamiento adecuado.
También muchas veces se presentan muestras ambientales o alimentos en los que

resulta de interés conocer el contenido de metales. Desde el punto de vista cuantitativo, las
intoxicaciones por metales más frecuentes provienen de la ingestión de agua o alimentos
contaminados, ya sea su contenido o continente (latas con plomo).
8.3 Tratamiento de las muestras.
Previo a la cuantificación de metales presentes en medios biológicos, es necesario

efectuar un tratamiento de la muestra, dependiendo el mismo de varios factores:
1- Material biológico (orina, suero, sangre, vísceras)

2- Metal en cuestión (volatilidad y formas no disociables del metal en el organismo)
3- Procedimiento utilizado para la determinación final (colorimétrico, absorción atómica,

activación neutrónica).
Los metales pesados se encuentran frecuentemente en el material a analizar

formando complejos con moléculas orgánicas y deben ser liberados de los mismos para
poder determinarlos. Entre los métodos más utilizados para el tratamiento previo de las
muestras, pueden mencionarse:
a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica (DMO) empleando ácido
nítrico, nítrico-agua oxigenada, nítrico-sulfúrico, nítrico-sulfúrico-perclórico, o bien
permanganato de potasio-clorhídrico.
b) Destrucción de materia orgánica por vía seca.
c) Formación de quelatos y extracción con solventes.
d) Precipitación de las proteínas y determinación de los metales en el sobrenadante.
e) Técnicas de volatilización (arsénico como AsH3, antimonio como SbH3 y mercurio como
vapor del elemento).
A veces pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, de manera
de obtener una muestra apropiada para las posteriores determinaciones.
El método de destrucción de materia orgánica (DMO) sulfo-nitro-perclórico (SNP),

puede ser aplicado para la determinación de arsénico, talio, plomo y otros metales de interés
toxicológico en medios biológicos. Para la determinación de mercurio se efectuará en un
dispositivo especial que incluye un refrigerante a reflujo con dedo frío para evitar pérdidas
del elemento por volatilización del mismo. Existen también otros métodos denominados
secos dado que realizan la Destrucción de Materia Orgánica (DMO) por calcinación.
A continuación se detalla el fundamento del método de DMO por Vía Húmeda

Sulfo-Nitro -Perclórica
8.3.1 Destrucción de materia Orgánica (DMO) por vía húmeda

sulfo-nitro-perclórica.
Se basa en la acción de una mezcla fuertemente oxidante sobre la muestra en

cuestión a fin de romper la unión entre los metales y la materia orgánica llevándolos a su
máximo estado de oxidación.
El HNO3 es un agente oxidante (punto de ebullición: 56ºC).
2HNO3 → H2O + NO + 3 O*__ en frío.

2HNO3 → H2O + 2 NO2 +1O* en caliente.
Luego O* + H (de la materia orgánica) → H2O
El H2SO4 permite trabajar a mayor temperatura (270 ºC) siendo además un

indicador de la destrucción de la materia orgánica: cuando ácido nítrico se consume
comienza a actuar el ácido sulfúrico que ataca la materia orgánica dando carbono de color
negro. En ese momento es necesario detener el calentamiento porque falta medio oxidante,
entonces se agregará ácido nítrico y se continúa el calentamiento. (El C es reductor y podrá
reducir el As a AsH3 perdiéndose por volatilización). Además el H2SO4 rompe cadenas de
glúcidos, proteínas y grasas, dando moléculas más pequeñas que serán fácilmente
atacadas por el ácido nítrico.
El ácido sulfúrico es también un deshidratante fuerte. Es indicador de que la materia

orgánica ha sido totalmente destruida, cuando no aparece color negro y se observan humos
blancos de SO3 .
El HClO4 posee un poder oxidante muy fuerte. Explota en presencia de materia

orgánica, por eso nunca se lo usa sólo sino como mezcla ácido nítrico-ácido perclórico.
Además de ser oxidante produce el clivaje de cadenas.
4 HClO4 → 2H2O + 2Cl2 + 7 O2 (4 HClO4 :14 O*)
4 HClO4 → 4 ClO2 + 3O2 +2H2O
4ClO2 + C (de la materia orgánica) → 4 CO2 + Cl2
La principal desventaja de la mezcla SNP es que resulta peligrosa debido a que los
ácidos oxidantes empleados generan vapores tóxicos e irritantes así como pueden producir
explosiones. Entre las ventajas se menciona la rapidez y utilidad si se manipula con cuidado,
permitiendo trabajar en presencia de materia grasa en la muestra permite romper cadenas
carbonadas mientras que la calcinación por vía seca no resulta suficiente.
8.3.2 Muestras biológicas.
Se describe a continuación la metodología empleada para el caso de sangre, orina o

vísceras. Para sangre, se emplean 5 a 10 ml de sangre entera; para orina se usan 50 ml y
para vísceras se emplean 25 g vísceras desmenuzadas
Reactivos
Acido nítrico (p.a.)

Acido sulfúrico concentrado exento de Arsénico, Talio y Plomo.
Mezcla en la proporción 1: 2 de ácido perclórico y nítrico
Oxalato de amonio, solución saturada a temperatura ambiente.
Equipos.
Balón de Kjeldahl de 100ml.
Procedimiento.
Todo el procedimiento debe realizarse bajo campana de extracción de gases. Si se

trata de vísceras se coloca 25 g de vísceras desmenuzadas en un balón Kjeldahl de 250 ml
de vidrio Pyrex tratando de no tocar las paredes. Se agregan 30 ml de ácido nítrico
concentrado y se calienta sobre tela metálica hasta disgregar todo el material. Se continúa
calentando directamente sobre llama pequeña hasta disolver el material. Se retira y se deja
enfriar.
Si se trata de orina, se miden 50 ml de orina y se calienta sobre tela metálica en un

vaso de precipitados hasta reducir a un quinto del original. Se pasa el líquido remanente a
un balón Kjeldhal de 100 ml y se incorpora 10 ml de ácido nítrico concentrado.
De allí en adelante se procede de la misma manera en ambos casos. Se agrega al

contenido del Kjeldhal 4-5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Se calienta el contenido hasta
llegar a carbonizar la materia orgánica. En ese momento debe suspenderse el

calentamiento dado que se genera ambiente reductor y se perderán metales como el
arsénico o el antimonio por volatilización. Se deja enfriar y se agrega lentamente por el
cuello del balón 4 ml de ácido nítrico y se vuelve a calentar. El agregado de ácido nítrico se
repite cuando se observe oscurecimiento del material. Se continúa calentando y si se
produce carbonización se agrega 4 ml la mezcla nitrico-perclórico. Se calienta nuevamente y
si se observa nuevamente oscurecimiento se agrega 4 ml de la mezcla nítrico-perclórico.
Se continúa calentando hasta la aparición humos densos y pesados de trióxido de

azufre. Llegado este punto, se retira el balón del fuego quedando un líquido incoloro o con
un ligero precipitado blanco o amarillento de sulfato de calcio o de hierro respectivamente.
Dejar enfriar y luego agregar 3 a 4 ml de oxalato de amonio y se vuelve a calentar

para eliminar los restos de sustancias oxidantes hasta nuevamente humos blancos de
trióxido de azufre. Se deja enfriar y se agrega 1 o 2 ml de agua destilada y se calienta para
desprender vapores de agua. Se repite el agregado de agua y se calienta hasta humos
blancos de trióxido de azufre. Se continúa calentando hasta obtener un líquido residual de
2ml, se deja enfriar y se trata el líquido y el residuo sólido si lo hubiera con agua destilada
transvasándolo a un matraz de 25 ml. En estos 25 ml de investigará los metales como Talio,
Arsénico, Plomo y otros metales de interés toxicológico.
8.3.3 Muestras de aguas.
Para el caso de muestras de agua, antes de la recolección de la muestra debe

tomarse la decisión de que tipo de dato se desea obtener como ser: metales disueltos,
suspendidos, totales o recuperables totales.
Los llamados metales disueltos que son aquellos constituyentes metálicos que
atraviesan una membrana filtrante de 0,45µm. Los metales suspendidos que son los que
quedan retenidos por la membrana de 0,45µm, los metales totales corresponden a la
concentración determinada sobre una muestra sin filtrar seguida por una vigorosa digestión
y los metales recuperables totales corresponden a la concentración de metales en una
muestra sin filtrar seguida de un tratamiento con ácido mineral diluido caliente.
Para la recolección de las muestras de agua el recipiente debe ser de vidrio al

borosilicato, polietileno lineal, polipropileno o teflón que deben ser muy bien lavados con
detergente y agua corriente, enjuagado con ácido nítrico 1:1, agua corriente, ácido
clorhídrico 1:1 y finalmente con agua destilada desionzada.
• Procedimiento.
Para la determinación de metales disueltos las muestras de agua deben estar libres
de turbiedad o filtradas a través de membrana filtrante de 0.45µm (previamente lavada con
ácido nítrico diluido). La muestra debe ser filtrada en el momento de la recolección y luego
se acidifica con 2 ml de nítrico concentrado por litro de muestra.
Para la determinación de metales suspendidos la muestra se filtra a través de una

membrana filtrante de 0.45µm (previamente lavada con ácido nítrico diluido) y el análisis se
realiza sobre la porción de muestra retenida en la membrana. Se transfiere la membrana a
un vaso de precipitado de 250 ml y se agregan 3ml de nítrico concentrado.
Cubrir el vaso con un vidrio reloj y calentar. Cuando se ha disuelto la membrana

incrementar el calentamiento y evaporar a sequedad. Enfriar y agregar 3 ml de ácido nítrico
continuar calentando hasta que se complete la digestión dado por un residuo de color claro.
Agregar residuo seco 2 ml de ácido clorhídrico (1+1) y calentar muy bien hasta disolver el
material. Lavar las paredes de vaso de precipitados con agua desionizada y filtrar si es
necesario para eliminar los silicatos u otros materiales insolubles que pueden obturar el
atomizador. Llevar al volumen original de la muestra con agua desionizada.
La concentración de metales totales resulta ser la suma de las concentraciones de
las fracciones disueltas y suspendidas.
La determinación de metales extraíbles se realiza después del agregado de ácido

mineral (2 ml/L) y del agitado vigoroso permitiendo que repose durante una noche. En
muchos casos esto representa el contenido metálico total si han sido disueltos todos los
sedimentos. La muestra está lista para el análisis cuantitativo mediante Espectroscopia de
Absorción Atómica.
8.3.4 Destrucción de Materia Orgánica (DMO) por vía seca.

Este tipo de destrucción de materia orgánica resulta de elección en el caso de

muestras de alimentos que presenten una proporción de hidratos de carbono elevada. Esta
técnica no es adecuada en el caso de matrices que presenten elevado contenido de
proteínas o lípidos. Se realiza la DMO por calcinación de la muestra con una mezcla de
nitrato de magnesio y óxido de magnesio que transforma el a los metales cuantitativamente
en compuestos derivados de magnesio. En estas condiciones los metales no son volátiles.
En el item denominado determinación de arsénico se describe el procedimiento y el
fundamento de las reacciones.
Luego, la muestra está lista para el análisis cuantitativo mediante Espectroscopia de

Absorción Atómica
8.4 Determinación de metales de interés toxicológico por

absorción atómica.
Los metales en solución pueden ser muy bien determinados por espectroscopía de
absorción atómica. El método es simple, rápido y aplicable a un gran número de metales en
agua de bebida, desechos domiciliarios, barros, fluidos biológicos como las muestras de
sangre, orina o vísceras luego de una adecuada DMO.
Algunos metales como el antimonio, arsénico, oro, iridio, mercurio, osmio, paladio,
platino, rhodio, ruthemio, selenio, plata, talio, estaño y titanio requieren modificaciones en el
proceso de digestión.
• Equipos
Espectrofotómetro de absorción atómica: debe poseer uno o dos canales haz de luz
simple o doble monocromador a red de difracción, detector fotomultiplicador, ranuras
ajustables, rango variable de 190 a 800 nm e interconección a un registrador.
Lámparas de cátodo hueco pueden utilizarse las del elemento simple o las
multicátodo.
• Reactivos.
Agua destilada desionizada

Acido nítrico concentrado grado espectroscópico.
Acido nítrico (1:1)
Acido clorhídrico (1:1)
Combustible y oxidante se usa generalmente acetileno comercial y aire proveniente de un
cilindro con aire comprimido.
Soluciones stock standard del metal
• Preparación del estándar y la calibración.
Se preparan a partir de metales de alta pureza, sales de calidad analítica no

higroscópicas usando agua desionizada y ácido nítrico. Las soluciones stock se preparan en
concentraciones de 1000 mg de metal por litro. Los standards de calibración se preparan por
dilución de la solución stock del metal en el momento del análisis y se descartan luego del uso.
Se deberá preparar un blanco y como mínimo cuatro estándares de calibración en intervalos
de acuerdo al rango total esperado. Se preparan empleando el mismo tipo y concentración de
ácido usado en la preparación de las muestras (ácido nítrico 1:1). Aspirar el blanco y las
soluciones registrando las lecturas. La curva de calibración debe cubrir un rango apropiado de
concentración que produce una absorción de 0 a 80 %.
Debido a que las concentraciones detectadas por este equipamiento son muy bajas
(ppm o ppb), debe evitarse interferencias de todo tipo. Una de ellas puede provenir del
material de vidrio utilizado. Por ello, debe mantenerse todo el material de vidrio en ácido
nítrico 1:1 durante 24 hs, para luego realizar los lavados y enjuagues del material con agua
bidestilada.
8.5 Métodos de Análisis para la determinación de metales.
8.5.1 Investigación y determinación de Talio.
• Generalidades de la intoxicación.
El talio es un tóxico de acción diferida y lenta excreción. El órgano principal de

eliminación es el riñón. Han ocurrido casos de intoxicaciones agudas en las que el Talio ha
sido eliminado por orina con valores de varios mg/L. Una intoxicación aguda con sales de
Talio puede producir daños gastrointestinales con efectos retardados o intermedios en el
sistema nervioso central y periférico, sistema cardiovascular, ojos y piel. La pérdida de
cabello es el síntoma típico de la intoxicación.
Las sales de talio son empleadas en la manufactura de semiconductores y

pigmentos. No hace mucho tiempo la investigación de Talio era frecuente debido al uso
difundido de sales de Talio en la formulación de cremas depilatorias, en las que éste tipo de
compuestos se encontraba en concentraciones muy cercanas a las tóxicas. También se
hallaban difundidas distintas mezclas rodenticidas (Pasta Zelio), con compuestos de Talio
como sustancias activas. Estas caen en desuso siendo reemplazadas por compuestos
cumarínicos. La dosis letal de talio en adultos es de 0,2 a 1 g.
El líquido de elección para la determinación de Talio es la orina, aunque puede

utilizarse sangre
• Investigación toxicológica del Talio
Existen diversos métodos en la bibliografía, a continuación se describen dos

métodos que han sido probados en nuestro laboratorio con excelentes resultados.
• Determinación cualitativa de Talio empleando ditizona.
La investigación toxicológica del Talio se realiza en tres etapas. 1) DMO con mezcla
sulfo-nitro-perclórica (SNP). 2) Extracción etérea del metal mineralizado como tricloruro de
talio. 3) Formación del ditizonato de Talio (rosado) en medio alcalino eliminando
interferencias de otros metales.
A continuación se describe el procedimiento de DMO para cantidades pequeñas de
muestras de orina.
Reactivos:
Acido sulfúrico concentrado
Acido nítrico concentrado
Acido nítrico/ácido perclórico
Agua Regia: 2 volúmenes de ácido nítrico 7 M y 6 volúmenes de ácido clorhídrico 6M)
Éter etílico
Sulfito de sodio
Ioduro de potasio 0.5M
Cianuro de potasio 2M
Solución de ditizona (250 mg/L) en cloroformo preparado recientemente.
• Procedimiento:
Colocar en cápsula de porcelana 5 ml del líquido biológico y agregar 4 gotas de

ácido sulfúrico concentrado y 10 gotas de ácido nítrico concentrado. Calentar en baño de
arena hasta que se observe oscurecimiento debido a la carbonización de la materia
orgánica. Se debe retirar del fuego y agregar 10 gotas de una mezcla constituida por dos
volúmenes de ácido nítrico concentrado y un volumen de ácido perclórico 70%.
Nunca se debe agregar el ácido perclórico directamente sobre la Materia Orgánica

(MO) por la formación de mezclas explosivas. Luego se continúa calentando para
concentrar y carbonizar la materia orgánica. Si nuevamente se observa que la muestra se
oscurece será necesario agregar la mezcla citada en la misma cantidad. Si esto no ocurre,
se continuará calentando hasta humos densos y pesados de trióxido de azufre. Si ha
quedado ácido perclórico, se eliminará éste antes, también como humos blancos pero no
tan densos y característicos como los del trióxido de azufre. El calentamiento continúa hasta
residuo siruposo.
Si se observa ligeramente coloreado de amarillo, esto puede deberse a la presencia
de hierro. Se deja enfriar, se agregan 2 ml de agua destilada y se calienta para
descomponer combinaciones nitradas y eliminar restos de sustancias oxidantes, hasta
humos blancos de trióxido de azufre. Enfriar y agregar nuevamente 2 ml de agua destilada,
disolver el residuo con ayuda de una varilla de vidrio y trasvasarlo luego a un tubo de
hemólisis, agregar 2 gotas de ácido nítrico 7M y 6 gotas de ácido clorhídrico 6M (agua
regia).
Calentar con mucha precaución directamente a la llama, hasta ebullición.
HNO3 + HCl → Cl2
Cl2 + Tl+ → TlCl4-
Enfriar y extraer dos veces con el doble de su volumen de éter etílico. Agitar, separar
la fase etérea y concentrar a pequeño volumen en baño María. Apagar los mecheros y
enfriar. Al extracto concentrado agregar una pizca de sulfito de sodio (para eliminar el cloro
proveniente del agua regia que podría oxidar el ioduro a iodo y constituir una interferencia y
2 gotas de ioduro de potasio 0,5M y agitar enérgicamente. Un color amarillo en fase etérea y
eventualmente, un precipitado en la interfase, indica reacción positiva.
IK + TlCl4- → TlI3 (Amarillo)
Agregar 5 gotas de solución de ditizona y uego gota a gota y agitando una solución
de hidróxido de sodio 4M hasta viraje de la ditizona. Luego agregar 4 gotas de solución de
cianuro de potasio 2M. Agitar enérgicamente y dejar separar las dos fases. Un color rosado
en la fase etérea indica reacción positiva (ditionato de talio).
• Determinación cuantitativa de Talio empleando ditizona.
El siguiente método es aplicado en forma cuantitativa a muestras de orina
• Reactivos:
1. Reactivo cianuro: Disolver 1.6 g de hidróxido de sodio, 1.2 g de tartrato de sodio y 1.36 g
de cianuro de potasio en 10 ml de agua. Tener sumo cuidado al usar el reactivo de
cianuro.
2. Solución de ditizona (250 mg/L) en cloroformo preparado recientemente.
• Estándares:
1. Blanco de orina al cual se le agrega una solución de acetato de talio en agua destilada
(1.0 g/L) para obtener una concentración de 0.1, 1.0, 5.0 y 10.0 mg/L
• Equipos:
Espectrofotómetro UV-visible
• Procedimiento:
1. Agregar 1 ml de reactivo cianuro a 5 ml muestra previamente realizada la DMO y

retomada con 5 ml de agua destilada o 5 ml de standard en tubos de 10 ml y agitar
mediante vortex durante 10 segundos.
1. Agregar 2 ml de solución de ditizona, mezclar con vórtex durante 1 minuto y centrifugar
durante 5 minutos.
2. Descartar la fase inferior, (fase acuosa) y filtrar el extracto cloroformo a través de papel
de filtro.
3. Medir la absorbancia del extracto y leer contra un blanco de orina a 480 mm. Un color
rosado en la fase inferior cloroformo indica presencia de talio a una concentración de 1
mg/L. Realizar una curva de calibración. Este método presenta un número de metales que
pueden interferir. Para realizar la medida en forma definitiva, debe realizarse la
determinación del extracto clorofórmico mediante espectrofotometría de absorción atómica.
Sensibilidad del método: 0.1 mg/L.
• Determinación cuantitativa de Talio (Método de Kobarin –Moucka, modificado

por Pompei).
A partir de muestras de sangre, orina, vísceras se realiza la Destrucción de materia

orgánica (DMO) como se describió previamente hasta lograr un residuo siruposo.
El extracto se resuspende en 5 ml de agua destilada en un vaso de precipitado.
• Reactivos:
Ácido Clorhídrico concentrado

Solución saturada de bromo
Solución acuosa de ácido sulfosalicílico al 20%
Violeta de metilo en solución acuosa al 0.2%.
Benceno p.a.
• Equipos:
Espectrofotómetro UV visible
• Procedimiento:
• Al extracto resuspendido en 5 ml de agua destilada, se agregan 0.3 ml de ácido

clorhídrico concentrado y 0.5 ml de agua de bromo. Se esperan 2 minutos y luego se agrega
0.5 mi de ácido sulfosalicílico 20% agitando enérgicamente (no se debe percibir olor a
bromo). Luego de 5 minutos, agregar 4 ml de benceno y 0. 1 ml de violeta de metilo 0.2%.
Todo el procedimiento debe realizarse en campana de extracción de gases. Recordar que el
benceno es muy tóxico.
• Agitar y dejar separar las fases. Se recoge la capa orgánica (bencénica) superior
que adquiere color azul-violeta de existir talio.
• La capa inferior acuosa adquiere color verde o amarillo de acuerdo a la acidez del
medio ya que el colorante actúa como indicador.
• Se lee la absorbancia a 604 nm llevando a cero con benceno. El valor de

absorbancia obtenido se interpola en una curva de calibración. Paralelamente a la muestra
se procesa un blanco de reactivos.
• Interpretación de los resultados:
El Talio no se detecta normalmente en fluidos biológicos de individuos no

contaminados. Pacientes con una concentración de Talio que superen los niveles de 0.5
mg/L (concentración asociada con signos de toxicidad) deben ser tratados médicamente.
8.5.2 Investigación y determinación de Arsénico.
• Generalidades de la intoxicación.
El Arsénico se halla presente en las aguas subterráneas utilizadas como agua de

consumo. Por eso se lo halla también en los vegetales que lo absorben en la raíz o son
regados con dichas aguas. Los mariscos filtran grandes cantidades de agua y concentran el
As. El As forma parte también de algunos medicamentos orgánicos e inorgánicos usados
antiguamente. El arseniato de sodio se usó como colorante y el arseniato de cobre en vidrio,
papel y pinturas. En pirotecnia se usan compuestos de As para las llamas verdes. En
algunos casos el As se usó desde el punto de vista criminal.
La sintomatología observada en casos de intoxicación pude distinguirse según

sea de tipo aguda o crónica.
• Aguda:
- Vaso dilatación de los capilares sanguíneos con alteración de la permeabilidad
de los mismos.
- Vómitos, diarrea (pérdida de agua y sales), irritación de garganta, dolores
faringes.
- Edemas subcutáneos. Hipertensión.
- Colapso, shock, coma. Muerte.
• Crónica:
El As se une a albúmina, se absorbe fácilmente a las mucosas y se deposita en

hígado, riñón, huesos, pelos y uñas. Se elimina por orina y heces, pero se reabsorbe en el
tabulo contorneado proximal. Por lo tanto, debido a que la absorción es mayor que la
eliminación, se acumula. Los síntomas más característicos son:
- caída del cabello.

- mano en forma de garra y pie colgante
- en piel:
- erupciones
- * hiperqueratosis (engrosamiento de la piel de la palma de las manos y pies)
* hiperpigmentación (manchas oscuras)
-degeneración grasa del hígado que puede dar cirrosis.
-temblores por alteración del SNC con desequilibrio de Na y K
-fase final: cáncer de piel.
• Investigación toxicológica de arsénico
Para la determinación de arsénico en materiales biológicos, alimentos, etc, es

necesario destruir previamente la materia orgánica. El método empleado depende del
material biológico de que se trate.
• Pelos y uñas.
Se utiliza una mezcla de ácidos oxigenados concentrados que deshidratan, oxidan y

saponifican la materia orgánica.
Procedimiento:
En una cápsula de porcelana colocar 1 a 2 g de material. Si se trata de pelos es

conveniente humedecerlos con unas gotas de agua destilada. Agregar 1 ml de ácido
sulfúrico concentrado y 5 ml de ácido nítrico concentrado. Si es posible dejar en contacto
varias horas.
Calentar progresivamente sobre tela metálica y luego en baño de arena. Cuando

aparecen humos blancos, retirar del baño de arena y agregar 2 ml de la mezcla constituida
por dos partes de ácido nítrico concentrado y una parte de ácido perclórico concentrado
(70%). Desde este punto en adelante, cuando se produzca oscurecimiento del líquido por
carbonización debe suspenderse el calentamiento del mismo pues en dicho medio reductor
se perderá As por volatilización.
Calentar hasta humos blancos y repetir este tratamiento hasta que el residuo sea
incoloro o blanquecino. Retirar del baño y agregar 10 ml de agua destilada. Calentar
nuevamente hasta residuo siruposo. Enfriar y tomar con 10 ml de agua destilada. El material
está listo para la determinación cualitativa y luego cuantitativa empleando Absorción

Atómica.
• Alimentos.
Nos referiremos en particular al caso de alimentos en base a hidratos de carbono. Se

realiza la DMO por calcinación de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y óxido
de magnesio que transforma el As cuantitativamente en piroarseniato de magnesio. En
estas condiciones el As no es volátil. En este caso es adecuada una DMO por vía seca
porque la proporción de hidratos de carbono es elevada, ya que con la presencia de
proteínas o lípidos, se dificulta la ruptura de las grandes moléculas.
Procedimiento:
Colocar 10 g de muestra en cápsula de porcelana y agregar 3.5 ml de solución de

nitrato de magnesio al 20% y 0.1 g. de óxido de magnesio. Mezclar bien formando una
papilla y calentar primero a baño maría hasta sequedad, luego en baño de arena y por
último en triángulo de pipas hasta cenizas blancas. Enfriar y tomar el residuo con 10 ml de
ácido sulfúrico al 10%. Filtrar si es necesario a fin de obtener una muestra de aspecto
límpido.
MgO + 2 Mg(NO3 )2 +As2O3 Mg3(AsO4)2 + 4 NO2
Mg3(AsO4 )2 CALOR As2O7Mg2 (piroarseniato) + MgO
As2O7Mg2 +H2SO4 AsO4H3 + MgSO4

(ác. arsénico)
• Determinación cualitativa.
Reacciones de identificación.
Se realizan luego de la destrucción de la materia orgánica (DMO). Las mismas se

basan en las propiedades reductoras de la AsH3 o de ciertos reactivos.
Reaccción de Bougault:
En un tubo de ensayo colocar un volumen de líquido a ensayar con un volumen de

reactivo (ácido fosfórico) a baño maría durante 10 minutos. En presencia de compuestos
arsenicales aparece un color pardo oscuro a marrón cuya intensidad varía con la
concentración.
2 AsO3-3 + 3 H3PO2 3 H3PO4 + 2 As 0 (marrón)
La reacción tiene una sensibilidad de 100 ppm aumentada a 10 ppm si se agrega

I2. El selenito actúa como interferencia pues da la misma reacción. Se requiere ausencia
absoluta de materia orgánica.
Reacción de Bettendorf:
En un tubo de ensayo poner un volumen de líquido más un volumen de reactivo . Calentar a

ebullición y dejar reposar. Si hay As aparece coloración parda oscura o marrón.
AsO3 -3 + 3 HCl Cl3As
2 Cl3As + 3 SnCl2 (2%) 2 As0 (marrón) + 3 SnCl4
Reacción de Gutzeit:
En un tubo de hemólisis colocar 1 ml de ác. sulfúrico al 25% Agregar 1 ml del

líquido problema y una granalla de Zn activado.
En la parte media del tubo colocar un trozo de algodón embebido en solución de

acetato de plomo al 1% y en la boca del tubo un papel de filtro sobre al que se coloca una
pequeña gota de una solución de nitrato de plata cuya concentración no sea menor del 50%
Colocar el tubo en baño de agua fría.
En presencia de As se obtiene una coloración amarilla característica. El papel

colocado en la boca del tubo puede pasar a color negro correspondiente a Agº debido a la
humedad del ambiente.
AsO4-3 + Zn + 11 H+ AsH3 + Zn+2 + 4 H2O
AsH3 + 6 NO3Ag As.Ag3.3 NO3Ag (amarillo) + 3 HNO3
As.Ag3.3 NO3Ag + 3 H2O AsO3-3 + 6 Ag0 ¯(negro) + 3 NO3- + 6 H+
La reacción tiene una sensibilidad de 10 ppm.
• Determinación cuantitativa de arsénico.
a) Método de Gutzeit:
Se basa en la formación de arsina por acción del hidrógeno naciente sobre

compuestos arsenicales. La arsina reacciona con un papel embebido en Cl2Hg formando
complejos coloreados. La longitud e intensidad de la mancha es proporcional a la
concentración de As la cual se compara con manchas estándar.
El aparato consiste en un frasco cuyo volumen varía según la cantidad de As a

determinar (Fig. 1). Para cantidades de As entre 50 y 300 ppm se utiliza un frasco cuyo
volumen de 250 ml. Para cantidades de As entre 0,1 y 20 ppm el volumen del frasco es
de 60 ml.
Lleva un tapón de goma con un orificio al que se ajusta un tubo de vidrio con un
estrechamiento; a éste se adosa otro tubo similar pero de menor diámetro en cuya parte
superior se coloca una banda de papel embebida con una solución de Cl2Hg y luego
secado.
• Reactivos.
Solución de acetato de plomo al 1%

Papel embebido en solución acuosa de cloruro de mercurio al 5%

Mezcla ácida
Alumbre férrico
Cloruro estannoso al 40% P/Ven ácido clorhídrico 60% V/V
Granallas de Zinc
• Procedimiento
Colocar en la parte inferior del tubo de desprendimiento un papel de filtro plegado y

embebido en solución de acetato de plomo seco. Por el estrechamiento de este tubo
introducir lana de vidrio embebida en acetato de plomo. Finalmente, en la parte superior del
tubo colocar una tira embebida en Cl2Hg seco. El Ac2Pb retiene el SH2 (como SPb) que
interfiere con el color.
En el frasco colocar 20 ml de mezcla ácida, 2 ml de solución de alumbre férrico, 0,5

ml de Cl2Sn. Agregar la capacidad de un crisol de 30 ml de granallas de Zn activado y llevar
a volumen de 200 ml con agua destilada y colocar por último una cantidad exactamente
medida de solución a ensayar.
El agregado de ClNa y H2O a la mezcla ácida produce un desprendimiento regular

de Arsina (AsH3). El alumbre férrico compleja el Sb que pudiera estar presente. El Cl2Sn
disminuye el sobrepotencial del Hidrógeno permitiendo la reducción.
Tapar perfectamente y colocar en baño de agua fría durante 45 minutos. Sacar la

banda de papel reactivo y sumergirla en una solución de KI al 10% que permite estabilizar el
color. Secar entre papel de filtro y comparar con bandas standard obtenidas operando de la
misma manera. En el caso de utilizar el frasco de 60 ml, las cantidades de reactivos varían.
AsO4-3 + 4 Zn0 + H+ <==========> AsH3 (arsina) + 4 Zn+2 + 4 H2O
2 AsH3 + 3 Cl2Hg <=========> As2Hg3 (amarillo pardo) + HCl

As2Hg3 + I-1 <===========> (I4Hg)3As3
La sensibilidad del método es de 50 ppm a 300 ppm
Fig. 1: Equipo para determinación de arsénico por el método de Gutzeit cuali y cuantitativo.
Expresión de resultados: se indicará la cantidad de As sobre la masa de muestra pesada.

Lo habitual es expresar el resultado en mg/Kg de muestra.
b) Método de Vasac y Sedivec:
El método es similar al anterior con el fundamento de reducir cuantitavamente el

arsénico en la muestra con granallas de zinc y luego la arsina reacciona con una solución
de dietilditiocarbamato de plata en piridina formando un complejo color rojo que es
medido espectrofométricamente.
• Reactivos:
Solución Estándar de Arsénico: disolver 0.1734 g de arsenito de sodio en 1000 ml de

agua bidestilada (solución A). Tomar 10 ml de esta solución (A) y llevar a 100 ml con
agua bidestilada (solución B). Tomar 10 ml de la solución B y llevar a 100 ml con agua
bidestilada (solución C)= 1µ/ml.
Se preparan Estándar de 0, 1, 2, 5 10 y 20 µg de As tomando 0,1, 2,5, 10 y 20 ml de la

solución patrón C.
loduro de potasio 15%
Acetato de plomo 10% P/V.
Acido clorhídrico concentrado
Solución piridinica de dietilditiocarbamato de plata (DDCAg) 0.5%
Granallas de zinc
Ioduro de potasio 15% P/V.
Cloruro estannoso al 40% P/Ven ácido clorhídrico 60% V/V
• Procedimiento:
•
Una vez finalizada la mineralización se trasvasa cuantitativamente el contenido del
balón al erlenmeyer A del dispositivo de Vasac y Sedivec lavando el balón con cantidad
suficiente de agua destilada hasta un volumen de 25 ml. Paralelamente procesar un
blanco de reactivos sin mineralización previa. Agregar a continuación en 1 ml de ioduro
de potasio 15% más 10 ml de ácido clorhídrico concentrado. Dejar reposar 2 minutos y
agregar 0,5 ml de solución de cloruro estanoso y dejar 15 minutos en reposo. La solución
debe permanecer incolora o ligeramente turbia. Si en la etapa final de la mineralización
no se eliminó todo el oxidante, el cloruro se convierte en Cl2 y aparece color amarillo en
la solución).
Adaptar inmediatamente el tubo B que contiene algodón impregnado en acetato

de plomo y el tubo acodado C que contiene la solución piridinica de dietilditiocarbamato
de plata (DDCAg).
Finalmente se agregan tres granallas de zinc y rápidamente se cierra el equipo

asegurando que no existan pérdidas en las juntas. Trabajar en campana de extracción de
gases. Se deja burbujear (desprender hidrógeno) durante 30 a 45 minutos.
En presencia de arsenamina el reactivo argéntico adquiere color rojo. Se realiza

una curva de calibración con 5 patrones. Realizar la curva de calibración representando
Absorbancia vs. µg de As.
Leer la absorbancia del complejo formado a 540 nm y se calcula la concentración

de As en la muestra interpolando el valor de la absorbancia obtenida en una curva de
calibración.
Interpretación química de la reacción:
En el mineralizado el As se encuentra como AsO4H2. El agregado de ioduro de

potasio tiene por objeto transformar el AsO4H2- en AsO3H2- de acuerdo a la siguiente
reacción:
AsO4H2- + 2 H+ + 3I- Æ AsO3H2- + H20 + I3-
EI C12Sn además de actuar como despolarizante reduce el I3- formado:
I3- + 6Cl- + Sn2+ Æ 3I- + (Cl6Sn)2-
El Znº libera H naciente el cual reduce el AsO4H2- a arsenamina (AsH3)
La AsH3, al incidir sobre la solución piridínica de dietilditiocarbamato de plata que es

de color amarillo, forma con éste un complejo de color rojo. La reacción química es la
siguiente:
N(Et)2 N(Et)2 N(Et)2

C S C S
+ + C S As/3 +
AH3 SH H2O + Agº
SAg S
color rojo
El acetato de plomo se utiliza para eliminar la interferencia del SH2 que en este caso
estaría presente por las condiciones reductoras de estos ensayos lo que favorecería la
transformación del SO42- en SH2 .
Límite de cuantificación:
En las condiciones de trabajo precedentes el límite de cuantificación es de 0,5 µg%.

Esta técnica permite determinar As total y es útil para la investigación en intoxicaciones
agudas y crónicas, pero no sirve para el seguimiento biológico de trabajadores expuestos al
As inorgánico.
8.5.3 Intoxicación por Plomo.
Generalidades de la intoxicación
El origen de la intoxicación con Plomo puede ser:
Profesional: En la industria se usan compuestos organometálicos de Plomo como

antidetonantes. Revestimiento de cables, anticorrosivos, en pinturas y esmaltes (óxidos de
Plomo), imprentas de tipografía. En fundiciones e industrias de recuperación del metal.
Ambiental: El agua potable puede contaminarse a partir del polvo atmosférico. Las
tuberías de Plomo vuelcan el metal soluble al agua en condiciones ácidas.
En una intoxicación con Plomo, generalmente crónica, se verán afectadas

fundamentalmente dos enzimas de la vía de síntesis del Hem:
(a) Delta-ALA dehidratasa, que cataliza la conversión de ácido delta-amino

levulínico (delta-ALA) a porfobilinógeno en el inicio de la vía
(b) ferroquelatasa que cataliza la introducción del Fe+3 en el anillo de la
protoporfirina IX para dar lugar a la formación del Hemo.
Esto va a derivar en una porfiria secundaria o adquirida, que, en forma crónica, se

manifiesta en el conjunto de síntomas característicos que constituyen el saturnismo.
En laboratorio se determina el Perfil Plúmbico, que consiste en la cuantificación de

delta-ALA (aumentada) y coproporfirinas (aumentadas) en orina y delta-ALA dehidratasa
(disminuída) y Plomo en sangre (aumentado).
Por otro lado se buscará también el punteado basófilo característico.
• Investigación de intoxicación plúmbica
Determinación de Plomo en sangre (Plumbemia).
El método clásico para la determinación de Plomo en sangre es el método de Jacobs

modificado, que se basa en la formación del ditizonato de Plomo, una vez eliminados por
complejación y extracción los metales interferentes, y su lectura espectrofotométrica a 510
nm.
Las técnicas de absorción atómica son más rápidas y precisas. Tienen además muy
alta especificidad de manera que las interferencias son pocas. Por esto los pretratamientos
utilizados en las técnicas colorimétricas se simplifican enormemente. Raramente se usan para
el análisis cualitativo.
Los límites de detección para las técnicas de atomización en llama se encuentran en el

orden de los µg/ml y los volúmenes de muestra requeridos son de alrededor de 2 ml. Los
coeficientes de variación son de 2 a 0,1%.
En técnicas en donde se realiza una atomización en horno de grafito se requieren

volúmenes de muestra de alrededor de 50 µL, con límites de detección 10 a 100 veces
menores que en la atomización en llama. Los coeficientes de variación son de 10 a 1%.
Se describe a continuación la determinación de plomo mediante espectrofotometría

de absorción atómica en sangre por dos métodos:
1. Método del sobreagregado

2. Curva de calibración
En el método del sobreagregado, cantidades conocidas del analito es sobreagregado

a la muestra de sangre realizándose luego la hemólisis de la muestra. Se forma luego un
complejo metálico para realizar entonces una extracción en fase orgánica del mismo y la
posterior medida mediante atomización en llama.
La muestra de sangre se toma por punción venosa una vez desinfectada la zona con
alcohol, mediante jeringa descartable de plástico, previamente heparinizada. Se necesita del
paciente un ayuno de por lo menos 10 horas.
Todo el material a usar debe ser tratado previamente con ácido nítrico 1:1 durante
24 horas. Se enjuaga luego tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y
tres veces con agua bidestilada.
• Reactivos:
Pirrolidín ditio carbamato de amonio (APDC) 4%: Se pesan 4 gr de APDC y se llevan a 100
ml con agua bidestilada caliente. Luego se filtra en papel Whatman No4.
Tritón X-100 10%: Tomar 10 ml de Tritón X-100 y llevar a 100 ml con agua bidestilada tibia.
APDC 2%-Tritón 5%: Se mezclan volúmenes iguales de las soluciones anteriores que deben
ser preparadas en el momento de usar.
Metil isobutil cetona (MIBK): Por lo menos 24 horas antes, saturar en agua destilada MIBK,
dejando en contacto permanente ambos líquidos.
Solución madre de Plomo: Se pesan 1.5985 gr de (NO3 )2Plomo p.a. llevando a un litro con
ácido nítrico 1/1000. Se tendrá una solución de 1 mg/ml.
Solución testigo: 12,5 ml de la solución madre se llevan a 100 ml con ácido nítrico 1/1000.
Se tendrá una solución de 125 g/ml.(125 ppm).
• Equipos.
Espectrofotometro de absorción Atómica.
• Procedimiento:
1. Colocar 2,5 ml de sangre entera de la misma muestra en cada uno de dos tubos,
provistos de tapa y cierre esmerilado.
2. A uno de los tubos agregar una cantidad conocida, por ejemplo 0,1 ml, de la solución
testigo de Plomo.
3. Paralelamente se preparan un blanco con 2,5 ml de agua bidestilada y un tubo

testigo con 2,5 ml de agua bidestilada y 0,1 ml de la solución testigo.
4. A cada uno de los tubos que contienen sangre se les adicionan 1 ml de la solución
APDC-Tritón. Se agitan los tubos en Vórtex, hasta hemólisis completa, durante
aproximadamente 15 segundos.
5. A los tubos blanco y testigo se les agregará 1 ml de la solución APDC 4%, pues la
solución APDC-Tritón con el agua forma emulsiones muy difíciles de separar.
6. Se agrega luego a cada uno de los tubos 2,5 ml de MIBK, agitando en Vórtex
durante aproximadamente 30 segundos. Se debe verificar que la mezcla sea
adecuada. Se centrifugarán luego durante 10 minutos a 3000 rpm.
7. Finalmente se separarán las fases superiores de MIBK. La fase orgánica debe tomar
un leve color amarillo y de no ser así se debe sospechar una agitación insuficiente y
se recomienda repetir la operación.
8. Los extractos de MIBK se nebulizan en el atomizador de llama y se leen contra
MIBK, controlando el cero del aparato después de cada medida.
Expresión de los resultados, para los siguientes valores:

Abs muestra = M
Abs muestra más testigo = M + T
Cantidad de Plomo en muestra = P
Cantidad de Plomo sobreagregada = Pa
Absortividad = a
Longitud de la ranura del quemador = b
Volumen de la muestra = Vm
Volumen agregado de la solución testigo = Vt
Concentración del testigo en µg / ml = Ct
. .
Se tienen las relaciones M= a b Pa
Vm
. .
M+T=a b (Pa + P)
Vm + Vt
Despejando el valor de se llega a una relación, independiente de los valores de a y b,

del siguiente tipo
M Pa
P= M+T .
Vm + Vt - M____
Vm M+T
Multiplicando este valor por el factor Ct xVt/Vm se obtendrá la concentración de Plomo en

µg / ml.
b) Método empleando curva de calibración:
Este método es similar al anterior con las siguientes modificaciones: se construye

una curva de calibración con sobreagregado de plomo concentración conocida a 5 tubos de
muestra entera de sangre. La curva se construye de la siguiente manera:
De la solución madre de Plomo (1000ppm), tomar 12.5 ml y llevar a 100 ml con ácido
nítrico 1/1000.De esta manera se obtiene una solución de Plomo de 125ppm.
Realizar una curva de calibración con sangre de la siguiente manera
En 5 tubos se colocan 2.5ml de sangre en cada uno y agregar 0, 5, 10, 15, 20 microlitros de
la solución de Plomo de 125 ppm.
Tubo Microlitros de plomo de Concentración de plomo

solución 125 ppm
1 0 X
2 5 X+25 µg/ 100 ml Plomo
3 10 X+50 µg/ 100 ml Plomo
4 15 X+75 µg/ 100 ml Plomo
5 20 X+100 µg/ 100 ml Plomo
1. Agregar 2 ml de APDC y tritón y luego agitar en vórtex durante 60 segundos. Luego

agregar 2 ml de MIBK durante 30 segundos.
2. Todos los demás pasos se conservan tal cual, incluido el tratamiento de la muestra
problema (cantidades, concentraciones, etc.)
3. La sangre empleada para realizar la curva debe ser de banco asegurando que no
contiene plomo mas allá de los valores normales. Es conveniente siempre contar con
un vial con sangre y cantidad conocida de plomo sobreagregada (standard interno) a

modo de verificar los resultados obtenidos.
4. Debe recordarse que el material de vidrio debe estar escrupulosamente
manteniéndolo en ácido nítrico 1:1 durante 24 hs para luego lavarlo con agua
bidestilada.
Valores de referencia para la población de Capital Federal y alrededores
Niños no expuestos: 17 ± 8 µg %
Adultos no expuestos: 19 ± 7 µg %
Adultos expuestos: 57 ± 21 µg %
Valor límite para el sujeto expuesto: 70 µg % (según Working Conference,

Amsterdam 1968).
Determinación de Porfobirinogeno (PBG) orina. Ensayo rápido.
1. Se utiliza como muestra la orina recolectada en las condiciones correspondientes a

la determinación de coproporfirinas totales (pH = 7.8) ver item 5.3.2.4. ya que el
plomo se polimeriza en medio ácido dando uroporfirina.
2. En un tubo pequeño a 2 ml del reactivo de Erlich (2 g de p-dimetil
aminobenzaldehído en 50 ml de HCl y 50 ml de agua destilada) se agregan 1 - 2
gotas de orina. Al cabo de 2 segundos un desarrollo de color rosado a rojo al tope de
la solución indica un test positivo para PBG.
3. El color amarillo que se observa a veces, se debe a compuestos tales como urea y
urobilinógeno que no desarrollan color en esas condiciones hasta una concentración
de 200 mg/g.
4. En una intoxicación con Plomo se encontrarán valores de PBG en orina normales o
disminuidos. Si se hallaran valores aumentados, sería indicio que la porfiria
manifestada es de otra naturaleza, por ejemplo de tipo congénito.
Determinación de Acido Delta Aminolevulínico (delta ALA) en orina. Método de Berkó-

Durkó modificado, Clinical Chem. Lab., 1973.
La reacción se fundamenta en la reacción del delta ALA con acetilacetona dando un

compuesto pirrolico (2 metil, 3 acetil 4 – (3 propion) pirrol) que condensa luego con el
reactivo de Erhlich originado un compuesto rojo que se determina por espectrofotometría a
553 nm.
• Muestra:
Orina correspondiente a 24 horas recolectada en frasco oscuro conteniendo solución

saturada de ácido tartárico aprox. 1 ml/ 100 ml de orina.
• Reactivos.
1. Reactivo de Erlich modificado = 1 gr de p-dimetilaminobenzaldehído se disuelve en

35 ml de ácido acético glacial, se agregan 8 ml de ácido perclórico 70% y se lleva a
50 ml con ácido acético glacial.
2. Solución acetato de sodio 0.5 M: 41 gr de AcNa se disuelven en 1 litro de agua
destilada.
3. Solución AcH 0.5 M: 28.7 ml AcH glacial se llevan a 1000 ml con agua destilada.
4. Buffer acetato: 93.2 ml AcH 0.5 M más 6.8 ml AcNa 0.5 M (pH=3.5).
5. Solución diluyente: 0.25 gr de carbón medicinal se agregan a 100 ml de solución
buffer acetato 0.5 M.
6. Estándar de delta-ALA 400 µg/ml: se disolverán 4 mg de delta-ALA p.a. en buffer
acetato, llevando a 10 ml totales.
• Equipos.
Baño termostático
Centrífuga hasta 500 rpm
• Procedimiento:
1. Transferir 1 ml de orina (pH 6 – 6.5) a un tubo de centrífuga y agregar 9 ml de

solución diluyente. Mezclar durante unos minutos y centrifugar.
2. Filtrar por papel de filtro y transferir 2 alícuotas de 2 ml c/u del filtrado a

sendos tubos de ensayo B y D (Blanco y Desconocido, respectivamente). Al
tubo D se le agrega 0.1 ml de acetilacetona y ambos tubos se llevan a baño
María (BM) hirviente durante 20 minutos.
3. Se enfrían entonces los tubos en baño de agua y se le agrega 2 ml de
Reactivo de Erlich a cada una. Luego de 15 minutos se lee la absorbancia del
tubo D a 553 nm contra el tubo blanco.
4. La cantidad de delta ALA se obtiene a partir de una curva de calibración
expresada en µg/ml. Se tomarán soluciones de 50, 30, 10, 5 y 1 µg/ml,
diluyendo la solución standard original de 400 µg/ml. sobre ellas se realiza la
reacción de Erlich en forma análoga a la realizada sobre las muestras.
Observación: La reacción del delta ALA con el reactivo de Erlich es muy sensible aunque no
específica pues también la dan las aminocetonas y las glucosaminas. Desde el punto de vista
de la determinación del perfil plúmbico, estas interferencias no tienen relevancia en los rangos
de concentración de δ-ALA halladas en el saturnismo.
Valores normales 0.1 a 0.5 mg% para menores de 15 años

0.1 a 0.6 mg% para adultos
excreción urinaria 1.3 a 7 mg/24 hs.
Ensayo para porfirinas en orina.
Se trata de un test rápido cuyo resultado es positivo desde valores de concentración de

70 µg% (1 µmol/L).
Reactivos
Acido acético
Alcohol amílico
Eter etílico
Procedimiento
En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de una mezcla de igual volumen (1:1:1) de ácido

acético, alcohol amílico y éter dejando caer sobre ella 15 ml de orina. Luego de 2 minutos el
reactivo habrá extraído la mayor parte de las porfirinas presentes por lo que se separara una
capa superior en el tubo. Si esta capa superior muestra fluorescencia roja, el test es positivo.
El ensayo se puede hacer más sensible transfiriendo la fase orgánica superior con una
pipeta Pasteur a otro tubo conteniendo 1 - 2 gotas de HCl. Se agita fuertemente (10 - 20
seg) y se observa la capa clorhídrica inferior a la luz UV.
También puede hacerse una prueba mediante 10 ml de orina, 0.5 ml de AcH glacial y
talco, agitando vigorosamente, para observar la fluorescencia en el tubo.
Determinación de coproporfirinas totales en orina. A.A.Fernández; R.J. Henry,

H.Goldenberg Clin. Chem. 12, 463 - 474, (1966).
El método se fundamenta en la extracción de coproporfirinas a pH adecuado con acetato

de etilo para la posterior oxidación del coproporfirinógeno remanente a coproporfinas que
luego se extraen con ácido clorhídrico y posterior lectura en espectrofotómetro a tres
longitudes de onda a efectos de corregir las interferencias
Muestra:
Orina correspondiente a 24 horas recolectada en un frasco oscuro conteniendo

CO3Na2 como conservador en cantidad suficiente para una concentración final de 0.1 -
0.5%. El CO3Na2 tiene como finalidad de evitar las pérdidas de coproporfirinas
fundamentalmente, conservando a pH 5 - 9.5. En estas condiciones, la mayor parte de los
coproporfirinógenos pasarán a coproporfirinas.
Reactivos
1. Acetato de sodio 1%: 10 g de sal anhidra o 16,6 g de acetato de sodio trihidratado

se disuelven en agua y se llevan a 1000 ml. La solución es estable varias semanas a
temperatura ambiente.
2. Buffer acetato de sodio (pH = 4,8): se mezclan 1 vol. de acético glacial con 4 vol. de
solución saturada de acetato de sodio y 3 vol. de agua.
3. Solución saturada de acetato de sodio: la saturación se facilita mucho disolviendo el
acetato de sodio a 70 - 80o C. Si el acetato de sodio no cristaliza al enfriarse el agua, se
calienta de nuevo la solución y se añade más sal. Se puede usar sal anhidra o trihidratada.
4. Solución alcohólica de iodo al 1% (de reserva): Se disuelve 1 g de iodo en alcohol y
se diluye hasta 100 ml. Conservar en heladera en frasco oscuro con tapón de vidrio.
5. Solución de iodo al 0,005%: se diluyen 0,1 ml de la solución de reserva en agua
destilada hasta 20 ml. Se debe preparar en el momento de usar.
6. Acido clorhídrico 1,5N se añaden 12,5 ml de HCl a 50 ml de agua destilada
aproximadamente y se diluye hasta 100 ml.
• Equipos:
Espectrofotómetro UV visible.
• Procedimiento:
1. Se debe controlar el pH de la orina con papel indicador de manera que se

encuentre en el rango de 5 a 9.5; no se debe trabajar con muestras cuyo pH
sea inferior a 5.
2. Posteriormente, se debe examinar la muestra de orina a la luz UV y si tuviera
fluorescencia roja se debe diluir la misma con agua en una relación 1:10.
3. A 20 ml de orina se le agregan 10 ml de buffer acetato (pH = 4.8) y se
transfiere a una ampolla de decantación. Se le agregan 30 ml de acetato de
etilo y se agita suavemente durante 3 a 5 minutos. Se deja reposar y se
descarta la fase acuosa.
4. La fase orgánica se lava 3 veces con 5 ml de acetato de sodio 1% cada vez.
Se colectan los extractos orgánicos, descartándose la fase acuosa y se
agregan 2 ml de solución de iodo al 0.005% preparada en el momento, no
dejando más de 5 minutos en contacto ya que el tiempo es crítico. Se
desecha la solución de iodo y finalmente se efectúan tres extracciones o
hasta que la capa orgánica no presente fluorescencia, con 2.5 ml de HCl 1.5
N cada vez. Se recoge el extracto clorhídrico en un tubo graduado midiendo
este volumen.
5. En forma alternativa puede realizarse una separación mediante el sembrado

de 1 ml de orina en una columna de intercambio aniónico Dowex 1X8,
dejando eluir con 3 ml de agua destilada. Se eluyen luego las porfirinas con
HCl 3 N hasta fluorescencia negativa.
6. A continuación, se lee la absorbancia del extracto clorhídrico a tres diferentes:
380, máximo entre 400 y 410 (generalmente 402) y 430 nm.
A corregida = 2 A max - (A 380 + A 430 )

1.835
Coproporfirinas (µg/24 hs) = A corregida . V c .V t . D

ε . V alícuota orina
donde:
A 380 y A 430 : indican absorbancia a 380 y 420 nm, respectivamente

A max : indica la absorbancia máxima en el rango 400 - 410 nm
Vc : volumen total de los extractos clorhídricos
Vt : volumen total de orina recolectada en 24 hs.
D: factor de dilución, si se diluyó la orina
ε: coeficiente de extinción (ml/µg) de coproporfirinas en HCl 1.5 N = 0.673
Valores normales = 0 - 160 µg / 24 hs.
Determinación de la actividad de la enzima Delta- aminolevulinico dehidratasa. Berlin,

A; Schaller, H.M.. Klim. Chim. Klim. Biochem., 12, 389-390 (1974).
• Muestra:
Se utiliza sangre entera que debe ser recogida con jeringa descartable de plástico
usando heparina como anticoagulante, en un volumen mínimo de 1 ml. No deben emplearse
NaF ni EDTA debido a que inhiben la actividad enzimática. La misma muestra puede usarse
para la determinación del hematocrito y Plomo.
La muestra se mantendrá en heladera a 4oC hasta su procesamiento. Se recomienda

efectuar la determinación en el día de recolección, pues la actividad enzimática desciende
en un 12% a 15% luego de 24 horas.
El material de vidrio deberá ser preferentemente de borosilicato. Para ser utilizado es

necesario tratarlo previamente con HNO3 1:1 durante 24 horas. Posteriormente enjuagarlo
tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua
bidestilada, para evitar cualquier contaminación. El material de plástico será
preferentemente de polipropileno.
• Reactivos:
1. Buffer fosfato: 29 ml de fosfato disódico 0.1 M con 71 ml de fosfato monosódico 0.1

M. Ajustar el pH a 6.4 con la solución correspondiente. Mantener en heladera a 4oC.
2. Buffer sustrato: disolver 0.01676 gr de µ-ALA p.a. en 5 ml de fosfato monosódico 0.1
M, llevar a pH 6.4 con fosfato disódico 0.1 M. Completar a 10 ml con buffer fosfato de
pH 6.4. Se conservará en freezer a -18oC.
3. Reactivo de Erlich: Disolver 0.24 gr de p-DMAB en 7.2 ml de ácido acético glacial,
posteriormente agregar 1.92 ml de ácido perclórico, completando a un volumen de
12 ml con ácido acético glacial. Se prepara en el momento de usar o se mantiene en
heladera a 4oC.
4. Ácido tricloro acético (TCA) 10%: Pesar 10 gr de TCA y disolver en 100 ml de agua
destilada.
• Equipos.
Baño termostatito
Centrífuga
• Procedimiento:
1. A un volumen de 0,2 ml de sangre agregar 1,3 ml de agua bidestilada y 1,0 ml

de buffer sustrato. Se produce la hemólisis total de la muestra de sangre.
2. Paralelamente se procesa un blanco con 0.2 ml de sangre a la que se le
agrega 1,3 ml de agua bidestilada, 1 ml de TCA 10% y 1 ml de buffer
sustrato. Incubar los tubos de blanco y muestra durante 60 minutos a 38oC; el
tiempo de incubación se empieza a contar desde el agregado de buffer
sustrato a las muestras.
3. Cumplido el tiempo de incubación, se le agrega al tubo de muestra 1 ml TCA
10%. Se centrifugan luego todos los tubos durante 10 minutos a 2000 RPM.
4. Reacción de color: A un volumen de 1.5 ml del centrifugado agregar 1.5 ml de
reactivo de Erhlich. Mezclar en Vórtex y leer luego de 10 minutos las
absorbancias respectivas contra reactivo de Erhlich a 555 nm.
Act delta ALA DEHIDRATASA = Abs x 100 x f x D

Hto x t x εm
donde:
Abs. Es la absorbancia de la muestra menos la Absorbancia del blanco
εm: coeficiente de extinción molar en l / µmol. cm = 0.062
Act ALA DEHIDRATASA: en U/ L de hematíes
f: factor de conversión de deltaALA a Plomo = 2
D: factor de dilución = 35
t: tiempo de incubación.
Valor de referencia para la actividad enzimática en sujetos sanos no expuestos al plomo:

mayor a 20 U / L hematíes
Determinación de Plomo en una muestra de alimentos de origen vegetal por el

método de absorción atómica.
La determinación de la concentración de Plomo se puede realizar sobre cualquier

tipo de una muestra de alimentos, en este caso se presenta el protocolo ya puesto a punto
para el caso de muestras de producto vegetales y en particular tomate enlatado.
El primer paso del análisis, consiste en una digestión de la materia orgánica (DMO)
para volver más sencilla la matriz que contiene el analito, así como obtener una solución
límpida y más fluida que la muestra original, hecho que facilita el proceso de inyección de la
muestra.
• Reactivos.
Ácido nítrico concentrado libre de plomo.
• Equipos.
En este caso se describe el procedimiento para un equipo Shimadzu AA-6701F

provisto de un quemador con cámara de premezclado y horno de grafito.
Digestor de microondas “CEM modelo MDS 2100”.
• Procedimiento.
La DMO se realiza en un digestor de microondas especialmente diseñado. Se pesan

0,5 gr. de la muestra a digerir, y se colocan dentro de un vaso especial, junto con 5 ml de
ácido nítrico concentrado de calidad pro-análisis, mas 1 ml de agua desionizada.
Los tubos de digestión y la tapa de ellos son de teflón. En la tapa se distingue una
válvula de seguridad, a la cual debe acoplarse un tubo que conecta el vaso con un
recipiente situado en el centro del aparato, este recipiente sirve como trampa para los
vapores nitrosos que salen del vaso, y/o para recibir cualquier sustancia que salga del vaso.
La válvula de seguridad debe revisarse en cada utilización del aparato, esta consiste en una
membrana, semipermeable, que permite la salida del vapor contenido en el vaso si la
presión desarrollada dentro de este resulta excesiva. La tapa se ajusta al vaso, por medio de
un cierre a rosca hecho de keblar. Una vez cerrado el vaso, se encamisa con un tuvo hecho
del mismo material que el cierre.
Luego de armar los vasos con las muestras a digerir, se disponen en un carrusel
situado dentro del horno, y se conecta el tubo de seguridad que corresponde a cada uno.
Uno de los vasos que se utiliza tiene una tapa diferente a las otras. Esta estará provista de
tres salidas, una se usa para introducir una fibra óptica que hace las veces de sensor de
temperatura, a otra de las salidas se conecta el sensor de presión, y la última se utiliza para
acoplar el tubo de seguridad.
Una vez que se introdujeron todos los vasos a utilizar, se procede a la programación
del esquema de calentamiento. Se elige es la presión y temperatura usada durante ese
proceso. Antes de comenzar la digestión, limpiar escrupulosamente los vasos, las tapas, los
cierres, y las camisas de los vasos, con un paño limpio y seco.
Al terminar el proceso, se debe esperar a que se enfríen los vasos para que
disminuya la presión en ellos, luego, se retiran los vasos, se trasvasa su contenido a un
matraz de 10 ml y se lleva a volumen con ácido nítrico 15%.
La digestión debe ser evaluada por el operador, considerándose terminado el

proceso, cuando el producto sea una solución límpida, sin residuos sólidos. Si esto no
sucede, se debe someter la muestra a un nuevo ciclo de digestión.
Curva de calibración:
La determinación de la cantidad de Plomo en la muestra se realizara en base a una

curva de calibración que se confecciona con una serie de soluciones estándar. Estas
soluciones son preparadas a su vez, a partir de una solución madre comercial pro-analisis
cuya concentración es 1000 mg/L, o 1000 ppm. El metal se encuentra por lo general en
forma de nitratos o sulfatos solubles, esta solución esta casi libre de la presencia de otros
metales. Las soluciones que se recomiendan en general son: 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 30
ppm, 50 ppm.
Estas soluciones se prepara tomando 50 ml de la solución madre, que se llevan a

500 ml con agua destilada desionizada. Con eso se tiene una solución de concentración
igual a 100 ppm de plomo. De esta se preparan las soluciones estándar, tomando 0.5 ml, 1
ml, 1.5 ml, 3 ml, 5 ml, para luego llevar a un volumen final de 100ml con ácido nítrico 15%.
Además se usara una sexta solución patrón para definir el 0 de concentración, este no es
mas que una solución de ácido nítrico 15%.
Cálculos:
La concentración en la muestra se determina mediante la siguiente expresión:
ppm = [ ppb.leida ] * 0.02
8.5.4 Intoxicación por Cromo.
Generalidades de la intoxicación.
El cromo es un importante metal (y oligoelemento) desde el punto de vista de la

higiene industrial y ambiental, si bien al ser mucho más irritante que tóxico es excepcional
que produzca cuadros clínicos sistémicos graves.
El uso principal son las aleaciones férricas (nicromo, cromel, aceros al cromo),
seguidas de las no férricas (stelita [Cr,Co,Wol). En las técnicas de cromado se utiliza en
grandes cantidades, como protección contra la corrosión, siendo quizá ésta la causa más
frecuente de patología grave en el ámbito ocupacional. Las sales de Cr(III) son utilizadas en
técnicas de curtido de cuero. Por último, los cementos, procesadores fotográficos, tintes y
algunas pinturas, mordientes textiles, litografía, escorias de altos hornos y fundición y
metalurgia del Mg, desechos de industrias de cromado, son potenciales fuentes de
exposición a compuestos crómicos.
Toxicidad y manifestaciones clínicas.
La acción fundamental de las sales crómicas es su carácter irritante. El efecto es

intenso para las sales de Cr(VI), que son oxidantes potentes, y poco manifiesto en las de
Cr(III). Los aniones acuosos del cromo son fuertes acomplejantes, sobre todo los de Cr(VI).
Por ello, no sólo su acción oxidante es motivo de irritación e incluso quemadura de tejidos,
sino que la acomplejación, favorece la producción de aductos con proteínas, que pueden
actuar como antígenos sensibilizantes, y desencadenar una respuesta alérgica de
intensidad variable. Aunque el Cr(VI) absorbido, tiene tendencia a formar compuestos de
Cr(III) menos tóxicos en el interior de la célula, si la dosis absorbida es masiva, las sales de
cromo generan lesiones renales y, en menor grado, hepáticas.
La exposición a polvos de Cr(VI) (aplicaciones metalúrgicas, trabajadores del

cemento) o aerosoles (técnicas de cromado) causan irritación local. La lesión característica
es la dermatitis química irritativa, de tipo eccematoso, que aparece en las zonas expuestas,
como dedos de la mano, borde de apoyo del guante, etc. Dichas lesiones tienen una base
química irritativa constante, con un factor de sensibilización variable. Si la concentración de
sales de cromo es pequeña, la dermatitis se manifiesta como un eccema alérgico variable,
Por el contrario, si la concentración de sales de cromo es suficiente, evolucionan a úlceras
de bordes poco definidos, curso tórpido e indoloro.
La inhalación de polvos o aerosoles ocasiona lesiones en vías respiratorias

superiores, cuya localización depende del tamaño de los gránulos de polvo, pero que, en
general, se localizan en la mucosa nasal. Se observa rinitis, con epistaxis y sensación de
sequedad. En las fases siguientes aparecen úlceras que en las épocas tempranas de la
medicina del trabajo llegaban a ser perforantes.
Los niveles normales de Cromo en suero son 1,58 + 0,08 µg/L. La eficacia de los
controles biológicos es escasa, pues los niveles de cromo son próximos a los límites de
detección y se suele recurrir a técnicas de concentración de muestras para el análisis, con lo
cual la probabilidad de error por contaminación o defecto instrumental es alto.
Investigación de cromo en muestras de aguas por el Método colorimétrico.
Este procedimiento mide únicamente el cromo hexavalente, por tanto, para

determinar el cromo total hay que convertir todo el cromo forma hexavalente oxidando con
permanganato potásico. El cromo hexavalente se determina colorimétricamente por una
reacción con difenilcarbazida solución ácida. Se produce un color violeta de composición
desconocida. La reacción es muy sensible, siendo la capacidad de absorción molar, basada
en el cromo, de aproximadamente 40.000 L.g-1 a 540 nm. Para determinar el cromo total, se
digiere la muestra con mezcla ácida sulfúrico-nítrico y luego se oxida con permanganato
potasio antes de la reacción con la difenilcarbazida.
Las interferencias principales son las sales de molibdeno y mercurio. La reacción con
la difenilearbazida es prácticamente específica para el cromo. Las sales de molibdeno
hexavalente y de mercurio reaccionarán para formar color con el reactivo pero las
intensidades son mucho más bajas que para el cromo al pH especificado. Se puede tolerar
concentraciones de hasta 200 mg Mo o Hg. El vanadio, interfiere fuertemente, pero las
concentraciones hasta 10 veces las del cromo no causarán problemas. La interferencia
potencial de permanganato se elimina por reducción previa con azida.
El hierro, concentraciones superiores a 1 mg/L pude producir un color amarillo, pero

color de ion férrico (Fe+3) no es fuerte y normalmente no se encuentran dificultades si se
mide la absorbancia fotometricamente a la longitud de onda apropiada. Las cantidades de
molibdeno, vanadio, hierro y cobre que interfieren pueden eliminarse por extracción de los
cupferratos de estos metales con cloroforno. Existe un método de extracción, pero no se
debe utilizar a menos que sea necesario, pues el cupferrón y el cloroformo residuales en la
solución acuosa complican la posterior oxidación. Por lo tanto, sígase la extracción por
tratamiento adicional de ácido fumante para descomponer estos compuestos.
• Equipos.
Espectrofotómetro, para utilizarlo a 540 nm con un trayecto luminoso de 1 cm o más largo.
• Reactivos.
1. Solución de cromo de reserva: Disolver 141,4 mg de K2Cr2O7 en agua y diluir hasta

1.000 ml; 1.00 = 50,0 µg Cromo.
2. Solución de cromo patrón: Diluir 10.0 ml de solución de de reserva hasta 100 ml;
1.00 = 5.00 µg Cr.
3. Acido nítrico, concentrado.
4. Acido sulfúrico (1+1)
5. Solución de indicador naranja de metilo
6. Peróxido de hidrógeno (30 %).
7. Hidróxido amónico, concentrado
8. Solución de permanganato potasio: Disolver 4 g de KMnO4 en 100 ml de agua.
9. Solución de azida sódica: Disolver 0,5 g de NaN3 en 100 ml de agua
10. Solución defenilcarbazida: Disolver 250 mg de 1,5-difenilcarbazida en 50 ml de
acetona. Conservar en frasco oscuro. Descartar cuando la solución se decolora.
11. Cloroformo
12. Solución de cupferrón: Disolver 5 g de cupferron C6H5N(NO)ONH4 en 95 mI de agua.

13. Ácido fosfórico concentrado
14. Ácido sulfúrico Diluir 17 ml de H2SO4 6N hasta 500 ml con agua bidestilada.
• Procedimiento.
Preparación de la curva de calibración:
Para compensar posibles pérdidas ligeras de cromo durante la digestión u otras

operaciones analíticas, tratar los patrones de cromo por el mismo procedimiento que la
muestra. Para ello, tomar volúmenes de solución de cromo patrón (5 µg/ml) que varan entre
2.00 y 20.0 ml, para obtener patrones de 10 a 100 µg Cr, a matraces de 250 ml. Estos
patrones deben ser tratados como si fueran muestras, realizándose el tratamiento de
cupferrón de los patrones si ha sido requerido para las muestras.
Para el desarrollo del color se procederá como en el caso de las muestras. Se toma
una porción adecuada de cada solución coloreada a una célula de absorción de 1 cm y se
mide la absorbancia a 540 nm. Debe utilizarse agua destilada como referencia. Se debe
corregir las lecturas de absorbancia de los patrones restando la absorbancia de un blanco
de reactivo que ha sido trabajado con el mismo método. Luego se realiza la curva de
calibración llevando valores de absorbancia corregidos frente a microgramos de cromo en
un volumen final de 102 ml.
Tratamiento de la nuestra:
Si la muestra está sin filtrar y se desea determinar el cromo total, debe realizarse una
digestión de la materia orgánica (DMO) con HNO3 y H2SO4 como se indica en la sección
DMO.
Eliminación de molibdeno, vanadio, hierro y cobre con cupferrón:
Se toma una porción de muestra digerida que contenga entre 10 y 100 µg Cr a una
ampolla de separación de 125 ml y se diluye a aproximadamente 40 ml con agua destilada
y se enfría en baño de hielo. Se añade 5 ml de solución de cupferrón enfriada con hielo,
agitando bien y se deja reposar en el baño de hielo durante 1 minuto. Se realizan tres
extracciones con 5 ml de CHCl3; dejar separar las capas y se descarta el extracto
cloroformico. La solución acuosa extraída se pasa a un elernmeyer de 125 ml y se lleva a
ebullición durante aproximadamente 5 minutos para volatilizar el cloroformo. Luego de
enfriar, se añade 5 ml de HN03 y 3 ml de H2SO4. Hervir las muestras hasta la aparición de
humos de S03. Enfriar ligeramente y añadir cuidadosamente 5 ml de HN03 y llevar de nuevo
a ebullición hasta el desprendimiento de humos para completar la descomposición materia
orgánica. Enfriar y repetir la operación hasta total desprendimiento de humos de S03 para
eliminar todo el HN03 .Enfriar y añadir 25 ml de agua.
Oxidación de cromo trivalenle:
Tomar 125 ml una porción de muestra digerida que contenga entre 10 y 100 µg Cr.
Empleando indicador naranja de metilo, añadir NH4OH concentrado hasta que la solución
sea justo básica al naranja de metilo. Añadir H2SO4 1 + 1, gota a gota, hasta que se vuelva
ácida, más 1 ml (20 gotas) adicional. Ajustar el volumen a aproximadamente 40 ml, añadir
un pedacito de plato poroso y calentar a ebullición. Añadir dos gotas de solución de KMnO4,
para obtener un color rojo oscuro. Si se empalidece, añadir KMnO4, gota a gota, hasta
mantener un exceso de aproximadamente dos gotas. Hervir 2 minutos más y añadir 1 ml de
solución de NaN3 y continuar una suave ebullición. Si el color rojo no desaparece por
completo después de una ebullición de aproximadamente 30 segundos, añadir otro ml de
solución de NaN3. Continuar la ebullición un minuto más después de desaparecido el color
por completo y enfriar a continuación. Añadir 0,25 ml (cinco gotas) de H3PO4.
Desarrollo del color y medida:
Utilizar H2SO4, 0,2 N y un pHmetro para ajustar la solución a pH 1,0 + 0,1 Pasar la
solución a un matraz volumétrico y diluir hasta 100 ml y mezclar. Añadir 2,0 ml de solución
de difenicarbazida, mezclar y dejar reposar 5 a 10 minutos para el total desarrollo de color.
Pasar una porción apropiada a una célula de absorción de 1 cm y medir la absorbancia a
540 nm. Utilizar agua destilada como referencia. Corregir la lectura de la absorbancia
restando la absorbancia de un blanco tratado con el mismo método. Determinar los
microgramos de cromo presentes a partir de la absorbancia corregida por referencia a la
curva de calibración.
Cálculos
µg Cr (en 102 m) de volumen final) x 100
AxB
donde:
A = ml de muestra original, y
B = ml de porción de 100 ml digerida.
Bibliografía
SALTZMAN, B. E. 1952. Microdetermination of chrornium with diphenylearbazide by

permanganate oxidation. Anal. Chem. 24:1016.
URONU, P. F. 1955. Stability of` colorimetric reagent for chromium, 5-diphenylcarbazide, in

various solvents. Anal. Chem. 27:1354.
ALLEN, T. L. 1958. Microdetermination of chromium with 1,5-dipheny1carbohydrazide. Anal.

Chem. 30:447.
SANDFLL, E. B. 1959. Colorimetric determination of traces of metals, P ed. Interscience

Publishers, Nueva York.
Chomium. Scientific Reviews of Soviet Literature on Toxicity and Hazards of Chemicals 68,
Centre of International Projects, GKNT, Moscow, USSR, 1984.
ALCEDO, J. A.; WETTERHAHN, K. E. Chromium toxicity and carcinogenesís. Int. Rev. Exp.
Pathol. 31: 85-108 (1990).
JONES, R. E. Hexavalent chrome: threshold concept for carcinogenicity. Biomed. Environ.

Sci. 3: 20-34 (1990).
WOOD, R.; MILLS, P. B.; KNOBEL, G. J.; HURLOW, W. E.; STOKOL, J. M. Acute
dichromate poisoning after use of traditional purgatives. A report of 7 cases. S. Afr. Med. J.
77: 640-642 (1990).
LANGARD, S.; NORSETH, T. Chromium. En: Friberg, L.; Nordb-érg, G. F.; Vouk, V. (eds.).
Handbook on the Toxicology of Metals. Elsevier, Arnsterdam, 1990, págs. 185-210.
WEDEEN, R. P.; QIAN, L. F. Chromium-induced kidney disease. Environ. Health Perspect.

92: 7174(1991).
STOKINGER, H. E.; Vanadium. En: Clayton, G. D.; Clayton, F. E. (eds.). Pattys Industrial
Hygiene and Toxicology. Wiley Interscience. New York, págs.1589-1605.
MASSON, S. Affections imputables aux derives mineraux du chrome. Université de Paris VII,
Faculté de Médecine Xavier-Bichat, Paris, France, 1982.
SHEEHAN, P. J.; MEYER, D. M.; SAUER, M. M.; PAUSTENBACH, D. J. Assessment of the

human health risks posed by exposure to chromium-contaminated soils. J. Toxicol. Environ.
Health 32: 161201(1991).
Capítulo 5, “Preparation of samples for metals analysis”, de “Sample Preparation Techniques

in Analytical Chemistry”, edited by Somenatah Mitra, Wiley Interscience, 2003.
Toxicological Profile for Arsenic, US Department of Health and Human Services, Public
Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry, September 2000.
Informe sobre el Arsénico en Argentina (métodos de tratamiento),

www.ingenieroambiental.com.ar, 1999.
The Enigma of Arsenic Carcinogenesis: Role of Metabolism, Toxicological Sciences, 49 – 5-

14, 1999.
WEN-YI CHEN et al, Analytical Sciences©The Japan Society for Analytical Chemistry..
Determination of Total Mercury and Methylmercury in Human Hair by Graphite-Furnace
Atomic Absorption Spectrophotometry Using 2,3-Dimercaptopropane-1-sulfonate as a
Complexing Agent. , March 2002, VOL. 18 255, 2002
MICHAEL KRACHLER et al, Fresenius J.Anal.Chem, editado por Springer-Verlag.

Microwave digestion methods for the determination trace elements in brain and liver samples
by inductively coupled plasma mass spectrometry, 355:120—128, 1996.
Principles of Toxicology: Environmental and Industrial Applications 2nd Ed., a Wiley-

Interscience Publication Wiley & Sons, Inc., New York, 2000.
Research Plan for Arsenic in Drinking Water, EPA, Review Draft, December 1996.
Method for Identifying Arsenic Species in Urine for Use in Exposure and Epidemiology
Studies, National Exposure Research Laboratory – September 2000.
Preconcentration of Arsenic Species of Environmental Waters by Solid Phase Extraction

using Metal-loaded chelating resins, Minoru Tanaka et al, Analytical Sciences 2001, Volume
17, Supplement, The Japan Society of Analytical Sciences.
Capítulo 9
Estudio de restos de deflagración de pólvoras por
métodos químicos e instrumentales.
Autor:
Doctor Luis Alberto Ferrari

Profesor Titular de la Cátedra Toxicología y Química Legal de la Universidad de Morón.
Perito Químico, Jefe del Laboratorio Toxicología y Química Legal del Poder Judicial.
Balística Forense.
La balística es la disciplina que estudia integralmente las armas de fuego, el alcance

y dirección de los proyectiles que disparan y los efectos que producen. Según la Real
Academia Española es el arte de medir el alcance y dirección de los proyectiles.
Para su estudio se la subdivide en:
• Balística interior: correspondiendo todo lo relativo a la estructura, mecanismo,

funcionamiento, carga y técnica del disparo del arma de fuego, hasta que el
proyectil disparado abandona la boca del cañón.
• Balística exterior: estudia los efectos producidos por el proyectil, desde que
abandona la boca del cañón del arma, hasta que llega al punto objetivo u otro
que el azar determine considerando la gravedad, resistencia del aire y obstáculos
que se le puedan interponer.
• Balística de efectos: corresponde al estudio de los efectos producidos por el
proyectil desde que abandona la boca del cañón del arma disparada
considerando el efecto de rebotes, choques, perforaciones, etc. hasta que incide
sobre el punto que el azar determine por desviación de trayectoria, cuyas causas
habrán de determinarse con la investigación criminal.
Arma: es todo aquello que potencia la fuerza humana.
Arma de fuego: es aquella que utiliza la propulsión de la pólvora para sus fines.
Arma corta o de puño: son las que se transportan y disparan con una sola mano (pistola y
revólver).
Armas largas o de hombro: las que además de transportarlas con una mano se utiliza el
hombro para dispararlas.
En este trabajo se exponen dos de las armas cortas o de puño: Pistola (Fig. 9.1) y
Revolver (Fig. 9.2).
9.2 Partes constituyentes del arma corta.
Culata: destinada a sujetar el arma.
Armadura: sostén de las otras piezas, lleva impreso el sello característico de la casa
fabricante y la numeración de serie. Esto es importante cuando se investiga la procedencia
del arma. Si se encuentra borrado o adulterado se procede al revenido o tratamiento para
revelar la numeración original.
Cañón: tubo por donde sale el proyectil. Tiene cuerpo, ánima y bocas. El cuerpo es variable
según el calibre y longitud del cañón. En los cañones cortos el tiempo de paso del proyectil
es reducido, la combustión de la pólvora es incompleta y por ende la velocidad y energía de
arribo disminuyen. Lo inverso ocurre con los cañones largos, los componentes de la carga
propulsora que constituirán el tatuaje se proyectarán también a distinta distancia según la
longitud del cañón para un mismo calibre.
Fig. 9.1: Pistola.

Fig. 9.2: Revólver.

Anima: es la superficie interior del cañón que puede ser lisa o rayada. El caso del rayado o
estriado imprime al proyectil un efecto giroscópico que asegura el alcance, penetración,
estabilidad en la trayectoria y precisión en el disparo. Este rayado adquiere la característica
del arma y deja en la superficie del proyectil, además de las señales comunes a todas las
armas de este tipo, características que la identifican y diferencian de las demás.
9.2.1 Tipos de armas cortas.
Revólver.
El utilizado es del calibre 32 largo, además de las características señaladas para

armas de fuego de puño, es de simple y doble acción con sistema de puntería compuesta de
alza y guión fijas. Presenta un cilindro apto para alojar hasta 6 cartuchos. El mencionado es
de fácil adquisición en los comercios del ramo por lo cual se toma éste, como tipo para las
experiencias de disparos. Además es bastante corriente en hechos delictuosos.
Pistola.
Esta es de simple acción, de carga automática y fuego semiautomático, con tres

sistemas de seguridad, a llave sobre el lado izquierdo, de cargador y de primer monte de
martillo percutor, con un cargador apto para alojar hasta 13 cartuchos pudiendo albergar uno
más en su recámara.
Cartucho/s.
Es el elemento formado por la vaina, el proyectil y la carga balística (unidad

funcional). Esta última constituida por fulminante y pólvora (Fig. 9.3).
Vaina: es la que contiene a las demás partes que integran el cartucho, es decir, es el
soporte del cartucho.
Bala o proyectil: cuerpo que será arrojado. En esta experiencia, proyectil único de plomo.
Carga propulsora
Sustancia cuya explosión libera energía necesaria para propulsar el proyectil y en el

caso de la pistola aprovecha la inercia para tirar la corredera hacia atrás, en el viaje de
cierre, arrastrar el cartucho siguiente y dejarlo presto para el próximo disparo.
Fulminante:
Es un explosivo muy poderoso y sensible que detona por estímulo externo, golpe de
la aguja percutora produciendo fuego. Sustancias tales como fulminato de mercurio, bario,
antimonio entre otras, producen la activación de la pólvora.
Fig. 9.3: Cartucho con fulminante tipo Berdan.
9.3 Obtención de halos de ahumamiento, proyectiles y restos de

pólvora.
Con cartuchos a los cuales se les retiró el plomo y en su lugar se colocó algodón, se
procede a cargar el arma y efectuar disparos, por ejemplo, en géneros de color blanco y del
tipo jean, con el cañón apoyado sobre las mencionadas telas, a distancias de 20 cm, 40 cm
y superiores a 50 cm. Como soporte de las telas se utiliza papel de diario prensado con un
espesor de aproximadamente 15 cm, de manera de absorber el cúmulo de gases y pólvora
incandescentes como consecuencia del disparo (Fig. 9.4).
Cabe señalar que en una causa penal, donde es necesario establecer si la víctima de
un disparo sufrió el impacto con el arma apoyada (en caso de suicidio u homicidio, a corta o
mediana distancia) es necesario realizar experiencias de disparos con el arma incriminada y
tratar de utilizar cartuchos del mismo año y lote de fabricación, con el objeto que la carga
impulsora, sea semejante a la sustancia que poseía la vaina incriminada antes de la

producción del hecho.
Las telas a utilizar en cada uno de los ensayos de disparo se manipulan con sumo
cuidado aplicándose la técnica de Peter Griess Von Illoswa, que se detalla mas abajo para
análisis químicos de restos de deflagración de pólvora.
Fig. 9.4: Halo de ahumamiento.
Posterior a la aplicación de la técnica se levantan de la mano con la que se efectuó el

disparo, restos de combustión de pólvora, mediante algodón embebido en ácido nítrico al
5%, para procesar en el espectro fotómetro de absorción atómica y efectuar las
interpretaciones pertinentes.
9.4 Análisis químico de restos de deflagración de pólvora en
prendas.
9.4.1 Colorimetría por diazotación-copulación.
• Reactivos:
Acido sulfanílico al 0,5% en agua.

Solución al 0,5% de alfa-naftilamina en metanol.
Papel fotográfico desensibilizado.
• Procedimiento:
Se utiliza la técnica de Peter Griess von Illoswa para el revelado de restos de pólvora
deflagrados. En primer lugar se realiza el análisis de las zonas perforadas en la ropa en
cuestión mediante lupa binocular para observar partículas de pólvora parcialmente quemada
alrededor de los orificios.
En segundo lugar, se practican las reacciones específicas de caracterización

cualitativa de restos de combustión incompleta de los propulsores del proyectil y permiten
individualizar los nitritos presentes. Las técnicas se basan en la conversión de los mismos
en un azocolorante.
Se utiliza papel fotográfico desensibilizado (sin la sal de plata del papel), dejando
solamente la gelatina, tratado con una solución de ácido sulfanílico al 0,5% en agua y luego
dejado secar. El papel secado es entonces tratado con una solución al 0,5% de alfa-
naftilamina en metanol.
El ácido sulfanílico es diazotado por el ácido nitroso formado a partir de los nitritos
por acción del ácido acético, empleado en gasas embebidas al 25% en agua. Este
compuesto formado copula con la alfanaftilamina, para formar un azocolorante rojo-
anaranjado. Las gasas embebidas en acético se colocan sobre la prenda, en la que la zona
agujereada se encuentra comprimida en el papel desensibilizado, mediante plancha caliente
durante breves minutos.
Las reacciones correspondientes se detallan en la figura 9.5.
9.4.2 Interpretación de resultados.

Esta reacción no ocurrirá a menos que haya nitritos y debe efectuarse en presencia
de un ácido como se indicó precedentemente. Las partículas de pólvora quemada o
parcialmente quemada existente en la ropa, pasarán al papel fotográfico en forma de puntos
color rojo-naranja.
En el caso que el orificio analizado hubiera sido provocado por la entrada de

proyectiles arrojando resultados positivos en las condiciones de ensayo, se confirma que el
disparo fue efectuado desde una distancia menor a 50 cm. Si la reacción es negativa, es
decir, no se observa distribución de puntos rojo-naranja alrededor del orificio analizado, se
interpreta que el disparo se realizó a una distancia superior a los 50 cm.
No obstante, este valor consignado dependerá del tipo de armas, del cartucho, lote,
año de fabricación, etc. También debe tenerse en cuenta que las partículas de nitrito hayan
podido ser arrastradas o lavadas de las prendas por la sangre que eventualmente emanara
de las heridas.
Hay que tener en cuenta, además, el manipuleo de la ropa sacada a las víctimas, la
cual se debe manejar con sumo cuidado para impedir que se pierda o desprenda cualquier
residuo de pólvora; Por esta razón al laboratorio debe ser enviada cada prenda por
separado entre dos capas de cartón grueso, bien apretadas. También las presuntas
manchas de sangre fresca que existieren, deberían secarse con corriente de aire tibio, ya
que al estar húmedas las prendas, se enmohecen y no permiten condiciones aptas para la
prueba.
En la actualidad, este tipo de discusiones es muy común en los juicios orales,

implementados desde hace poco tiempo en nuestro país, para casos de homicidios y cuyo
objetivo es establecer distancia probable del disparo. En las siguientes reacciones se ilustra
el mecanismo de formación de los puntos coloreados originados en las reacciones positivas.
Importante: debe interpretarse como positivos aquellos ensayos en los que se observan
varios puntos (5 o 6 como mínimo) que posean disposición circular, es decir, dispuestos
alrededor del presunto orificio de entrada. Si los puntos se observan aislados o no
dispuestos en la forma indicada, carece de valor legal el informe de la existencia de puntos,
que han reaccionado con los reactivos del sistema de identificación de Von Illoswa.
S O 3H
S O 3H
+ NO H + H + H 2O
2
NH2
+N H NO
2
S O 3H
NH2
+N= N :
S O 3H
H N -N +N H Cl
2
Fig. 9.5: reacciones de diazocopulación.
9.4.3 Espectrofotometría de absorción atómica.
Investigación de restos metálicos provenientes de deflagración de pólvora asentado

sobre las manos: se procede a realizar la determinación de antimonio, bario y plomo
(componentes del detonador), previa extracción de los residuos de las manos mediante el
lavado con ácido nítrico diluido (5%), utilizando para ello hisopos de algodón.
Los hisopos embebidos en la solución son pasados por la zona dígito pulgar varias
veces y rotando el soporte.
Al ser accesibles económicamente, se adquieren en provedores habituales de

laboratorio e inclusive en farmacias. Deben guardarse un hisopo virgen como blanco. Luego
de realizar el hisopado, los hisopos se colocan en recipientes plásticos, que previamente
han sido lavados con ácido nítrico para eliminar eventuales contaminaciones. Luego se trata
con ácido nítrico al 5% y se agita, la solución resultante se introduce en el equipo de
absorción atómica y se coteja contra soluciones testigos de los correspondientes analitos
(Plomo, Antimonio y Bario).
A continuación se describen las condiciones utilizadas para la determinación de los

distintos parámetros metálicos utilizando llama:
Plomo:
Longitud de onda: 217 nm
Ranura: 2 nm
Corriente de lámpara: 5nA
Combustible: acetileno
Oxidante: aire
Estequiometría de la llama: oxidante.
Rango de trabajo: 5-20 ppm
Antimonio:
Longitud de onda: 217,6 nm
Ranura: 2 nm
Corriente de lámpara: 10 nA
Oxidante: aire
Estequiometría de la llama: oxidante
Bario:
Longitud de onda: 553,5 nm
Ranura: 5 nm
Corriente de lámpara: 10 mA
Oxidante: aire
Estequiometría de la llama: reductora
Se obtienen límites más bajos trabajando con horno de grafito.
Condiciones de trabajo:
Lámparas de cátodo hueco de los elementos: antimonio, plomo y bario.
Programa de calentamiento:
Temperatura de lectura de plomo: 1800ºC
Temperatura de lectura de bario: 2700ºC
Temperatura de lectura de antimonio: 2.000ºC
Gas de limpieza: Argón

Corrección de background: mediante lámpara de deuterio
Cuantificación: Mediante curva de calibración con standares indubitables, por
Determinación de altura de pico y comparación entre muestra y standard.
Límite de detección:
Plomo: 5 ng/ml
Antimonio: 5 ppb
Bario: 50 ppb
9.4.4 Valores de corte (cut-off).

Guatelli (Manual de Policia Federal, 1983) refiere la opinión de algunos autores aconsejando
su medición considerando positivas las determinaciones de antimonio mayores a 170
nanogramos y bario mayor a 550 nanogramos. En las manos que no han accionado armas
de fuego los niveles estipulados por Guinn para el antimonio son menores a 20 nanogramos
y para bario menor de 60 nanogramos. Hay consenso que en todos los individuos existen
antimonio y bario en el orden del nanogramo.
Dimaio (1985), ha informado que valores superiores a los consignados a

continuación son presuntivos de existencia de residuos de pólvora:
Antimonio 35 ng.
Bario 150 ng.
Plomo 800 ng
El mismo autor, no obstante, considera varios casos en los que elevado contenido de
bario y plomo son atribuidos a contaminación, pero nota que la cantidad de antimonio
permanece muy baja o ausente. Por lo tanto el resultado analítico debe manejarse con
ciertas precauciones y en lo posible efectuar la determinación simultánea de los tres
elementos mencionados, especialmente el antimonio.
En nuestro medio (R. Nieto, S. Giorgeri et al, 2001) se han establecido valores de
cut-off en base a colección propia por experiencias de disparos con distintas armas y
municiones, llegando a los siguientes resultados:
Plomo: 1000 ng
Antimonio: 20 ng
Bario: 150 ng
9.5 Métodos basados en el estudio morfológico y elemental de las

partículas deflagradas.
Microscopía electrónica de barrido-sonda EDX.

Es un excelente método que combina la observación de las características de la

partícula en estudio y su composición atómica. Esto último gracias a la sonda dispersiva de
rayos X que permite obtener señales, como las que se muestran en la Fig. 9.6 asignables a
determinado elemento contenido en la partícula analizada. Además tiene la ventaja de ser
una técnica no destructiva. Es considerada actualmente la técnica de más alta selectividad
para el estudio de residuos de pólvora deflagrada.
La Microscopía Electrónica de Barrido, se basa en el análisis de la superficie de una

muestra con un haz de electrones. La interacción de la muestra con dicho haz da como
resultado diferentes tipos de señales provenientes de la misma. Estas señales secundarias
son captadas por detectores apropiados, brindando información sobre micro estructura
topográfica o de contraste por composición con una sensibilidad de 0,1 numero atómico
(electrones retrodispersados BSE). Dado que cada elemento presente en la muestra, por
interacción de un haz de electrones incidente, emite fotones de rayos X de energía
característica (sonda EDAX) el análisis permite la identificación inequívoca.
Según nuestra experiencia sólo puede presentar problemas si la matriz sobre la que
se ha de analizar el residuo es ósea. Esto debido a que las señales de calcio suelen
interferir en las de antimonio, elemento éste fundamental para asignar identidad de una
partícula sospechosa de ser pólvora.
Algunos autores han dado importancia no solo a la morfología y composición sino

también a la medida de las partículas. Estas suelen ser de unos pocos micrones de
diámetro, esféricas. La fusión de los elementos relevantes (Pb, Sb y Ba) en una partícula,
generadas bajo condiciones específicas de temperatura y presión, suele ser tomada como
“característica de residuos de arma de fuego”. Así, es muy común observar partículas
fusionadas de Pb-Sb-Ba , Sb-Ba, Pb-Sb, etc.
Asimismo, es aconsejable efectuar un cotejo con partículas obtenidas de la misma

arma incriminada y los mismos cartuchos utilizados. Con ello se obtendrá una mejor
aproximación de identidad de la partícula y evitará disquisiciones sutiles en casos
disputados en estrados judiciales. En definitiva una Corte podrá evaluar más claramente la
prueba científica si se efectúa en base a cotejo utilizando la misma arma y proyectiles
semejantes que si se deduce del análisis de la partícula solamente.
La toma de muestra en este caso debe realizarse por el método denominado: “tape
lifting” o levantamiento por medio de cintas adhesivas tipo “Scotch”.
Debido a que el receptáculo de muchos microscopios electrónicos de barrido poseen

un centímetro cuadrado, se debe tratar de utilizar una cantidad discreta de cinta al tomar la
muestra. Si esto no fuera posible, dividir cuidadosamente dicha cinta en cuadrículas de
manera de formar una grilla, tomando cuadrados representativos. Evitar la manipulación
excesiva de la cinta.
Laboratorios más avanzados poseen en sus microscopios electrónicos platinas más

amplias en las que pueden colocarse objetos de dimensiones relativamente grandes. Por
ejemplo, en nuestro país el laboratorio de Gendarmería Nacional, cuenta con tal
equipamiento.
Las normas americanas ASTM contiene una guía standard para análisis de residuos
de pólvora (ASTM E1588-95), sin embargo las definiciones y clasificaciones consignadas no
dan una visión profunda del problema a la hora de interpretar el resultado.
Fig. 9.6: Microscopía electrónica de barrido parte superior observación de partículas, parte
inferior espectro EDAX.
Bibliografía.
Aplicación de la espectrofotometría de Absorción Atómica y Microscopía electrónia con

sonda EDX en la investigación de restos de deflagración de pólvoras. R. Nieto, S. Giorgeri,
C.A. Nardo, P. Brignoles y L.A. Ferrari. Actas del II Congreso Internacional de
Criminalística. Paraná, Entre Rios, p. 17, 2001
La muerte violenta. Raffo, Osvaldo. Ed. Universidad, 1980.

Restos de deflagraciones. Manuel Guatelli en Tratado de Criminalística. Tomo II. La Química

Analítica en la Investigación del Delito. Editorial Policial, 1983.
Identification of gunshot residue: a critical review. F.S.Romolo & P.Margot. Forensic Sci. Int.
119 (2) 195-211, 2001
Toxic Metals and their Analysis. E. Berman. Ed. Heyden, 1980
Fundamentals of Criminal Investigation Charles O Hara. Charles C. Thomas Publisher, 1976
Gunshot Wounds, Practical Aspects firearms. Ballistics and Forensic Techniques. Vincent
Dimaio. Chap 12. Elsevier Pub. 1985.
Nitrites Examinations in Propellant Powder Residue. Watson D. J. A.F.T.E. (1): 32, 1979.
Examination of Gunshot Residues. Stone & Petty C.S. Forensic Science. 19(4): 784-788,
1974.
ASTM-E1588-95, Standard guide for gunshot residue analysis by scanning electron

microscopy/ energy dispersive spectroscopy. American Society for Testing and Materials.
West Conshohocken. PA, pp.1006-1008, 1995
CAPÍTULO 10
MANCHAS HEMATICAS.
Autor:
Dr. Rodolfo Nieto, Perito del Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Asesoría
Pericial dependiente del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción.
Según el diccionario, se entiende por mancha a “una señal que una cosa hace en un
cuerpo, ensuciándolo”. Desde el punto de vista forense, el estudio de las manchas de
sangre reviste un gran interés ya que a partir de éstas, las técnicas empleadas hoy en día
permiten llegar a resultados de gran certeza respecto de la persona a partir de la cual se
originó la misma.
10.1 Búsqueda de las posibles manchas de sangre.
La misma deberá ser sumamente minuciosa ya que estas pueden encontrarse sobre
cualquier superficie y lugar. En primer lugar debe considerarse que una mancha de sangre
reciente es de color rojo brillante para, posteriormente, virar a un color pardo-rojizo y sin
brillo.
El proceso de variación de su aspecto depende de diversos factores entre los cuales

podemos mencionar la luz, la temperatura, la humedad y el soporte sobre el cual se
encuentra asentada. En ese sentido, el color de la misma es una característica de sumo
interés ya que sobre superficies oscuras, por ejemplo, la búsqueda suele complicarse y aquí
hay dos elementos que resultan de utilidad: el empleo de luz con diferentes ángulos y la luz
ultravioleta, aunque ésta última no es aconsejable dado las alteraciones que la misma puede
ocasionar a nivel del material genético. Otra posibilidad, la constituye el empleo de las
reacciones de orientación, las cuales veremos más adelante.
10.2 Recolección de las muestras.
Un tema de vital importancia en este tipo de estudios lo constituye este paso, ya que
de una correcta toma de muestra en el lugar del hecho dependerán los resultados
obtenidos. Un dato a tener en cuenta será el tipo de superficie sobre el cual se encuentra
asentada la mancha y así, por ejemplo, sobre una superficie absorbente será fuertemente
retenida mientras que sobre una superficie pintada o un mosaico pulido será fácil de
desprender.
En cualquiera de los dos casos, una posibilidad para su obtención será embeber un
papel de filtro o una tela blanca de algodón con solución fisiológica (S.F) o agua destilada,
colocándolo sobre la mancha y presionando con cuidado. Posteriormente, el elemento
utilizado se deja secar en corriente de aire. Para acelerar este proceso, puede utilizarse un
secador de pelo, aunque esta operación debe hacerse con sumo cuidado a fin de evitar
ocasionarle daños a ciertos componentes de la mancha que podrían, posteriormente,
complicar (cuando no imposibilitar) su análisis.
En el caso de tratarse de una superficie pulida, una alternativa consiste en raspar la

superficie con ayuda de un bisturí, colectando el material sobre un papel.
Cuando se trate de prendas manchadas tres precauciones son fundamentales:

A – No doblar las prendas húmedas ya que podrían mancharse zonas que no lo estaban.
B – Dejarlas secar en condiciones similares a las expuestas anteriormente.
C – Una vez secas, las prendas deben ser envueltas preferentemente en papel madera y en
forma separada.
Vale aclarar que cuando el soporte de la mancha es tal que el mismo puede ser
remitido al Laboratorio, este es el camino a seguir guardando siempre las precauciones ya
enunciadas. Cualesquiera sea el caso, su pronta remisión una vez obtenida la muestra es el
procedimiento indicado.
10.3 Estudio de las manchas de sangre.
Una vez recepcionado el material en el laboratorio, el mismo se procesará según el

siguiente orden:
1– Descripción de las condiciones de remisión.
2– Descripción de los elementos motivo de pericia.
3– Reacciones de orientación.
4– Reacciones de certeza.
5– Determinación de especie.
6– Tipificación: Investigación del grupo sanguíneo, isoenzimas , sistema HLA, ADN.
• Descripción de las condiciones de remisión:
La descripción de las condiciones en las cuales las muestras llegan al laboratorio

resulta un paso de sumo interés ya que el mismo debe cumplir ciertos requisitos, entre los
cuales pueden mencionarse el que se encuentren correctamente rotulados y bajo
condiciones de inviolabilidad, ya sea mediante lacre o bien precintos adecuados a tal efecto.
• Descripción de los elementos motivo de pericia:
La descripción de los elementos debe ser tal que en la misma se destaquen aquellas
características que permitan su identificación. Las manchas, en la medida de lo posible,
deberán ser “ubicadas” y en ese sentido, resulta de suma utilidad acompañar la descripción
con un esquema o figura de cada elemento en los cuales se indique la posición de las
diferentes manchas. En este paso, al igual que en el precedente, son sumamente ilustrativas
las fotografías.
• Reacciones de orientación:
Las reacciones de orientación, tal como su nombre lo indica, de ser positivas solo
expresan la posible presencia de sangre, adquiriendo un valor definitivo cuando resultan
negativas, situación esta derivada de su gran sensibilidad.
Las mismas aprovechan la actividad peroxidásica del grupo hemo, la cual se pone en
evidencia mediante el empleo de H2O2 y reactivos orgánicos que pasarán de una forma
incolora a otra coloreada o bien luminiscente. Podemos representar lo antedicho de la
siguiente manera:
H2O2 + peroxidasa H2O + O
O + Reactivo reducido Reactivo oxidado (coloreado o luminiscente)
Debemos tener en cuenta que diversas sustancias poseen una actividad similar a la
del grupo hemo y de allí su inespecificidad. Entre ellas podemos mencionar las peroxidasas
de origen vegetal y las sales de cobre y níquel.
Entre los numerosos reactivos utilizados para la realización de esta prueba,
mencionaremos los siguientes (Fig. 10.1):
• Ensayo de Adler:
Emplea bencidina disuelta en ácido acético o bien en una mezcla de etanol y el

mencionado ácido. En caso de ser positivas dan color azul o azul-verdoso. Su sensibilidad
es de 1: 250.000. Un dato de interés y que ha hecho que la misma caiga en desuso es la
actividad carcinogénica de la bencidina. El reactivo se prepara en el momento de usar
disolviendo 0,01 a 0,05g. del mismo en 10 ml de ácido acético glacial.
• Ensayo de Pierre Medinger:
Utiliza como reactivo la leucobase del verde de malaquita. De ser positiva origina un
color verde intenso. Es un reactivo que ha resguardo de la luz posee una aceptable
estabilidad. Su sensibilidad es del orden de 1:100.000. Se prepara disolviendo 1g. de
leucobase en 50 ml de ácido acético glacial, adicionando a continuación 150 ml de agua
destilada. Guardar en frascos de color caramelo.
• Reactivo de Kastle – Meyer:
Emplea fenolftaleína reducida en medio alcalino originando, de ser positiva, el clásico

color rosado – rojizo de este colorante. Posee dos ventajas dignas de mención y que lo
transforman en un reactivo altamente recomendable: su notable sensibilidad (1:1.000.000) y
que el medio alcalino elimina muchas de las interferencias que afectan a estos ensayos.
El reactivo se prepara disolviendo en un matraz 20g. de KOH en 100 ml de H2O

destilada, a los cuales se adiciona a continuación 2g. de fenolftaleína y 20g. de zinc en
polvo. Se coloca un refrigerante a reflujo y se calienta hasta decoloración. Alcanzado este
punto se filtra en caliente recogiendo el líquido en frascos de color caramelo conteniendo
zinc en polvo.
Un detalle a tener en cuenta, es que la gran sensibilidad de este reactivo requiere de

material estrictamente limpio para su preparación y conservación. Cualesquiera sea el
reactivo a emplear, se puede proceder tal como se detalla a continuación:
a) A gotas de un macerado obtenido de la mancha en estudio en S.F. o agua destilada,
se adicionan gotas del reactivo y a continuación gotas de H2O2 al 30%. La aparición
del color correspondiente, según el caso, indica una reacción POSITIVA.
b) Una pequeña muestra obtenida del material en estudio se coloca en una cápsula de
Petri, y se le adicionan gotas del reactivo y a continuación gotas de H2O2 al 30%. La
aparición del color correspondiente al reactivo empleado indica una reacción
POSITIVA.
La secuencia indicada para el agregado de los reactivos es importante ya que en

algunos casos, en forma previa a la adición del H2O2, ya se produce la aparición del color
propio del indicador, situación esta que nos permite diferenciar una mancha supuestamente
de sangre de otra que no lo es. En tal sentido, el cemento es un material que produce este
tipo de fenómeno.
Finalmente, no podemos dejar de mencionar el ensayo del luminol (5-amino-2,3-

dihidroftalazino-1,4-diona) el cual manifiesta una reacción positiva mediante la aparición de
quimioluminiscencia. Resulta de suma utilidad para la localización de manchas no visibles
en superficies grandes (por ejemplo pisos), las cuales se rocían con el reactivo. Posee una
sensibilidad de 1:5.000.000 y una elevada especificidad aunque la misma no es total.
Fig. 10.1: formas químicas de las leucobases y sus formas coloreadas.
Para su empleo se deben preparas dos soluciones:
Solución A: 0,1g de luminol y 0,5g de NaCO3H se disuelven en 50 ml de agua

destilada y se colocan en un recipiente no metálico.
Solución B: Disolver 1,4g de perborato de sodio tetrahidrato en 50 ml de agua
destilada y colocar en un recipiente similar al anterior.
En el momento de emplear, volúmenes iguales de ambas soluciones se colocan en

un rociador no metálico. Debemos recordar que el luminol reacciona con el hierro del grupo
hemo y, por lo tanto, podría reaccionar con otros metales de modo similar.
Una vez preparada la mezcla, la misma es estable de 60 a 90 minutos y de allí que

resulte conveniente hacerlo en pequeñas cantidades. Si bien se han detectado sustancias
interferentes, en general, la intensidad, duración y color de estos falsos positivos no se
corresponden con aquellos de la sangre diluída.
Un dato interesante lo constituye la estabilidad de las soluciones y su relación con la

temperatura y así se ha observado que se obtiene buenos resultados cuando los reactivos
se conservan separados durante 28 días a –18ºC o 4ºC, disminuyendo este período a 21
días si la temperatura asciende a 37ºC.
• Reacciones de certeza:
Son aquellas que nos permiten afirmar que una mancha es de sangre o bien
descartar esa posibilidad. Casi la totalidad de los estudios de este tipo se basan en la
identificación del grupo hemo de la hemoglobina. La excepción la constituye la búsqueda de
los elementos formes de la sangre, tal como los glóbulos blancos y/o rojos, hecho este que
no es común en laboratorios forenses.
Entre las diversas técnicas que se han descripto, podemos mencionar las siguientes:
Cristales de Teichman:
Se basa en la obtención de los cristales de hematina o hemina. La misma se realiza

dejando caer una gota de un macerado de la mancha en agua destilada o S.F. en el centro
de un portaobjetos la que se lleva a sequedad calentando sobre un mechero en forma suave
(la temperatura no debe superar los 60ºC.), repitiendo la operación (gota-secado) de dos a
tres veces (Fig. 10.2).
Se cubre con un cubreobjetos y luego, por capilaridad, se adiciona ácido acético

glacial (al que debe adicionarse ClNa en una concentración igual al 0.1% en caso de haber
preparado el macerado con agua destilada) y a continuación calentar de manera algo más
enérgica a la anterior. Repetir la operación una vez y luego observar al microscopio. La
observación de cristales de color castaño a castaño claro y con forma de prismas alargados
a rómbicos, indica una reacción positiva.
Una modificación digna de ser mencionada es la de Bertrand, para la cual se emplea

el siguiente reactivo: Cl2Mg 1g., agua destilada 1 ml, glicerol (30% v/v) 5g. y ácido acético
glacial 20 ml. La técnica se desarrolla de manera similar a la anterior pero ahora
observaremos cristales algo más pequeños.
Fig. 10.2: Cristales de Teichman.
Cristales de Takayama:
Se basa en la obtención de los cristales de piridino-hemocromógeno. El

hemocromógeno es un derivado obtenido por la desnaturalización y reducción consecutiva
de la hemoglobina o de la oxihemoglobina, la cual posteriormente con una base origina las
formas cristalinas típicas de este derivado. El reactivo a emplear está formado por 5 ml de
una solución de glucosa al 10%, 10 ml de HONa al 10%, 20 ml de piridina y agua destilada
en cantidad suficiente para 100 ml
Se procede de modo similar al descripto precedentemente, aunque el calentamiento

deberá ser suave luego del agregado del reactivo. Posteriormente observar al microscopio.
La presencia de cristales de color rosado y con forma de helechos, pinceles o espinas indica
reacción positiva.
Otra técnica de suma utilidad es aquella que emplea la cromatografía en placa

delgada, la cual se basa en la obtención de Rf iguales para un extracto de la mancha en
estudio y otro preparado a partir de una muestra de sangre (diluía 1:1000 en S.F.).
Como reactivo revelador se puede emplear una solución de leucobase del verde de
malaquita en etanol al 1% adicionado de ácido acético a una concentración final del 0.5%
(preparada en el momento) y H2O2 al 6%. Como fase estacionaria puede utilizarse silicagel
G y como fase móvil el solvente formado por metanol : ácido acético : agua destilada en la
relación 90 : 3 : 7. Cargar la cuba cromatográfica con la mezcla y aguardar no menos de 30
minutos antes de colocar la placa.
Se siembran las muestras a estudiar, el testigo y se desarrolla el cromatograma.

Luego se retira la misma de la cuba y se lleva a 100ºC durante 5 minutos, operación esta
que permite la destrucción de las peroxidasas de origen vegetal pero manteniéndose aquella
de la sangre.
Luego rociar la placa con el reactivo del verde de malaquita y a continuación con el
H2O2. La reacción se considera positiva si se observa la aparición de manchas de color
verde de Rf 0,7 a 0,8.
10.4 Determinación de especie.
Una vez confirmada la presencia de sangre se procede a la determinación de la

especie de la misma, con el objeto de establecer si es humana o no. Estas reacciones
adquieren una particular importancia en ciertos casos como, por ejemplo, de homicidio en
los cuales se ha empleado un arma blanca, ya que de ser positivas, por un lado indican la
presencia de sangre humana y, por otro, habilitan la investigación de parámetros
conducentes a la identificación del individuo del cual procede la sangre encontrada.
De ser negativas, en cambio, deberán tenerse en cuenta una serie de factores de

importancia: en primer lugar deberá evaluarse la posibilidad del uso de antisueros contra
diversas especies animales ya que esta constituye, en la mayoría de los casos, la única
manera de constatar que la sangre no es humana.
Por otro lado, deberán tenerse en cuenta las condiciones de la mancha en estudio ya
que su antigüedad, presencia de hongos, putrefacción etc., son elementos que pueden
sugerir la degradación de los elementos específicos a determinar. También deberá
considerarse la cantidad de material a estudiar ya que no puede descartarse que la misma
resulte insuficiente para las reacciones a practicar.
En lo que respeta a la determinación en sí, uno de los métodos, abandonado en la

actualidad, se basa en la identificación de los elementos formes de la sangre tales como
glóbulos rojos, blancos y / o plaquetas.
Hoy en día se emplean los métodos que utilizan los denominados sueros
antihumanos, es decir, sueros capaces de reaccionar específicamente con elementos de la
sangre (proteínas). Son reacciones de tipo antígeno-anticuerpo y dado los notables
adelantos realizados en materia de anticuerpos monoclonales, los resultados obtenidos son
altamente confiables.
De modo similar pueden emplearse antisueros capaces de reaccionar con sangre

procedente de otras especies, aconsejándose, especialmente, el uso de aquellos contra
animales domésticos o de campo como perro, gato, aves de corral, ganado ovino, bovino,
porcino, etc.
10.4.1 Ensayo de las precipitinas.
Como se mencionó anteriormente, estos análisis consisten en una reacción

antígeno-anticuerpo visualizándose la misma mediante la formación de un precipitado (de
allí su nombre) o bien, como ocurre con kits comerciales, por la aparición de bandas
coloreadas.
Entre las condiciones que debe cumplir el antisuero a emplear pueden mencionarse:
esterilidad; que se encuentre libre de turbiedad, en ese sentido la presencia de la misma
hace desaconsejable su utilización; especificidad, es decir, debe reaccionar con muestras
procedentes de la especie animal contra la cual fue preparada.
Finalmente, puede destacarse el título del antisuero como un dato de importancia

siendo aquel de 1:10.000 el aconsejado.
En ese sentido, una forma de determinar el título del antisuero es la siguiente:

preparar diluciones del suero a emplear en S.F., por ejemplo de 1:1.000 a 1: 32.000 en
forma seriada. A continuación, en tubos de hemólisis adicionar 50 µl del antisuero en estudio
y luego, con sumo cuidado a fin de evitar que se mezclen, 100 µl de las diferentes
diluciones a ensayar y dejar en reposo.
La aparición antes de los 20 minutos de un anillo en la interfase suero-antisuero ,

indica una reacción positiva siendo aconsejable la utilización de un fondo oscuro e
iluminación adecuada a fin de lograr una mejor visualización (Fig.10.3).
Fig. 10.3: Reacción de Precipitación.
Así, la recíproca de la última dilución que a temperatura ambiente produce una

reacción visible en el tiempo mencionado será el título del antisuero.
Preparación de la muestra:
Se realiza una dilución empleando Solución fisiológica siendo la concentración

adecuada de 1:1.000. A modo de ejemplo puede estimarse que 1 cm2 de tela manchada
debe eluirse en 1 ml de la citada solución.
Técnicas para la investigación de especie:
Método del tubo:
Se procede tal como se indicó anteriormente para la valoración del antisuero, con la
salvedad que en lugar del suero diluido ahora colocamos 100 µl del macerado de la muestra
en estudio.
Una variante de esta técnica es aquella que emplea capilares en lugar de tubos. Para
ello, uno de los extremos del capilar se sumerge en el antisuero y a continuación en el
macerado. Luego se sella el otro extremo con plastilina o bien con calor. En el último caso
deberá procederse con sumo cuidado a fin de evitar proyecciones.
Técnicas de difusión en agar:

Una de las ventajas de ésta técnica consiste en el escaso consumo de antisuero

empleado al tiempo que permite el procesamiento de un buen número de muestras en forma
simultánea.
Para su realización se prepara una solución de agar al 1-2% en agua destilada y a
continuación con el auxilio de una pipeta se adicionan 5 ml de la misma sobre un portaobjeto
de modo tal de lograr una capa uniforme. Debemos aclarar que la temperatura del agar
debe ser próxima a aquella de su fusión y el agregado será lento y cuidadoso a fin de evitar
que el mismo se derrame.
Una vez formado el gel de agar se procede a practicar orificios en el mismo pudiendo
utilizar para ello un sacabocado.
En la figura se detalla la distribución de los mismos:
Antisuero Muestra
Muestra A ntisuero
La cantidad de orificios en torno al central dependerá de la cantidad de muestra y de

la habilidad del operador pudiendo repetirse la formación dos a tres veces por placa. Tanto
el antisuero como las muestras pueden adicionarse mediante el empleo de pipetas Pasteur
o bien capilares con cuidado de no rebalsar los hoyuelos. Entre muestra y muestra deberá
cambiarse el elemento usado o bien realizar un buen enjuague del mismo con S.F.
Finalizada la operación se coloca la placa en cámara húmeda y se

lleva a estufa a 37ºC durante 24 hs. Luego se procede a la lectura de los resultados siendo
positivo aquellas en las cuales se observe un halo de precipitación entre la muestra y el
antisuero (Fig. 10.4). La lectura deberá hacerse mediante el empleo del luz y fondo
adecuado.
Fig. 10.4: Método de Outcherlony.
Método electroforético:
Esta técnica nos permite efectuar el ensayo en forma rápida y con resultados
satisfactorios. Básicamente, la técnica puede explicarse de la siguiente manera: el antisuero
colocado en un orificio próximo al ánodo es enfrentado con un extracto sanguíneo ubicado
en un hoyuelo del lado del cátodo.
Los antígenos presentes en el extracto son fundamentalmente albúmina y alfa y beta

globulinas, mientras que los anticuerpos presentes en el antisuero son principalmente
gamma globulinas. La electroforesis causa un movimiento anódico y al mismo tiempo un
flujo endosmótico hacia el cátodo el cual se genera en el movimiento del líquido en sentido
contrario al de la migración de la corriente.
De lo expuesto surge que mientras la corriente eléctrica “arrastra” los antígenos del
extracto sanguíneo hacia el ánodo, las gamma globulinas lo hacen hacia el cátodo, pero
impulsadas por el flujo endosmótico.
Sobre un portaobjeto limpio y desengrasado vertir 2 a 2,5 cc de solución de agar al

0,2 %. El agar a utilizar deberá ser grado electroforético con baja electroendosmosis,
propiedades de suma importancia para la técnica a emplear. Dejar 30 a 40 minutos a
temperatura ambiente y luego llevar a estufa a 65ºC por 90 minutos.
A continuación adicionar a esta capa 4,5 ml de agar al 2% de modo tal que esta
tenga un espesor de 2 mm . Posteriormente practicar orificios en la capa de agar tal como
se indicó anteriormente y según la siguiente distribución.
Los orificios deben tener un diámetro de 1.5 a 1.8 mm y separados, de a pares, una
distancia de 3 mm.
Polo positivo (+) (-) Polo negativo
Una vez completada la placa colocar el antisuero de izquierda a derecha en los

orificios de las hileras 1ra., 3ra., 5ta. y 7ma y las muestras en los orificios restantes, de modo
tal que los líquidos queden al ras pero sin rebalsar.
A continuación agregar el buffer en la cuba electroforética y colocar el portaobjetos

debiendo quedar las columnas con el antisuero del lado del ánodo. Una vez ubicada la placa
hacer con papel absorbente los puentes correspondientes entre las mismas y los electrodos.
Efectuar la corrida electroforética según las siguientes condiciones: 150 voltios 20

minutos (aproximadamente 15 mAmp). La aparición de un halo de precipitación entre la
muestra y el antisuero indica una reacción positiva.
Una vez leídos los resultados, puede revelarse la placa de la siguiente manera:
Sumergir el portaobjetos en solución de ClNa 1 M durante una noche y luego lavar con agua
durante 5 minutos (para tal operación, la placa se sumerge en una cuba conteniendo agua
destilada dejándola el tiempo mecionado). A continuación secar o bien colocar papel de filtro
Whatman Nº1 sobre el gel y llevar a 60ºC. Esta operación deberá ser efectuada con sumo
cuidado a fin de no dañar el gel. Retirar el papel siendo conveniente que se encuentre
húmedo. Concluída esta operación se expone la placa a la acción de la solución colorante
(ver más adelante) durante 5 minutos. Transcurrido ese lapso, eliminar el exceso de esta
solución con solución de lavado (ver más adelante), dando por concluída esta operación
cuando se observa la aparición de bandas de color azul sobre un fondo claro.
De producirse precipitados inespecíficos se aconseja diluir el o los extractos.
Reactivos:
• Agar al 0,2 % y 2% en agua bidestilada / desionizada. Agar para
inmunoelectroforesis Oxoid.
• Buffer gel pH 8,6 : Barbiturato de Sodio 7,00 g ; ácido dietilbarbitúrico 1,10 g; lactato
de calcio 1,00 g y agua bidestilada csp. 1 l. Conservar a 4ºC.
• Gel de agar mezclar volúmenes iguales de agar al 2% y Buffer gel
• Buffer Cuba pH 8,6, barbiturato de sodio 8,76g ; ácido dietilbarbitúrico 1,38g; lactato
de calcio 0,38 g; agua bidestilada csp 1 l conservar a 4º C.
• Solución 1 M de cloruro de sodio.
• Solución colorante, 0,10 g de negro amido 10 B y disolverlos en 100 ml de solución de
lavado, la que está constituída por metanol: agua bidestilada: ácido acético glacial en
la relación 40: 50:10.
Una variante de esta técnica emplea un buffer (pH 8,4) constituido por: tricina ( sigma T-
0377) 4,5 g (0,025 M); tris base ( sigma T-1503) 9 g (0,074 M); agua bidestilada csp 1 Lt.
También puede emplearse la siguiente mezcla: glicina (sigma G- 7126) 21,8 g ; tris base 4,5 g y
agua bidestilada csp 1Lt .
En esta técnica se emplea agar al 0,2 % pero, a continuación, se utiliza una solución de
agarosa al 1% en uno de los buffer descripto previamente. El resto de la metodología es
idéntica a la ya detallada.
Por otra parte, para este tipo de estudio hoy en día pueden emplearse kit comerciales
destinados al análisis de sangre oculta en materia fecal, los cuales ofrecen muy buenos
resultados y poseen entre sus ventajas la velocidad en la determinación. Así, por ejemplo, el
Hem-check-1 (Veda Lab-France) emplea una única combinación de anticuerpo monoclonal
conjugado y anticuerpo monoclonal en fase sólida para identificar hemoglobina humana,
realizandosé el test en tan solo 10 minutos. Esta determinación es de carácter presuntivo.
Investigación de grupo sanguíneo:
Una vez constatada la especie de la muestra de sangre en estudio se procede a su

tipificación, pudiendo determinarse para tal fin el grupo sanguíneo (sistemas ABO, MN, etc.),
patrón de isoenzimas, proteínas polimórficas y ADN.
Con test de éste tipo, sin el análisis de ADN, la probabilidad típica que una pieza
específica no pertenezca a un sospechoso particular está en el rango de 1:100 a 1:10.000
dependiendo de las proteínas particulares y el número de las mismas estudiadas. Por otra
parte, el uso de ADN polimórfico puede resultar en probabilidades tan bajas como 1:1019 que
dos muestras cotejadas no sean de un mismo individuo.
Sistema ABO:
En las manchas de sangre seca los glóbulos rojos en general están destruidos, sin
embargo, los antígenos responsables de la especificidad de grupo mantienen su capacidad
para reaccionar con los anticuerpos específicos. Claro está que, en éstas condiciones, las
técnicas de aglutinación directa no son aplicables.
Pueden investigarse tanto las aglutininas (anticuerpos anti-A y anti-B) como los
aglutinógenos A, B y O. Por ser las más utilizadas se detallarán aquellas técnicas orientadas a
detectar la presencia de los últimos.
Método de absorción – inhibición:
Esta técnica puede utilizarse no solo en manchas de sangre, sino también en otros
fluidos biológicos tales como saliva y semen. Básicamente el método consiste en enfrentar la
mancha en estudio con un antisuero de título conocido, al cual transcurrido un cierto tiempo se
lo retitulará. Una disminución del título original indicará la presencia del antígeno investigado.
Así, si disminuye aquel correspondiente al suero anti-A, la muestra pertenecerá al grupo A, si lo

hace en el anti-B será B, y, si disminuyera en ambos, será AB.
De no observarse disminución en ninguno de los dos antisueros, la muestra sería O,

aunque deberá confirmarse por otra metodología dado que los aglutinógenos podrían estar
destruidos.
Para la realización de la técnica se procede de la siguiente manera: Cortar 1 cm2 de tela

manchada y dividirlo a la mitad, repitiendo esta operación con una zona de la tela no maculada
la cual oficiará como blanco. A cada uno de los trozos se los coloca en una policubeta tal como
se indica en la siguiente figura:
Muestra Blanco
Blanco Muestra
Adicionar a los dos primeros trozos de tela 2 gotas de suero anti-A y a los dos últimos
una gota de suero anti-B. Dichos antisueros deberán ser previamente titulados y la dilución a
emplear debe ser tal, que se produzca una aglutinación visible hasta la última dilución a realizar
en esta técnica. En ese sentido digamos que los autores indican la dilución de 1 : 32 como
aquella a emplear pero es aconsejable la titulación previa a fin de evitar inconvenientes.
A continuación se fragmentan las fibras con la ayuda de agujas de disección

comenzando siempre por el blanco. Luego de cada muestra es conveniente cambiar las agujas
o bien enjuagarlas. Luego colocar las placas en cámara húmeda y dejar una hora a
temperatura ambiente.
Trascurrido ese lapso proceder a retitular los antisueros. Para ello adicionar a cada
hoyuelo de la policubeta una gota de S.F. y a continuación tomar una gota del antisuero en
contacto con la muestra y adicionarlo a la primera gota de S.F. Mezclarlas y pasar una gota de
esta dilución a la siguiente concavidad procediendo de igual manera hasta la última de esta, de
modo tal de obtener diluciones seriadas al medio. Es conveniente practicar no menos de 7
diluciones para cada muestra.
Proceder de igual manera con el blanco y el resto de las muestras con la precaución de
enjuagar bien el material empleado entre muestra y muestra. Posteriormente, adicionar a las
diluciones de las muestras y blanco en las que se investiga el aglutinógeno A una suspensión
de glóbulos rojos A en S.F. al 1,5% . Es aconsejable lavar previamente los glóbulos rojos 3
veces en S.F. previo a la preparación de la suspensión. Repetir la operación para aquellas
muestras y blancos en las cuales se investiga el aglutinógeno B, pero con una suspensión de
glóbulos rojos B.
Completada esta operación agitar con cuidado de no mezclar los contenidos de las
concavidades e incubar en cámara húmeda observando, o no, la presencia de aglutinación
cada 10 a 15 minutos agitando en cada caso y por un lapso de 30 minutos.
La ausencia de aglutinación en una de las muestras o una disminución de no menos de

3 concavidades del título en esta respecto de su blanco indica la presencia del aglutinógeno
investigado. Para facilitar la lectura es aconsejable la utilización de un elemento de aumento
como puede ser una lupa.
Como datos a tener en cuenta para obtener resultados confiables podemos mencionar
los siguientes : las muestras deberán procesarse con guantes , no sólo por razones de
seguridad sino porque, de ser secretor, por medio de la transpiración se transmitirían los
aglutinógenos propios al material investigado.
Tanto el agregado inicial de los antisueros como su posterior dilución deben realizarse
con sumo cuidado ya que cualquier error puede traducirse en un resultado incorrecto.
Método de absorción – elución:
Esta técnica ofrece excelentes resultados y puede ser empleada tanto para el sistema
ABO como para el MN. También puede utilizarse para el estudio del sistema Rh aunque los
resultados suelen no ser confiables y de allí que su realización sea desaconsejada por muchos
autores.
El fundamento de esta técnica es el siguiente: las muestras en estudio se ponen en

contacto con antisueros específicos a fin de formar los correspondientes complejos antígeno-
anticuerpo . Luego se elimina el exceso de anticuerpo, y se calienta a 50ºC a fin de romper el
inmunocomplejo de modo tal que los anticuerpos liberados pueden ponerse de manifiesto
mediante el agregado de una suspensión de glóbulos rojos con los cuales darán lugar a la
típica reacción de aglutinación.
Para el estudio del sistema ABO se procede de la siguiente manera:

1- Sobre una hoja de policarbonato de 10 x 15 cm y 1 mm de espesor se marcan
cuadrados de aproximadamente 1,5 cm de lado.
2- Se toman muestras de hilo de 2 a 5 mm de longitud y se adhieren a la placa por uno
de sus extremos mediante el empleo de, por ejemplo, acetato de celulosa. (ver figura).
Anti A Anti B Anti H Controles
Bl
T
M : Muestra
Bl : Blanco
T : Testigo
3- Una vez seco el adhesivo adicionar a cada hilo una gota del antisuero indicado en la
columna respectiva. Para la dilución a emplear valen las mismas consideraciones
hechas previamente. El hilo debe quedar totalmente sumergido en el antisuero.
4- Incubar durante no menos de 3 hs. a 4 º C en cámara húmeda siendo aconsejable
dejarlo toda la noche
5 - A continuación lavar la placa con S.F. a 4º C con ayuda de una piseta. Secar con
papel de filtro con sumo cuidado y sumergir a un recipiente con S.F. a 4 º C durante 30
minutos con agitación suave y constante.
6- Retirar la placa y secar con papel de filtro.
7- Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos adecuada según el antisuero
utilizado. La misma se prepara en S.F. con el agregado de albúmina bovina al 0,3 %
con una concentración del 0,1 %. Los glóbulos rojos deben lavarse 3 veces con S.F.
empleando sangre heparinizada. Llevar a cámara húmeda y luego a estufa a 50 º C
durante 15 minutos.
8- Retirar de la cámara húmeda y colocar la placa en un agitador de baja velocidad
durante 30 minutos.
9- Observar la presencia o no de aglutinación con ayuda de un microscopio. Así, de
verificarse esta en la columna anti A, indica que esa muestra corresponde al grupo A.
En esta técnica es aconsejable el uso de controles de los grupos 0, A , B y AB.

Si bien las técnicas descriptas precedentemente son de suma utilidad y ofrecen resultados
confiables, la determinación de grupo sanguíneo se puede efectuar mediante una serie de t
métodos alternativos entre los cuales podemos citar aquellas por inmunoensayo en fase
sólida, en la cuales uno de los reactantes se fija a una fase sólida dentro de las cuales el
plástico constituye una de las más utilizadas. En tal sentido, tubos de 0,25 o 0,50 ml
colocados en dispositivos adecuados a tal efecto o bien policubetas del citado material
constituyen una buena alternativa.
Así, una metodología de este tipo, es la siguiente: En un primer paso se produce la

inmovilización de los aglutinógenos ABO presentes en la mancha a la fase sólida. Para tal
fin, hilos de la tela manchada o bien gasa embebida en un macerado de las manchas
presente en un material diferente a una tela absorbente (por ejemplo un cuchillo, una tela
sintética, etc), son colocados en las cubetas o tubos por pares a fin de investigar la
presencia de antígeno A en uno de ellos y el B en el restante, cargándolo hasta las 2/3
partes de su capacidad con una solución de NH3 al 5%. Se maceran los hilos en la solución
y luego se los retira (la solución idealmente debe alcanzar una coloración rojo-castaño) y se
los retira con el auxilio de una pinza o un elemento adecuado a tal efecto.
Luego incubar en estufa a 70ºC durante 15 minutos (sin cámara húmeda) y otros 20
minutos a 62ºC en idénticas condiciones. Posteriormente lavar con solución de ClNa 0.15 M
o S.F. sumergiendo a tal fin las policubetas en la misma y dejando en reposo durante 2
minutos. De este modo se eliminan aquellas partículas no fijadas o débilmente adsorbidas.
A continuación las cubetas se cargan con los sueros anti-A y anti-B ya sea sin diluir o
diluidos 1:2 hasta las 2/3 partes de su capacidad incubando a 4ºC durante 40 minutos y con
cámara húmeda. En este paso se producirá la unión antígeno-anticuerpo correspondiente.
Cumplido el tiempo de incubación se procede a efectuar dos lavados consecutivos tal

como se indicara anteriormente pero durante 5 minutos cada uno. Este paso tiene por objeto
la eliminación de aquellos anticuerpos excedentes.
Luego se procede a adicionar suspensiones de glóbulos rojos al 2%

correspondientes al Grupo A y B según corresponda y se incuba a 55ºC durante 15 minutos.
Tal como hemos visto anteriormente, en esta etapa se produce la elusión de los anticuerpos,
de allí que tanto la temperatura como el tiempo de incubación resulten de suma importancia.
A continuación colocar las cubetas en un agitador mecánico durante 15 a 20 minutos.

La agitación no debe ser enérgica dado que de otra manera se desorbe el material de la
fase sólida provocando aglutinación de tipo inespecífico, procediendo posteriormente a la
observación microscópica. Para tal fin, se resuspende el depósito de los pocillos con ayuda
de una pipeta Pasteur (con precaución de no tocar las paredes de los mismos), colocar una
gota de cada uno en un portaobjetos y observar con objetivo de 10X. La presencia de

aglutinación indica un resultado positivo para la presencia del antígeno en cuestión.
Por último, en relación a este tema, digamos que se han desarrollado numerosas
técnicas de tipo electroforético que permiten no solo la determinación del grupo sanguíneo
sino también el análisis del polimorfismo del sistema ABO, las cuales no serán expuestas en
el presente capítulo.
Bibliografía.
Manchas de sangre. Capítulo IV. Tratado de Criminalística. Tomo II. La Química Analítica en
la Investigación del Delito. Editorial Policial, 1.983.
Nuevas Aportaciones a la Medicina Legal del Hemocromógeno. Gisbert Calubuig J.A. Rev.
Med. Legal, 1.948 (3). Madrid.
SWAFS, IEF Workshop. Tucson, Arizona. EEUU. October 1.991.
Curso de entrenamiento en el análisis de manchas de sangre. Crime Laboratory, Tucson

Police. Arizona. EEUU.
La Evidencia Médico Legal en Delitos Contra las Personas y Muertes Violentas. Dr. R Martín
Laguens. Colaboradores Luis A. Ferrari, Roberto E.Federici, Néstor P. De Tomas. Suprema
Corte de Justicia de la Provincia de Buenos Aires. Pp 53 – 58. 2.000.
Budowle B, Leggitt JL, Defenbaugh DA, Keys KM, Malkiewicz SF. The presumptive reagent
fluorescein for detection of dilute bloodstains and subsequent STR typing of recovered DNA.
J Forensic Sci 2000;45(5):1090–1092.
Inhibition of Bleach-Induced Luminol Chemiluminescence, Erina J. M. Kent,1 M.Sc.; Douglas

A. Elliot,1,2 Ph.D.; and Gordon M. Miskelly,1 Ph.D., J Forensic Sci, Jan. 2003, Vol. 48, No. 1.
The effect of luminol on presumptive tests and DNA analysis using the polymerase
chain reaction, Gross AM, Harris KA, Kaldun GL. J Forensic Sci 1999;44(4):837–840.
Análisis Serológico. División Laboratorio FBI. Capítulo V.
Examination and Typing of Bloodstains in the Crime Laboratory. LEAA 1.971, pp 62 – 66,
Culliford GJ.
DNA Profiling. New Tool Links Evidence to Suspects With High Certainty. Special Report.
John I. Thornton. C&EN. November 20, 1.989. Distribution by American Chemical.
Luminol. What’s Glowing On?. Perkins J.D.Swafs. Journal; Vol 13 Nº 2, October 1.991.
Agarose Gels: Properties and Use for Electrophoresis. Review Serwer P. Electrophoresis
1.983, 4, 375 – 382.
Hemotipificación de Muestras Proveninentes de Manchas Secas Según Sistemas de

Alutinógenos “ABO” por Inmunoensayo no Competitivo Directo en Fase Sólida. Laboratorio
Químico de la Policía de Entre Ríos. II Congreso Internacional de Criminalística. Paraná 15,
16 y 17 de Agosto de 2.001.
Encyclopedia of Forensic Sciences, Three-Volume Set, Edited By Jay Siegel , Michigan

State University, East Lansing, U.S.A. Geoffrey Knupfer , National Training Center for
Scientific Support to Crime Investigation, Harperley Hall, Crook, UK , Pekka Saukko ,
University of Turku, Finland, Elsevier, 2000.
Capítulo 11
Manchas de Semen.
Autor:
Dr. Rodolfo Nieto, Perito del Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Asesoría
Pericial dependiente del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción.
En los casos de violación es común contar con muestras de semen secas asentadas
sobre diversos soportes, o bien hisopados obtenidos de la víctima. A su vez, este tipo de delitos
sexuales, constituyen un grupo de hechos sumamente difíciles de comprobar, de allí, que el
procesamiento de los materiales citados adquiera gran importancia ya que con las técnicas
actuales podría demostrarse de manera fehaciente la intervención de un determinado
individuo.
Se define el esperma como un líquido compuesto por dos fracciones, el líquido seminal
y los espermatozoides, revistiendo ambos gran importancia desde el punto de vista pericial.
En el primero encontramos bases orgánicas tales como la colina, la espermina y la

espermidina, sustancia este última a la cual debe su olor el esperma. También posee en su
composición proteínas entre las cuales se pueden mencionar, por su importancia, la fosfatasa
ácida prostática, el antígeno prostático específico (PSA), la fosfoglucomutasa (PGM), peptidasa
A (Pep A) y la Glioxilasa I (Glo I). Debe mencionarse también la presencia de sustancias
similares a los antígenos del sistema ABO, los cuales estarán presentes en aquellos individuos
secretores y que permitirán la determinación del mismo en este fluido. En tal sentido, se conoce
que entre el 75 y el 80% de la población tiene esta característica y, por lo tanto, todos sus
fluidos corporales contienen este tipo de sustancias.
11.1 Estudio de las manchas de semen.
Un modo práctico para el estudio de las manchas de semen es el que se detalla en el

siguiente cuadro:
Visual
Localización Táctil
U.V.
¼ de hisopo o ½ cm2 de mancha Mancha o hisopo

+ 250 µl de Solución Fisiológica
visualización de espermetazoides
centrifugar a bajas revoluciones (2.000 rpm)
ABO
Sobrenadante Pellet
Fosfatasa ácida (AP) Observación microscópica PGM – Pep A

PSA
11.2 Localización de la mancha.
Las manchas de semen pueden presentarse sobre diversos soportes pero, los más
comunes son la ropa interior de la víctima y las prendas de cama. Un dato a tener en cuenta
serán las características del material a examinar, entre las cuales se destaca la capacidad
de absorción del mismo, su color, etc.
De todos modos, en general, puede decirse que las manchas de semen presentan
un color blanco grisáceo que va tornando hacia el amarillento con el paso del tiempo,
adquiriendo, en especial sobre las telas, una consistencia apergaminada, característica que
resulta de utilidad para su ubicación por medio del tacto. El empleo de luz U.V. constituía un
método práctico para localizar este tipo de manchas, pero los daños que ésta puede causar
al material genético ha hecho que caiga en desuso. La misma se basaba en la propiedad
fluorescente de las manchas de esta clase.
11.3 Observación de Espermatozoides.
La visualización de espermatozoides completos constituye, por sí sola, la única

prueba irrefutable de la presencia de semen en una mancha.
De allí que, previo a detallar las técnicas a emplear para tal fin, es importante repasar
someramente su estructura. Los espermatozoides son células móviles compuestos
básicamente por cabeza (en la cual se encuentra el núcleo), cuello, cuerpo y cola. Su
longitud oscila entre 40 y 50 µm, mientras que con respecto a su forma la cabeza, vista de
frente, es oval, mientras que de perfil es aguzada (Fig. 11.1).
Fig. 11.1: espermatozoide.
Para su estudio, tal como puede verse en el esquema precedente, hay dos
posibilidades. Una de ellas es trabajar directamente sobre el material motivo de pericia y la
otra sobre el pellet obtenido en la centrifugación de un macerado en solución fisiológica de
la mancha a estudiar. Cualesquiera sea la metodología empleada, un hecho para tener en
cuenta es que los espermatozoides son elementos sumamente lábiles, de modo tal que la
cabeza y la cola se separan muy fácilmente. De allí que múltiples factores que hacen a la
conservación de la muestra dificultan, cuando no imposibilitan, la observación de estos
elementos en forma completa. Paralelamente, esto implica un sumo cuidado en el
procesamiento del material a estudiar.
Por otra parte debe tenerse en cuenta que ciertas enfermedades afectan, de forma
diversa, la cantidad de espermatozoides que produce un individuo. Así, en la
oligozoospermia, su concentración está disminuída, mientras que en la azoospermia no se
encuentran presentes en el semen.
• Visualización directa: para tal fin, un trocito de la mancha en estudio se coloca

en el centro de un portaobjetos, adicionando sobre el mismo una gota de
solución fisiológica y otra de una solución al 0,5% de eritrosina en NH3 al 5% y
se comprime el material con ayuda de dos agujas de disección, con el objeto
que los componentes de la mancha pasen a la solución. Luego se retira la
muestra, se coloca un cubreojetos y se observa al microscopio con ocular de
40X. Los espermatozoides se verán con la cabeza teñida de color rosa.
• Visualización previa centrifugación: en este caso, y tal como se indica en el

esquema, se emplea el sedimento de la centrifugación de un macerado de la
mancha en solución fisiológica.
Para tal fin, ¼ de un hisopo o un cuadrado de 0,5 cm de lado de tela manchada se

coloca en un tubo de centrífuga al cual se adicionan 250 µl de solución fisiológica. Luego,
con sumo cuidado, se presiona el material contra las paredes del tubo con ayuda de una
varilla de vidrio a fin que el material presente en el mismo pase a la solución.
Posteriormente, de retira el material presionando de modo tal que escurra el líquido

casi en su totalidad. Luego se centrifuga a baja velocidad (1.500 a 2.000 rpm) durante 3 a 5
minutos. El sobrenadante se transfiere con sumo cuidado a otro tubo y sobre el sedimento
se procede a investigar la presencia de espermatozoides, previa resuspensión del mismo
agitando suavemente, empleando la coloración descripta precedentemente.
En ese sentido, diversas son las técnicas que pueden utilizarse, siendo una de ellas
la desarrollada por I.C. Stone.
Para ello se prepara las siguientes soluciones:
a) Solución Kernechtrot; disolver 5g de Al2 (SO4 )3 (grado analítico) en 100 ml de agua
destilada hirviendo. Inmediatamente adicionar 0,1g de Nuclear Fast Red y agitar con
ayuda de una varilla de vidrio. Enfriar y filtrar a través de papel de filtro. Esta solución
es estable de 3 a 6 meses a 8ºC.
b) Solución picroindigocarmín (PICS); adicionar 4g de ácido pícrico (grado analítico). a
300 ml de agua destilada, en un vaso de precipitado Tapar el recipiente y dejar
durante toda la noche a temperatura ambiente a fin de obtener una solución
saturada. Luego disolver 1g de Índigo-carmín, filtrar y guardar. Unos pocos cristales
de ácido pícrico pueden permanecer en la solución.
Procedimiento: una gota del pellet se coloca en un portaobjetos y se adiciona sobre ésta
una gota de solución a). dejando 15 minutos debajo de un vaso de precipitado adecuado
(600 ml) invertido. A continuación, con una pipeta limpia adicionar en un lateral del
portaobjetos 1 – 2 gotas de agua deionizada de modo tal que no toque la mezcla. Inclinar
con cuidado el portaobjetos y quitar el excedente con papel de filtro. No tocar el área original
de la gota muestra con el papel. Repetir esta operación hasta que el agua de lavado resulte
incolora.
Luego, agregar una gota de la solución b) sobre el sector donde se había colocado la
muestra y emplear la misma técnica de lavado descripta anteriormente, pero empleando
etanol absoluto. Al observar al microscopio, los espermatozoides se visualizarán teñidos de
la siguiente manera: la cabeza de color rojo, la parte central roja y verde y la cola de color
verde. De existir células de la mucosa se observarán teñidas de color azul con su centro
rojo.
En muestras mal conservadas los espermatozoides pueden aparecer pálidos o

descoloridos e, inclusive, de una tonalidad verdosa o violeta. Debe tenerse presente que
éste fenómeno también puede ocurrir en casos de sobrecoloración con la solución b).
Si los espermatozoides no se observan completos, el autor refiere que pueden

reconocerse las colas, aunque debe recordarse aquí la importancia, por el grado de certeza,
de observar estos elementos completos. Una variante más sencilla de realizar esta técnica
es la siguiente: una gota del sedimento se fija a un portabjetos mediante la acción del calor
(30 minutos a 60ºC).
Luego, cubrir el preparado con una gota de Nuclear Fast Red y dejar al menos 10
minutos. Lavar con agua destilada. A continuación, adicionar una gota de picroindigocarmín
y rotar el preparado durante 15 – 30 segundos (pero no más). Lavar con etanol, secar y
observar a 400X, usando aceite de inmersión de ser necesario.
Otras metodologías a emplear serían Papanicolau, May Grünwald – Giemsa, azul de

Loeffler, etc. Cualesquiera fuera la metodología empleada, se coloca una gota del sedimento
en un portaobjetos, se hace un extendido y se lo deja secar al aire, pudiendo recurrir
eventualmente y con precaución, a una fijación con ayuda de calor muy suave.
11.4 Fosfatasa ácida prostática.
Como hemos dicho anteriormente, los espermatozoides son elementos sumamente

lábiles, motivo por el cual en los Laboratorios Forenses resulta muy frecuente no poder
observarlos completos. A este hecho debe sumarse que, tal como se mencionó
anteriormente, diferentes patologías pueden disminuir su número e incluso estar ausentes
en el fluido seminal.
Es en estos casos cuando evidenciar la presencia de semen se torna más dificultosa

aunque, diversos marcadores, permiten arribar con un grado de certeza muy importante a
tal objetivo. Para tal fin se debe demostrar en la mancha la existencia de componentes
habituales del plasma seminal, tales como colina, espermina, fosfatasa ácida prostática (AP)
y el antígeno prostático específico (PSA), siendo los dos últimos los más empleados hoy en
día.
Para ello, se puede trabajar con el sobrenadante de la centrifugación o bien con el

líquido obtenido luego de adicionar al material en estudio solución fisiológica. La primera
alternativa posee como ventaja la “limpieza” de la solución a emplear.
La AP es una enzima presente en el semen en concentraciones tan elevadas como
en ningún otro fluido biológico. Si bien es cierto que la misma no se encuentra
exclusivamente en dicho fluido, la característica enunciada sumado a que es inhibida por el
ácido L (+) tartárico, han permitido el desarrollo de técnicas destinadas a su investigación.
Una de ellas es la de Sivaram la cual por su practicidad, rapidez, sencillez y la

posibilidad de realizar varios ensayos simultáneamente, resulta de suma utilidad para el
estudio de esta enzima.
Los reactivos a emplear son los siguientes:
• Buffer citrato- cítrico pH 4,9: disolver 1,89 g de ácido cítrico monohidrato en 50 ml

de H2O destilada. Adicionar a la solución resultante 18ml de NaOH 1 N y 10 ml de HCl 0.1
N, ajustando el pH a 4,9. Completar a 100 ml y conservar en heladera.
• Tartrato de Sodio 0,4 M: disolver 0.6g de ácido L (+) tartárico en 5 ml de agua
destilada y luego adicionar 3.5 ml de NaOH 2 N. Ajustar el pH a 4.9 y completar el volumen
a 10 ml con agua destilada. Conservar en heladera.
Los reactivos siguientes se deben preparar en el momento de usar:

• Reactivo I: alfa-naftil fosfato disódico (5 mg) se disuelven en 5 ml de buffer citrato y a

continuación se le adicionan 5 mg de Fast Blue B. Disolver.
• Reactivo II: 5 mg de alfa-naftil fosfato disódico se disuelven en 4,5 ml de buffer
citrato y 0,5 ml de tartrato 0,4 M, adicionando, a continuación, 5mg de Fast Blue B.
Observar que la diferencia entre los dos últimos reactivos consiste en la presencia del
inhibidor en el segundo de ellos.
11.4.1 Ensayo de orientación.
El mismo tiene como utilidad descartar, o no, la presencia de la enzima en el material

en estudio. Para su realización, la mancha se comprime con un papel de filtro húmedo y se
adiciona sobre el mismo gotas del reactivo I que de ser positivo, se observa en forma
prácticamente inmediata, la aparición de un color púrpura.
Es aconsejable la realización de un ensayo en blanco empleando para tal fin un sector
no manchado del material en estudio. El mismo tiene por objeto descartar la presencia de
interferencias.
11.4.2 Ensayo de confirmación.
en caso de obtener resultado positivo en el ensayo precedente, se procede a efectuar

la prueba definitiva, la cual se realiza de la siguiente manera: en el primer pocillo de una
policubeta de Kline se coloca una gota de solución obtenida de modo similar a aquella del
material en estudio, pero empleando una zona del mismo no maculada (blanco).
En los dos pocillos contiguos adicionar una gota del macerado o sobrenadante en
estudio(ver fig. 11.2)
Fig.11.2 1 gota blanco 1 gota muestra problema
Posteriormente, se adiciona a los dos primeros pocillo una gota del Reactivo I y, al
tercero, una gota del Reactivo II. Al cabo de un minuto, aproximadamente, deberá
observarse la aparición de un color púrpura en el segundo pocillo, permaneciendo
inalterables los otros dos en caso de una reacción positiva, mientras que de ser negativa no
se observará la aparición de dicha tonalidad. Eventualmente, puede apreciarse una cierta
tonalidad en el tercer pocillo, pero su intensidad deberá ser considerablemente menor que
aquella del primero. Este hecho se debe a que la concentración de la enzima presente es
muy elevada y por lo tanto, rebasa la capacidad inhibitoria de ácido L (+) tartárico. De todos
modos, el primer pocillo deberá permanecer siempre inalterable, ya que la aparición de color
indicará la presencia de algún tipo de interferencia originado en el soporte de la mancha.
Algunos autores consideran importante la cuantificación de la enzima debido a

determinados cuestionamientos legales relacionados, por ejemplo, con la concentración de
la misma en la mancha y en el semen del imputado. Sin embargo múltiples factores pueden
afectar la cantidad y actividad de la enzima en el material a estudiar por lo cual el autor del
presente capítulo estima que este hecho resulta irrelevante.
11.5 Antígeno Prostático Específico (PSA).

Este marcador consiste en una glicoproteína intracelular (PM 34.000 dalton),

sintetizada exclusivamente por la glándula prostática, siendo, por lo tanto un componente
normal del plasma seminal.
Para su estudio pueden emplearse diferentes metodologías, entre las cuales el kit
comercial “PSA-check 1” provisto por la firma Veda-lab ofrece muy buenos resultados,
siendo además un método práctico y rápido.
Se trata de un ensayo inmunocromatográfico, el cual emplea una única combinación
de conjugado colorante-anticuerpo monoclonal y anticuerpo policlonal en fase sólida,
permitiendo así identificar el antígeno con un aceptable grado de sensibilidad (límite de
detección 4 mg/ml).
De este modo, el antígeno se combina con el anticuerpo monoclonal, fluye por la placa
por capilaridad y se combina con los anticuerpos anti-PSA fijos, originando un complejo
coloreado visualizado en forma de banda, que indicará una reacción positiva.
Técnica: 6 gotas (aproximadamente 200µl) del macerado de la mancha o del

sobrenadante se dejan caer en el sector de la placa destinado a tal efecto, se deja unos 10
minutos y luego se lee el resultado. La aparición de dos bandas de color indicarán una
reacción positiva mientras que la aparición de una sola banda indicará un resultado negativo
(fig.11.3).
Sector agregado macerado banda control banda que indica presencia de PSA
Fig. 11.3: determinación por inmunocromatografía de PSA (Veda-lab).

La banda control debe observarse en todos los casos, ya que de no ser así, indica la
existencia de algún inconveniente, siendo aconsejable repetir la prueba empleando otra
placa.
Electroforesis empleando anti-P30:
La proteína P30 es una glicoproteína característica del semen y cuyas características

coinciden, exactamente, con aquellas del antígeno prostático específico, no obstante lo cual
será designada con el nombre de la técnica original.
El antisuero empleado, anti-P30 provisto por los Laboratorios SERI, es específico de
P30 y no muestra reacción cruzada con ningún otro fluido corporal. Este reacciona con
máxima sensibilidad (semen diluido 1:3.000) usando la técnica de cross-over y de allí que
sea la misma la aconsejada.
Un hecho a tener en cuenta, es que la proteína a investigar está formada por cuatro
fracciones y se requiere, por lo tanto, una correcta combinación de los valores de
endosmosis y pH para que las mismas permanezcan unidas.
Reactivos:
• Buffer de corrida: disolver 25,2 g de Tris base más 2,5 g de EDTA (libre de ácido) y
1,9 g ácido bórico en 1 litro de agua destilada. Ajustar a pH 9,1 con solución de
NaOH al 20%.
• Buffer Gel: Idem buffer de corrida.
• Gel de Agarosa 1%: disolver 0,08g de Agarosa en 8ml de Buffer Gel
• Coomassie Blue 0,2% disolver el colorante en una mezcla de solventes formada por:
50 ml de metanol , 50 ml de agua y 10 ml de ácido acético.
Procedimiento:
Emplear placas de 3 x 2 pulgadas (1 pulgada = 2,54 cm). Con un sacabocados realizar

hoyuelos en la placa tanto del lado anódico como catódico y sembrar el antisuero y las
muestras y testigos del segundo.
Varios autores aconsejan el empleo testigos de semen y flujo vaginal, pudiendo

mencionarse que los Laboratorios SERI proveen estándares de semen (SERI lyophilized
semen – std – R563).
La corrida electroforética se realiza a temperatura ambiente y bajo las siguientes

condiciones: voltaje 120 V durante 20 minutos. Luego, leer con luz reflejada sobre un fondo
oscuro. La lectura puede completarse de la siguiente manera: lavar la placa en una solución
salina 1 Molar durante toda la noche. A continuación cubrir con papel de filtro Wahtman Nº1
y secar a 60ºC.
Luego emplear una solución colorante de Coomassie Blue al 0,2% sumergiendo la

placa durante 15 minutos. Lavar con solución salina 1M hasta que el fondo sea claro.
11.6 Determinación de Grupo ABO en manchas de semen.
Una vez establecida la presencia de semen, el paso siguiente es la determinación

del grupo sanguíneo ABO y luego de las isoenzimas PGA y Pep A. Si bien es cierto que las
modernas metodologías para estudio del ADN han superado ampliamente (por su poder de
discriminación) a las técnicas mencionadas, el autor considera que, al menos en lo que
respecta al estudio del grupo, sigue constituyendo por su simplicidad y costos, una
interesante alternativa que permite descartar a un sospechoso.
En ese sentido, un hecho de fundamental importancia será la cantidad de muestra

disponible de la que dependerá, por razones obvias, cuales serán las pruebas a efectuar.
En cuanto a la presencia de los antígenos ABO en plasma seminal, fue establecida
por Yamasani y Shirai (1926), siendo el título de los mismos igual o mayor que aquel
observado en saliva.
La tipificación de individuos secretores mediante la técnica de absorción – inhibición

(ver capítulo Manchas de sangre) no resulta dificultosa y ofrece buenos resultados, mientras
que aquella de absorción – elución puede arrojar falsos negativos para la presencia de un
antígeno. Esta situación se debe a que las sustancias secretadas son solubles y, por lo
tanto, podrían ser descartadas en los pasos de lavado. Por tal motivo, la última de las
técnicas no es aconsejable para procesar este tipo de muestras.
Un hecho a tener muy en cuenta en la interpretación de los resultados obtenidos,

deriva de la siempre posible contaminación del semen presente con flujo vaginal (lo cual
ocurre invariablemente en hisopados vaginales) y/o sangre de la víctima.
En ese caso, algunos autores desaconsejan la determinación del grupo y, de

efectuarlo, tener muy presente que, en el resultado obtenido, bien pudo haber influido la
presencia de dichos fluidos. En tal sentido, resulta de suma utilidad el conocimiento del
grupo sanguíneo de la víctima y, de ser posible, el del sospechoso, al igual que el carácter
secretor o no de los mismos.
11.6 Otras determinaciones.
Dos sustancias cuya determinación suele investigarse en el análisis de manchas de

semen, ya sea por que son solicitadas por la instrucción o bien por la influencia que en los
resultados de las pericias podrían tener, son la saliva y la materia fecal.
11.6.1 Investigación de saliva.
Si bien la misma no posee un marcador característico, una elevada concentración de

la enzima amilasa sugeriría la presencia de este fluido.
Reactivos:
• Buffer pH 6.9: disolver 2,7 g de NaPO4H2 más 3,9 g de Na2PO4H y 0,2 g de NaCl (7
mM) en 500 ml de H2O deionizada
• Gel: disolver 0,1g de agarosa y 0,02g de Almidón soluble en 10 ml de Buffer pH 6.9
Procedimiento:
Volcar la solución del gel en una cápsula de Petri plástica de 15 x 100 mm y dejar en
reposo hasta que se forme el gel. Luego practicar en el mismo, con ayuda de una Pipeta
Pasteur o similar, hoyuelos separados por una distancia de, al menos, 1,5 cm y luego
sembrar las muestras y controles con cuidado de no rebalsar los orificios. Los últimos
pueden ser, por ejemplo, saliva sin diluir y en diluciones 1:500 y 1:1.000, los cuales,
además, servirán para tener una idea aproximada de la concentración de saliva en la
muestra en estudio, a partir de la medida de los diámetros obtenidos.
Tapar la cápsula e incubar a 37ºC toda la noche. Luego adicionar a la placa una
dilución 1:100 de una solución de yodo saturada. La presencia de círculos claros en torno a
un hoyuelo indica reacción positiva para la presencia de la enzima en la muestra en
cuestión.
11.6.2 Investigación de materia fecal.
Para tal fin, se analiza la presencia de urobilinógeno. Este test se basa en la formación
de un complejo verde fluorescente zinc – urobilina. El urobilinógeno es oxidado a urobilina la
cual es soluble en alcohol, y así, en presencia de una sal neutra de zinc en solución
alcohólica se forma el mencionado complejo.
Procedimiento: preparar un extracto acuoso de la mancha en un tubo pequeño. Colocar la

misma cantidad de agua en un segundo tubo como control. Adicionar a cada tubo 3 gotas
de una solución saturada de cloruro mercúrico en etanol.
Adicionar un volumen igual de una solución saturada de cloruro de zinc en etanol y

agitar. Luego observar bajo luz U.V. Una fluorescencia estable de color verde indica la
presencia de urobilinógeno.
Bibliografía.
Manchas de esperma.Cátedra de Toxicología y Química Legal. García Fernández, J.C.

Guatellei M.A. Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires.
Manchas de esperma. Fernández E.J, Padula, R.A., Gurrea, M.L., Carrar, A.H. Sección
Química Biológica de la Policía Federal Argentina. La Química Analítica en la Investigación
del Delito. Ediciones Policiales.
SWAFS, IEF Workshop. Tucson, Arizona, EEUU, October, 23 – 24, 1.990.
Curso de Entrenamiento en el análisis de manchas de semen. Hatch, A. Crime Laboratory

Tucson Police, Arizona, EEUU.
La Evidencia Médico Legal en Delitos Contra las Personas y Muertes Violentas. Laguens,
M., Ferrari, L.A., Federici, R.E., De Tomas, N.P. Suprema Corte de Justicia de la Provincia
de Buenos Aires. 53 – 58, 2.000.
Análisis Serológico. División Laboratorio FBI. Capítulo V.
DNA Profiling. New Tool Links Evidence to Suspects UIT High Certainty. Special Report.
Thornton J.I., C&EN. November 20, 1.989. Distribution by American Chemical.
Staining of Spermatozoa with Kernechtrot and Picroindigocarmine for Microscopical

Identification. Stone I.C. SWIFS, Criminal Investigation Laboratory, September 1.972.
Genetic Markers in Human Semen: A Review. Blake, E.T., Sensabaugh, J. For. Sci. 21 : 784
– 796, 1.976.
The individuality of Semen, with Reference to Its Property of Inhibiting Specifically

Isohemagglutination. Yamakami, K. Journal od Immunology, Vol. 12, (3), 185 – 189, 1.926.
Blood Group Substances in Body Fluids. Comparison of the Concentrations in Semen and
Saliva. Sato, M., Ottensooser, F. Journal of Forensic Medicine, Vol. 14 (1), 30 – 38, 1.967.
Tumor Markers. Bagshawe, K.D. Br. J. Cancer 48 : 167 – 175, 1.993.
Use of Human Prostate Specific Antigen in Monitoring Cancer. Kuriyama, M., Wang, M.C.,
Lee, C.L., Papsidero, L.D., Killan, C.S., Inaji, H., Slack, L.H., Nishiura, T., Chu, T.M. Cancer
Res. 41 . 3.874 – 3.876.
Measurement of Prostate – Specific Antigen by Radioimmunoassay. Liedtke R.L., Batjer,

J.D. Clin. Chem. 30 : 649 – 652, 1.984.
Monoclonal Antibody to Human Prostate Antigen. Papsidero, L.D., Crighan, G.A., Wang,
M.C., Kuriyama, M. Johnson E.A., Valenzuela, L.A., Chu, T.M. Hybridoma 2 : 139 – 147,
1.983.
Forensic Detection of Semen I. The Acid Phosphatase Test, Dale L. Laux, M.S., Attorney
General Jim Petro’s Office, Ohio Bureau of Criminal Identification, 4055 Highlander Parkway,
Richfield, Ohio 44286.
The quantitative acid phosphatase test. A statistical analysis of endogenous and postcoital
acid phosphatase levels in the vagina, Sensabaugh GF. Journal of Forensic Sciences, 24
(2), April 1979, pp. 346-365.
Reliability of the acid phosphatase test for the identification of seminal fluid, Schiff AF.,
Journal of Forensic Sciences, 23 (4), October 1978, pp. 833-843.
The Acid Phosphatase Test for Seminal Stains, A Study of Reliability of Aged Stains, Sidney
Kaye, JOURNAL OF CRIMINAL AND CRIMINOLOGY of Northwestern University
Vol. 41, No. 9, March-April, 1951.
Encyclopedia of Forensic Sciences, Three-Volume Set, Edited By Jay Siegel , Michigan

State University, East Lansing, U.S.A. Geoffrey Knupfer , National Training Center for
Scientific Support to Crime Investigation, Harperley Hall, Crook, UK , Pekka Saukko ,
University of Turku, Finland, Elsevier, 2000.
Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología
Capítulo 12
Estudio de documentos.
Autor:
Valentina Garrote
Docente de la Cátedra de Toxicología y Qca Legal de la UNLP.
Antonio Forte.
Perito del Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Asesoría Pericial dependiente
del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción.
En este capítulo, nos referiremos al análisis que se efectúa sobre un documento

cuando se sospecha de la autenticidad del mismo; ya sea porque éste ha sido adulterado,
es decir se le ha modificado parcial o totalmente su naturaleza original, o bien es el
resultado de una falsificación, ya que se lo ha confeccionado imitando otro documento.
Cualquier tipo de documento puede ser objeto de análisis dependiendo de cual sea
este (billetes, sellos, pagarés, cheques, títulos de propiedad, actas, etc) el análisis se
centrará en el papel con el que están confeccionados, en la impresión de sellos o marcas de
seguridad o en la escritura de los mismos, pudiendo ser ésta manuscrita, mecanografiada o
impresa, original o fotocopia.
El análisis del papel incluye determinar su naturaleza, así como también la

alteración de la misma, ya sea por la existencia de borrados, lavados o zonas del papel que
han sido reemplazadas por otras (parches).
373
Al efectuar un borrado físico a través de algún elemento que abrasione la superficie

escrita ( goma de borrar, bisturí, etc.), las fibras del papel pierden su ordenamiento original y
el papel disminuye su espesor y satinado. Por otro lado, la tinta tendrá mayor difusión en la
zona donde las fibras están desordenadas.
Para individualizar estas zonas es útil utilizar el método de iluminación por

transparencia, pero si el borrado no es muy profundo y no llega a observarse fácilmente de
esta manera, es de gran utilidad la observación a la luz U.V. Esta técnica ha prácticamente
reemplazado el uso de material pulverulento que queda adherido a la zona erosionada o la
exposición del documento a vapores de I2 , basado en la absorción de la zona afectada
respecto al soporte. La elección de la exposición a la luz U.V. se basa en la no alteración del
documento y en la rapidez del análisis.
El objetivo de un borrado químico es decolorar la tinta o bien hacerla soluble para

extraerla fácilmente del soporte. Para ésto, se utilizan compuestos oxidantes que son
capaces de "blanquear" los pigmentos, sin destruir el soporte. Podemos citar entre ellos al
ácido hipocloroso, al permanganato de potasio y al ácido oxálico en solución acuosa de
hipoclorito de sodio. Una vez decolorados, los pigmentos deben ser removidos con agua
destilada. De todas maneras, el soporte pierde su satinado y altera su rugosidad, por lo que
las zonas que han sido tratadas también pueden ser identificadas por exposición a la luz
U.V.
Agotado el estudio del soporte, continúa el análisis de la escritura, componente muy

importante dentro de un documento. Es en este paso, donde se evalúan tipos y tamaño de
letras, la probabilidad de que una persona sea o no la que confeccionó el manuscrito
comparando su escritura de puño y letra con la del manuscrito cuestionado, la existencia de
entrecruzamientos entre trazos de tintas, de estrías en los trazos o cualquier otra
particularidad que pueda llegar a definir o señalar las acciones ejercidas sobre el documento
y por quien o quienes han sido realizadas.
En el caso de ser posible, se busca poder establecer la edad relativa de un

documento dubitado con su indubitado o de distintas zonas de su escritura; como también
en casos muy especiales, poder arribar a la conclusión sobre la fecha de confección,
adulteración o falsificación del documento (edad absoluta), siempre dentro de un margen de
tiempo.
374
Es en este paso del análisis donde interviene la Caligrafía, disciplina que utiliza
diferentes instrumentos ópticos como lupa simple, lupa binocular, microscopio de distintos
aumentos, y distintos focos de iluminación de variadas intensidades y con diferentes ángulos
de incidencia.
Actualmente, existen técnicas de análisis más sofisticadas como el procesamiento y

análisis digital de imágenes, que a través de fuentes de luz en un amplio rango del espectro
(visible, ultravioleta e infrarrojo) y el empleo de software asociado, aporta información
adicional a las técnicas tradicionales.
Es importante destacar que las técnicas arriba nombradas, permiten analizar un

documento de forma no destructiva, por lo que siempre deben efectuarse en primera
instancia y previamente al análisis químico y cromatográfico de las tintas.
En este capítulo, nos referiremos especialmente a estos dos últimos aspectos.
12.1 Análisis químico de un documento.
Una vez agotadas las pericias físicas no destructivas, comienza el análisis químico,
tendiente a poner de manifiesto la existencia de más de un tipo de tinta en la escritura de un
documento, o el tipo o tipos de tinta utilizadas.
Se dice que se trata de un estudio destructivo ya que, por ejemplo, en el análisis

conocido como "ensayo a la gota", los reactivos utilizados y colocados sobre los trazos de
escritura (ácidos fuertes, álcalis y distintos solventes), pueden afectar el soporte. Una
alternativa para evitar la destrucción total del documento y que es el procedimiento habitual
usado en la extracción de muestras previa a una cromatografía en capa delgada (TLC), es
extraer una pequeña porción del trazo objeto de estudio, pero de todos modos, el
documento es destruido parcialmente.
Debido a ésto, debe informarse a la autoridad que solicita el análisis que el

documento resultará alterado luego del estudio, por lo que debe esperarse la autorización
375
escrita para llevarlo a cabo. Asimismo, en estos casos resulta indispensable realizar una
cuidadosa documentación fotográfica del documento previo a su alteración.
12.1.1 Ensayos químicos a la gota.
El fundamento de este análisis se basa en la existencia de diferentes tipos de tintas,

las cuales presentan un determinado comportamiento frente a distintos reactivos químicos.
Así, el objetivo del mismo es comparar dichos comportamientos con el presentado por las
tintas cuestionadas.
• Descripción del documento.
El primer paso en el análisis de un documento e independientemente de la técnica

utilizada para ésto, es hacer una descripción detallada del documento a analizar,
documentando con fotos, escaneados o fotocopias, el estado del documento antes de ser
sometido a análisis.
Por otro lado, deben identificarse perfectamente las zonas que serán estudiadas, lo
que permitirá la correcta interpretación de los resultados obtenidos.
• Agregado de los diferentes reactivos.
Para esto se utiliza una micropipeta, dejando caer una gota del reactivo sobre el
trazo que ha de ser analizado.
Existen 5 grupos de reactivos:
• Acidos: (HCl al 5 % ; ácido oxálico al 10 %)

• Básicos: (NaOH al 2 %; NH3 al 5 %)
• Reductores: (SnCl2 al 10 % en HCl 0,1N; agua saturada de SO2 , hidrógeno naciente)
• Oxidantes: (agua de bromo; agua de cloro; hipoclorito de sodio al 10 %)
• Hierro: ferrocianuro de potasio al 5 % en HCl 0,1N;: ferrocianuro de potasio al 5 % en
HCl 0,1 N).
Luego del agregado del reactivo elegido dentro de los pertenecientes a un grupo, sobre
cada una de las porciones del documento, se deja actuar aproximadamente 1 minuto. El
376
exceso de reactivo debe ser eliminado con papel absorbente y luego la zona lavarse con agua
destilada y se observan los resultados. De esta manera se evita que el soporte se destruya
más de lo necesario.
Existen tablas confeccionadas por distintos autores, que consignan los resultados
obtenidos para diferentes tipos de tintas. Una de ellas son las tablas de O' Hara y Osterburg.
Debido a que actualmente las tintas más utilizadas son las tintas de bolígrafos y a
que en el mercado existe una gran variedad de éstas y con diferente composición, no es
posible obtener una base de datos que incluya los resultados de este tipo de pruebas.
En el caso de escrituras mecanografiadas, el negro de humo presente en la tinta

utilizada es resistente a la mayoría de los reactivos, por lo que enmascara los resultados.
Asimismo, para ensayar la respuesta de cada trazo de tinta frente a por lo menos
uno de los reactivos de cada grupo, se necesita extraer muchas porciones de la escritura,
originando que el documento deba destruirse en gran medida, alterando definitivamente la
prueba.
Por otro lado, en la mayoría de los casos, no se busca conocer cuál es el tipo de tinta
utilizado, sino en definir si hay más de un tipo de tinta dentro de la confección de un mismo
documento o de varios asociados. Con éste objetivo, es suficiente hacer un análisis
comparativo entre los diferentes trazos que a simple vista pueden mostrarse ligeramente
diferentes o no. Este análisis es generalmente realizado por cromatografía en capa delgada.
12.1.2 Examen cromatográfico en capa delgada.
Una tinta está formada por un cierto número y tipo de pigmentos. El hecho que dos
tintas puedan observarse indistintas a la luz visible, o incluso a la ultravioleta o infrarroja, no
implica que los pigmentos que las forman sean los mismos.
La TLC permite separar los pigmentos que componen una tinta y luego compararlos
con los que conforman otra, fundamentándose en el hecho que dos compuestos de
diferentes estructura molecular diferirán en su comportamiento cromatográfico.
377
Al analizar un documento es importante realizar, para las mismas muestras,

diferentes corridas cromatográficas con distintos solventes, ya que de ésta manera nos
aseguramos la separación total de todos los pigmentos que componen una tinta.
Procedimiento.
• Descripción del documento:
La aplicación de técnicas destructivas del documento debe ir precedida de una

documentación fotográfica del mismo mostrando su estado original y las alteraciones
producidas después de su análisis.
• Extracción de los trazos
De manera de obtener las muestras de tintas y destruir lo menos posible el

documento, se utiliza un sacabocados de pequeño diámetro (0,5 mm, según indican
Kempny y Blanco) o en su defecto un bisturí, con los que se extraen pequeñas porciones de
los trazos.
Es de elección tomar zonas en donde existan entrecruzamientos o una mayor

descarga de tinta, de manera tal de obtener la mayor cantidad de muestra en la menor
superficie posible.
Luego de la extracción, colocar cada porción perfectamente identificada en tubos de

ensayo pequeños o en placas de toque también identificadas, para proceder a extraer la
tinta del soporte (papel, telas, etc.)
Otra metodología de trabajo consiste en colocar directamente la zona de soporte

extraída sobre el punto de siembra definido en el cromatofolio. Sobre cada fragmento, se
dejan caer gotas del solvente de extracción elegido hasta observar la transferencia de la
tinta desde el soporte original al cromatofolio. Este método es poco eficiente y propenso a
que la muestra se desprenda de la placa.
• Extracción de las tintas.
378
Existen diversos solventes y mezclas de los mismos que se utilizan para la

extracción, dependiendo del tipo de tinta que se desee extraer. El solvente más general y
comúnmente usado, es la piridina o mezclas piridina - agua (1:0.2).Otros solventes muy
utilizados especialmente para tintas de bolígrafo, son el metanol o la mezcla propuesta por
Nakamura- Shimoda, butanol-etanol-agua (50: 10:15)
Una vez que las muestras de los trazos han sido aisladas e identificadas se agrega, a
cada una de éstas, una a dos gotas del solvente adecuado. Esperar hasta que la tinta difunda
totalmente desde el soporte hasta el solvente, observando cómo éste se colorea por la tinta y el
soporte pierde todo rastro de la misma, ayudando con un vórtex al menos durante 15 minutos.
En el caso de tratarse de tintas de sellos, un caso particular analizado en el

Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Asesoría Pericial del Poder Judicial de la
Provincia de Buenos Aires, permitió luego de diferentes ensayos experimentales, concluir
que éstas podían extraerse del papel utilizando piridina : amoníaco (1:1). En este ensayo se
colocó una gota de amoníaco sobre el fragmento elegido y separado del documento. Se
dejó actuar hasta notar la difusión de la tinta y luego se colocó una gota de piridina, con la
cual se retomó la tinta. Posteriormente, los extractos fueron sembrados en un cromatofolio
HPTLC RP-18 F254 y se utilizó como solvente de corrida el propuesto por Nakamura-
Shimoda.
• Siembra de las muestras.
El extracto líquido obtenido de cada una de las muestras, será un punto de siembra en
la placa cromatográfica.
Los cromatofolios que habitualmente se utilizan son placas de silicagel 60 F254

Merck. El indicador de fluorescencia sirve en los casos en que exista un componente de
alguna de las tintas que presente fluorescencia a la luz ultravioleta, pudiendo diferenciarla
de otras que al intervalo de longitudes de onda del visible, presenten los mismos pigmentos.
Las placas comerciales comúnmente usadas, son cuadradas y de 20 cm de lado. Las

mismas deben cortarse en su parte media, tal cual lo indica la figura 12.1.
379
10 cm
✁
20 cm
Figura 12.1. Corte de la placa cromatográfica.
De esta manera, se obtendrán dos placas de 10 cm de alto por 20 cm de ancho. Es

importante realizar un corte parejo y tratando de no dañar la sílicagel, ya que pequeñas
imperfecciones del soporte pueden afectar la correcta resolución de los componentes.
En la figura 12.2 se muestra la distancia a la que se siembran las muestras (línea de
siembra) y el espacio que se debe dejar entre cada una de ellas( puntos de siembra ).
1.5 cm
Línea de siembra
Puntos de siembra
Figura 12.2. Marcado de la placa cromatográfica.
• Siembra.
La siembra de cada una de las muestras se realiza con un capilar de vidrio muy fino
hasta agotar los extractos líquidos. En el caso que la muestra se halla evaporado al momento
de la siembra, ésta debe ser retomada con 1 a 2 gotas del solvente usado en la extracción.
380
Es muy importante una correcta siembra, permitiendo que el solvente se evapore luego
de cada toque y antes del siguiente. Para ésto, el cromatofolio puede colocarse sobre una
placa calefactora de manera tal de acelerar la evaporación del solvente usado en la extracción.
Pero la temperatura no debe ser excesivamente alta, ya que podría afectar los pigmentos que
componen las tintas.
Otra forma de permitir la rápida evaporación del solvente para que la muestra difunda lo
menos posible sobre la sílica en el punto de siembra obteniendo máculas bien definidas y
circulares, es usar una corriente de aire (ej.: secador de cabello, caloventor, etc.) en dirección a
la siembra. En este caso también debe tenerse cuidado con la temperatura alcanzada.
• Análisis cromatográfico.
En este paso es fundamental utilizar el solvente de corrida adecuado, y así obtener la

mejor resolución de los componentes de las tintas. Lo que se busca es tener bandas lo más
separadas y definidas posibles.
Por otro lado es necesario realizar la corrida cromatográfica con al menos dos
solventes de corrida diferentes, de manera de asegurarnos al separación total de todos los
pigmentos.
Se han propuesto diferentes solventes o mezclas de éstos, siendo los más

comúnmente usados los siguientes:
• Butanol - etanol - agua (50:10:15), propuesto por Nakamura-Shimoda y es el solvente de

corrida que mejor poder resolutivo tiene para la mayoría de las tintas del mercado.
• Isopropanol - agua - n-butanol (25:25:50).
• n-propanol - fenol - agua (28:7:15).
• Acetato de etilo - etanol - agua - ( 70:35: 30).
Es recomendable colocar el solvente de corrida en la cuba cromatográfica, unos 15

minutos antes de colocar la cromatoplaca dentro. Esto permite una buena saturación de la
cuba con los vapores del solvente y una mejor corrida.
381
Debe tenerse cuidado con el volumen de solvente que se coloca en la cuba. Este
no debe ser tal que, en altura, llegue o supere la línea de siembra. Si así fuera, se produciría
la "inundación" de las zonas de siembra y el "lavado" de las mismas. El solvente debe llegar
a los puntos de siembra solo por capilaridad. De esta manera, el volumen de solvente de
corrida dependerá del tamaño de la cuba y de la altura de la línea de siembra.
Por otro lado, y una vez comenzada la corrida, no debe moverse ni abrirse la cuba,
que debe estar cerrada herméticamente y nivelada. Para lograr un buen cerrado se utiliza
grasa siliconada o vaselina. De esta manera evitamos la pérdida de solvente por
evaporación y el cambio de composición del mismo debido a las diferentes volatilidades de
sus componentes. La correcta nivelación de la cuba permite una corrida pareja de los
pigmentos, lo cual se traduce en bandas comparables a través de sus Rf.
12.2 Cromatografía Líquida de Alta Perfomance.
Un método que ofrece mayor capacidad de comparar muestras de tintas es el que

reemplaza la TLC con la cromatografía líquida de alta perfomance. Esta técnica permite la
posibilidad de obtener de los picos resueltos en el cromatograma espectros completos
cuando se utiliza un detector con arreglo de diodos, además de permitir a través del
software que acompaña a los HPLC la comparación directa de los cromatogramas de
referencia y las muestras cuestionadas y sus espectros.
La electroforesis capilar, considerada por muchos como la técnica sucesora del

HPLC también ha sido aplicada con gran éxito a la resolución del estudio de tintas.
• Procedimiento:
La mayoría de las tintas de bolígrafos de color negro debería ser solubles en un

solvente de extracción compuesto de 55 % de acetonitrilo y 45 % de una solución acuosa de
HEPES 0,005 M pH 4,7. El mismo solvente se utilizará como fase móvil en la cromatografía
líquida de fase reversa.
Los segmentos provenientes del documento cuestionado se obtienen mediante una

aguja calibre 20 que se utiliza a modo de sacabocado. Transferir 10 de estos segmentos a
un tubo eppendorff de 1,5 ml con la ayuda de un hilo metálico. Agregar 0,5 ml del solvente
382
de extracción y colocar en un baño ultrasónico durante 15 minutos para facilitar la extracción

de la tinta. Se debe agregar muestras obtenidas del papel en zonas sin escritura y de zonas
donde la tinta no está bajo sospechada.
Centrifugar los eppendorff para sedimentar las fibras de papel en suspensión o filtrar
por filtros para muestras de 0,2 micras.
• Espectrofotometría Visible.
Utilizar cubetas de vidrio de volumen pequeño. Realizar un escaneo de la zona

comprendida entre 350 y 750 nm con un ancho de banda de 1 nm del solvente de extracción
puro y utilizarla como línea de base, obtener un espectro del papel sin tinta y de las zonas
confiables y bajo sospecha. Se recomienda obtener al menos 50 espectros y promediarlos.
Existen varios métodos para el procesamiento de datos, aunque la obtención de la

primer y segunda derivada con cualquier software de análisis estadístico permite resaltar las
pequeñas diferencias si estas existen.
• Análisis por Cromatografía Líquida de Alta Perfomance.
Equilibrar una columna de fase reversa (C18) de 20 cm de largo (dp 5 micras) con la
fase móvil utilizada en la extracción. Ajustar el caudal a 0,3 ml/min. Resulta óptimo utilizar un
sistema DAD (detector de arreglo de diodos) para mejorar las posibilidades de comparación,
de lo contrario registrar a una longitud de onda promedio obtenida de los espectros
anteriores. Comparar los cromatogramas con respecto al número de picos, tiempos de
retención y alturas relativas de los picos.
12.3 Digitalización de Imágenes.
383
Una imagen g (x, y) , en principio, es continua tanto en la variación espacial

(coordenadas x, y ) como en las amplitudes (resolución en niveles de gris o Bits). Para que
una imagen sea representada en un computador, es necesario que sea digitalizada, tanto en
el dominio espacial (x, y) como en el de las amplitudes.
Supongamos una imagen continua, g(x, y) , representada en forma de una matriz N x

N:
G(0,0) g(0,1) g(0,2) ..... g(0,N-1)
G(1,0) g(1,1) g(1,2) ..... g(1,N-1)
G(x,y) ......... ......... .......... ........ ...........
........ ............ ........ ....... ..............
g(N-1,0) g(N-1,1) g(N-1,2) ... g(N-1,N-1)
donde : cada elemento de matriz es un valor entero, g(i, j) = g(i x,j y) , como i,j = 0, 1, 2, ....
N-1 y son los intervalos de muestreo en las direcciones x e y respectivamente.
Esta ecuación representa una imagen digital. Cada elemento de la matriz es

conocido como un elemento de imagen ó PIXEL. El valor de cada elemento, denotado por
un nivel de gris, debe estar dentro de un intervalo finito, (0, K-1) , donde K es el número de
valores posibles de niveles de cuantización. Los procesos de muestreo en las coordenadas
espaciales x e y en una grilla de puntos NxN y de cuantización de los niveles de gris
continuos en K valores son conocidos como Muestreo y Cuantización respectivamente.
Cuanto más fina la grilla de muestreo, (N más grande), y la cuantización, (K mayor),
mejor será la aproximación de la imagen original.
Ejemplo de una imagen digital:
384
Cada “cuadrado” de la imagen representa un píxel (escala muy exagerada), con

valores tanto espaciales (x, y) como espectrales.
A modo de comparación, ejemplo de película fotográfica convencional:
La posibilidad de tratar una imagen como un conjunto de números asimilables por un

computador permite que este pueda realizar distintos análisis y realces sobre la imagen
original.
12.4 Métodos de Análisis.

385
Actualmente podemos dividir los métodos de análisis de datos de Sensores Digitales

en dos grandes grupos:
ANALISIS VISUAL - ANALISIS DIGITAL
Podemos decir, que a pesar que la técnica de análisis visual es anterior a la de

análisis digital, actualmente es necesario primero un análisis digital, ya que ciertos
tratamientos mejoran la calidad de la imagen, facilitando por ende su análisis visual.
Entonces, podemos definir al Procesamiento y Análisis Digital de Imágenes como:

TECNICA QUE NOS PERMITE EL ANALISIS Y MANIPULACION DE IMÁGENES POR UN
COMPUTADOR cuya finalidad es:
1.- EXTRAER INFORMACION DE IMÁGENES

2.- TRANSFORMAR LA IMAGEN DE MODO QUE LA INFORMACION SEA MAS
FACILMENTE DICERNIBLE POR EL OJO HUMANO.
Tipos de Imágenes.
Dentro del dominio espacial tenemos dos grandes grupos: las Imágenes Escala de
Gris y las Imágenes Color. Ciertos programas nos permiten obtener una “Imagen” de su
espectro, aplicando Transformada de Fourier: tendríamos una imagen dentro del dominio
de las frecuencias .
Color:
El empleo del color en el procesamiento de imágenes está motivado por dos factores
principales. Primero, en el análisis automático de imágenes, el color representa un potente
descriptor que a menudo simplifica la identificación de un objeto y su extracción de una
escena. Segundo, en el análisis de imágenes realizado por seres humanos, el interés por el
color reside en que nuestro ojo es capaz de discernir miles de matices e intensidades de
color, en comparación con sólo dos docenas de niveles de gris.
386
El procesamiento de imágenes en color se divide en dos áreas fundamentales: el

procesamiento en color real o todo color y en falso color. En la primera categoría, las
imágenes en cuestión se adquieren mediante un sensor de color, como una cámara digital o
un escáner. En la segunda categoría, el problema consiste en asignar un nivel de color a
una determinada intensidad o rango de intensidades monocromáticas.
Aunque el proceso seguido por el cerebro humano para percibir el color es un

fenómeno psicofisiológico que todavía no se ha llegado a entender, la naturaleza física del
color se puede expresar en una base formal corroborada por los resultados experimentales
y teóricos. Básicamente, los colores que los seres humanos percibimos en un objeto están
determinados por la naturaleza de la luz reflejada por el objeto. La luz visible está formada
por una banda de frecuencias relativamente estrecha del espectro electromagnético. Un
cuerpo que refleje luz que esté relativamente equilibrada en todas las longitudes de onda
aparece como blanco para el observador.
Sin embargo, un cuerpo que tiene una mayor reflectancia en una determinada banda
del espectro visible aparece como coloreado. Por ejemplo, los objetos de color verde
reflejan la luz con longitudes de onda esencialmente en la banda entre 500 y 570
nanómetros, mientras que absorben casi toda la energía en las restantes longitudes de
onda.
Aplicaciones:
a.- Detección de adulteración de documentos, incluyendo: borrado, enmiendas,

superposición de tintas, identificación por respuesta espectral de distintos tipos de tintas,
medición de espesores de trazos, etc.
b.- Realce y mejoramiento de placas TLC y cromatográficas en los casos que las corridas
son poco discernibles al ojo humano.
c.- Captura y mejoramiento de imágenes en revenidos en motores y armas, mejorando su
visualización y cotejo por superposición entre los números.
d.- Morfometría e identificación de distintos tipos de fibras.
387
388
Caligrafía:
a.- Permite la captura de documentos y trazos bajo lupa binocular de alta resolución, ó
microscopio, permitiendo la observación a escalas mayores a las habituales y su posterior
graficación en alta resolución.
b.- Cotejo de escrituras mecánicas o manuscritas por superposición.
c.- Alteraciones en documentos, falsificaciones de papeles de uso oficial.
d- Cotejo por superposición de tipografía en máquinas de escribir.-
e.- Determinación de falsificación de papel moneda.
f.- Cotejo por superposición de sellos, a fin de determinar los apócrifos.
g.- Determinación de superposición de escrituras con sellos.
389
Aplicaciones con cámara CCD multiespectral (ultravioleta –

infrarrojo).
Lo anteriormente expuesto se realiza con un sensor que capta solamente el espectro

visible, o sea el rango comprendido entre las longitudes de onda de 0.4 y 0.76 nanómetros
del espectro electromagnético, siendo simplemente lo que ven nuestros ojos (las
combinaciones de rojo, verde y azul), región ésta muy pequeña del campo de las ondas
electromagnéticas.
En este amplio espectro, (el de las ondas electromagnéticas), sin embargo, existen
diversos rangos de ¨luz¨ que nuestros ojos y los sensores convencionales no pueden ver,
como son los rayos X, los ULTRAVIOLETAS, y fundamentalmente los INFRARROJOS.
Alcances Periciales del Infrarrojo.
En la actualidad se ha abierto un campo sumamente extenso a la digitalización

infrarroja en lo que se refiere al estudio de documentos, identificaciones y descubrimientos
de las falsificaciones. Los pigmentos y los colorantes y, en consecuencia, las tintas,
390
barnices, pinturas y capas que los contienen, reaccionan de manera diferente acorde a su
poder reflector ante el infrarojo, siendo por ende identificables acorde a su composición.
Podemos citar, a modo de ejemplo, algunas de las aplicaciones.
Documentología.
a.- Reconstitución de Documentos Quemados: Este problema se presenta muy complejo en

la investigación Criminológica y Judicial. Un documento calcinado puede haber
experimentado temperaturas muy variables, y según su soporte, presentan en estado muy
diferente los posibles trazos residuales del escrito a determinar. La digitalización infraroja
obra, en estos casos, esencialmente por las diferencias de respuesta espectral entre los
componentes del papel y de la tinta, siendo entonces fácilmente identificable una escritura.
b.- Agregado de enmiendas con distintas tintas: Cada tinta posee una respuesta espectral
distinta ante el infrarrojo, por ende son fácilmente discernibles.
391
c.- Tachaduras: es posible, gracias la penetración del infrarojo sobre los soportes
celulósicos, registrar escrituras tachadas o efectuadas en distintos tiempos por distintas
tintas.
d.-Marcas sobre papel subyacente al escrito: son fácilmente identificables los surcos
bajorrelieve.
e.-Comparación por superposición de distinta tipografía en máquinas de escribir e
impresoras.
f.-Fácil identificación de escritura en papeles pegados, gracias al poder de penetración del
infrarrojo en materiales celulósicos.
g.-Identificación de tarjetas magnéticas adulteradas (tarjetas de crédito, tarjetas de acceso a
cuentas bancarias, etc.)
h.-Identificación en un mismo documento de distintas tintas: Aplicando la técnica del
infrarrojo, se evitaría en primera instancia efectuar las clásicas cromatografías, las cuales
implican un costo de reactivos y placa de corrida y un tiempo estimado de dos horas, siendo
además una técnica destructiva. Aplicando la técnica del infrarojo, no existiría costo alguno
392
en reactivos, el tiempo se limitaría a segundos, y la técnica sería NO destructiva,

permitiendo además identificar claramente la zona del documento que fue alterada.
i.- Perfecta reconstrucción de escrituras tapadas o corregidas con correctores.
12.4 Interpretación de los resultados.
Frente a un determinado resultado, es difícil asegurar la igualdad entre dos o más

tintas. A partir de esta técnica se concluye que las tintas analizadas presentan el mismo o
distinto comportamiento cromatográfico frente a las condiciones utilizadas en el ensayo.
Para llegar a asegurar la igualdad entre dos tintas deberían hacerse muchos ensayos,
independientes entre sí y frente a distintas condiciones (solvente de extracción, de corrida ,
tipo de cromatoplaca, etc.), pero en la práctica esto es prácticamente imposible, ya que ante
todo debe resguardarse la integridad del documento.
C. Roux et al. confirmaron a través de un trabajo la importancia de combinar

distintas técnicas en el estudio de tintas. Este grupo, analizó por tres metodologías
diferentes (filtered light examination (FLE); reflectance visible microspectrophotometry
(MSP); y thin-layer cromatography (TLC), las tintas de distintas marcas de bolígrafos
393
presentes en el mercado australiano. Los resultados obtenidos demuestran que la TLC

sigue siendo la metodología con mayor capacidad de discriminar tintas, incluso diferenciar
marcas, modelos y partidas, aunque se concluyó una combinación secuencial de las tres
técnicas permitía una discriminación superior.
Una técnica que permite una excelente grado de comparación entre muestras es la
FTIR (Fourier Transformed Infrared). Este método espectrofotométrico puede ser acoplado a
la TLC mediante el análisis por reflectancia de las bandas separadas agregando más
parámetros de comparación.
Sin embargo, la combinación de ésta con nuevas técnicas de avanzada tales como
el procesamiento y análisis digital de imágenes, la cromatografia líquida de alta
performance (HPLC) y la electroforesis capilar, permiten obtener resultados cada día más
acabados sobre la autenticidad de un documento.
Bibliografía.
Blas, L. "Química de las tintas"
Guatelli. "Guía de Trabajos Prácticos de Toxicología y Química Legal" Facultad de Farmacia

y Bioquímica, UBA (1978)
Machado Schiaffino, Carlos A. "Pruebas periciales" Ed. La Roca, (1989)
Policía Federal Argentina. "Tratado de criminalística - Tomo I, Documentos- Su estudio

analítico-pericial"- Ed. Policial (1983)
C. Roux, M. Novotny, I. Evans, C. Lennard, "A study to investigate the evidential value of
blue and black ballpoint pen inks in Australia". J. Forensic Sci. 101 167-176, (1999)
Charles E. O' Hara, "Fundamentals of Criminal Investigation"- Fourth Edition
394
"Guía de Seminarios de la Cátedra de Toxicología y Química Legal, Facultad de Cs.

Exactas, UNLP", 2000.
"Guía de Trabajos Prácticos de la Cátedra de Toxicología y Química Legal, Facultad de Cs.

Exactas, UNLP", (2000)
Brunelle, Richard L. "Questioned Document Examination." Richard Saferstein, ed. Forensic

Science Handbook. (Prentice Hall: Englewood Cliffs, 1982) pp. 672-725.
Vogt, C.; Becker, A.; Vogt, J. "Investigation of Ball Point Pen Inks by Capillary
Electrophoresis (CE) with UV/Vis Absorbance and …" J. Forensic Sci. 44, 819-831. (1999)
Zlotnick, J.A.; Smith, F.P. “Chromatographic and Electrophoretic Approaches in Ink Analysis”
J. Chrom. B, 733, 265-272.( 1999)
Photodegradation and Laser Desorption Mass Spectrometry for the Characterization of Dyes
Used in Red Pen Inks, Jamie D. Dunn et al, J Forensic Sci, May, Vol. 48, No. 3. (2003)
Inks Analysis by Capillary Electrophoresis - Analytical Conditions Optimisation, Joanna

Mania, Katarzyna Madej, Pawe Kocielniak, Chem. Anal. (Warsaw), 47, 585 (2002).
Analysis of writting dyestuffs by TLC and FTIR and its application to forensic science,
Kasuhiro Tutsutmi and Kasuha Ohga, Japan Analytical Sciences, Vol. 14, April, 1998.
Baxes, Gregory A., Digital Image Processing: Principles and Applications, John Wiley &
Sons, Inc., New York, NY, (1994)
Castleman, Keneth R., Digital Image Processing, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ,
1979.
Conrac Corporation. Raster Graphics Handbook, 2nd Edition, Van Nostrand Reinhold
Conipany, New York, 1985.
Foley, J. D., et al. Fundamentals of Interactive Computer Graphics, 2nd Edition, Addison-
Wesley Publishing Company, Reading, MA, 1990.
395
Gonzalez, Rafael C. and Woods, Richard E., Digital Image Processing, Addison Wesley
Publishing Company, Reading, MA, 1992.
Newmann, W. M. & Sproul, R. F. Principles of Interactíve Computer Graphics, McGraw-Hill,

New York, 1973.
Pratt, William K., Digital Image Processing, John Wesley and Sons, New York, NY, 1978.
Rosenfield, A. and Kak, A. A Digital Picture Processing, Volumes I and II. Academic Press,
San Diego, 1982.
Russ, John C., The Image Processing Handbook, 3rd Edition, CRC Press, Inc., Boca Raton,
FL, 1998.
Capítulo 13
Ficotoxinas.
Autor:
Dr. Darío Andrinolo.
396
Las cianobacterias (cianofitas o algas verde-azules).

Las cianobacterias, cianofitas o agas verde-azules son microorganismos procariotes,
de morfología variada y amplia distribución geográfica, que colonizaron un gran número de
ecosistemas terrestres y acuáticos desde los comienzos mismos de la vida en la tierra hace
aproximadamente 3.500.000 millones de años. La mayoría son fotosintetizadores y sin
embargo algunos son capaces también de vivir en simbiosis con hongos o plantas.
Las cianobacterias son importantes por su destacada contribución a la producción

primaria de materia orgánica, la producción de O2 y a la fijación biológica del nitrógeno.
Algunas especies son cultivadas para producir alimentos de alto valor nutricional, conversión
de energía solar y productos farmacológicos con un gran potencial.
Sin embargo, ciertas especies cianobacterianas pueden causar problemas al medio

ambiente y a la salud humana y animal. Ciertas especies, bajo determinadas condiciones
ambientales, generalmente vinculadas a un aumento de la temperatura y baja relación entre
nitratos y fosfatos, pueden aumentar exponencialmente su biomasa produciendo floraciones
(“blooms”) superficiales, que son frecuentes en reservorios y cuerpos de aguas dulce.
Las floraciones pueden tener origen a partir de un enriquecimiento de las aguas con
nutrientes generados por contaminaciones agrícolas, industriales y urbanos que producen
degradación ambiental con pérdida de la biodiversidad. Los procesos de eutrofización
producen cambios cuantitativos y cualitativos en la comunidad del fitoplancton conduciendo
al predominio de cianobacterias (generalmente hacia el final del verano y en otoño) dado
que algunas especies tienen capacidad de fijar nitrógeno y que el nitrógeno combinado es
un nutriente limitante de la productividad primaria en ese momento.
Las cianobacterias tendrían ventajas competitivas en esta situación y por lo tanto, su

población puede incrementar dominando ampliamente el fitoplancton y causando un
desequilibrio más o menos durable del ecosistema acuático. Muchos investigadores
consideran que el aumento en el número de floraciones y la dominancia creciente de las
cianobacterias en un número creciente de ambientes es un expresión de los cambios
globales y es una razón mas para que todos los países, fundamentalmene los mas
industrializados se adhieran al tratado de Kioto.
397
Se ha estimado que más del 50 % de las proliferaciones masivas (floraciones)

producen y liberan compuestos tóxicos. Las floraciones ocasionan perjuicios importantes en
aguas que son utilizadas como lugares recreativos (aspecto y olor) pero también en los
reservorios de agua destinados al consumo humano y animal convirtiéndose de esta forma
en un problema ambiental sanitario y económico de envergadura creciente. Es el potencial
tóxico de ciertas cianobacterias y los riesgos asociados que tornan alarmantes a estas
proliferaciones.
Se conocen desde hace décadas episodios de muerte de animales después de

beber agua conteniendo cianobacterias productoras de toxinas. Las primeras referencias de
intoxicaciones por el consumo de agua contaminada por cepas tóxicas de cianobacterias
fueron descriptas en Australia en 1878 mientras que en Argentina Los Doctores Ringuelet y
Guarrera del Museo Ciencias Naturales de La Plata describen el primer florecimiento
toxígeno de América en 1954. Desde entonces se han registrado innumerables eventos de
este tipo en todo el mundo siendo el mas significativo el registrado, en Caruarú (Brasil) en
1996, donde se produjo la muerte de 52 pacientes de una clínica de hemodiálisis. Pruebas
de laboratorio demostraron que las muertes fueron provocadas por cianotoxinas presentes
en el agua utilizada en los tratamientos, obtenida a partir de agua proveniente de un
embalse con una importante floración de cianobacterias.
En los medios de agua dulce, los principales géneros de cianobacterias tóxicas que
se han descripto son Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Anabaenopsis, Aphanizomenon,
Cylindrospermopsis, Nostoc, Raphidiopsis, Oscillatoria, Lyngbya, Nodularia, Synechocystis y
Umezakia, siendo las especies del género Microcystis las responsables de más del 60 % de
los casos de intoxicación en todo el mundo. La toxicidad depende de las cepas y es
frecuente encontrar referencias al género más que a la especie tóxica.
El primer antecedente de intoxicaciones debidas a la presencia de cianobacterias en

el cono sur es del año 1954, cuando se verificó una mortandad de ganado y peces en la
laguna de San Miguel del Monte, en coincidencia con una floración de Anabaena circinalis y
Microcystis aeruginosa. También se describen casos de mortandad de ganado producido
por la ingesta de agua de lagunas y charcos y de peces (por ejemplo en el Río de la Plata y
en el Río Salado), posiblemente asociados a floraciones que son informados por
veterinarios, productores e investigadores, se engloban dentro de la categoría muerte por
398
anoxia, pero que por lo general quedan sin diagnóstico seguro ni causa determinada
fehacientemente.
Fig. 13.1 Florecimientos de

Microcystis aeruginosa en la
costas de Río de la Plata se
repiten año tras año en zonas de
pesca, recreativas y de toma de
agua para ser potabilizada.
Numerosos artículos se han publicado en los últimos años informando sobre

florecimientos en distintos sitios del país. Hay registros de floraciones, como la que se
muestra en la figura 1 de especies potencialmente tóxicas en las provincias de Misiones
(Uruguay, Yacyretá), Salta (Cabra Corral), Tucumán (El Cadillal), Santiago del Estero (Rio
Hondo), Córdoba (San Roque, Rio Tercero, Río Cuarto), San Luis (Cruz de Piedra), Santa
Fe (Portmann), Entre Rios (Salto Grande), Buenos Aires (Paso de las Piedras y Bahía
Blanca), Rio Negro y Neuquén (Pellegrini, Ramos Mexía, Limay-Rio Negro), Chubut
(Willimanco, F. Ameghino, Chubut inferior). Se han encontrado en las floraciones los más
importantes géneros (Microcystis, Anabaena Nodularía, Cilindrospermopsis, Oscillatoria,
Aphanizomenon) y especies tóxicas descritas en otras partes del mundo.
13.2 Detección de cianobacterias toxígenas.

La identificación de géneros y especies de cianobacterias basada en rasgos
morfológicos es lo que tradicionalmente se ha venido llevando a cabo. Aún cuando, las mismas
toxinas pueden ser sintetizadas por especies diferentes, incluso de géneros diferentes. Un
correcto monitoreo de la cianobacterias es de enorme utilidad tanto a nivel de control ambiental
como de investigación científica. Sin embargo, la imposibilidad de discriminación morfológica
entre cianobacterias tóxicas y no-tóxicas es una dificultad.
399
La utilización de marcadores moleculares que detecten sólo las poblaciones tóxicas

independientemente de su identificación taxonómica es extremadamente útil por su
especificidad (teniendo como blanco sólo a genes involucrados en la biosíntesis de toxinas),
sensibilidad y rapidez. Pero por el momento no están disponibles.
13.2.1 Riesgo para la salud humana y animal.
La prevención de intoxicaciones humanas consiste en evitar el contacto con grandes

concentraciones de cianobacterias e impedir la ingesta de sus toxinas ya que la intoxicación
por ingesta de cianobacterias durante actividades recreativas ha sido reportada a nivel
internacional y se puede relacionar este fenómeno con el aumento de gastroenteritis con
enrojecimiento de mucosas que se detectan todos los veranos entre los bañistas de las
costas del Río de La Plata y que acuden a los hospitales locales.
Dado el riesgo que representan las cianobacterias en los cuerpos de agua la OMS
sugiere algunos criterios y parámetros a tener en cuenta (Fig 13.2)
Aplicando los criterios consensuados por la Organización Mundial de Salud (OMS), en

“Toxic cyanobacteria in water”, el riesgo relativo de tener problemas de salud en La Cuenca
del Plata a causa de floraciones cianobacterianas es muy alto. Esto debido a que el sistema
de tratamiento del agua potable no cumple dos condiciones que la OMS postula básicos.
1.- el tratamiento del agua no pasa por procesos tales como ozonización o filtros especiales
de carbón activado.
2.- No se realizan monitoreos constantes sobre la presencia de cianobacterias y sus toxinas

en los cuerpos de agua utilizados como fuentes de abastecimiento. La situación se agrava si
consideramos que la cloración del agua provocan la lisis celular y la liberación de las toxinas
al agua potable que la filtración convencional no retiene.
Cianobacterias
en la fuente de
abastecimiento
Aguas de recreación
Agua de Red
Nivel de Cel/ml µg/l Clorofila a
vigiliancia
200 0.1
Alerta 1 2.000 400 1.0
20.000 10 Nivel 1
Alerta 2 100.000 50 Nivel 2

Fig 13.2. Niveles de alerta y parámetros propuestos para el control de cianobacterias en las
fuentes de agua destinada al consumo. El nivel de vigilancia implica aumentar la frecuencia
de los monitoreos y la búsqueda de toxinas. El alerta 1 se deberán tomar recaudos
adicionales en los sistemas de potabilización la alerta 2 es la imposibilidad de utilizar esa
fuente de abastecimiento.
13.2.2 Las cianotoxinas.
Las cianobacterias producen un gran número de metabolitos secundarios bioactivos,

algunos de los cuales son tóxicos y liberados a partir de la lisis celular al medio. Estas
cianotoxinas (Fig. 13.3), son compuestos químicamente diversos que se agrupan según su
modo de acción en hepatotoxinas, neurotoxinas y dermatotoxinas. Las toxinas no son una
característica constante dentro de un género o especie de cianobacteria. Las mismas
toxinas son sintetizadas por varias especies o bien varias toxinas pueden ser producidas
simultáneamente por una misma cepa.
Dentro de las hepatotoxinas se pueden citar a las microcistinas, las nodularinas y la

cilindrospermopsina.
Las microcistinas, que son las toxinas más frecuentemente encontradas son
heptapéptidos monocíclicos aislados por vez primera del género Microcystis. Se conocen
mas de 50 microcistinas diferentes, todas conteniendo el péptido característico Adda y
diferenciándose según el grado de metilación, configuración del Adda o en la variación de
dos aminoácidos que se identifican como X e Y la microcystina más abundante y tóxica
(DL50 intraperitoneal 50 µg/Kg) es la LR que denota la presencia de leucina y arginina.
Las nodularinas son pentapétidos monocíclicos hepatotóxicos análogos a las

microcistinas, descritos por primera vez en el género Ondularía, aunque varias nodularinas
también han sido aisladas de esponjas marinas. En cuanto a los mecanismos de acción de
401
las microcistinas y nodularinas se ha probado que es a través de la inhibición específica de

las fosfatasas de proteínas de tipo I y 2A, uniéndose a la subunidad catalíticay formando
uniones covalentes con la enzima. En peces se ha descrito que la microcistina LR inhibe
canales iónicos y a la bomba de Na+/K+ de las branquias y se ha propuesto este mecanismo
como causa de mortandad..Por otra parte, estos péptidos cíclicos se sintetizan siguiendo
vías no ribosomales, lo que complica los estudio sobre la regulación de su expresión.
Las cilindrospermopsinas son completamente diferentes en cuanto a su modo de acción

y han sido aisladas de especies del género Cilindroespermopsis. Su estructura consta de una
guanidina tricíclica combinada con hidroximetiluracilo. En 1979 se produjo un evento de
hepatoenteritis en 139 personas que bebieron agua potable contaminada con esta toxina en
Queensland, Australia.
Dentro de las neurotoxinas se encuentran las anatoxinas y las toxinas paralizantes.

Estas toxinas producen muerte de ganado y otros animales que beben de lagunas o charcos
donde crecen cianobacterias tóxicas. En Caruarú se han detectado también toxinas
paralizantes en la especie Cilindrospermopsis raciborskii que crece en reservorio de
Tabocas, por lo que queda abierta la pregunta si estas toxinas tuvieron participación en el
caso de intoxicación masiva ocurrido en 1996.
La anatoxina-a fue primeramente aislada de la especie Anabaena flos aqua. Además de

anatoxina-a se ha descrito la homoanatoxina-a y la anatoxina-a(s), las que por vías diferentes
causan parálisis por sobrestimulación muscular, convulsiones y muerte en pocos minutos con
paro respiratorio.
Las toxinas paralizantes comprenden más de 30 toxinas diferentes que comparten un

núcleo de tetrahidropurina. Cada una de estas toxinas posee diferentes toxicidades ya que
bloquean con diferentes afinidades los canales de sodio dependientes de voltaje, inhibiendo
la propagación de los impulsos nerviosos y de la contracción de músculos esqueléticos. Son
sintetizadas en el mar por dinoflagelados y en agua dulce por varios géneros de
cianobacterias como Anabaena sp., Aphanizomenon sp. y Cilindrospermopsis sp.
De menor a mayor grado, la intoxicación con toxinas paralizantes se expresa con

parestesia facial y de extremidades, dificultad para respirar, debilidad muscular, y muerte por
paro respiratorio y shock cardiovascular.
402
13.2.3 En Argentina.
Hasta la fecha, las microcistinas son las únicas toxina identificadas en nuestro país,
asociadas a la presencia de Microcystis aeruginosa. La distribución de M. aeruginosa es
amplia en toda la cuenca del Plata, en la cual existen también, otras especies potencialmente
tóxicas como Cilindrospermopsis racoborkii y varias especies de anabaenas y oscilatorias.
Sin embargo M. aeruginosa, es la especie que, extendida en el territorio y ocupando gran
diversidad de ambientes está siempre presente en los escasos eventos tóxicos descritos en
la literatura y ocasiona problemas en el abastecimiento de agua potable en importantes
ciudades como Bahía Blanca y Córdoba.
M aeruginosa produce floraciones intensas de localización variable y especialmente

intensos durante los meses cálidos aunque no siempre ausente durante los meses fríos. De
esta forma la población está expuesta a las toxinas en el agua potable fundamentalmente en
verano y cuando la floración se ubica cerca de la toma de agua de las plantas
potabilizadoras, por lo que se hipotetiza un exposición intermitente de niveles desconocidos
de toxinas.
403
Cylindrospermopsina
Saxitoxinas
Microcistinas
Anatoxinas
Fig 13.3: La diversidad química de las ficotoxinas es una de sus características.
De igual forma la intoxicación aguda y letal de ganado y animales silvestres en los

campos se da en forma esporádica debido presuntamente a anatoxinas o microcistinas.
Además diversas enfermedades asociadas a daños hepáticos relacionados posiblemente con
el consumo intermitente de M aeruginosa que crece en charcos y pequeños cuerpos de agua
es frecuente en las zonas ganaderas de la provincia de Buenos Aires.
Se puede afirmar que el riesgo relativo que representa la presencia de las

microcistinas en la cuenca del Plata es enorme, dado:
1.- La intensidad de las floraciones.
404
2.-las diversidad de cepas de M aeruginosa que crecen en distintos ambientes

3.-El área que abarca el fenómeno,
4.-La toxicidad que presentan las diferentes cepas y el número de microcistinas producidas.
5.- La magnitud de su posible impacto sobre la población
6.- Que puede afectar fuertemente un recurso tan valioso como las fuentes de agua potable y
el agua potable misma.
Es por esto, que este capitulo pondrá especial atención en la toxicología de las microcistinas.
13.2.4 Toxicología de las microcistinas.
Las intoxicaciones agudas clínicamente se expresan como vómitos, diarrea y

debilidad. La hepatitis tóxica aguda asociada con los fenómenos de floraciones
cianobacterianas es ahora reconocida como una Toxicosis Cianobacteriana a raíz de la
intoxicación registrada en Caruarú.
Las intoxicaciones crónicas con dosis bajas de microcistinas potencian la formación de

tumores, de hecho, existe una fuerte correlación entre cáncer primario de hígado y la
contaminación con cianobacterias de las fuentes de agua dulce que utiliza la población aún
en ausencia de casos agudos como los mencionados.
Los efectos tóxicos en mamíferos ocasionados por dosis letales y subletales sean
estas agudas o crónicas y sea las toxinas administradas intraperitonealmente o adicionadas
en agua o comida de animales como ratones, cabras y cerdos, han sido estudiados y son
coincidentes en remarcar el carácter hepatotóxico y nefrotóxico de microcystinas así como su
acumulación dentro de los hepatocitos y su detección incluso en la leche de vacas y cabras.
Las microcistinas entran en los hepatocitos vía el sistema de transporte

multiespecífico de los ácidos biliares. Este mecanismo particular de penetración explica el
tropismo celular de las microcistinas. El modo de acción intracelular está mediado por la
inhibición específica de las fosfatasas de proteínas PP1 y PP2A (serin/treonin fosfatasas) lo
que provoca una hiperfosforilación de las proteínas hepáticas. El resultado es diferente según
el tipo celular y la dosis. El principal órgano blanco de microcystina es el hígado, donde
provoca la pérdida de la integridad del citoesqueleto, disociación celular, pérdida de la
405
estructura del parénquima hepático y por tanto de su función. Además, provocan la división
celular de los hepatocitos (que puede desencadenar en formación de tumores y la dilatación
de los vaso del sistema vascular hepático lleva a la vasocongestión.
La detección de microcistinas en plasma de personas intoxicadas se a propuesto

como marcador de exposición y de hecho es el único marcador de exposición con que
contamos. La cuantificación de microcistinas en plasma se puede hacer mediante ensayos
tipo ELISA o Cromatografía de Alta Precisión.
Se han propuesto como marcadores de exposición, marcadores de la función

hepática como ciertas transaminasas plasmáticas o el nivel de ácidos biliares se ven
aumentados en casos de intoxicaciones subletales, pero también es cierto que un gran
número de factores ambientales, nutricionales también hacen variar estos parámetros.
Los niveles de exposición a cianotoxinas se desconocen, la epidemiología de las

intoxicaciones con hepatotoxinas y de otras cianotoxinas en Argentina es nula. Las causas
que contribuyen a esto son el desconocimiento de los médicos de las toxicosis
cianobacterianas, la imposibilidad de determinar toxinas en agua potable, fluidos biológicos o
el ambiente y asociar su presencia con la expresión clínica de la intoxicación.
• Intoxicación aguda.
La Dosis letal 50 descrita para microcistina LR es de 50 µg/kg cuando se aplica por

vía intrperitoneal (ip) y varia entre 50 y 200 µg/kg para las otras variantes de microcystinas.
Sin embargo al ser péptidos las toxinas son digeridas en el sistema digestivo y la dosis letal
50 oral es considerablemente mayor.
Análisis histológicos de hígados de ratones inyectados con dosis letales de

microcystina LR (100 µg/kg ) revelan disrupción masiva de la arquitectura lobular y sinusoidal
del hígado, dilatación de los vasos hepáticos, pérdida de hepatocitos y displasia. En nuestra
experiencia no hemos detectado hemorragia intra hepática ya que no se detectan elementos
figurados de la sangre en el parénquima hepático (Fig 13.4). Es posible que en un principio
406
los investigadores hayan confundido la evidente congestión vascular hepática con

hemorragia.
2 3 4
2
3 1
Corte de hígado de ratón control. 1- Corte de hígado de un ratón

Vena hepática terminal 2- Tracto inyectado 2- Tracto portal con
portal 3- Interface del parénquima importante vasodilatación 3-
en posición radiada Disrupción de la interfase del
parénquima 4- Pérdida del
parénquima
Fig. 13.4: Cortes histológicos mostrando lesiones hepáticas en ratón.
• Intoxicación crónica :
Estudio de exposición crónica con dosis subletales también señalan un daño hepático
con dosis entre 3 y 25 µg/kg de dosis i.p durante períodos entre 30 dias y 8 meses. El
experimento que se muestra en la figura 5 consistió en la administración intraperitoneal de dosis
subletales de 25 ug/kg de microcystinas cada 48 horas durante un mes a dos grupos de 4
ratones cada uno.
Transcurrido un mes un grupo de cuatro ratones fue sacrificado en ese momento y los
restantes cuatro al mes siguiente. Se realizaron las autopsias correspondientes, a partir de los
hígados se obtuvieron cortes histológicos, los cuales fueron sometidos a diferentes técnicas de
tinción y observados al microscopio.
Los daños hepáticos observados fueron macrovacuolización y microvacuolización

intracitoplasmáticas en las tres principales zonas de los hepatocitos, pérdida parcial de
arquitectura, binucleación y leve discariosis nuclear; mientras que no se observaron fibrosis,
ectasia (congestión vascular ), ni hemorragias. La pérdida de arquitectura del parénquima
407
hepático puede deberse a la gran cantidad de vacuolas presentes en el citoplasma de los

hepatocitos, así como a la pérdida de cohesión celular y una ostensible disrupción de la red de
reticulina que no se recupera aun después de finalizada la exposición (fig 13.5 D). Se observan,
núcleos replegados por la presencia de las macrovacuolas que ocupan gran parte del citoplasma
celular, así como, núcleos aumentados en tamaño y con vesiculación. Las características
observadas en estos preparados se correlacionan con un daño hepático moderado ( fig. 135 A,
C, E).
En los cortes histológicos de los hígados de los animales a los que se les permitió una
recuperación de 1 mes sin exposición a la toxina, luego del tratamiento previo de 1 mes con
inyecciones intraperitoneales de microcystina, se observaron triada hepática y vena porta con
estructura normal, pérdida parcial de estructura, microvacuolas que no deforman los núcleos,
células espumosas, discariosis, hipercromacia nuclear y atipía reactiva leve (Fig 13.5 B, D, F)
Es importante aclarar que si bien existen reportes sobre los efectos tumorígenos de
microcystinas la Asociación Internacional para el Estudio del Cancer (IARC), que compila las
sustancias cancerígenas no considera a estas toxígenas como tales ya que considera
insuficientes los estudios que apoyan esta idea. Sin embargo esto está lejos de definitivo ya que
es aceptado que potencia la formación de tumores provocados por otros compuestos como
benzopirenos entre otros y no debemos olvidar la probada relación entre cianobacterias
productoras de microcystinas y cáncer primario de hígado bien reportado en China.
La consecuencia práctica es que al no estar las microcystinas en la lista de

compuestos cancerígenos es posible determinar valores guía de concentraciones permitidas en
agua potable y alimentos dado que esto no es posible para los compuestos listados por la IARC.
Valores Guía y agua potable
En base a estudios con animales se determinó el Nivel de Efectos Nocivos No

Observables (NOAEL según sus siglas en ingles) de 40 µg/kg. Para determinar la TDI (Ingesta
Diaria Tolerable) al NOAL se le aplica un factor de seguridad (FS) de 1000.
Considerando que la ingesta de estas toxinas por consumo de agua sería el 80 % del
total se aplica un facto P de 0.8 y se estima un peso promedio de 60 kg y un consumo promedio
de 2 litros de agua por persona (L).
408
La ecuación que utilizó la OMS para determinar la concentración de microcistinas

recomendada en agua potable es
TDI vía agua potable = (NOAEL * P * peso corporal)/FS* L
Lo que da un valor de 0.96 µg/L que se redondea en el Valor Guía de 1 µg/L. de

microcystina-LR o su equivalente en otras variantes. Sin duda que mas estudios son necesarios
para confirmar los niveles propuestos por la OMS de hecho varios países proponenen en su
legislación valores de 0.5 µg/L. Ademas de dilucidar su posible acción cancerígena que de
confirmarse significaría entre otras cosas que no hay posible Valor Guia y que las microcistinas
deberian estar completamente ausentes en el agua potable.
A C
B D
409
Fig 13.5 Corte histológico teñido con Hematoxilina Eosina de A) Hígado de ratón (20 X) al
que se administró microcistina i.p. 25 µg/kg dia por medio durante un mes. Se observa
Macrovacuolización intracitoplasmática y pérdida parcial de arquitectura B) Hígado de ratón,
1 mes de inyección (40 X), C) Hígado de ratón, sometido al mismo tratamiento que el
anterior y al que luego se dejó un mes sin 1 mes de descanso y recuperación (20 X ). Se
aprecia macrovacuolización y microvacuolización intracitoplasmática, pérdida parcial de
estructura del parénquima, leve discariosis nuclear y binucleación. D) Hígado de ratón, 1
mes de recuperación (Idem C) (40 X) donde se aobservan áreas con pálida eosinofilia en el
citoplasma, debido a la presencia de microvacuolas intracitoplasmáticas, discariosis,
hipercromacia nuclear, binucleación, E) Hígado de ratón, 1 mes de recuperación (Tinción
Reticulina 40 X), donde se aprecia que ostensible pérdida de la red de reticulina no se
recupera.
13.4 Tecnología para eliminar las toxinas presentes en el agua

potable.
El tratamiento del agua potable debe eliminar las células intactas, evitando la lisis
celular para que las toxinas no sean liberadas en el agua. Esto es conseguido, en principio,
con una captación adecuada y una buena coagulación seguida de filtración. Aunque esto es
claramente insuficiente durante floraciones. Los sistemas potabilización del agua no son los
adecuados o recomendados para retener cianotoxinas.
Se han propuesto e implementado diversos métodos para evitar que las cianotoxinas
lleguen al agua potable basados en la utilización sola o combinada de carbón activado,
ósmosis inversa, ozonización del agua e irradiación con UV. La utilización de longitudes de
onda entre 250 y 270 nm tiene acción antibacteriana. La luz UV de baja intensidad isomeriza
410
el ADN y a alta intensidad rompe el anillo de microcistina a compuestos no tóxicos (Alam et.
al. 2001). Otra de las alternativas consiste en utilizar carbón activado en forma de polvo,
granulado y de diverso origen con el fin de adsorber las toxinas cianobacterianas (Warhurst
et al. 1997).
Resulta importante analizar las alternativas tecnológicas existentes y adaptarlas a las

condiciones de cada lugar en particular y desarrollar distintas metodologías para eliminar las
toxinas en las instalaciones convencionales de plantas potabilizadoras de agua. El
tratamiento con ozono aplicado simultáneamente con la luz UV implica un avanzado proceso
de oxidación cuya efectividad en el tratamiento de aguas resulta interesante para ser
analizada. No se debe descartar una correcta cloración y manejo de la toma de agua para
reducir los riesgos y que podrían ser suficientes sin la utilización de tecnología mas costosas.
13.5 Identificación y cuantificación de cianotoxinas.
Dada la enorme variabilidad química que presentan las toxinas, para su detección,
identificación y cuantificación se emplean metodologías particulares para cada grupo, las que
se pueden diferenciar entre ensayos biológicos, químicos y técnicas analíticas.
El ensayo biológico mas utilizado es el bioensayo ratón, tienen la característica de ser

inespecífico y de baja sensibilidad. Los ensayos químicos tales como kits tipo ELISA o
enzimáticos son sensibles y específicos pero son diseñados para un limitado número de
moléculas (por ejemplo para microcistina LR saxitoxinas). La técnica analítica mas utilizada
sensible aplicable a todas las toxinas es el uso de Cromatografía Líquida de Alta Resolución
con detectores UV y de fluorescencia HPLC-UV-FDL. Las técnicas basadas en HPLC son
muy sensibles y permite identificar y cuantificar todas las toxinas descritas hasta la fecha. Es
la metodología que permite la calibración y adaptación de los ensayos químicos o biológicos
a las condiciones locales. El problema de esta tecnología es que son necesarios los
estándares analíticos y éstos en general no están disponibles. Y los que están disponibles no
se pueden importar debido a que dada su condición de toxinas (saxitoxina es un arma
química de nivel 1) su importación está restringida y guiada por legislación internacional, la
consecuencia es que ninguna empresa Argentina está debidamente acreditada para poder
ingresar estas toxinas al país.
411
La consecuencia de esto es la imposibilidad, salvo excepciones, de detectar,

identificar y cuantificar cianotoxinas y por ende dimensionar el problema correctamente.
Según nuestra experiencia casi podemos afirmar que donde hemos buscado
cianotoxinas las hemos encontrado.
Es necesario superar una serie de barreras tecnológicas que en el presente impiden

“ver” a las cianotoxinas presentes en nuestro mas cercano entorno, incluso el agua potable.
Los pocos ensayos disponibles comercialmente son excesivamente costosos para ser
utilizados masivamente, los estándares analíticos no se encuentran disponibles en su
totalidad y los disponibles son sujetos a tediosos tramiterios aduaneros que en la práctica
impiden su obtención. Sumado a esto en el país hacen falta el desarrollo de recursos
humanos capacitados asi como de infraestructura. La creación de un centro nacional o
laboratorio de ficotoxinas que se especialice en la obtención de estándares y el desarrollo de
métodos de detección es el camino que han seguido países como Australia y Canadá y que
sería apropiado seguir.
Cada grupo de toxinas tiene sus métodos y técnicas específicas, en este capítulo nos
dedicaremos a las microcistinas.
13.6 Detección, identificación y cuantificación de microcystinas.
PROTOCOLOS DETECCIÓN DE MICROCISTINAS PRESENTES EN UN

FLORECIMIENTO CIANOBACTERIANO.
BIOENSAYO RATÓN. (según el programa de monitoreo de las cianobacterias y gestión del

riesgo para la salud en aguas superficiales contaminadas. Instituto de Salud Pública
“Ricardo Jorge”. Lisboa, Portugal) (Fig.13.6).
• Preparación de los ratones.
1.- Los animales deben ser ratones macho Charles River o semejantes de 20-25 g de peso.
Durante el ensayo los animales deberán tener acceso a alimento y agua. Los ratones
deberán ser pesados y marcados debidamente y todos los valores anotados en la tabla.
412
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1.- Las muestras de agua recogidas son transportadas para el laboratorio en termos.
2.- En caso de material concentrado puede ser utilizado después de homogeneizado. Se

recomienda centrifugar a 5000 rpm por 10´.
2.1.- El material resultante deberá ser resuspendido en un volumen reducido de

solución salina (NaCl 0.9 %).
2.2.- Una alícuota de este volumen fijada con lugol para posterior identificación de
las especies planctónicas y el restante sometido a tratamiento de homogenización
(ultrasonido o dos ciclos de congelación-descongelación) .
2.3.- El extracto así obtenido utilizado inmediatamente o congelado.
3.- Si el material no es muy concentrado, concentrar el fitoplancton en filtros de fibra de

vidrio.
4.- Para determinar toxicidad de microcystinas disueltas en agua (agua potable o agua en
contacto con el florecimiento) las toxinas deben primero concentrarse.
4.1.- Para concentrar las toxinas se utilizan filtros de de silica gel C18 por los que se pasa el
agua, quedando las toxinas retenidas en el filtro. Se eluyen posteriormente con 100%
metanol.
4.2.- El metanol debe eliminarse y las toxinas resuspenderse en solución salina antes del
ensayo.
INYECCIÓN DE LOS RATONES.
5.- La inyección de cada muestra se debe hacer en dos ratones mas uno de control.
5.1.- Las inyecciones deben realizarse de mañana para poder observar los síntomas de los
animales durante el día.
5.2.- El volumen a inyectar será de 1 ml o menos. La inyección es intraperitoneal (ip)
413
Fig. 13. 6 Tres

pasos en el
bioensayo ratón para hepatotoxinas, extractos
acuosos son obtenidos de las muestras de cianobacterias. Los
mismos son inyectados intraperitonelmente en ratones
con un peso de 18-20 gr. Finalmente el aspecto y peso de
los hígados son las características que permiten
señalar la hepatotoxicidad de las células
6.- Los ratones inyectados deben observarse continuamente durante las dos primeras horas
anotando en la tabla cualquier síntoma o alteración del comportamiento. Los animales son
observados a periodos regulares hasta las 24 horas posteriores a la inyección.
7.- En caso de muerte anotar la hora en que ocurrió. Los animales son sometidos a
necropsia. Los órganos son observados para detectar alteraciones macroscópicas.
8.- Se registran todos los datos en la tabla y se pesan los hígados y se comparan con el
control. Se calcula el peso del hígado como porcentaje del peso total de ratón. Se considera
que hay hepatotoxicidad si el hígado pesa mas del 7 % del peso del ratón, ya que la
condición control no debe superar el 5 % (datos en la Tabla 13.I)
414
vol Peso(gr) Muerte Peso

iny.(ml (min) hígado
)
Control 1 19,5 - 0.87
Control 1 18.3 - 1.11
Control 1 20.3 - 0.95
Muestra 1 19.9 36 1.63
Muestra 1 18.9 43 1.52
Muestra 1 19.8 43 1.60
Tabla 13.I : Datos de un ensayo realizado para determinar toxicidad de un florecimiento de

M aeruginosa del Río de la Plata.
CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC).
Preparación de la muestra.
Se parte del mismo extracto que el utilizado en el bioensayo ratón. Los principales
pigmentos cianobacteriales (Clorofilas, Phycocianinas y otros ) son eliminados pasando la
muestra a través de filtros de silica gel de 1 gr C18. Estos filtros deben ser previamente
activados.
• Activación de los filtros: Pasar 10 ml de metanol gota a gota y 10 ml de aire
• Concentración y limpieza de la muestra

Pasar 10 ml de muestra
Pasar 10 ml de aire
Pasar 10 ml de una solución metanol agua (20-80 v/v)
Pasar 5 ml de metanol puro.
415
• Se utilizarán placas de silica gel 60F254 de 0.2 mm.
• Sembrar 100 µl del extracto metanólico.
• Solución de corrida Agua –Acetato de Etilo- n- propil alcohol (2-5-3 V/V/V) al que se
adiciona 5% de àcido acético glacial.
• Secar bajo corriente de aire caliente
• Revelado.
200 mg de vanillina disuelta en una solución de 25 ml de metanol 3 ml de ácido acético

glacial y 1,5 ml de ácido sulfúrico. Rociar con esta solución y calentar a 100 ºC por 5
minutos.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC.
Existen en la literatura variados métodos de HPLC el que describiremos es solo uno

mas que a nuestro entender equilibra sensibilidad, capacidad de resolución, plasticidad y un
mejor cuidado de la columna y el sistema en general. El método que utilizamos en nuestro
laboratorio es isocrático y utiliza una solución de corrida de Buffer fosfato (10 mM) y 27 % de
acetonitrilo pH 7, flujo de 1 ml/min, columna C18 de 150 mm de largo y 5 µm de poro, La
detección es por absorbancia a 242 nm y la identificación y cuantificación se realiza
mediante comparación con estándares analíticos. En el HPLC se inyectan 20 µl del extracto
para el ensayo ratón previamente filtrado por filtro de nylon de 0, 45 µm.
416
Fig 13.7 Comparación de una corrida de estándares analíticos (arriba) con las toxinas
micricistinas -RR,-YR y -LR. Muestra real de M aeruginosa obtenida de un florecimiento en
la zona de la toma de agua de la ciudad de La Plata donde se aprecia microcistina -YR y –
LR (Picos 4 y 6 respectivamente)(centro). Los espectros de absorción entre los 200 y 300
nm permiten identificar o confirmar la presencia microcistinas (abajo) las que deben mostrar
su espectro característico como es el caso de los picos 4, 6 y 7.
En la figura 13.7 se muestra una corrida cromatográfica de un estándar comercial

con las microcistinas -RR,-LR y -LR de 0.3 µg/ml cada una. Debajo de esta se compara una
corrida de un extracto natural de M. aeruginosa colectada del Rió de La Plata. Para
Identificar la presencia de toxinas se presume que todos los picos de absorbancia que se
ven al mismo Tiempo de Retención que los estándares analíticos corresponden a los
diferentes tipos de toxinas. Para cuantificar su cantidad se compara las áreas bajo la curva
del pico en cuestión y su correspondiente estándar de concentración conocida.
Sin embargo se aprecia que en el extracto de M. aeruginosa se detectan mas picos

que no coinciden con los del estándar y surge la pregunta ¿Son toxinas también de las
cuales no tengo el estándar? Si Ud. cuenta con un detector UV-visible con arreglo de
diodos es posible tener una idea mas clara al determinar su espectro de absorción entre los
200 y 300 nm. En nuestro caso de ejemplo los picos 1, 2, 3 y 5 no serían toxinas mientras
que los 4, 6 y 7 si.
417
Bibliografía.
Azevedo SMFO Carmichael W, Jochimsen E, Rinehart K, Lau S, Shaw G, Eaglesham G,

(2002) Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-
Brazil. Toxicology 181-182: 441-446.
Carmichael WW, Beasley V, Bunner D, Elof j, Falconer L, Gorham P, Harada k,

Krisnamurphy t, Moore R, Rinehart K, Runnegar M, Skulberg o, Watanabe M, (1988).
Naming of heptapeptide toxins of cyanobaceteria (blue-green algae). Toxicon 26: 971-
973.
Codd GA, Bell SG, Kaya K, Ward CJ, Beatheka, Meteaf JS (1999) Cyanobacterial toxins,
exposure routes and human health. Eur J Phycol 34: 405-415
Echenique R.O. (1999) Cyanophyta toxicas, antecedentes y estudios actuales en la

República Argentina. Notas Botánicas de la Soc. Arg. Bot, 3-7.
Echenique R.; L. Giannuzzi; L. Ferrari & D. González. 2003 Estudios sobre la calidad del
agua de red en Bahía Blanca, Argentina. Anales 13º Congreso Argentino de Saneamiento y
Medio Ambiente 30: 1-18.
Francis GR (1878) Poisonous Australian lake. Nature 18: 11-12.
Harada KI; Matsuura K; Suzuki M; Oka H; Watanabe F; Oishi S; Dahlem AM; Beasley VR,
Carmichael WW. 1988. Analysis & purification of toxic peptides from cyanobacteria by
reversed phase high-pressure liquid chromatography. J Chromatogr 448: 275-283.
Lagos N, Onodera H, Zagatto PA, Andrinolo D, Azevedo S, Oshima Y (1999) The first
evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cilindroespermopsis
raciborskii, isolated from Brazil. Toxicon 37: 1359-1373.
Pereira P, Onodera H, Andrinolo D, Franca S, Araujo F, Lagos N, Oshima Y (2000)b.

Paralytic Shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae,
isolated from Monteargil reservoir, Portugal. Toxicon 38: 689-1702.
418
Ueno Y, Nagata S, Tsutsumi T, Hasegawa A, Watanbe MF, Park HD, Chen GC, Chen G, Yu
SZ (1996) Detection of microcystins, a blue-green algal hepatotoxin, in drinking water
samped in Haimen and fusui, endemis areas of primary liver cancer in China, by highly
sensitive immunoassay. Carcinogen 17: 1317-1321.
419
Capítulo 14
Micotoxinas.
Autor:
Mónica Molinas.
Docente de la Cátedra de Toxicología y Qca. Legal de la UNLP.
Introducción.
Dentro del amplio tema de intoxicaciones debido al consumo de alimentos el mayor

interés se concentra en las levaduras, los mohos y las setas comestibles y venenosas.
420
Este diverso conjunto de organismos, se caracteriza por ser eucarióticos, poseer un

metabolismo heterótrofo y por la presencia de una pared externa. Así a diferencia de las
plantas, los hongos requieren de fuentes de carbono orgánicas de diferente grado de
complejidad. La presencia de la pared determina su forma de alimentarse, a través de la
absorción de nutrientes solubles.
Los hongos filamentosos, comúnmente llamados mohos, son activos agentes del
biodeterioro. Si bien no causan el tipo de degradación putrefactiva asociada a algunas
bacterias, alteran las características organolépticas haciendo que los alimentos
enmohecidos no sean aptos para el consumo humano. Debemos hacer la salvedad que
algunas modificaciones inducidas por ciertos hongos en los alimentos son deseables, tal
como ocurre con algunos quesos, embutidos, etc.
La actitud del hombre frente a la contaminación fúngica de los alimentos, se ha ido

modificando, debido a un descubrimiento reciente, relacionado con la capacidad que tienen
muchos hongos contaminantes de producir una gran variedad de metabolitos secundarios
denominados MICOTOXINAS.
Estas sustancias presentan estructuras químicas diversas y han sido involucradas

tanto en brotes de enfermedades que afectan a diversas especies animales como en una
amplia variedad de enfermedades humanas, desde la gastroenteritis hasta el cáncer. Las
enfermedades producidas por la ingestión de micotoxinas se denominan MICOTOXICOSIS.
El reconocimiento del problema de las micotoxinas data de comienzos de los años

sesenta, cuando se produjo en Inglaterra la muerte de un gran número de aves de corral. En
esa oportunidad se pudo comprobar que la causa de la enfermedad había sido la presencia de
metabolitos tóxicos producidos por el hongo Aspergillus flavus, contaminando el maní
empleado para la preparación de las raciones alimentarias de las aves. A esas sustancias
desconocidas hasta entonces, se las llamó AFLATOXINAS.
Además de los problemas asociados con la salud, han causado un gran impacto
económico en el comercio internacional. Principalmente, en los países productores y
exportadores de alimentos como el nuestro.
421
14.1 Hongos Productores de Micotoxinas.
Los hongos productores de micotoxinas están ampliamente difundidos en el medio

ambiente y son contaminantes frecuentes de los alimentos, especialmente los de origen
vegetal.
Las especies toxicogénicas de mayor importancia pertenecen a tres géneros:

Aspergillus, Penicillium y Fusarium. También producen micotoxinas ciertas especies de
Alternaria, Claviceps, Stachybotrys, Pythomyces, Trichotecium, Byssochlamys y Rhizopus,
entre otros.
La mayoría de los productos agrícolas son susceptibles de la invasión por mohos

durante alguna de las etapas de producción, procesado, transporte y almacenamiento. La
presencia de mohos en un alimento no implica necesariamente la presencia de micotoxinas,
sino que indica un riesgo potencial de contaminación. Por otra parte, la ausencia de hongos
toxicogénicos no garantiza que un alimento esté libre de micotoxinas, pues éstas persisten
aún cuando el hongo ha perdido su viabilidad.
Las toxinas de los hongos se diferencian de las de origen bacteriano, asociadas a

intoxicaciones alimentarias, dado que éstas últimas, en su mayoría son macromoléculas
tales como, proteínas, polisacáridos, etc. las micotoxinas son compuestos de peso
molecular bajo. Por otra parte su química puede ser compleja y presentan una estabilidad
frente a agentes físicos y químicos que las hacen muy difíciles de eliminar una vez que han
sido producidas en los alimentos.
14.1.1 Género Aspergillus y sus toxinas.
Los mohos de éste género causan deterioro en muchos productos alimenticios. Sus
productos metabólicos son altamente tóxicos tanto para los animales como para el hombre.
Algunas especies son de interés industrial, mientras que otras se emplean en la
fermentación de alimentos en algunas regiones.
422
El factor principal de la ubicuidad de los aspergilos es su capacidad para crecer a

diferentes temperaturas sobre sustratos con contenido de humedad variables. El rango de
temperatura de crecimiento de los mismos oscila entre 0° a 55° C para la mayoría de las
especies.
El color es la principal característica macroscópica para la identificación de los

grupos de aspergilos. Poseen distintos tonos de verdes, pardo, amarillo, blanco, gris y
negro. Son varios los metabolitos secundarios de los aspergilos, algunos de los cuales
también pueden ser producidos por Penicillium. Es común que las condiciones óptimas para
el crecimiento de las especies toxicogénicas no coincidan con las que facilitan la producción
de micotoxinas. El aumento de los metabolitos secundarios es una respuesta al “stress”.
Dentro de las micotoxinas producidas por éste género se puede citar entre otras:
ácidos aspergílicos (neurotoxina), ácido ciclopiazónico (neurotoxina-necrótica), aflatoxinas
B1,B2,G1,G2, (hepatotóxica, cancerígena), citrinina (nefrotóxica), esterigmatocistina
(hepatotóxica, cancerígena), ocratoxina A (hepatotóxica, nefrotóxica, teratogénica,
inmunosupresora), patulina (hepatotóxica, nefrotóxica).
Se representan algunas de las estructuras químicas de algunas toxinas y sus

metabolitos :
423
AFLATO XIN A B1 O O AFLATO XIN A B2 O O
O O
H H
O O OC H O O OC H
H 3 H 3
O O AFLATO XIN A G 2 O O
AFLATO XIN A G 1
O O O O
H H
O O OC H O O OC H 3
H 3 H
ESTERIGMATO CISTIN A AFLATO XIN A M 1 O O
O OH O
H OH
O
O O OC H3 O O OC H 3
H H
14.1.2 Género Fusarium y sus toxinas.
Las especies de Fusarium son “mohos de campo”, ya que se encuentran sobre los
vegetales antes de la cosecha, persistiendo sobre los productos almacenados. Los fusarios
no compiten bien con los “mohos de almacenaje”. (Aspergillus, Penicillium), salvo el F.
culmorum. Alguno de los fusarios son patógenos para los cereales y pudiendo formar
micotoxinas aún antes de la cosecha. Pueden crecer durante el almacenamiento refrigerado
y contribuir a la podredumbre de frutas y hortalizas almacenadas.
Las micotoxinas principales producidas por los fusarios comunes son: DAS
(diacetoxiscirpenol), NIV (nivalenol), ZEA (zearalenona), MON (moniliformina), FUM
(fumonisinas), T2 (toxina T2), DON (deoxinivalenol), entre otras.
424
En el siguiente cuadro se muestran algunas de las fórmulas estructurales:
O O MONILIFORMINA
O-
COOH
COOH
O O CH OH
3
HC
HC 3
OH O CH 3
3
O O HO
O
FUMONISINA b
1 COOH
OH
COOH
ZEARALENO NA HN CH
O 2 3
• Tricotecenos: son tóxicos potentes de las células eucarióticas, causan lesiones

dérmicas y alteraciones en la respuesta inmunológica. Tienen acción letal a altas
dosis.
• Zearalenona: son estrogénicas, actúan sobre el aparato reproductor , en el cerdo
producen vulvovaginitis, abortos y atrofia de genitales.
• Moniliformina: produce la leucoencefalomalacia equina, dan temblores y produce la
licuación de cerebro.
• Fumonisinas: interfiere en el metabolismo de los esfingolípidos. Se aislaron la B1,
B2 y B3, siendo la principal es la B1, estan muy relacionadas con la
leucoencefalomalacia equina.
14.1.3 Género Penicillium y sus toxinas.
425
Los penicilios crecen sobre los alimentos preparados o sus materias primas, ya sean
de origen vegetal o animal. Sus micotoxinas consumidas regularmente, aún en cantidades
mínimas, causan lesiones irreversibles en riñon, hígado, cerebro y tienen actividad
teratogénica. Producen una gran variedad de micotoxinas, siendo algunas de ellas: ácido
ciclopiazónico, ácido penicílico, citreoviridina, citrinina, ocratoxina A, patulina, penitrem A,
rubratoxina A, rubratoxina B, toxina PR, veruculógeno y roquefortina.
A continuación se muestran alguna de sus estructuras químicas:
O OH O
HOOC
N
O
H
CH
OCRATOXINA 3
CH
3
C
O CH
3
O
PENITREM A
OH
OH
OH
Cl N CH
3 O
CH
3
O
OH
HOOC
O O
O CITRININA
O CH
3
PATULINA
CH3 CH3
O OH
Ocratoxina A: Producida por P. verrucosum, se encuentra sobre cereales, embutidos y

quesos. Produce degeneración grasa del hígado y necrosis del tejido renal en aves de
corral. Se acumula en tejido graso de animales y de ésta forma pasa al ser humano.
426
Citrinina: Es un metabolito de P. citrinum. Incorporada en la dieta de animales puede

causarles la muerte por degeneración renal.
Patulina: Producida por el P. griseofulvum, común en cereales y nueces, P.expansum,

frecuente en manzanas y P. roquefortii es ubicuo. Es una micotoxina hepatotóxica,
nefrotóxica y mutagénica.
14.2 Investigación.
El análisis de micotoxinas se plantea según un esquema que consta de varias etapas

básicas. Este esquema sufre modificaciones en función de la naturaleza de la muestra y del
propósito del análisis.
Las metodologías que implican el uso de enzimoinmunoensayos puede aplicarse

directamente luego de la etapa de extracción. Estas técnicas presentan una alta sensibilidad
y especificidad para distintas micotoxinas y arrojan resultados cuantitativos de mucha
precisión.
• Tipos de muestras: Cereales, alimentos balanceados, leche y sus derivados,
oleaginosas, especies.
Se realizan los siguientes pasos:

a) Molienda del material a tamaño particulado
b) Extracción de las aflatoxinas (AFL.) con mezcla de solventes adecuada
c) Purificación de los extractos
d) Detección mediante TLC.
14.2.1 Técnica.
Pesar 25 gr de muestra, molerla en molinillo o licuadora y colocarla en un erlenmeyer

con tapa esmerilada, en lo posible. Agregarle 50 ml de la mezcla metanol:agua (60:40), 1 gr
de NaCl y 20 ml de hexano, luego colocarlo en un agitador mecánico, durante 30 minutos.
Decantar y filtrar por papel Whatman Nº 4, tomar 25 ml de la capa inferior (metanol:agua),
mediante el empleo de pipeta y colocar en ampolla de decantación.
427
Agregar en la ampolla 25 ml de tolueno o cloroformo, agitar 1 min con cuidado y

dejar decantar para que se separen las fases. Tomar la porción superior (en el caso de
haber usado tolueno), o inferior (si empleó cloroformo), filtrar por papel de filtro con Na2SO4
anhidro.
Realizar otra extracción con tolueno o cloroformo, nuevamente, lavando el papel de

filtro con una porción del solvente empleado- Reunir los extractos secos y llevara sequedad
en rotavapor (80 ºC). Emplear el extracto redisuelto para realizar la TLC.
14.2.2 Aislamiento y Presunción de Identidad.
Ficha técnica de la AOAC (Official Methods of Analysis 13 th Ed. Association of Official

Analytical Chemists), 26031, pág. 419 Washington 1980).
TECNICA
Disolver el residuo en 100 µl de tolueno:acetonitrilo (98:2), agitar vigorosamente para

disolver adecuadamente y con jeringa de 10 µl. Sembrar en placa de sílica gel (como fase
estacionaria):
a) una mancha de 2 µl
b) una mancha de 5 µl
c) dos manchas de 10 µl del extracto problema.
En la misma placa se siembra:

d) una mancha de 2 µl de estándar
e) una mancha de 5 µl de estándar
f) una mancha del 10 µl de estándar
g) una mancha de 10µl de estándar sobre una de las manchas c)
El cromatograma se desarrolla utilizando como fase móvil la mezcla cloroformo-acetona

(9:1) sin equilibrar. El revelado se realiza bajo luz ultravioleta de onda larga.
428
INTEPRETACION
Deben analizarse las manchas que presenten la muestra problema y comparar sus
respectivos valores de Rf con los de los estándares.
Examinar la fluorescencia de las manchas de la muestra, observando si manchas

fluorescentes de idéntico valor de Rf ofrecen un aspecto similar al de los patrones,
A partir de los datos obtenidos en la TLC, se debe estimar la dilución más adecuada a
efectuar para el análisis cuantitativo, teniendo en cuenta para el cálculo la cantidad de
extracto usada en este caso.
CUANTIFICACION
Técnica
Si de acuerdo a lo observado en el paso anterior fuera necesario diluir el extracto, el mismo

debe evaporarse previamente a sequedad en baño de agua y redisolver en el volumen
calculado de tolueno:acetonitrilo (98:2).
En una placa cromatográfica debe sembrarse:

a) una mancha de 3,5 µl del extracto problema
b) una mancha de 5,0 µl del extracto problema
c) dos manchas de 6,5 µl del extracto problema
d) manchas de 3,5-5,0 y 6,5 µl del patrón cuantitativo correspondiente a la aflatoxina
sospechosa, según lo observado en la etapa anterior
e) 5,0 µl del patrón cuantitativo sobre una de las manchas problema de c), actúa como
patrón interno.
Luego se procede al desarrollo del cromatograma como se indicó anteriormente.
INTERPRETACIÓN
429
El patrón deberá presentar una resolución adecuada, caso contrario deberá

recromatografiarse. Los valores de Rf de las AFL- usadas como patrones internos deben
diferir muy poco (lo ideal es que sean idénticos), de los correspondientes a los respectivos
patrones cuantitativos. Como las manchas de extracto problema se comparan directamente
con la de los patrones de AFL. carece de importancia la magnitud de los valores de Rf
apreciados.
Toda mancha fluorescente que pretenda identificarse como AFL B o AFL G, deberá
tener idéntico valor de Rf y un color similar al ofrecido por la mancha patrón
correspondiente.
Comparar la intensidad de fluorescencia presentada por la mancha del extracto

problema con la intensidad de fluorescencia de la mancha de AFL. B1 del patrón y
determinar cuál de las alícuotas del extracto problema presenta una intensidad de
fluorescencia igual a una de las manchas patrón. Si la intensidad de la mancha problema es
intermedia entre dos manchas patrones, se deberá interpolar entre las mismas.
CÁLCULOS
El contenido de AFL. B1 se determina aplicando la fórmula siguiente:
S.Y.V
µl de AFL. B1/ Kg. de producto =
X.Z
Siendo:
S ....... µl. del patrón de AFL. B1 de intensidad de fluorescencia igual a la
muestra problema.
Y ....... concentración de AFL. B1 en el mencionado patrón, en µgr/ml.

V ........µl del solvente requeridos para diluir el extracto final
X ....... peso en gr. de la muestra original contenido en el extracto final.
Z ....... µl. del extracto problema aplicado para obtener una intensidad de
fluorescencia igual a S del patrón de AFL. B1
430
Los cálculos para B2, G1 y G2 son similares
Procedimiento para determinar simultáneamente aflatoxinas, ocratoxina y zearalenona
Drogas y reactivos:
• Hexano, cloroformo, cloruro de metileno, dietiléter, todos de grado p. a.

• Amoníaco.
• Solución metanol/agua (85:15)
• Solución H2SO4 30%
• Solución de Fast Blue Salt RR 0,7 % p/v en agua destilada.
• Solución de NaOH 0.1 N
• Solución de NaCI al 10% p/v,
• Solvente cloroformo/acetona (9:1)
a) Solvente tolueno/acetato de etilo/fórmico 85% (6:3:1)
Estándares:
• Solución de Aflatoxinas B1 0.33 µg/ml, B2 0.70 µg/ml, G1 0.33 µg/ml, G2 0.70 µg/ml en
cloroformo.
• Zearalenona 50 µg/ml en cloroformo.
• Ocratoxina 5 µg/ml en metanol.
Materiales y equipos especiales:
• Cromatofotios de silicagel 60 sin indicador de fluorescencia, 0.2 mm de espesor

• Lámpara UV 365 nm
• Micropipetas 100 µl
• Jeringa Hamilton 10-25 µl
• Columnas SPE de 5 ml de capacidad
• Rociadores de cromatofolios
Extracción:
431
Mezclar 20 gramos de triturado con 80 ml de una solución metanol/agua (85:15). Agitar

manualmente durante 30 minutos o en shaker o licuadora cinco minutos.
Filtrar en papel de filtro de poro grueso y colectar 40 ml de filtrado.
Agregar 40 ml de NaCI 10% a los 40 ml de filtrado.
Desgrasar por extracción de 2 x 25 ml con hexano en ampolla de decantación. Descartar el
extracto hexano.
Extractar la solución desgrasada con 2 x 25 ml de cloroformo. Colectar ambos volúmenes de
cloroformo y evaporar, descartando la fase acuosa.
Purificación:
Acondicionar la columna con 3 ml de hexano, seguida de 3 mililitros de cloruro de metileno.

No permitir que el lecho de la columna se seque.
Disolver el residuo clorofórmico en 3 ml de cloruro de metileno y transferir cuantitativamente
a la columna con cloruro de metileno. Aspirar la muestra.
Lavar con 3 mililitros de hexano, seguido de 3 ml de dietiléter, seguido de 3 ml de cloruro de
metileno. Descartar los eluatos.
Eluir la muestra desde la columna con 6 ml de cloroformo/acetona (9:1). Evaporar hasta
residuo seco.
Cromatografía en placa fina:
El residuo se redisuelve en 200 µl de cloroformo, usando este extracto para la siembra en

TLC. El solvente de corrida a usar es tolueno/acetato de etilo/fórmico 85% (6:3:1)
Revelado:
Las aflatoxinas aparecen con fluorescencia azul al UV (365 nm). Rociando con H2SO4 30%
la fluorescencia se toma amarilla. Límite de detección 0,5 ng. Rf afla. ≅ 0.20.
La zearalenona aparece luego del rociado de la placa con Fast Blue Salt RR y
seguidamente con NaOH 0. 1 N. Se observará la aparición de una mancha púrpura bajo luz
blanca. Límite de detección 5 ng. Rf zea. ≅ 0,70.
432
La ocratoxina aparece con fluorescencia verde bajo luz UV (365 nm), Luego de exponerla
placa a vapores de NH3 se observa viraje a fluorescencia azul. Límite de detección 0.5 ng.
Rf ocra. ≅ 0.40.
Procedimiento para determinar Tricotecenos de los grupos A y B
Drogas y reactivos:
• Acetonitrilo, acetato de etilo, cloroformo, tolueno, ácido fórmico, benceno, acetona, todos
de grado p.a.
• Carbon activo para cromatografía o equivalente. Activado cinco minutos a 150 ºC
• Alúmina neutra para cromatografía o equivalente
• Celite para cromatografía o equivalente.
• Solución de cloruro de aluminio. Disolver 15 gr de Cl3AI.3H20 en 15 ml de agua más 85
ml de etanol puro o en 100 ml de etanol 96º
• Solución de ácido sulfúrico al 30%.
• Solvente I mezcla acetonitrilo/acetato de etilo/agua (50:41:9).
• Solvente lI: cioroformo/acetonitrilo (4:1).
Estándares:
• T-2 100 µg/ml en cloroformo.

• Neosolaniol 100 µg/ml en cloroformo,
• DON 100 µg/ml en metanoL
Materiales y equipos especiales:
• Cromatofolios de silicagel 60 sin indicador de fluorescencia, 0.2 mm de espesor.

• Estufa 120 ºC.
• Lámpara UV 365 nm,
• Micropipetas 100 µl
• Jeringa Hamilton 10-25 µl
• Columnas de 1 cm de diámetro interno y 10 cm de longitud de material no atacable por
solventes, pudiendo usarse el cilindro de jeringas descartables de 5 ml.
433
• Rociadores de cromatofolios.
Extracción:
Pesar 10 gr. de triturado y agregar 40 ml de Solvente 1 y 36 ml de hexano.

Agitar manualmente durante 30 minutos o en shaker o licuadora cinco minutos. Filtrar a
través de papel de filtro de poro grueso. Tomar la fase inferior (acuosa) para proceder a la
limpieza del extracto.
Clean-up:
Preparar una columna con elementos en el siguiente orden desde abajo hada arriba:
papel de filtro de poro grueso igual al diámetro de la misma, 0.1 gr de celite y 1.5 gr de la
mezcla carbón activado/alúmina/celite (0,7:0,5:0,3), compactando hacia el fondo de la
columna.
Lavar la columna con 6 ml de Solvente 1, aplicando vacío con una velocidad de
elución de 5 ml/min. Descartar el líquido de lavado. Agregar sucesivamente 20 ml del filtrado
y 10 ml del Solvente 1, recuperando el total del eluído.
Trasvasar a un balón y llevar a sequedad a 70 ºC. Lavar el balón con dos volumenes
de acetato de etilo a temperatura de baño maría para asegurar la disolución de todas las
toxinas adheridas a las paredes del balón. Llevar nuevamente a sequedad.
Cromatografía en placa fina
Redisolver el extracto en 100 µl de Solvente II. El solvente de corrida a usar es

benceno/acetona (3:2).
La placa se desarrolla y se seca en la oscuridad.
Revelado:
El DON aparece con una fluorescencia azul a la luz UV de 360 nm, luego de
embeber la placa en una solución al 15% en clooruro de aluminio en etanol 96º y calentar a
120 ºC durante cinco minutos. Rf DON ≅ 0.30. T2 y neosolaniol aparecen con una
fluorescencia gris-verdosa a la luz UV de 360 nm, luego de nebulizar con una solución de
434
ácido sulfúrico al 30% y calentar a 120 ºC durante cinco minutos. Rf T2 ≅ O.7; Rf neos.
≅0.45.
435
CAPITULO 15
EL PELO COMO MATRIZ PARA LA BÚSQUEDA DE
DROGAS DE USO INDEBIDO.
Autor:
Prof. Miriam G. Arado.
Perito Químico Judicial. Docente Universitario.
Introducción
El análisis de la matríz pelo hunde sus raíces en el conocimiento íntegro de la

morfología, actividad metabólica, distribución y almacenamiento de drogas, en la criteriosa
elección de metodologías consensuadas por la comunidad científica internacional y aún más
en la correcta interpretación de resultados.
436
15.1 Conceptos generales

Es bien conocido el papel que juega el pelo cuando es hallado en escenas de hechos
delictivos, tornándose en una herramienta valiosa de cotejo. Estudios de su morfología,
estructura, propiedades físicas, entre otras, aportan datos para descartar o confirmar
individuos presuntamente imputados, mucho más aún cuando ésta matriz posee bulbo,
condición para realizar estudios de análisis comparativos de ADN.
Asimismo, su utilidad para detectar tóxicos minerales como arsénico y talio, entre
otros, es bien conocida desde mucho tiempo atrás.
Respecto de encarar en este tejido estudios tendientes a detectar compuestos
orgánicos de interés toxicológico, podemos mencionar grupos de investigadores de Estados
Unidos, Alemania e Italia como pioneros en la temática. Los primeros compuestos orgánicos
detectados han sido drogas de abuso principalmente morfina, compuestos relacionados y
cocaína.
Surge el interrogante del porqué no se ha estudiado y/o detectado drogas y fármacos
antes de 1979, fecha en que Baumgartner da a conocer a la comunidad científica el primer
aislamiento e identificación de morfina en pelo, mediante la técnica de radioinmunoensayo.
Hay una respuesta que parece evidente: los niveles detectados son bajísimos en el
orden del nanogramo por miligramo de pelo.
En ésa época resultaba dificultoso alcanzar dichos niveles de detección, más aún la
cuantificación se tornaba engorrosa ya que los estándares internos deuterados eran
prácticamente inasequibles y de muy alto costo.
Inicialmente hubo una euforia generalizada entre los toxicólogos norteamericanos y
europeos que muy pronto debieron llamarse a la prudencia ya que en Alemania se
informaban drogas de abuso positivas en individuos que no habían consumido activamente
la droga en cuestión pero sí habían estado en contacto con ellas. Así aparece el concepto
de contaminación externa y también de ingreso pasivo “sistémico”. Término que encuentro
apropiado para definir el ingreso de la droga y su distribución en el organismo y posterior
depósito en el espécimen de estudio.
Aquí comienza a discutirse la necesidad de valores de Cut-Off ajustados, que
pudieran dar sustento firme a los guarismos encontrados en pelos de personas
supuestamente consumidoras de drogas.
437
Prosigue la discusión sobre la elección de un sistema de lavado óptimo y los

procedimientos de extracción. Cabe destacar respecto de esto último que ha sido el
parámetro que más cambios ha sufrido en los últimos 4 a 5 años, obviamente tendiente a
una mejor recuperación del analito. Resulta propicio expresar en éste sentido, que desde la
introducción del sistema SPE hacia mediados de la década del 90 nos hallamos hoy frente
al uso más frecuente de la SPME y de la SFE (fluido súper crítico). Dando como resultado el
uso de técnicas que requieren menor cantidad de matriz o espécimen ofreciendo como
ventaja muy altos rendimientos. Está en plena discusión la reproducibilidad de los valores
cuantitativos para éstos dos últimos métodos de extracción.
En nuestro país existen indicios que a principio de la década del 90 se utilizó pelo
con el objeto de descartar drogas de abuso.
Nuestra experiencia comenzó sistemáticamente en el año 1994, al efectuar
aislamientos mediante SPE (extracción en fase sólida) aplicada a casos post-mortem e
individuos vivos consumidores consuetudinarios en tratamientos psiquiátricos.
Los estudios efectuados han proporcionado hallazgos sorprendentes; inclusive ha
permitido no solamente contemplar el pelo pericraneal como matriz alternativa sino también
el vello pubico, axilar y barba.
Sin duda alguna, en la actualidad el examen químico es el encargado de mostrar
más allá de otros signos visibles, el consumo de sustancias de uso indebido. También
resulta de interés el estudio de medicamentos utilizados con fines terapéuticos prescriptos o
automedicados.
Es importante poder establecer en el cabello pericraneal, la cronología de
administración de drogas. Este dato es aportado por el rastreo de tóxicos en diferentes
segmentos repartidos desde el bulbo hasta el extremo distal o punta. (fig.1)
438
Fig.1 Corte de aproximadamente 36 cm de longitud, dividido en segmentos de 3 cm

cada uno que se estudian en forma separada.
La experiencia nos indica que una droga incorporada tres días antes de la toma de
muestra podrá ser hallada solamente en el bulbo o en las primeras porciones de la matriz. A
medida que el tiempo transcurre, el depósito de las sustancias se desplaza hacia el extremo
distal del mismo. Como se mencionó precedentemente teniendo en cuenta éste fenómeno,
puede determinarse la Cronología de Consumo. Normalmente los cabellos crecen durante 8
a 10 meses a razón de 1 cm por mes (fase de crecimiento o fase anágena), luego cesa el
crecimiento durante dos o tres meses (fase telógena), para luego involucionar y caer (fase
catágena).
Además, ofrece posibilidades de análisis cuando median estados putrefactivos

importantes como en muestras provenientes de exhumaciones de corta o larga data. En
éste sentido los pelos han demostrado ser uno de los mejores reservorios de drogas por
tiempo prolongado. De hecho, nuestras propias observaciones en la permanencia de
sustancias fueron logradas al aislar drogas alucinógenas de la A. colubrina en pelos de
momias andinas de más de mil años de antigüedad.
Todas esas ventajas hacen a que su aplicación en la esfera judicial sea amplia y un
aporte útil respecto a otras matrices como vísceras, sangre u orina. Recordemos que la
orina proporciona información en tiempo relativamente breve de consumo, mientras que el
pelo nos permitirá conocer incorporaciones mediatas, es decir, semanas, meses, años.
439
Es indispensable hacer una criteriosa elección de tejido, secreción o líquido corporal cuando
se desee detectar una sustancia pues dependerá de la biodisponibilidad unida a otros
factores inherentes a la propia droga (pH, pKa, tiempo de vida media, etc.)
De esta manera la ventana de detección de sustancias se amplía.
15.2 Biologia del pelo
Para poder comprender como una droga ingresa al pelo y porque escapa al metabolismo
general es necesario entender que el pelo es solo una parte de un órgano bastante
complejo, incluido y diferenciado a partir de otro órgano, la piel, llamado complejo pilo
sebáceo.
- Órgano pilosebáceo
Este sistema estructural funcional complejo puede ser dividido en dos compartimientos
metabólicos diferentes aunque interdependientes y dependientes funcionalmente del órgano
madre que lo contiene, la piel.
A uno de los compartimientos podríamos llamarlo “productor”, metabólicamente activo

poseyendo todas las células generadoras de queratina y la secreción sebácea formativa de
otro compartimiento que podríamos llamar “producto”. Éste metabólicamente menos activo, el
pelo propiamente dicho y la secreción sebácea que recubre al mismo.
15.3 Morfología del pelo
Así, el pelo apéndice de la piel que crece a partir del folículo piloso, se extiende desde el
bulbo empotrado en el folículo a través de un eje y finalizando en una punta.
En el eje se distinguen tres planos desde afuera hacia adentro en forma concéntrica, la
cutícula, corteza y médula.
La corteza rica en queratina fibrilar forma entrecruzamientos con otras proteínas mediante
puentes disulfuros que hace al pelo una estructura altamente estable, aún en la etapa de
apoptosis. (del griego: apo: hoja y ptosis : caída. Metáfora que compara la eliminación de
440
células cuando éstas completan su ciclo vital como la caida de hojas en otoño) La apoptosis es
considerada hoy como un acontecimiento fisiológico de destrucción programada de células
durante la queratinopoyesis. En éste proceso de apoptosis las membranas celulares pierden
adhesión y las células pueden descamarse.Sin embargo, en el pelo las estructura permanece
junta, debido a la producción de otras proteínas que mantienen unidas a las células entre sí.
La médula se halla formada por material proteico y lipídico de degradación celular más
abundante en agua que la capa cortical, totalmente deshidratada y prácticamente impermeable.
El órgano pilosebáceo presenta una glándula anexa, la sebácea,

Que brota como una yema en la porción ístmica del folículo. La secreción proveniente de
ésta glándula contiene ácidos grasos alifáticos y otros complejos divididos generalmente en
tres grupos: Escualenos y esteroles (aproximadamente 12 % del total de la secreción),
ésteres de ácidos grasos con alcoholes grasos (25%), triglicéridos y ácidos grasos libres
(57%).
La secreción sebácea, variable por diferentes factores es eliminada por el mismo poro por el
que emerge el pelo, bañando el tallo piloso.
15.4 Coloración del Pelo
En la corteza se hallan gránulos de pigmentos cuyo principal componente es la melanina,

sintetizada en pequeños cuerpos que se hallan en el bulbo, (melanocitos)
La cantidad y calidad de melanina varía según el tipo de pelo (negro, castaño, rubio,
pelirrojo).Además de la melanina existen otros pigmentos en menor cantidad que dan al pelo
diferencias de matices, como: carotenoides flavonoides y otros pigmentos denominados
genéricamente tricocromos.
De todas maneras, es la melanina el pigmento más importante concentrándose mayormente
en la corteza del pelo, siendo la médula habitualmente hipocrómica aunque no siempre.
Melanina
La melanina se sintetiza a partir de la Tirosina, que por efecto de la enzima Tirosinasa pasa a
Dopa y luego a Dopaquinona. Ésta última puede ciclarse a dopacromo y conformar
oligómeros que van a formar la Eumelanina o Melanina verdadera (de color castaño oscuro
o negro con escasos sulfhidrilos) o unirse a glutatión y/o cisteína para dar lugar a glutatión
dopa o cisdopa,que a través de diferentes modificaciones llega a formar benzotiozinil-
441
anilinas, originando oligómeros feomelanina o melanina falsa (de color pardo rojizo rica en
aminoácidos azufrados como la cisteína) o bien tricocromos monoméricos.
15.5 Tipos de Pelo
De acuerdo a su conformación y longitud, el pelo puede ser dividido en: Lanugo, vello y pelo
de cuero cabelludo (cabello)
El lanugo es un pelo fino y suave que existe en el feto, cayendo a los pocos días de vida .
El vello es un pelo generalmente más grueso que el cabello, con médula completa a menudo
de diámetro irregular y con tendencia a curvarse. El vello no posee el mismo ciclo biológico ni
la misma velocidad de crecimiento que el cabello pero si una hormono-dependencia similar.
15.6 Crecimiento
El pelo humano tiene tres fases de crecimiento:
a) Anagénica: Es una fase de crecimiento activo. Dura entre 2 –3 años.
b) Categénica: Es una fase de transición entre el crecimiento activo y la etapa final.
c) Telogénica :Dura entre 2-3 meses y constituye la fase final,donde el pelo se desprende
fácilmente.
15.7 Incorporación de Drogas al Organismo
Habiendo analizado la anatomía y fisiología del complejo pilosebáceo, surge una serie de
posibilidades de incorporación y permanencia de drogas de abuso en el tallo piloso.
a)-Difusión Pasiva: La hipótesis más simple de elaborar es la de difusión pasiva de la droga

a la zona de síntesis del folículo piloso a partir de la concentración de droga en plasma. No es
ilógico pensar que el folículo piloso se “embebe”de la droga por un simple mecanismo de
biodisponibilidad, en una distribución uniforme de éstas hacia células metabólicamente
activas.
Esta idea presenta varios datos que le quitan sustento: por un lado, estudios analíticos
muestran que en pelo es mayor la concentración de droga íntegra más que sus metabolitos.
Por otro lado, la concentración de drogas en pelo es seis veces mayor que en sangre, lo que
indica que de alguna manera la droga no difunde pasivamente.
442
También se conoce que la droga se ubica en el tallo piloso, por lo que debe existir un rápido
pasaje de la misma, inalterada, hacia compartimientos metabólicamente inactivos.
Es lógico pensar que la droga incorporada a la zona de síntesis del folículo piloso es
directamente proporcional a la droga circulante, por lo que al metabolizarse ésta la
concentración plasmática cae, invirtiéndose el proceso, volcando el folículo piloso droga a la
circulación, siendo lo mismo para drogas libres en plasma o unida a la fracción proteica. Por lo
tanto debe existir un mecanismo de atrapamiento y protección de moléculas que impidan que
éstas entren al sitio de metabolización y biodisponibilidad general del organismo.
b)-Modelo Multicompartimental : Se postulan diversas hipótesis.

b1) Incorporación de droga a la zona queratógena. Quienes apoyan ésta idea
sostienen que la droga es incorporada a la zona queratógena del pelo, metabólicamente
menos activa, a partir de la difusión desde la sangre. El hecho de poseer menor actividad
metabólica justifica la falta de degradación de las moléculas. Sin embargo no explica la mayor
concentración, ya que tendría que existir una extremada avidez de la queratina inmadura
para fijar la droga y protegerla, hecho que no ha sido demostrado fehacientemente. Tampoco
se conoce la capacidad de saturación de la queratina, factor limitante más importante para
alcanzar concentraciones elevadas en el pelo.
b2) Transferencia de droga a partir de la secreción sebácea

Quienes apoyan ésta hipótesis argumentan que las células de la glándula sebácea atrapan
moléculas lipofílicas, desde la sangre y luego son volcadas a la secreción para ser
incorporadas a través de la cutícula del tallo piloso. Esta idea encuentra varios obstáculos:
en primer lugar, las células sebáceas son metabólicamente activas, por lo que la droga
tendría que estar parcialmente metabolizada. Además el pelo es prácticamente impermeable
a la incorporación de elementos desde el exterior, por su cutícula por la marcada
disminución del agua intrapilosa y por su pH interno (6 o menos).
Por otro lado, porque la secreción sebácea es un ecosistema en el cual existen
microorganismos que metabolizan activamente lípidos y otras sustancias.
b3)Transferencia de drogas desde la secreción Sudorípara
443
Aquí, valen los mismos detalles para transferencia a partir de secreción sebácea, con el
agravante que la secreción sudorípara es acuosa y rica en electrolitos.
b4) Transferencia por contaminación externa

Quienes sostienen ésta hipótesis argumentan que la droga es eliminada a través de la
superficie cutánea y luego penetra al tallo piloso. Esto encuentra los mismos obstáculos ya
citados. De ellos, tal vez el más importante es la impermeabilidad del pelo.
Por otro lado, debemos considerar la adsorción de droga a pelo en ambientes donde se
consume (principalmente fumada). Expresase que en estas circunstancias la adherencia al
pelo es débil, por lo que como veremos más adelante, los sistemas de ¨lavado¨ removerán
fácilmente la sustancia del sector externo.
b-5) Incorporación Sistémica
Es muy importante tenerla en cuenta que en casos donde hubo contactos con la droga , aún
accidentalmente, puede ingresar al organismo (por ejemplo, mediante las vías respiratorias)
absorberse y entrar a la circulación general, fenómeno este que preferimos denominar :
contaminación sistémica.
15.8 Permanencia de drogas en el pelo
Como se mencionó precedentemente, nuestras propias observaciones indican que esta

matriz, otorga protección extrema a las drogas incorporadas a la misma.
Así, nos inclinamos a pensar en un mecanismo de difusión, desde la sangre hacia la zona
de síntesis de pelo y en la existencia de mecanismos de atrapamiento de moléculas que
permitan a estas escapar de la metabolización.
Existen varias opciones de protección:
a) Retención en la Queratina :
Habiendo disponible varios tipos de queratina (fibrilares, enrolladas, helicoidales, etc.)
puede existir protección de las moléculas al quedar atrapadas dentro de la estructura, la que
444
podría rechazar electrostáticamente a las enzimas degradadoras o modificar el

reconocimiento de los sitios alostéricos de las enzimas por parte de la droga.
b) Quelación de la droga
Existen sustancias que poseen actividad quelante, tales como aminoácidos, flavonoides,
carotenoides, tricocromos, etc.que pueden ejercer un mecanismo de atrapado, protección y
transporte de droga hacia porciones superiores de pelo.
15.9 Incorporación a médula en estructuras lipídicas sin actividad

Metabólica
La droga en la zona queratógena podría encontrarse libre o unida a las sustancias

mencionadas precedentemente. La droga libre puede unirse, en caso de ser lipofílica, a
membranas celulares lipídicas que en el proceso de apoptósis son degradadas formando
cuerpos apoptósicos que tienden a ser eliminados a la médula del pelo, sitio este
metabólicamente inactivo, donde tenderían a acumularse.
15.10 Retención de la droga en otros componentes

Se ha afirmado que la Melanina, con su estructura cuaternaria puede atrapar droga en forma
similar a lo que hace la queratina. Esto es cierto, ya que la melanina es un polímero de
aminoácidos modificados a partir de la fenilalanina; con agregados de otros aminoácidos
azufrados.En este sentido L. Pöstch, consigna que la melanina juega un rol muy importante,
cuando propone que las moléculas de drogas se acumulan en la superficie de la misma, ya
que es conocido que los polímeros de la melanina actúan como adsorbentes. No obstante,
recordemos que la melanina se encuentra dentro de los melanosomas.Por otro lado los
melanosomas se incorporan al queratinocito en la zona queratógena no existiendo en la
porción de síntesis del pelo.Esto induce a pensar que la droga que ingresa al sitio de
síntesis no es atrapada y transportada por la melanina, sufriendo en consecuencia
metabolizaciones antes de llegar a la zona quertaogénica en la que la melanina cumpliría
su función adsorbente.
15.11 Estudios sobre dosis - concentración en pelo
445
Baumgartner y colaboradores han reportado correlación positiva entre sujetos adictos y las
concentraciones de heroína, cocaína y marihuana en su pelo.
Nakahara encontró una buena correlación entre la dosis de metoxianfetamina y la
concentración de droga en el pelo de 5 personas.
Nuestra experiencia en el estudio de pelo pericraneal, vello axilar y púbico comprendido en
una amplia población de personas adictas, nos sugiere que en general la concentración de
cocaína en pelo es mayor cuando se incrementa la dosis .Sin embargo la variabilidad entre
sujetos es tan grande que es dificultoso estimar la cantidad de droga administrada basada
en la concentración de droga hallada en el pelo.
Balikova M.A. Habrdova V.establecen que la determinación cuantitativa de opiaceos en
pelo esta fuertememte ligada entre otros factores a la distribución de opiaceos dentro de la
matriz.
Paterson S.et.al, no hallan relacion interindividual entre dosis /concentracion para metadona.
Strankrond R.y col. Han observado el incremento y luego descenso en la concentración de
nitrazepam, clonazepam y diazepam posterior a la liberación uniforme de la dosis prescripta.
15.12 Relación Droga Metabolito
Quizás el desafío más grande para el modelo de transferencia pasivo sea el hallazgo de
altas relaciones droga / metabolitos.
La cocaína fue identificada como analito primario en el cabello de todos los cocainómanos
,encontrándose en concentraciones 6 veces mayores que su metabolito primario
benzoilecgonina y aproximadamente 10 veces más que ecgonina metil éster.
En casos post-mortem hemos podido aislar sustancias de corte como anestésicos
arilamínicos, cuya concentración con respecto a sus metabolitos también ha sido mayor.
En el caso de las benzodiacepinas la relacion esta a favor de sus 7, amino metabolitos.
Nitrazepam/7,amino nitrazepan,Flunitrazepam/7,amino-flunitrazepam,clonazepam/ 7,amino-
clonazepam.El Alprazolam no fue detectado en ninguna muestra.
A la hora de obtener resultados analíticos es importante tener en cuenta la posibilidad de

detectar la droga madre y ademas productos de biotransformación. Para los que debe
446
emplearse valores de corte (cut-off) que aportan un sustento firme al resultado analítico
obtenido.
Un gran número de expertos de reconocida trayectoria internacional, indican valores

de corte promedios de 0,5 ng por mg de pelo, mientras otros grupos de investigadores en
Francia informan valores de 1 ng por mg de pelo.
El laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Suprema Corte de Justicia de la
Provincia de Buenos Aires toma como valor de corte 0,5 ng por mg de pelo adhiriendo a lo
recientemente estandarizado por la comunidad científica internacional. Por otro lado,
contemplando la posibilidad de contaminación pasiva, se recomienda considerar cuatro
criterios:
a) Identificación de metabolitos.
b) Uso de la relación metabolito /droga madre.
c) Ensayos cuantitativos de la droga en los líquidos de lavado.
d) Valores umbrales.
Por otro lado, resulta altamente recomendable el empleo de dos técnicas analíticas
independientes, indicándose RIA (Radioinmunoensayo) y GC-MS (Cromatografía Gaseosa
Espectrometría de Masas) como así también el uso de drogas análogas deuteradas
empleadas como estándares internos. La metodología de RIA debe considerarse un buen
método analítico para descartar o no la existencia de una droga de abuso. Si ésta resulta
positiva se prosigue con la próxima etapa: GC/MS donde se confirma y cuantifica.
Los kit para RIA poseen una elevada sensibilidad aunque presentan como
desventaja el problema de las posibles reacciones cruzadas o interferencias. Así por
ejemplo en el caso de determinación de benzoilecgonina, puede presentarse la interferencia
de lidocaína (sustancia que habitualmente es utilizada como sustancia de corte) .
El caso de las Benzodiacepinas, el ensayo RIA, sólo permite detectar el grupo y no

el compuesto específico. Por otro lado, la extracción empleando enzimas Glucuronidasa
/arilsulfatasa para el posterior análisis mediante GC/MS permite obtener muy buen
rendimiento.
447
15.13 Obtención de la muestra
a) Debe ser obtenida en forma legal.

b) Se debe labrar un acta donde se exprese el consentimiento de la toma de
muestra (es un método invasivo).
c) La cadena de custodia es un documento que debe acompañar a las muestras en
todo momento, dejando constancia en el mismo de todas las personas
involucradas en la toma de muestra y/o traslado hasta el laboratorio. La identidad
de la muestra queda así certificada.
d) La recolección del material puede realizarse de dos maneras:
Una de ellas consiste en cortar el pelo del sector occipital superior (
por presentar este un crecimiento más homogéneo) al ras del cuero cabelludo
(Fig.2) en lo posible entre 1 a 2 grs. En la práctica un puñado o mechón es
suficiente. Por otro lado, es posible obtener muestras de diferentes sitios del
cuero cabelludo, y si el hecho lo requiere, de otras partes del cuerpo como ser
vello púbico, axilar o de la barba (considerando que el ritmo de crecimiento de
éste último es similar al del cabello). La situación ideal sólo es alcanzable en
muestras cadavéricas, donde se puede obtener pelo por arrancamiento para
utilizar el bulbo.
e) El material obtenido se coloca sobre una hoja de papel con el objeto de lograr
una mejor individualización de la zona próxima al bulbo respecto de la punta, para
el posterior estudio de los segmentos obtenidos por corte. En el caso, en que el
análisis no sea inmediato o deba ser remitido al laboratorio, se debe colocar otro
cartón encima y atar. El envoltorio debe permanecer firme y aislado de otras
matrices biológicas y/o efectos. Finalmente se guarda en un sobre rotulado.
Se denomina efecto a diversos objetos levantados en el lugar del hecho, pastillas,

fármacos, fibras, ropas, etc.
448
Fig.2 Toma de muestra zona occipital para determinar cronología de administración

de sustancias.
En cuanto al vello axilar y pubiano estos deben colocarse en cajas de Petri en

forma separada y rotulados.
15.14 Información básica que debe consignarse.
En pacientes ambulatorios resulta de interés contar con la máxima cantidad de datos,

lo cual resulta de gran valor cuando es el individuo quien narra los hechos. No obstante ello
el protocolo debe ser puntual de modo de asegurar una descripción ordenada que deberá
incluir información complementaria como el sexo, la edad, el último consumo de drogas y/ o
medicamentos, la profesión, las características del cabello (aspecto, color de pelo,
tratamientos, longitud).
En estudios Post-mortem será necesario contar con un Informe de autopsia minuciosa

indicando los mínimos detalles de la observación macroscópica. Si el médico autopsiante
estima, aunque crea con mínima posibilidad la existencia de alguna sustancia tóxica,
debería mencionarlo consignando su opinión. También resulta de utilidad la Historia Clínica
u otras drogas que se piense o se sabe que consumía el individuo antes de muerte.
449
15.15 FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA PERMANENCIA DE DROGAS
- Tratamientos Capilares
- Contaminación Sistémica
- Contaminación externa
15.16 ESQUEMA GENERAL DE BÚSQUEDA DE DROGAS EN PELO.
En los siguientes puntos se detallan los pasos de extracción secuencial y purificación

en columnas con rellenos especiales útiles para aislar drogas de carácter ácido, básico y
neutro de mayor relevancia toxicológica (cocaína y relacionados, marihuana, sustancias de
corte (anestésicos arilamínicos) y psicotrópicos). Posteriormente se describen las técnicas
para el caso particular orientado a la búsqueda de tetrahidrocanabinoles (THC).
No obstante, es interesante tener en cuenta otras posibilidades de extracción y los

rendimientos que ofrece una u otra metodología cuya elección se basa fundamentalmente
en el tipo de drogas que se desea aislar y ellos son:
Drogas Analizadas Procedimiento Extracción Méts.de detec. ng/mg pelo

Tratamiento Cond.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Cocaína Acido Hcl 0.1 M RIA 8.0 11.5
Cocaína Base NaOH 0.1 M RIA 2.0
BEG Solvente Etanol RIA 0.3 18.0
Cocaína Acido HCL 0.1 M GC-MS 0.6 6.4
Cocaína Acido HCL 0.1M RIA 0.6 6.4
450
Cocaína Acido HCL 0.1M GC-MS 0.2 26.0
BEG Base/Acido NaOH/HCL RIA 0.2 0.5
Cocaína Enzimático Pronasa 1mg/ml RIA 0.3 9.8
Cocaína Enzimático Prot.K 10mg/ml GC-MS 0.5 5.7
Cocaína Enzimático Glicur/Arilsul GC/MS 1.7 45.2
BEG Enzimático Glicur/Arilsul GC/MS 0.6 14.3
Cocaína Solvente Metanol GC/MS 0.1 10.0
LA DETERMINACIÓN ANALITICA CUANTITATIVA DE SUSTANCIAS ESTA FUERTEMENTE

LIGADA AL METODO APLICADO EN LA DIGESTIÓN.
COCAINA
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
metanol acida neutra enzim. basica
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Droga Analizada Procedimiento de extracción Métodos de det. ng/mg de pelo
Tratam. Condic.
451
Benzodiacepinas: Enzimático Proteín K LC/MS/MS 0.05-1,41

(diacepam)
Rango de calibración para dosis altas: 2.5-100 ng/muestra
Rango de Calibración para dosis bajas: 0.5-20 ng/muestra
morfina Neutra Soerensen Buffer Ph:7.4 GC/MS 0.9- 3.5

morfina Acida HCL 0.1 M GC/MS 1.2-10.5
morfina Basica NaOH 1 M GC/MS 0.9- 8.2
Codeína Neutra Soerensen Buffer Ph:7.4 GC/MS 0.1- 0.6
Codeína Acida HCL 0.1 M GC/MS 0.1- 0.5
Codeína Basica NAOH M GC/MS 0.1- 0.4
acetilcodeína Neutra Soerensen Buffer Ph:7.4 GC/MS 0.2- 3.7
acetilcodeína Acida HCL 0.1 M GC/MS nd.
Acetilcodeína Básico NaOH 1 M GC/MS nd.
6-monoacetilmorfina Neutra Soerensen Buffer Ph:7.4 GC/MS 1.1- 21.3
6-monoacetilmorfina Acido HCL 0.1 M GC/MS nd.
6-monoacetilmorfina Básico NaOH 1 M GC/MS nd.
A) Decontaminación o Sistema de lavados: tiene por objeto remover droga externa

adherida al pelo. (Fig.3)
452
Fig.3 Fase de lavado crucial para decontaminar exteriormente la muestra. El líquido de

lavado debe ser posteriormente analizado.
En la práctica se detectan serios deterioros en la cutícula ya sea por tratamientos capilares

o mala conservación, por tal motivo se recomienda realizar un exámen microscópico
previa coloración con azul de metileno.
A continuación se sugieren algunos solventes para lavados.
Su elección se basa fundamentalmente en las condiciones de la muestra
- Metanol o Etanol (Martz) **

-Soluciones acuosas-Buffer (Baumgartner) *****
-Surfactantes (Nakahara)*** (cabellos de exhumaciones)
-Diclorometano –Agua (Kintz & Mangin) ****
-Diclorometamo e incubación a 40 °c.(Jurado)
-Diclorometano-Acetona-Metanol-Metanol (Balíková- Habrdová)
-Isopropanol-Acetona-Metanol-Metanol (Balíková-Habrdová)
-Diclorometano-Isopropanol-Metanol-Metanol (Balíková-Habrdová)
-n-Hexano-Acetona-Metanol-Metanol (Balíková-Habrdová)
-Isopropanol-Buffer fosfato- Isopropanol (Kronstrand R.et.al) (Benzodiacepinas)
-n-Hexano –Metanol-Agua( Ferrari -Arado)
-Agua-Diclorometano-Agua (Ferrari –Arado)
-n-Hexano-Metanol-Metanol (Ferrari-Arado) Cabellos de exhumaciones.
-Agua-Agua-Agua (Ferrari-Arado) Cabellos sanos y limpios.
B) Preparación de la Muestra y extracción de la droga: Consiste en la extracción de la

droga incorporada en la matriz. Nos remitimos al inicio del apartado 15.4.
C) Purificación: tiene por finalidad remover la matriz y otras sustancias contaminantes.
D) Identificación analítica: de droga madre y metabolitos
453
-Cocaína: Benzoilecgonina-cocaetileno
-Heroína: 6-monoacetilmorfina-acetilopiáceos-morfina-codeína
-Cannabis: THC-COOH
-Anfetaminas: no determinados
-Benzodiacepinas: Diacepam-nordiacepam-oxacepam-alprazolam-
OH-alprazolam-Nitracepam,7-amino-nitracepam,flunitracepam,7-
Aminoflunitracepam,clonacepam,7-aminoclonacepam.
Relación Droga Madre Metabolito
Cocaína:Benzoilecgonina/Cocaína >0.05
Opiáceos:6-monoacetilmorfina/morfina >1.3
Interpretación de resultados:
Valores de Cut-off (Kintz, Francia)
Compuesto Cut-Off ng/mg
6-Monoacetilmorfina 0.5
Cocaína 0.5
THC-COOH 0.001
Anfetamina 0.5
PROTOCOLO Nª 1
1. Descontaminación:
454
Tomar el material a analizar y comenzar la decontaminación siguiendo el

procedimiento descripto a continuación:
1.1. Lavar con diclorometano durante 15 minutos a 37ºC
1.2. Lavar con agua destilada durante 15 minutos a 37ºC
1.3 Finalmente lavar con diclorometano durante 15 minutos a 37ºC
1.4. Guardar los lavados para posterior análisis por CG-MS
1.5. Secar el pelo colocándolo entre papeles de filtro y presionando.
1.6. Pesar exactamente todo el material a analizar
1.7. Cortar en segmentos de 1,2 a 1,5 cm cada uno.
2. Preparación de la muestra. Extracción de cada uno de los segmentos en forma

separada.
2.1. Realizar una hidrólisis ácida utilizando HCl 0.1 N. Incubar durante 22 hs. A 37 ºC.
2.2. Llevar a pH 5.5 y agregar el estandar interno deuterado o bien Nalorfina
/Pseudoefedrina. (Fig.5,6)
Fig.4 y 5: Estandares deuterados disponible en la actualidad
3. Purificación:
455
Los extractos obtenidos anteriormente deben ser sometidos a una etapa de

purificación. A continuación se describen en forma detallada los pasos requeridos para la
purificación comúnmente empleados en el laboratorio de toxicología: el sistema de Sistema
de extracción en fase sólida (SPE) Clean Screen Dau de World Wide Monitoring.
3.1. Preparación de la columna

Eluir una vez con 3 ml de metanol
Eluir una vez con 3 ml de agua destilada
Eluir una vez con 1 ml de ácido acético 1N.
En ninguno de estos pasos se debe dejar secar la columna. El vaciado debe realizarse
aplicando una bomba de vacío.
3.2. Aplicación de la muestra

Colocar la totalidad de la muestra dentro del reservorio y aplicar a la columna a un flujo de 1-
2 ml / minuto.
3. 3 Lavado de la columna:
Eluir una vez con 3 ml de buffer fosfato 0.1 M pH 6
Eluir una vez con 1 ml de ácido acético 1 N.
Luego drenar la columna durante 5 minutos con máximo vacío (15-20” Hg.)
Eluir una vez con 3 ml de n-hexano.
3. 4. Elución de drogas ácidas y neutras (Fracción A):

Eluir en un nuevo recipiente dos veces con 2 ml de Diclorometano y guardar.
Evaporar bajo corriente de nitrógeno, hasta sequedad; adicionar 1 ml de metanol 80 % en
agua, agitar y centrifugar, descartar la fase superior (hexano) y evaporar el metanol
totalmente, retomar el residuo con 50-100 microlitros de acetato de etilo.
3.5. Lavado de la columna:

Eluir dos veces con 2 x 1 ml de metanol.
3.6. Elución de drogas básicas (Fracción B):

Eluir en un nuevo vial dos veces con 1 ml de metanol básico (2 partes de hidróxido de
amonio concentrado en 98 partes de metanol), guardar
456
Al eluato, agregar 3 ml de agua destilada y 200-300 µl de cloroformo, agitar y centrifugar

durante 30 segundos.
Retirar el sobrenadante con pipeta y dejar secar en campana de gases.
4-Identificación analítica:
La identificación analítica se realiza por medio de Cromatografía Gaseosa acoplada a
Espectrometría de Masas siendo la técnica más utilizada y recomendada para el análisis de
drogas de uso indebido en pelo.
Caso particular: Determinación de Tetrahidrocanabinol (THC) en pelo.
A continuación se describe la técnica para investigar la presencia de tetrahidrocanabinol

(THC) y el ácido THC carboxílico. Se realizan los pasos indicados en 1 (descontaminación o
sistemas de lavados).
2. Preparación de la muestra: a partir de 20 a 50 mg de pelo se realiza la hidrólisis alcalina

con Hidróxido de sodio 0,1 N durante 20 minutos a 60°C. Luego de enfriar, se ajusta el pH a
3.5±0.5 con 2 ml de ácido acético glacial
3. Purificación.
3.1. Preparación de la columna:
Eluir una vez con 3 ml de Cloroformo y una vez con 3 ml de agua destilada
Eluir una vez con 1 ml de ácido clorhídrico 100 mM
Resulta importante no dejar secar la columna y el flujo de elución debe ser entre 1 a 2
ml/minuto.
3.2. Aplicación de la muestra
A partir de la muestra de pelo a la cual se le realizó la hidrólisis alcalina, se aplica en la

columna el extracto correspondiente con una frecuencia de 2 ml/min.
3. 3 Lavado de la columna:
457
Eluir una vez con 2ml de agua destilada y aspirar.

Eluir una vez con 2 ml de ácido clorhídrico 100 mM / acetonitrilo (60/40) y aspirar.
Drenar la columna durante 5 minutos a 10 mm de Hg.
Eluir una vez con 200 µl de n-hexano.
Aspirar y luego cambiar el tubo.
3.4 Elución de THC y ácido THC carboxílico:
Eluir dos veces con 3 ml de n-hexano/acetato de etilo (50/50) colectar en vial limpio al
menos de 5ml / minuto.
4. Identificación analítica.
Los extractos obtenidos son evaporados a sequedad a temperatura menor de 40°C y

derivatizados con anhídrido heptafluorobutírico 100 µl, más hexafluoropropanol 70 µl o bien
utilizar BSTFA con 1% TMCS (Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con 1 % trimetilclorosilano),
para canabinoles.
Luego de incubados y evaporados bajo corriente de nitrógeno, se reconstituye con

acetato de etilo y se inyecta en el instrumental CG-MS. Los estándares internos utilizados
son los recomendados por una amplia mayoría de equipos de todo el mundo.
Protocolo de trabajo N° 2
Extracción con disolventes Orgánicos
Si bien el rendimiento por ésta metodología extractiva no es tan satisfactorio como el

que se logra usando columnas con rellenos especiales para extracción en fase sólida antes
detallado, puede ser considerado como una buena alternativa.
1-Decontaminación idem método anterior.
458
2-Extracción.
A continuación se describen las técnicas de extracción para Cannabis así como la

extracción y derivatización de cocaína y morfina
Técnica de extracción para THC (Cannabis)
2. 1. Agregar a los extractos los estándares deuterados THC-d3 y THC-COOH-d3.

2.2. Realizar la hidrólisis alcalina con KOH 11,8 N y mantener a temperatura ambiente
durante 10 minutos.
2.3 Neutralizar con ácido Maleico a pH 7.
2. 4. Extraer dos veces con 5 ml. de Hexano-Acetato de etilo (9:1) en ampolla de
decantación.
2.5 Evaporar y derivatizar con 100 µl hexano +60 µl HFBA (anhídrido
heptafluorobutírico) mas 50 µl HFPOH (hexafluoropropanol) a 100°C durante 10
minutos.
2.6. Secar y retomar con 100 µl de Hexano
Técnica de extracción y derivatización de cocaína y morfina.
2.1. Se toma el pelo previamente segmentado y se agrega el estándar interno deuterado

Nalorfina / Pseudefedrina (1µg/ml) 250µl de cada uno
2.2. Se agrega 1 ml HCl 0.1 N a 50°C durante 18hs.
2.3. Se neutraliza con NaOH 0.1 N a pH 7
2.4. Se agrega Buffer pH: 9.2 u 8.2
2. 5. Se extrae dos veces con 5 ml cloroformo- isopropanol.-n heptano (50:17:33) 2 veces 5
ml
2.6 Evaporar y derivatizar con 100µl de HFBA mas 70µl HFP-OH a 60ºC durante 30 minutos.
2.7 Evaporar y reconstituir con acetato etilo
3. Identificación Analítica:
459
De igual manera que se realizó en el Protocolo 1, la Cromatografía Gaseosa-Espectrometría

de Masa resulta ser de elección para la realización de estas determinaciones.
15.17 Algunas consideraciones inherentes a la metodología empleada.
Empleo de cromatografía en placa de alta performance (HPTLC)
Al encarar un estudio químico analítico en éste espécimen es importante tener en

cuenta que los niveles cuantitativos detectados se hallan en el orden del ng. Esto dificulta
enormemente la posibilidad de utilizar métodos más sencillos o rutinarios, tales como TLC,
espectrofotometría, etc. No obstante, existe una manera de aumentar el límite de detección
del sistema analítico. Un método consiste en aumentar la cantidad de matriz analizada o
bien efectuar algún cambio físico o químico en el sistema separativo. Por ejemplo el empleo
de cromatografía en placa de alta performance (HPTLC) la cual permite incrementar la
posibilidad de detección de drogas. En otras palabras, podría intentarse la búsqueda de
drogas mediante HPTLC y revelado con UV mediante el empleo de una cantidad
considerable de pelo respecto de lo recomendado permitiendo aumentar el límite de
detección.
En el caso de emplearse una cromatografía en placa de alta performace (HPTLC) la
fase estacionaria corresponde a Sílica gel GF 254. La fase móvil mas comúnmente
empleada es Metanol – Amoníaco (100:1.5)
Una vez desarrollada la placa observar mediante luz UV onda corta 254 nm la
presencia de máculas absorbentes. Luego revelar con el reactivo Dragendorff. Dejar secar y
rociar con nitrito de sodio al 10 %. Resulta importante notar que la aspersión con Nitrito
suele incrementar notoriamente la visualización de la mácula generada con reactivo de
Dragendorff.
15.18 Control de Calidad.
Los estudios de drogas de abuso en pelo, requieren un control antes de presentar

los resultados. Los métodos desarrollados son los recomendados con el aval de los
controles producidos en Alemania, Italia, España, Francia y Estados Unidos. Cada
Laboratorio en particular debe establecer sus propios controles de calidad, teniendo en
460
cuenta que la matriz biológica analizada es muy particular ya que especímenes dañados
podrían inducir resultados erróneos. De acuerdo a lo expresado es importante que para
cada muestra analizada sean también estudiados los líquidos de lavado.
15.19 Interpretación de Resultados.
Para que una evidencia científica adquiera validez se deben definir los analitos a
monitorear, relación droga madre/metabolitos, niveles mínimos detectables, tiempo
transcurrido hasta la aparición de la droga en pelo, relación de la dosis respuesta,
estabilidad de la droga en pelo, valores de corte (Cut-Off), efectos de tratamientos capilares,
entre otras.
Así, debe establecerse que metabolito debe monitorearse junto a la droga madre,
que se hallará esta en mayor proporción. En el caso de cocaína se utiliza Benzoilecgonina,
que se halla siempre en una concentración menor que la droga madre. Para el caso de
Morfina, es muy útil monitorear la 6-Monoacetilmorfina que se halla en una relación
aproximada y constante 1/3 en relación a la droga madre. Esto último ha permitido
diferenciar adictos a la Heroína y Morfina de aquellos que consumen jarabes antitusígenos a
base de Codeína.
Antes del advenimiento del pelo como matriz periciable, resultaba muy difícil
asegurar un consumo activo de Morfina o Heroína, respecto de personas con consumos
terapéuticos de Codeína, utilizando orina para monitorear la incorporación de estas drogas.
Debemos recordar que en la orina encontramos mayor proporción de productos de
biotransformación que la droga madre, en la que es muy difícil detectarla intacta.
El área de mayor desacuerdo para la aceptabilidad del estudio analítico son los
potenciales resultados falsos positivos, debido a contaminación externa de la matriz y a la
diferencia en la proporción de droga incorporada según las características raciales.
Recordemos que la melanina juega un importante rol en la incorporación de drogas en la
matriz pilosa. En caso que un líquido de lavado arroje resultados positivos, deberíamos
presumir una contaminación externa, inclusive pasiva. Es decir, personas que estuvieron
expuestas en un ambiente donde se consumía drogas de abuso. No obstante, la unión de
drogas a proteínas externas del pelo es débil.
461
Comentamos un caso, en el que dieciocho lavados sucesivos arrojaron resultados

positivos para Cocaína. Posteriormente se realizó la extracción propiamente dicha de la
matriz consignándose un valor extraordinariamente alto. Tampoco se detectó
benzoilecgonina como metabolito. Esto nos hizo plantear la posibilidad de una
contaminación externa que por daño de la estructura capilar, permitió la incorporación
pasiva. Esta situación fue aclarada a los magistrados, haciendo notar que resultados
positivos per se, no constituyen indicio de consumos activos.
15.20 ¿La droga más hallada en nuestro medio? Cocaína

Productos de biotransformación y otros de transformación química
El conocimiento de las complejas transformaciones que sufre la droga en el organismo en

vida, postmortem y también en circunstancias posteriores a la toma de muestra nos
proporcionará un criterio más racional e inclusive permitirá evaluar como incide la vía de
administración de la cocaína (inhalatoria, inyectable, por fumado) en los compuestos
relacionados característicos que se generan.
Las denominadas enzimas estearásicas desempeñan un importante papel en el proceso
metabólico de la droga. Los diversos órganos revelan elevados niveles de estearasas
inclusive el cerebro aunque, la experiencia demuestra que en cerebro la droga se halla sin
metabolizar en un altísimo porcentaje, esto podría relacionarse a que éste órgano es rico en
fosfolípidos que por algún mecanismo de protección impediría la biotransformación de la
sustancia.
Las colinesterasas (colinesterasa plasmática, colinesterasa sérica, pseudo colinesterasas y
colinesterasas específicas) desempeñan una función prominente en la degradación
metabólica de la cocaína.
Hay tres caminos metabólicos considerados fundamentales en la interpretación de

consumos en individuos vivos y postmortem.
La vía que conduce a la formación de cocaetileno en presencia de etanol es tres veces más
rápida que la vía que conduce a la formación de benzoilecgonina (BE), uno de los
metabolitos hallados con mayor frecuencia en personas consumidoras.
462
La etilbenzoilecgonina, comunmente denominada etilcocaína o cocaetileno, es formada en

el hígado por trans-esterificación enzimática de la cocaína en presencia conjunta de etanol
(Hearn et al, 1991, Dean, 1991, Isenschmid, 2004, Moffat et al, 2004).
Recordando la incorporación de drogas al pelo y los consecuentes hallazgos el compuesto
cocaetileno debería ser incorporado y hallado como tal.
Observaciones finales:
1- Si bien hemos considerado todas las ventajas que esta matríz

ofrece, es aconsejable siempre que se pueda, utilizar diversidad de
fluidos y tejidos, con el objeto de ampliar la ventana de detección de
sustancias. En la práctica es óptimo el empleo de muestras de orina y
pelo. Nótese, que con el primer análisis tendremos datos inmediatos,
mientras que el segundo mostrará un dato mediato, es decir, lo
ocurrido días, semanas o meses.
2- En el caso de buscar 6-Monoacetilmorfina, se aconseja utilizar saliva.

Este fluido permite detectar drogas y/o metabolitos cuando la
administración ha sido a corto plazo, es decir, desde minutos a
escasas horas. Su recolección es sencilla y requiere menor cantidad
de muestra.
3- Cuando median estados putrefactivos y solo pernanece el pelo como

evidencia químico legal, como en otros casos de daño severo, debe
tenerse especial cuidado en el paso de lavado (decontaminación).
Aquí se acentúa el riesgo de extraer sustancias desde el interior de la
médula debido al deterioro de la cutícula.
4- Curiosamente éste último concepto, se aplicaría en forma inversa

en los casos de adulteración o depósito pasivo de sustancias en
generosas concentraciones.
463
5- En la práctica es raro observar orinas positivas y pelos negativos.
6-No siempre un resultado positivo sobre el cut-off indicaría

administración activa de la droga. Remitirse a la introducción.
Agradecimientos:
Al Sr. técnico Químico César Agustín Nardo por su invalorable quehacer diario.
Al Dr. Ruben Martín Laguens por su aporte en el Aspecto Anatómico y fisiológico.
A todos los hombres y mujeres ambulatorios provenientes de Tribunales de Familia y

penales que con su consentimiento en la toma de muestra nos permitieron enfrentar
éste trabajo como un verdadero servicio.
A los Señores Magistrados que nos incluyeron en sus equipos multidisciplinarios

para develar consumo de sustancias.
Al Dr. Jorge Folino que alentó al empleo de Matrices Alternativas como aporte a
relevantes casos en psiquiatría forense.
Bibliografía.
Mechanism of drug incorporation into hair. Henderson G.L. Forensic Sci. Int. 84, 87-111.
(1997)
464
Análisis de drogas de uso indebido en pelo. Actas de las Primeras Jornadas de Toxicología
del Interior. Ferrari L.A. y Arado M.G. Colegio de Bioquímicos de Córdoba p.35-39. (2000)
Hair Today. Flanagan, B. Bull. Int. Assoc.For. Toxicologists 29 (4) 9-11 (1999).
What constitutes a positive result in hair analysis? Kintz, P and Mangin, P. Forensic Sci. Int.
70, 3-11. (1995)
Hair analysis. P. Kintz in Clarke’s analysis of drugs and poisons. Moffat, Widdop, Osselton
(Eds) Pharmaceutical Press, (2004).
Drug monitoring in non conventional biological fluids and matrices. Pichini, R et al. Clin.
Pharm. 30 ( 3) 211-228 (1996)
Potential problems with the interpretation of hair analysis results. Wennig, R. Forensic Sci.
Int. 107, 5-12 (2000)
Evaluation of Analytical Methodologies for non-intrusive drug testing: Supercritical fluid

extraction of cocaine from hair, NIJ Report 601-98 (1998)
Advances in Forensic Applications of Mass Spectrometry, CRC Press, International Standard

(2004).
Pharmacokinetics, Metabolism, and Pharmaceutics of Drugs of Abuse NIDA Research

Monograph 173, U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, National
Institutes of Health, (1997).
Capítulo 16
Investigación de Drogas de Abuso y Productos de
Corte.
465
Dr. Luis Alberto Ferrari

Perito I del Cuerpo Químico Forense. Profesor de Química Forense en la Universidad de
Morón.
Esquema Analítico para la identificación de cocaína pura o

adulterada.
Introducción.
El esquema analítico que se utiliza para la identificación de cocaína pura o

adulterada se ajusta a determinar la composición cualitativa de una sustancia que, por su
aspecto, puede ser clorhidrato de cocaína pura o con otros componentes de uso común que
actúan como adulterantes. Este esquema de identificación sufre modificaciones periódicas
para considerar la incorporación de nuevas sustancias utilizadas como adulterantes.
En la actualidad no se registra el agregado de sustitutos atípicos del clorhidrato de

cocaína como anestesina, novocaína, ácido bórico. Se comprueba usualmente la presencia
de xilocaína (Lidocaína). En la práctica, los sustitutos o adulterantes no deben aumentar el
precio del producto destinado al consumo y lo frecuente es que sean mucho más baratos.
Entonces, por razones de competencia y a fin de retener o aumentar un grupo consumidor
estable, se observa una tendencia a reducir el precio del producto reemplazando los
clásicos anestésicos locales por azúcares (glucosa, lactosa) y ocasionalmente, sacarosa, en
proporciones variables.
En nuestro medio los Profesores Guatelli, M y García Fernández, JC han ofrecido un
método de análisis tal como se consigna a continuación.
Ensayos para la determinación de cocaína:
Ensayo de solubilidad.
466
Es importante que en este ensayo se disponga de una muestra homogénea. Con

frecuencia se observa un polvo blanco y fino, con grupo en número y tamaño variable por la
presencia de porciones húmedas. En estos casos debe pulverizarse la muestra, fraccionarla
– si es suficiente – en un mortero común de capacidad adecuada, separando con una
espátula el material que se adhiere al mortero. El producto pulverizado se tamiza para
separar las partículas más gruesas que se reducen a polvo fino nuevamente mediante
mortero. Una vez obtenida la pulverización de toda la muestra, se la ubica en un recipiente
plástico de tapa a rosca y de boca ancha que se agita durante un tiempo según el volumen
de polvo, hasta disponer de un producto homogéneo.
Se realiza una observación a simple vista y con magnificación adecuada como una
lupa común y siempre que el producto sea homogéneo en su aspecto, se obtiene una
fracción adecuada, la cual se coloca en un tubo de ensayo limpio y seco disolviéndola en 1 o
2 ml de agua destilada. Se agita y se observa si la muestra se disuelve total o parcialmente,
pudiéndose agregar un nuevo volumen de agua destilada para certificar la presencia de un
agregado de baja solubilidad o insoluble.
La solubilidad de la cocaína base en agua destilada, según Clarke (1969) es de 1

:1300, mientras que la del clorhidrato de cocaína en agua destilada es de 1:0,5.
Reacción de la solución acuosa.
Del ensayo anterior se toman unas gotas del sobrenadante en un vidrio reloj y se
registra la reacción con papel de pH. Las soluciones de clorhidrato de cocaína pura o en
mezclas con adulterantes neutros son ligeramente ácidas, mientras que el agregado de
bicarbonato de sodio confiere una reacción ligeramente alcalina (pH 8). Los preparados que
contienen sulfato de cocaína, presentan un pH ácido neto, de acuerdo con el grado de
hidrólisis de la sal. La cocaína base en agua destilada presenta un pH entre 8 y 8,5.
Comentarios.
El ensayo de solubilidad y la reacción de la solución acuosa tienen importancia

porque permiten inferir la probable existencia de ciertos compuestos, poco o relativamente
solubles, que resultan de utilidad cuando se tratan de sustancias que se utilizan para
467
purificar la cocaína o agregarse a la misma para su desnaturalización. Por otra parte, la

cocaína salificada puede coexistir con ciertos adulterantes solubles que no inciden en el pH
como azúcares reductores y sacarosa.
El ácido bórico – que aparece asociado en ocasiones a otros adulterantes – es un

ácido débil y si bien el aspecto de los cristales (no del producto amorfo) es coincidente con
el del la cocaína por formar escamas blancas delgadas y de aspecto nacarado, no puede
agregarse más de cierta proporción por su baja solubilidad en frío (4 % a 18 C°) . Además,
sus efectos nocivos limitan su uso como sustituto del clorhidrato de cocaína. En muchos
países el uso de ácido bórico está prohibido incluso como preservador de alimentos.
Reactivo de Draggendorff:
El ensayo se realiza agregando una o dos gotas de reactivo a 1 o 2 ml de la solución a

investigar. En presencia de alcaloides se obtiene un precipitado de color rojo a rojo naranja.
Este reactivo por dilución se altera y precipita aún en ausencia de alcaloides, si la dilución
es mayor se separa triyoduro de bismuto de color negro. Este reactivo produce un
precipitado con otros compuestos de estructura más simple. Para asignarle valor en los
ensayos genéricos deben obtenerse respuestas positivas también con los restantes
reactivos.
Reactivo pícrico:
Es una solución saturada de ácido pícrico. Es el menos sensible de los reactivos que
integran el grupo. Soluciones diluidas de los alcaloides suelen dar respuestas negativas de
tal manera que, mientras los tres restantes dan positivo, la solución pícrica no responde al
ensayo. Tiene aplicación en microcristalografía ya que produce formas típicas con ciertos
alcaloides en soluciones puras o en presencia de sustancias no interferentes.
Identificación del ión cloruro.
La mayoría de los alcaloides se presentan en forma de clorhidrato, solubles en agua

destilada fría. Este anión se identifica mediante el ensayo clásico con nitrato de plata en
medio nítrico.
468
Técnica:
En tubo de ensayo limpio colocar una pequeña cantidad del producto y disolver en 2 o 3 ml
de agua destilada, acidificar con unas gotas de nítrico puro y agregar gota a gota un exceso
de solución de nitrato de plata al 5 %, aparece precipitado blanco, caseoso. Si se quieren
efectuar ensayos complementarios para certificar la naturaleza del precipitado (AgCl),
deberá eliminarse el alcaloide porque de lo contrario interfiere (en caso de comprobar la
solubilidad del AgCl con amoníaco precipita el alcaloide en su forma básica).
En ocasiones se ha observado, al agregar el ácido nítrico, un color azul que cambia

de inmediato al rosado o violeta claro, imputable a la presencia de Dipirona.
Identificación del ión sulfato.
A un pequeño volumen de la solución del alcaloide agregar del alcaloide agregar 2-3 gotas
de ácido clorhídrico puro, calentar a ebullición y agregar gota a gota, un ligero exceso de
solución acuosa de cloruro de bario al 10 %. Aparece precipitado blanco en presencia del
ión sulfato.
Identificación de derivados aril-amínicos.
En esta denominación se incluyen los anestésicoslocales (sustitutos de la cocaína)

con grupo amino libre (Novocaína, Procaína, Benzocaína o Anestesina, etc). La xilocaína o
clorhidrato de Lidocaína no responde al ensayo por tener uno de los hidrógenos sustituidos
(-NH- en lugar de –NH2). El grupo amino libre se halla en posición para con respecto a los
otros sustituyentes del núcleo bencénico. El reactivo es una solución de p-
dimetilaminobenzaldehido 1 % (1 g de PABA en 100 ml de etanol 96°, acidificada con 20
gotas de ácido sulfúrico). El reactivo esestable y se tolera hasta un débil color amarillo. Debe
tomarse en cuenta que el agregado de ácido sulfúrico intensifica el color amarillo del
reactivo de tratarse de droga adulterada. Con todo, el contraste es neto en presencia de un
sustituto con grupo amino libre.
Técnica:
469
En placa de toque colocar unos centigramos de la muestra y agregar una o dos gotas
de reactivo. Aparece de inmediato un color amarillo intenso que adquiere color naranja
según la proporción del susitituto. Como alternativa en lugar del reactivo indicado puede
utilizarse una solución acuosa reciente del ácido 1,2 naftoquinon-4-sulfúrico al 5 % con el
cual se obtiene un color rojo. El reactivo es inestable por lo que debe prepararse en la
cantidad necesaria para el momento de la prueba.
Investigación de azúcares reductores.
El agregado de azúcares reductores es una adulteración frecuente. Se emplean con

preferencia glucosa o lactosa.
Técnica.
En un tubo de ensayo colocar una pequeña fracción de la muestra homógenea y 4 a

5 ml del reactivo de Benedict (17,3 g de sulfato de cobre pentahidratado, 173 g de citrato de
sodio, 100 g de carbonato de sodio anhidro completando a 1 Lt con agua destilada) calentar
a ebullición y mantener esa temperatura unos minutos. Una reacción positiva pone en
evidencia un color verde que de inmediato se transforme en color rojo ladrillo por
precipitación de óxido de cobre (I).
Comentarios.
Durante el calentamiento a ebullición se puede observar la separación de un líquido

oleoso que se proyecta por las paredes del tubo y que vuelve al seno del líquido al
suspender el tratamiento. Si se coloca una cantidad mayor de muestra, por enfriamiento se
separa un producto sólido blanco que generalmente se asienta sobre el reactivo. Dicho
producto es la cocaína separada por la alcalinidad del reactivo y el líquido oleoso que es la
cocaían base en estado líquido (t.f: 97-98 C°). El clorhidrato de cocaína no funde a una
temperatura inferior a 197 C°.
En la adulteración de la cocaína con azúcares reductores se realiza la identificación

con espectrofotometría infrarroja.
470
Investigación de ázucar común.
Se trata de un adulterante ocasional. El ázucar común cristalizado se observa a

simple vista, finalmente pulverizado se adapta mejor como adulterante. Como la sacarosa
no es reductora, se procede a una hidrólisis previa, para los ensayos del poder reductor de
los ázucares resultantes.
Técnica:
En un tubo de ensayo limpio colocar una fracción de la muestra junto con 5 ml de

ácido sulfúrico al 5 %, calentar suavemente a ebullición utilizando un broche de madera y
concentrar el líquido ácido hasta aproximadamente la mitad, dejar enfriar y agregar en
pequeñas fracciones carbonato de sodio en polvo hasta obtener un precipitado blanco por
precipitación o separación de cocaína base no degradada (de reacción alcalina) e incorporar
el reactivo de Benedict, procediendo como en la técnica para identificar azúcares
reductores.
Comentarios:
La investigación de azúcar común se ha realizado en muy contadas ocasiones,

otorgándose preferencias a las hexosas (glucosa o lactosa) en la adulteración de cocaína
con azucares que aparecen en nuestro medio.
Investigación de ácido bórico.
El ácido bórico cristalizado forma escamas incoloras de brillo perlado, solubles en

agua en una proporción del 4% a 15 – 18 C°. La solucipon acuosa presenta reacción
levemente ácida. El ácido bórico cristalino se usa en la adulteración del clorhidrato de
cocaína puro, cristalino, pero cuando el producto fraccionado se ofrece en forma
pulverulenta, se adultera con ácido bórico amorfo. Existen varios procedimientos descriptos
para la determinación de ácido bórico. Un procedimiento práctico y simple se basa en la
formación del éster metil bórico.
471
Técnica:
En una cápsula de porcelana de 5 a 6 cm de diámetro, escrupulosamente limpia y

seca, colocar una fracción de la muestra y alrededor de 10-15 ml de alcohol metílico p.a
ligeramente con ácido sulfúrico. Colocar la cápsula en un ambiente oscuro e inflamarla. De
inmediato se observa un color verde por fromación del borato de metilo que generalmente,
prevalece sobre el color azul de la llama producida por la combustión del metanol. No se
han registrado interferencias en este ensayo. Pequeñas cantidades de ácido bórico originan
un color nítidamente perceptible en la oscuridad.
Ensayos de identificación para cocaína.
Se dispone de varios procedimientos para la identificación de cocaína. Se cuenta con el

ensayo de color en fase orgánica, ensayo de olor por formación de benzoato de metilo y
cromatografía en capa delgada (TLC).
Ensayo de color:
El ensayo de Scott aprovecha la formación de un complejo de color azulado con el tiocianato

de cobalto. Son interferencias la xilocaína, butacaína, fenciclidina y metapireno. Si se agrega
a la reacción anterior gotas de HCl concentrado y luego cloroformo, la fase orgánica
adquirirá un intenso color azul, no reaccionando los interferentes. El mecanismo de la
reacción es desconocido.
Ensayo de olor:
Se basa en la hidrólisis de la cocaína por tratamiento con hidróxido de potasio en medio

metanólico. Aprovecha la formación de benzoato de metilo de un olor característico
detectable a concentraciones bajas. Tiene una sensibilidad y especificidad muy superiores a
muchos de los ensayos indicados para cocaína.
Cromatografía:
472
La TLC es una técnica analítica ampliamente utilizada en cualquier laboratorio de

toxicología analítica. A través del tiempo se ha optimizado su utilización, destacándose su
bajo costo, rapidez y confiabilidad.
Se han propuesto diversos solventes para el desarrollo. Se ha propuesto un sistema

que resuelve bien la lidocaína. En los sistemas tradicionales esta no se separa
convenientemente y además, debido a la falta de reactividad de los anestésicos
arilamínicos, puede interpretarse erróneamente las manchas que se puedan visualizar.
El solvente de corrida consiste en una mezcla de cloroformo: acetona: amoníaco

40:60:III. Como revelador se utiliza una solución de iodoplatinato de potasio (45 ml de ioduro
de potasio al 5%, 5 ml de cloruro de platino5 % y 100 ml de agua destilada).
La Comisión de Expertos de las Naciones Unidas ha establecido que el criterio de

identidad para las drogas de abuso es la elección mínima de dos parámetros analíticos
independientes y dice textualmente: “En cualquier caso concreto, al seleccionar estos dos
parámetros deberá tenerse en cuenta la droga en cuestión y los recursos de laboratorio de
que disponga el analista. Por ejemplo dos sistemas no correlacionados de TLC se contarían
como dos parámetros. En este contexto, dos sistemas no correlacionados de TLC significan
que los sistemas de solventes o la fase estacionaria son completamente distintas”.
La cromatografía gaseosa y la HPLC también son técnicas que se adaptan bien al

análisis de una muestra de cocaína.
Aislamiento, purificación e identificación de cocaína proveniente de materiales

biológicos (sangre, orina, vísceras y saliva).
El aislamiento de cocaína a partir de tejidos humanos pueden efectuarse mediante

los métodos tradicionales basados en la desecación con sulfato de sodio anhidro de las
vísceras previamente desmenuzadas y posterior extracción etérea y clorofórmica;
precipitación preoteica con sulfato de amonio, etc. Debe tenerse especial cuidado con la
temperatura (mayores a 45 C°) ya que la cocaína es termolábil.
473
Actualmente, estos métodos de aislamiento están siendo reemplazados por la

extracción en fase sólida (SPE), que consiste en la retención del analito de interés en un
relleno basado en partículas de sílica modificada dentro de una columna plástica. Son muy
utilizadas las de C-2, C-4, C-8, C-18 o mezclas de rellenos no polares, medianamente
polares o polares. La ventaja en el uso de esta metodología radica en los altos porcentajes
de recuperación, obtención de eluatos puros, disminución del tiempo de trabajo y ahorro de
reactivos. En capítulos anteriores se esbozó el tema con mayor detalle.
Investigación en bebidas analcohólicas:
Técnica:
En cápsula de porcelana colocar 50 a 100 ml de la bebida en estudio, calentar a baño María

con agitación periódica para eliminar el CO2, enfriar y trasvasar a una ampolla de
decantación controlando la reacción que debe ser ácida (incorporar HCl si fuera necesario).
A continuación, extraer con cloroformo (20 ml) agitando enérgicamente unos minutos, dejar
separar las fases, decantar y proseguir con la fase acuosa ácida. Tratar dicha fase con
cantidad suficiente de NH3 puro hasta reacción alcalina y luego extraer la cocaína base con
15 ml de cloroformo. Dejar separar las fases, filtrar la fase clorofórmica por sulfato se sodio
anhidro y concentrar a menos de 45 C°. Utilizar este extracto redisuelto en cloroformo para
su análisis cromatográfico o en HCl al 1 % para reacciones de precipitación.
Estudios en sangre y orina:
La sangre, orina y saliva pueden ser procesadas por los métodos SPE de fase unida
o bien columnas con rellenos hidrofílicos del tipo Extrelut (Merck). La técnica es sumamente
sencilla y los resultados satisfactorios.
En el caso de orina existen en la actualidad placas o tiras reactivas comerciales
basadas en métodos inmunológicos y que no requieren del aislamiento del analito.
Este método es rápido, requiere de poco muestra y posee muy buena sensibilidad. Sin
embargo está sujeto a reacciones cruzadas y los resultados positivos deben ser confirmados
mediante un método analítico instrumental de óptima sensibilidad para detectar niveles
bajos de la droga madre y sus metabolitos.
474
Algunos estudios que se han efectuado en humanos indican que si una muestra de
orina es recolectada luego de un lapso superior a 12 hs desde el momento de consumo,
muy poca cantidad o nada de cocaína será detectada. Es decir, si la cocaína es detectada
en orina, se admite que su administración se produjo hasta 12 hs antes de la recolección de
la muestra.
Este período se toma sólo como referencia ya que depende de numerosos factores,
muchos de ellos individuales. La benzoilecgonina – principal metabolito – puede ser
detectada hasta 36 hs después de la administración de cocaína y permanece en
concentraciones muy bajas hasta las 60 hs. En orina, se puede encontrar entre el 1-9 %
como cocaína sin metabolizar y entre 35 al 54 % como benzoilecgonina.
En cuanto a la sangre, se debe considerar la acción de enzimas sobre la cocaína

que la degradan y la ventana corta de detección de solo algunas horas en muchos casos. La
preservación de la muestra es importante ya que se ha informado que cocaína intacta en
muestras hemáticas deficientemente resguardadas pueden transformarse in situ en
compuestos como los producidos por biotransformación endógena, tal como
ecgoninametilester o benzoilecgonina.
La preservación de la muestra a baja temperatura, pH 5 y agregado de 2% de fluoruro de
sodio estabiliza la cocaína en sangre pudiendo permanecer hasta 200 días sin
transformación química dentro del reservorio (Insenschmid, 2004).
Cromatografía gaseosa (GC-FID)

(Técnica utilizada para el entrenamiento de Naciones Unidas, 1989)
Técnica.
Columna 2m, d.i. 2 –4 mm, SE – 30, OV –17.

Gas portador nitrógeno 30 ml / minuto.
Detector FID (detector de ionización por llama)
Hidrógeno a 30 ml/min, aire 450 ml/min.
Condiciones de trabajo
475
Temperatura del inyector: 220 C°.

Temperatura del horno: 220 C°.
Temperatura del detector: 300 C°.
Patrón interno: n- tetracosano o tetrafeniletileno.

Agente derivatizante: N-O bis- trimetilsililacetamida o N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida
(MSTFA).
Cromatografía líquida de alta presión (HPLC):
Técnica.
Columna: 160 mm, d-i: 5 mm.

Material de relleno: Octadecil-Si, diámetro de partícula 5 µm.
Fase móvil
Eluyente A: Metanol (300 ml), agua (700ml), 1 % ácido fosfórico (v/v), n-hexilamina (10,71 g/
14 ml pH 2,5).
Eluyente B: Metanol (1000ml), 1 % ácido fosfórico (v/v) n-hexilamina (10,71 g/ 14 ml pH 2,8).
Detector UV 230 nm.
Cannabis y sus componentes.
Análisis físico de los productos de Cannabis.
Los características microscópicas de Cannabis sp., permiten reconocer por técnicas

micrográficas el material que puede estar finamente particulado o en grandes trozos. Los
abundantes tricomas presentes en los distintos componentes de la planta (hoka,
subunidades floridas y frutos) son los elementos histológicos más importantes para distinguir
la Cannabis sativa. Se reconocen también pelos cistolíticos unicelulares y tricomas o pelos
glandulares. Los pelos glandulares pueden observarse como glándulas sésiles, pequeños
tricomas glandulares pluricelulares (con pie y cabezuela).
476
Ensayos presuntivos.
Se trata de reacciones presuntivas adecuadas para realizarse en terreno, de manera de

poder descartar “a priori” el estar en presencia de material proveniente de Cannabis.
Reacción con Fast Blue:
La reacción se fundamenta en la reacción de copulación de los canabinoides con

Fast Blue B formando un compuesto de color púrpura intenso. Se utilizan dos papeles de
filtro de manera de retener en el primero compuestos fenólicos que se encuentran en
Cannabis y que interfieren con la reacción produciendo falsos positivos.
Con dos papeles de filtro se forma un embudo realizando cuatro dobleces en forma
adecuada. Se coloca una pequeña cantidad pulverizada de la planta o resina en el centro
del papel. Se añaden dos gotas de éter de petróleo de modo que penetren en el papel de
filtro inferior, dejando secar el papel de filtro inferior. Se deposita una pequeña cantidad de
Fast Blue B sólido en el centro del papel inferior. Se añaden dos gotas de agua al reactivo y
se extiende la mezcla sobre el papel con papel con una espátula.
Si aparece un color púrpura, se está en presencia de canabinoides. Se recomienda

no usar el reactivo en exceso para evitar el amarronamiento de la mancha.
Ensayo de Duquenois-Levine:
La prueba puede realizarse sobre material pulverizado o sobre su extracto. Este se

obtiene de la siguiente forma: 100 mg de muestra se extraen con éter de petróleo. Filtrar y
evaporar en cápsula hasta sequedad.
Se coloca una pequeña cantidad del material sospechoso o su extracto. Se agregan

2 ml del reactivo preparado con acetaldehido y vainillina en etanol al 95 % agitando 1
minuto. Se añaden luego 2 ml de HCl concetrado por los bordes del tubo, dejando en reposo
durante 10 minutos. En presencia de canabinoides aparece en la interfase una gama de
colores: verde, azul y violeta. Puede extraerse en fase clorofórmica observándose color
violeta.
477
Cromatografía en capa delgada.
Tiene por objeto poner de manifiesto los componentes canabinoides más

importantes: CBD, THC y CBN. La siembra se hace a partir de un extracto obtenido con el
contacto de una hora del material con acetato de etilo que luego se concentra por
calentamiento en baño maría.
Como fase estacionaria se utiliza Sílica Gel G con indicador de fluorescencia a 254
nm. Respecto a la fase móvil se han propuesto muchas mezclas de las cuales dos que
ofrecen resultados satisfactorios son éter de petróleo: éter etílico 80:20 y benceno: n-
hexano: dietilamina (75:30:5). Como fase móvil se utilizará una mezcla acetato de etilo:
metanol: amoníaco 90:10:II. El agente revelador es Fast Blue B en agua destilada al 1 % y
posterior exposición a vapores de amoníaco. Este revelador tiene un límite de detección de
aproximadamente 0,5 µg.
Detección de productos canábicos en sangre.
Algunos investigadores han informado la dificultad de obtener muestras de sangre de

sujetos fumadores ya que los mismos evitan ser identificados. En los casos en que esto es
posible se procede de la siguiente manera:
Técnica:
A 5,0 ml de sangre total se adiciona 1,0 ml de ácido tricloroacético al 10 % luego se agrega

10 ml de n-hexano y después de agitación durante varios minutos se calienta a reflujo
durante 30 minutos.
Dejar enfriar, centrifugar, separar y reservar la capa orgánica. Con el resto se realiza una
segunda extracción utilizando el mismo volumen de solvente. Las dos fracciones orgánicas
reunidas se lavan con 10 ml de solución acuosa saturada de NaCl, se secan con sulfato de
sodio anhidro, se concentran a presión reducida hasta obtener un volumen aproximado de
0,5 ml.
478
La concentración debe realizarse a temperatura ambiente para reducir la pérdida de

compuestos volátiles. Sobre el extracto final se efectuan ensayos cromatográficos en capa
delgada o CGL.
Cromatografía gaseosa (CG-FID).
Es utilizada fundamentalmente con fines cuantitativos. Las condiciones de trabajo pueden

resumirse a continuación:
Detector FID (ionización de llama) H2: 30 ml/min, aire 300 – 450 ml/min
Columna 2 m, d.i. (2 – 4) m
Relleno 3 % OV – 17, SE – 30, OV –1
Gas portador N2 a 30 ml/min.
Condiciones de trabajo:
Temperatura inyector: 270 C°

Temp. Horno: isotérmica 240 – 260 C°
Patrón interno: n-tetradecano, tetracosano.
Canabinoides en saliva
Hasta hoy no se ha encontrado una correlación entre la concentración plasmática de THC

en sangre y saliva. Pese a ello, se han observado niveles similares o superiores de THC en
saliva respecto al plasma de individuos fumadores de marihuana. Se sugiere que las
concentraciones de THC informadas en saliva provienen de un alojamiento o secuestro de la
misma en la cavidad bucal durante el fumado.
El resultado positivo en este fluido permite detectar la droga psicoactiva por un

tiempo más prolongado que en sangre. Si bien no se tiene gran información acerca de los
metabolitos de canabinoides en saliva, se estima que el derivado carboxilado puede provenir
del mismo acto de fumado o bien del metabolismo bucal. Por otra parte, se ha observado
479
que la ingestión de alimentos y bebidas comunes no interfieren en la detección de

canabinoides en saliva.
Canabinoides en orina.
Es el medio que permite detectar estos compuestos por un tiempo más prolongado
(5 a 20 dias) dependiendo de la dosis y frecuencia de uso. Como resultado de la
biotransformación operada en el hígado, el THC es convertido, a través de varios
intermediarios, en 11-nor- 9- δ-THC carboxílico en orina.
Actualmente se utilizan tiras reactivas o placas comerciales basadas en técnica

inmunológica. El resultado positivo debe ser confirmado mediante un método analítico
independiente. Debe tenerse en cuenta que los valores de corte para estas estructuras se
hallan en el orden de los nanogramos, por lo que se deben extremar los cuidados en la fase
de aislamiento cuando se debe confirmar el resultado obtenido por la vía del ensayo
preliminar.
Técnica:
Colocar 5,0 ml de orina en tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 0,5 ml de solución

de HONa 1 N. Incubar en baño de agua a 50 – 60 C° durante 15 minutos. Enfriar y acidificar
con HCl 1N. Agregar 5 ml de n-hexano agitando suavemente durante 20 minutos.
Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. Transferir la fase orgánica con la ayuda de una
pipeta Pasteur a otro tubo y evaporar a temperatura ambiente mediante corriente de aire
seco.
Resuspender el residuo con 3-4 gotas de una mezcla de cloroformo-metanol (3:1) y

sembrar en placas cromatográficas de alta resolución (HPTLC) conjuntamente con los
respectivos patrones. Desarrollar con el sistema n-heptano:n-butanol: ácido acético glacial
90:9:1 en una cuba saturada durante 15 minutos. O bien Eel sistema Eter Etílico: eter de
petroleo (2:8) Secar la placa a temperatura ambiente y revelar rociando con dietilamina
seguido del reactivo Fast Blue BB al 0,1 % en agua-metanol (9:1). Esperar 10 minutos,
observar y rociar nuevamente con dietilamina.
480
GHB (Gamma hidroxi butirato)
Es un eficaz agente depresor del sistema nervioso central e hipnótico, no obstante su baja
potencia. A pesar de su escasa aplicación en terapeútica, se lo está utilizando en la
actualidad como droga objeto de uso indebido.
Como droga de abuso es asequible en forma sólida o líquida. A principio de 2000 la
comunidad científica comenzó a prestar atención en esta droga, que se ha popularizado
rápidamente, principalmente en Europa y Estados Unidos.
Hasta hoy en nuestro país su consumo ha sido escaso.
El GHB es usado por fìsico-culturistas como alternativa a los esteroides anabólicos con el
objeto de aumentar la masa muscular. Otros lo utilizan en circunstancias recreacionales por
los comprobados efectos de euforia, deshinibición y sedación.
El mecanismo de acción no ha sido dilucidado completamente hasta hoy, si embargo se
sabe que atraviesa rápidamente la barrera hematoencefálica. Algunos investigadores se
encuentran estudiando en la actualidad su posible acción neurotransmisora y/o
neuromoduladora. Se acepta que altera la actividad dopaminérgica, dependiendo de la dosis
incorporada.
La toxicidad del GHB se caracteriza por nauseas, vómitos, sudoración profusa,
incontinencia, disturbios visuales, ataxia, bradicardia, hipotensión; respondiendo así a los
clásicos efectos colinérgicos. La depresión respiratoria puede ser severa al igual que el
grado de inconciencia; esto dependera de la respuesta particular del individuo.
Las respuestas deletereas varían según la susceptibilidad del individuo. Hay quienes con
dosis de 10 mg/Kg presentan amnesia e hipotonía; otros requieren mayores dosis. En
general la euforia se adquiere con dosis aproximadas a los 25 mg/Kg. Se ha informado que
la incorporación de 60 mg/Kg o más ha provocado coma e inconciencia permanente que
aparece a los 30-40 minutos de incorporada la droga.
481
Los efectos del GHB aparecen en general a los 10 minutos y el pico máximo en plasma
aparaece entre 20-45 minutos. Los efectos duran entre 2-5 horas aunque dependen de la
dosis. Incorporación de concentraciones altas pueden llevar el efecto a 6 horas de duración.
Generalmente provocan tolerancia con el uso consuetudinario.
Eliminación de GHB
Luego de una dosis intravenosa el GHB sigue una eliminación de orden “0, por lo que no
tiene en realidad una vida media y por tanto el tiempo requerido para eliminar la mitad de
una dosis se incrementa con la dosis consumida.
Generalmente se eleimina rápidamente, haciendose indetectable en plasma a las 8 horas y
en orina a las 12 horas (Hoes et al, 1980).
A continuación pueden observarse los resultados hallados por Kintz, 2005. Aquí notamos
que el autor detecta hasta las 6 horas GHB en sangre, mientras que en orina encuentra
valores considerables hasta las tres horas y prácticamente indetectable a partir de las 6
horas.
Excreción de GHB en sangre (Kintz, 2005)

mg/l
mg/l
160
160
140
140
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
00
min
min 20
20 30
30 40
40 60
60 90
90 140
140 180
180 210
210 240
240 270
270 300
300
Excreción de GHB en orina (Kintz, 2005)
482
mg/l
mg/l
10000
10000 mg/l
400
8000 350
8000
300
250
6000
6000 200
150
4000
4000 100
50
2000
2000 0
5 6 7 8 9
00
hours
hours 11 22 33 44 55 66 77 88 99
Analítica toxicológica
El GHB es una molécula polar de muy difícil aislamiento desde los tejidos o humores.
Algunos autores prefieren extraerla como butirolactona (GBL) ajustando el pH y
posteriormente derivatizándola para el análisis mediante GC-FID o GC-MS.
El método que exponemos a continuación no requiere la conversión a GBL y se derivatiza
químicamente por sililación.
Extracción de GHB en orina mediante técnica SPE (Telepchak et al, 2004)
1. Se toman 200 µl de orina, agregando el estándar interno (GHB-d6) y 100 µl de buffer

fosfato 0.1 M; pH 6.0. Mezclar y aplicar en Vortex.
2. Utilizar columna SPE con sorbente CLEAN SCREEN ZSGHB020, conteniendo 200
mg de partículas de sílica de fase unida.
3. A continuación se aplica 3 ml de metanol p.a, seguido de 3 ml de agua deionizada y
o.5 ml de buffer fosfato.
4. Introducir la muestra en el cartucho plástico del sorbente y comenzar la aspiración
bajo el sistema de cámara de presión. Tomar la muestra filtrada en tubos adecuados
dentro de la cámara.
5. Lavar la columna con una mezcla de metanol-amoníaco(99:1)
6. Evaporar a 60°C o con corriente de nitrógeno.
7. Agregar 200µl de dimetilformamida y 1 ml de hexano saturado con dimetilformamida,
mezclar por inversión durante 5 min. Centrifugar a 3000 rpm
483
Transferir la capa inferior de dimetilformamida a un tubo limpio.

8. Evaporar a 50°C utilizando corriente de aire o nitrógeno.
9. Agregar 100µl de acetato de etilo + 100µl de BSTFA (con 1% TMCS). Mezclar o
agitar en vortex. No se requiere calor.
10. Inyectar 1-2 µl de muestra en el instrumental GC.
Iones monitoreados GHB-diTMS 233, 234, 235

GHB-D6-diTMS: 239, 240, 241
Couper & Marinetti, 2002, consignan otras metodologías mediante cromatografía líquida de
alta presión (HPLC), además de otras técnicas en cromatografía gaseosa.
Interpretación de resultados:
Debe tenerse gran precaución en la interpretación de los hallazgos de laboratorio, ya que

este es producido en forma endógena postmortem; más aún si existió sobrevida luego de la
ingesta de GHB que pueden arrojar concentraciones similares a las producidas luego del
óbito. En este caso la diversidad de matrices biológicas recolectadas puede ayudar a la
interpretación (por ejemplo: humor vítreo, líquido cefalorraquideo y orina).
Datos aportados por investigadores sobre niveles de GHB en organos o humores de
individuos no expuestos a GHB pueden facilitar la interpretación (ejemplo: en humor vítreo
se ha informado niveles de 1-6 mg/L en ocho casos postmortem).
Por último hacemos hincapié en la preservación del espcimen a temperaturas menores a
los 0ºC y el envío urgente del material al laboratorio en caso de sospecha de consumo de
GHB.
DETERMINACIÓN DE ANFETAMINAS Y DERIVADOS ANFETAMINICOS DE ANILLO

SUSTITUÍDO
484
En nuestro medio los compuestos anfetamínicos no constituyen las drogas de abuso de

mayor consumo. Sin embargo se ha informado un incremento de volumenes incautados a
partir de los años 90.
Dentro de los diversos compuestos de la familia, los derivados anfetamínicos de anillo sustituído
son los que más se utilizan, por ejemplo el éxtasis (metilendioximetanfetamina).
Dada la entrada en vigencia de la ley de desfederalización de drogas hacia fines de 2005, es
presumible que los laboratorios o gabinetes policiales y/o judiciales de las provincias que adhirieron
a la ley se vean exigidos a imponer una metodología de rastreo para este tipo de sustancias.
La siguiente técnica ha sido ensayada con éxito por los autores.
Cromatografía en placa delgada (TLC)
Muestras: sangre, orina y tejidos

Método de aislamiento: Extracción en fase sólida (SPE) con sílica de fase unida C-18 o
copoliméricas mix o extracción con columnas rellenas de tipo Extrelut.
Fase estacionaria: Silicagel G con indicador de fluorescencia F 254.
Fase Móvil: Acetato de etilo-metanol-amoníaco (85:10:5)
Estándares: de diversos anfetamínicos en concentraciones de 5 ug/uL
Revelado: Secuencial del siguiente modo:
a) Fast Black K ( 10 mg/100ml, disuelto en agua destilada)
b) Solución de ácido clorhídrico al 30%(v/v).
c) Iodoplatinato de potasio acidificado
Asperjar con la solución a) observando la coloración de las máculas. Luego calientese la placa en
estufa a 80°C unos 5 minutos. A continuación se asperja con solución de HCl al 30%. Observar el
cambio de coloración y/o desaparición de la mácula.Colocar la placa en estufa o plancha
calefactora a 80°C por 5 minutos. Finalmente se rocía con solución de Iodoplatinato de potasio,
observando la coloración de las máculas.
El resultado se resume en la siguiente tabla:
Droga de abuso Rf Fast Black K HCl 30% Iodoplat.de potasio

Anfetamina 0.52 Rojo Naranja Rojizo s/fondo azul
Metanfetamina 0.46 Naranja Desaparece color Gris s/ fondo azul
Mescalina 0.30 Rojo Naranja Gris azulado
Metilfenidato 0.77 Naranja Desaparece color Gris
485
MDMA (éxtasis) 0.40 Púrpura Atenuado Gris

Fenmetracina 0.55 Naranja Desaparece color Sin color
Bibliografía.
Ferrari, Luis A, Informe sobre Identificación y análisis de drogas de uso indebido, División
Narcóticos, Naciones Unidas, pp. 10-354, 1989.
Forensic and clinical applications of solid phase extraction. M.Telepchak, T.F.August and G
Chaney (Eds.) Humana press, pp.91-97, 2004.
Kintz, P. Testing for a nightmare or GHB. Proceedings First Southamerican Regional TIAFT
meeting. La Plata, Argentina, 2005.
Spinelli E., Silva O. A., Rev. Brasileira de Toxicología 8 (2), 21-28, 1995.
Clarke’s analysis of drugs and poisons. Widdop, Moffat, Osselton Eds. The Pharmaceutical
Press, 2004.
Scheurer, C. et al, SPE of Drugs from biological tissues. A Review. J. Anal. Toxicology,
1993.
Cardona P.S, Chaturvedi A.K, Soper J.W and Canfield, D.V Simultaneous analyses of
cocaine, cocaethylene and their possible metabolic and pyrolytic products. Forensic Sci. Int.
157 (1) 46-56, 2006
Kuzmack, J. The use of copolimeric phases to enhance recovery and selectivity in SPE.
World Wide Monitoring, 1998.
SPE Choosing the best sorbents. The separation Times. Vol. 3 N° 3, 1987.
486
Extrelut, Nuevo procedimiento para la extracción de sustancias lipófilas. Diagnóstica

Merck.1992
Couper, F.J & Marinetti, L.J. Gamma Hydroxybutirate- Effects on human performance and
behaviour. Forensic Sci. Rev. 14, 101-119, 2002
Th
Baselt, R. Disposition of toxic drugs and chemicals in man. 6 . Ed. Biomed. Publish, Foster
City, 2002.
Capítulo 17
487
Espectrofotometría de Absorción Atómica en

Toxicología.
Autor: Lic. Carlos H. Colangelo.

Perito del Laboratorio de Toxicología y Qca. Legal de la Asesoría de Tribunales dependiente
del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción.
En este capitulo se comentará la aplicación de la espectrofotometría de absorción

atómica más importantes en el área de la Toxicología Forense, Ambiental, Clínica y Laboral
que pertenecen al espectro de experiencia adquirida en la actividad profesional.
No se entrara en la descripción de los principios de la técnica instrumental, sobre la

cual hay innumerables referencias bibliográficas (1) (2) (3) (4). Básicamente este método
consiste en la medición de las especies atómicas por su absorción a una longitud de onda
particular. La especie atómica se logra por atomización de la muestra, siendo los distintos
procedimientos utilizados para llegar al estado fundamental del átomo lo que diferencia las
técnicas y accesorios utilizados.
La Absorción Atómica es capaz de detectar y determinar cuantitativamente la mayoría

de los elementos del Sistema Periódico. Sus campos de aplicación son, por tanto, muy
diversos. Se emplea en: Área Medioambiental, Geoquímica, Toxicología, Metalurgia,
Alimentos, Análisis Clínicos, etc.
Ideal para varios campos:
Medio ambiente: Agua del mar, río y corriente, residual. Suelos. Sedimentos.
Metales, semiconductores, cerámicos: Metales, mineral, vidrio y cerámicos,
488
Petróleo, Compuestos químicos, Polímeros:- Petróleo, óleo, catalizador, productos

sintéticos, alimentos.
Médico, Biológico, Farmacéutico: Sangre, organismos biológicos, plantas,
medicamentos
Industria alimenticia, Industria petroquímica, etc.
En la figura 17.1 se puede observar un equipo de los tantos que existen en el mercado
de espectrofotometría de absorción atómica:
Figura Nº 17.1
Los componentes de estos equipos , que varían según los modelos , entre los que
podemos mencionar :
• Llama ( aire/acetileno y nitroso/acetileno )

• Horno de Grafito
• Generador de Hidruros / Vapor Frío para la determinación de mercurio
con los cuales se pueden realizar la gran versatilidad de análisis que esta técnica permite.
489
Figura Nº 17.2 Figura Nº 17.3
En todas estas técnicas de Absorción .Atómica se produce la absorción de energía de

longitud de onda adecuada y una cuantificación similar por el sistema óptico y electrónico del
espectrofómetro al que se encuentra adosado el accesorio correspondiente, o sea nebulizador /
quemador en llama, horno de grafito ó generador de hidruros / vapor frío. Todas las
metodologías citadas son muy versátiles y contando con variedad de lámparas, permite
abordar los diferentes campos analíticos. La Espectrofotometría de Absorción Atómica es una
técnica muy versátil, ya que es capaz de analizar cualquier muestra que se encuentre en
disolución o que mediante un método u otro sea factible de disolverse
Técnica con llama:
La técnica de atomización más usada es con llama, que nebuliza la muestra y luego la
disemina en forma de aerosol dentro de una llama de aire acetileno u óxido nitroso-acetileno,
donde la selección de esta dependerá de la naturaleza del analito a determinar .Además por su
carácter de utilizar la muestra que debe nebulizarse nos esta hablando que la misma debe
encontrarse en solución.
Respecto de las llamas debe recordarse que es importante el orden de la utilización de
los gases intervinientes en cada par de aquellos para evitar explosiones
Horno de grafito :
Otra técnica de atomización es la electrotérmica, que utiliza el horno de grafito como

accesorio. El método consiste en colocar la muestra diluida dentro de un tubo de grafito, que
luego es calentado con una resistencia eléctrica pasando por distintos intervalos de
temperatura para secar, calcinar y finalmente atomizar la muestra en el rango 2200 -2700 ºC.
490
Al trabajar con niveles de detección en el orden de las ppb (partes por billón ) (ug/l) es
imprescindible una escrupulosa decontaminación del todo el material empleado y un extremo
cuidado de la pulcritud analítica en todos los aspectos del proceso analítico.
Esta modalidad de trabajo es mas sensible de de las espectrográficas, con limites de

detección de 10 a 100 veces mejores que los obtenidos con llama o la espectroscopia de
emisión de plasma (ICP- AES). Las limitaciones de esta técnica lo es en las interferencias en el
análisis de muestras biológicas , las cuales pueden evitarse o por lo menos corregirse usando
corrector de fondo de deuterio o Zeeman. También ha de recurrirse al uso de modificadores de
matriz que trasforman un compuesto en otro mas volátil que puede eliminarse antes de la
atomización.
No obstante todo lo mencionado , la principal desventaja de esta técnica es que se

trata de una metodología lenta , dado que requiere de varios minutos para efectuar un análisis.
Generación de Hidruros . Vapor Frio de mercurio:
Una tercer metodología denominada generación de hidruros aprovecha la cualidad de

algunos elementos tales como arsénico, plomo, antimonio, selenio ,bismuto y teluro, de formar
hidruros volátiles bajo un ambiente reductor, los que una vez generados en condiciones
especiales son trasladados por un gas portador a una celda de cuarzo la que es calentada a
una temperatura optimizada para producir la atomización del analito a dosar. Una variante la
constituye la técnica de vapor frío, que aprovecha la facultad del mercurio de emitir vapores
monoatómicos a temperatura ambiente (Figura 17.2 – Generador Hidruros / Figura 17.3 - Vapor
Frío ).
Digestión de las muestras :
Las muestras sólidas , semisólidas o con gran cantidad de material en suspensión y

que deban analizarse sin la separación de las fases, requieren tratamiento ácido en
condiciones que aseguren : que los analitos fácilmente volátiles no se pierdan y que la
recuperación sea buena . Muchas de las técnicas tradicionales exigen digestiones por el
espacio de muchas horas o incluso días de trabajo. La aplicación de los digestores de
491
microondas aseguran el resguardo de las condiciones mencionadas anteriormente con

menores tiempos de trabajo , permitiendo según el modelo trabajar hasta con 12 muestras
simultáneamente . En la figura 17.4 se observa un equipo comercial digestor de microondas .
Figura Nº 17.4
Aplicaciones Generales al campo de la Toxicología Forense,

Ambiental, Clinica y Laboral.
492
De describen algunas de las innumerables aplicaciones de la técnica espectrofotometría

de absorción atómica al campo de la Toxicología, dividiéndola en Forense, Ambiental, Clínica
y Laboral (7) para un desarrollo más ordenado.
Toxicología Forense.
Debe considerarse en primer termino las condiciones de la toma de muestras , en

cuanto a los recipientes de recolección que deben estar perfectamente limpios con mezcla
sulfo - crómica y agua destilada. Los tapones de goma deben evitarse particularmente si se
determina zinc o cobre, por el aporte que los mismos pueden contribuir a la muestra. Asimismo
deben remitirse sin ningún tipo de agregados, siendo particularmente importante la
conservación en frio , útil para el resguardo de la muestra para ulteriores determinaciones como
lo requiere el screening toxicológico de rutina.
Otra aspecto importante a tener en cuenta es la viscosidad y tensión superficial de las

muestras biológicas liquidas a analizar. El caso de la orina es una matriz sencilla y con
propiedades como las mencionadas anteriormente muy similares a la del agua, por lo que
puede analizarse directamente.
Para el caso de suero y dependiendo de los elementos a analizar una simple dilución
podría ser suficiente , pero en cantidades trazas puede recurrirse a métodos tales como :
a- Extracción con complejos orgánicos (pirrolidin ditio carbamato de amonio) y

posterior extracción con solventes orgánicos (metilisobutilcetona, heptanodiona,etc
) previo ajuste del pH , de igual manera deben tratarse los estándares para su
posterior lectura en el equipo. En este caso debe tenerse en cuenta que debe
ajustarse el acetileno disminuyendo el suministro del mismo en la llama por la
contribución del solvente orgánico como combustible.
b- Eliminación de proteínas con ácido tricloroacetico,
Si la muestra esta constituida por tejidos , restos de órganos , la misma requiere de la

destrucción de la materia orgánica por medio del clásico método sulfo- nítrico - perclórico ,
493
entendiendo el peligro que representa el trabajar con este ultimo con una matriz de la
naturaleza mencionada anteriormente. A los fines cuantitativos debe sumarse la pesada de la
muestra.
Se determinan rutinariamente talio, arsénico , mercurio urinarios, otras matrices y otros

diversos elementos que pueden hallarse en sustancias de fácil alcance doméstico y pueden
eventualmente producir accidentes o ser utilizados por un usuario con fines suicidas o
criminales, por ejemplo raticidas, curasemillas, hormiguicidas, fungicidas, etc.
Muchos de los elementos metálicos se encuentran en concentraciones muy bajas en

los organismos vivientes, a modo de oligoelementos fundamentales para el desarrollo de la
vida. Muchos de estos en concentraciones superiores a las requeridas por lo mencionado
anteriormente son tóxicos. Por supuesto que la metodología a emplear dependerá de las
concentraciones y del tipo de intoxicación acaecida , aguda o crónica .
El arsénico es uno de los venenos inorgánicos más conocidos desde la antigüedad y

uno de los mejores estudiados. Su utilización esta referenciada a diferentes fines : criminales
o suicidas . También puede darse el caso de intoxicaciones alimentarías por confusión en la
utilización de algunos de sus compuestos como el trióxido de arsénico. Todas estos ejemplos
tienen en común como vía de entrada la gastrointestinal .
El caso del arsénico amerita no solo su análisis en sangre , sino también en función del
tipo de intoxicación , de pelos o uñas con el tratamiento previo de mineralización . Además la
longitud de onda de trabajo esta situada en la zona del ultravioleta por lo que la llama
absorberá parte de la radiación de la lámpara quitándole sensibilidad , por eso es conveniente
trabajar con la generación de hidruros y la posterior descomposición térmica de la arsina en
cámara de cuarzo para originar la población atómica de arsénico. Además la metodología por
llama no es sensible con un limite de detección entre 0,05 a 0,3 mg/litro , con llama de oxido
nitroso /acetileno. La bibliografía menciona una relación de 2 a 1 sobre un total de 224 trabajos
, la utilización de la generación de hidruros respecto a horno de grafito para la determinación
de arsénico, para diferentes matrices biológicas.
En relación al tratamiento de las muestras biológicas para su mineralización se

recomienda el tratamiento por medio de microondas con mezcla ácida, que por lo mencionado
anteriormente se asegura que no halla perdidas del analito.
494
El mercurio presenta causas de intoxicaciones agudas o crónicas . Debe destacarse

que son pocos los casos de envenenamientos criminales con derivados inorgánicos del
mercurio , por su sabor muy desagradable.
El análisis de mercurio, que por llama tiene un limite de detección muy alto, lo que
conlleva a la utilización del vapor frío , para generar en una cámara de reacción con un fuerte
agente reductor (cloruro estannoso ) átomos de mercurio al estado elemental , procediendo
de igual manera para los estándares .
En el caso del talio , aunque ya no es frecuente la intoxicación con este elemento , es a

través de la técnica de complejamiento, ajuste de pH y extracción con solvente orgánico, en
orina puede practicarse esta metodología. Asimismo la determinación en la forma de hidruro
de este metal , presenta serios inconvenientes , por ser una especie muy inestable, lo que
hace no recomendable su utilización. La determinación por horno de grafito para este
elemento es severamente cuestionada desde el punto de vista bibliográfico , por las siguientes
razones : prematura perdida del analito como oxido de talio o cloruro de talio u otros haluros., o
bien porque el talio es vulnerable a interferencias por parte de cloruros, sulfatos , que pueden
provenir de la mineralización de la muestra. Es importante considerar según el ámbito de
situación , cuales son los rangos de concentraciones esperables en promedio de encontrar en
los diferentes especimenes biológicos a examinar., es decir cuales son los valores promedios
para metales o metaloides según el ámbito ( valor normal., valor toxico , valor letal,
respectivamente ). Se mencionan algunos valores según lo referido anteriormente, expresados
en miligramos por litro en sangre, suero y orina , respectivamente.
Normal Toxico Letal

Metal sangre suero orina sangre suero orina sangre suero orina
As 0-0,01 0-0,02 0,002- 0,6(a) 0,05 1-20 (a) 10 10 0,2
0,05 0,01- 0,05 – 5
0,5 (c) (c )
Hg 0,001 – 0- 0-0,007 0,2 0,3 0,3 0,5 0,8
0,01 0,004
Pb 0,04 – 0- 0005 0,012 – 0,7 ( c ) 3,5
495
0,3 0,08
(a) agudo ,una única dosis y elevada / (c) crónico
Lo expresado anteriormente es valido también cuando se consideran los niveles de

diferentes elementos en tejidos humanos , en particular para los casos post mortem , que
tendrán sin dudas connotaciones singulares a la hora de evaluar los datos obtenidos. Otra
fuente que puede citarse es la obra de Baselt y Cravy. En tal sentido se mencionan algunos de
aquellos guarismos en algunas matrices de interés forense y para los metales mas
significativos desde esta óptica de la Toxicología, que se tabulan a continuación : .
Muestra Unidad Valor de referencia Fuente Bibliográfica
As
Pelo ug/g 0,06 13
Riñón ng/g 129 14
Hígado ng/g 129 14
Uñas ug/g 0,58 15
Pb
Pelo ug/g 1,34 16
Uñas ug/g 1 17
Hg
Pelo ug/g 0,1 – 1,33 18
Hígado ug/g 0,01 – 0,37 19
Tl
Hígado ng/g Mayor a 0,6 – 4,84 20
ug/g – microgramo por gramo / ng/g – nanogramo por gramo
Los valores consignados para arsénico son promedios y varían ampliamente según la
ocupación, el ambiente, la dieta, y otros factores de exposición.
Debe considerarse dentro de esta división , el análisis de metales provenientes de la

deflagración de pólvoras, y presentes en los detonantes, tales como bario, plomo y
antimonio , cuyas determinaciones son muchísimos mas sensibles que el clásico análisis de
nitritos y nitratos. Estos elementos mencionados son componentes habituales en las diversas
496
mezclas empleadas en la fabricación de detonantes. Por lo tanto si se encuentran en los

detonantes , es de esperar de hallarlos en los restos de deflagración en las manos de quien
disparo un arma de fuego . Asimismo es de considerarse los valores de corte (cut off), que para
el Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Suprema Corte de Justicia ,están en : 20
ng para antimonio , 150 ng para bario y de 2100 ng para plomo , para concluir de su presencia
una exposición o bien descartarse la misma, en particular tener en cuenta que estos metales
estudiados no tienen un origen exclusivo en los detonadores, la presencia de los tres en
valores significativos constituye una evidencia de suma importancia de que una persona pudo
haber efectuado un disparo. La metodología consiste en el hisopado de ambas manos con
solución de ácido nítrico , colocados en frascos separados y escrupulosamente limpios , como
así también los correspondientes blancos.
Toxicología Ambiental.
La ley Nacional 24051 de Residuos Peligrosos, establece niveles guía para

elementos que pueden determinarse por esta técnica analítica, para aspectos tales como :
calidad de aguas de bebida para calidad humana, para protección de vida acuática, para agua
de irrigación , para suelos, emisiones , calidad de aire ambiental, entre otros., los cuales se
mencionan en el Anexo correspondiente de la legislación mencionada.
La normativa citada describe límites de contaminantes a cumplir por los lixiviados de

residuos sólidos ( según norma SW 846 EPA ) con valores máximos para arsénico, bario,
cadmio, zinc, cobre, cromo, mercurio, níquel, plata , plomo y selenio. Este ensayo reproduce
en el laboratorio las condiciones en la naturaleza por parte del residuo sólido , determinando
a través del mismo su potencial de contaminación a aguas subterráneas y suelos, tomando
para las aguas un valor máximo de 100 veces el limite permitido fijado para aguas de
consumo humano de los diferentes metales que se consideran en este apartado.
El análisis de metales en cuerpos de agua superficiales es de aplicación muy utilizada ,

en particular para establecer la relación de contaminación con metales al origen del vuelco. De
esto ultimo surge su aplicación a los efluentes industriales para parámetros tales como zinc,
plomo, cromo, níquel, cadmio, entre otros. La legislación establece diferencias de
concentraciones de vuelco permitidas de vuelcos según sea conductoras pluviales, mar, etc.
497
El agua constituye una buena matriz por estar sus componentes en disolución debiendo
según la concentración del analito proceder a su análisis directo por llama o bien a técnicas
de preconcentración (evaporación , intercambio iónico, o extracción con disolventes orgánicos
). También si el nivel de concentraciones es del orden de las ppb debe recurrirse a la técnica de
horno de grafito, las que no necesitan un pretratamiento.
Debe aclararse algunos conceptos respecto del agua , relacionados con una
homogenización de criterios , y según el ámbito de la determinación a realizar :
a- Metales disueltos : Metales en muestras no acidificadas que pasan a través de

membrana de 0,45 um de tamaño de poro.
b- Metales suspendidos: Metales en muestras no acidificadas que son retenidas
por membrana de 0,45 um.
c- Metales totales : Es la concentración de metales en la muestra no filtrada luego
de una digestión , o la suma de la fracción disuelta y suspendida.
Para el caso de los vertidos, los niveles a medir suelen ser altos comparados con los
de cuerpos de aguas no contaminados. Debe considerarse que muchos de estos efluentes
presentan coloración que no interfiere en esta técnica tal como ocurre en los métodos
calorimétricos. Los efluentes suelen tener una muy variada naturaleza de compuestos por lo
que hay que utilizar el corrector de deuterio para determinaciones de elementos cuyos
máximos de absorción se encuentren por debajo de los 260 nm para evitar interferencias.
Otro aspecto de suma importancia lo constituye el tipo de recipientes de recolección

que idealmente deberían ser de cuarzo o de teflón, materiales estos muy costosos, y frágil en el
caso del primero. El polipropileno constituye una alternativa adecuada. La preservación es otro
aspecto importante. El agregado de ácido nítrico concentrado hasta pH menor a 2 , en envase
plástico , eso último con relación a los metales, con excepción del mercurio para el cual se
recomienda agregar 2 ml por litro de solución de dicromato de potasio al 20 % (peso en
volumen) y en envases de vidrio .
Debe tenerse en cuenta que las tapas de goma y algunos plásticos pueden aportar zinc
a la muestra con su consecuente contaminación . También considerar que el plomo , es un
contamínate ubicuo en el aire urbano y polvos.
498
A continuación se menciona condiciones de almacenamiento y preservación de

algunos parámetros metálicos para muestras de agua propuestos por el CEPIS (Centro
Panamericano de Ingeniería Sanitaria):
Parámetro Tipo de Cantidad Preservación Tiempo

frasco mínima de máximo de
muestra almacenaje
Agregar HNO3
Metales PoV 100 ml 6 meses
hasta pH < 2
refrigerar, agregar
Arsénico PoV 50 ml 6 meses
HNO3 hasta pH < 2
refrigerar, agregar
Mercurio V 100 ml H2SO4 hasta pH < 28 días
2
P- plástico / V- vidrio / HNO3 - ácido nítrico / H2SO4 – ácido sulfúrico
Las muestras de suelos y sedimentos deben tomarse con sacabocados y colocarse en

frascos limpios y secos, acondicionadas a 4º C hasta el momento de su análisis, Así también
deben secarse hasta peso constante para realizar los cálculos analíticos correspondientes. La
mineralización para la técnica instrumental objeto de discusión es necesaria dado que la
muestra debe hallarse en solución para su adecuado comportamiento analítico. Se procede
luego al análisis por absorción atómica de los analitos que deseen investigarse.
En el caso de emisión de chimeneas una de las posibilidades de captación es a través

de bombas de alto caudal y de carácter isocinético en el ducto por medio de agujero toma
muestras y recolección sobre membrana apropiada y ulterior digestión, previa pesada para la
determinación analítica de los elementos a cuantificar.
Toxicología Clínica.
En esta faceta de la Toxicología, la pronta respuesta dará no solo un diagnostico

certero sino que estará involucrado en la recuperación de la salud del paciente intoxicado.
Debe tenerse en cuenta el diagnostico presuntivo, como así también el ámbito de

trabajo del intoxicado y de los relatos de los familiares o amigos.
499
Los elementos que pueden determinarse son numerosos y generalmente proviene de

victimas de suicidios o de homicidios por la utilización de diferentes sustancias entre ellas los
derivados de metales .
En las causas de Toxicología, y en el ámbito de la Clínica, derivan muestras de

diferente naturaleza provenientes de Hospitales públicos para proceder a la rápida
determinación de los metales por la técnica de absorción atómica, en carácter de colaboración
por carecer casi siempre los centros asistenciales de equipamientos como los que se
describen en esta contribución.
Las muestras recomendadas para el análisis toxicológico, y que entrarían dentro de la

problemática de metales en esta relación de la Toxicología Clínica la podemos resumir en el
siguiente cuadro:
Muestra Identificación de :
Sangre Plomo
Orina Metales pesados
Contenido Estomacal Útil para sustancias
ingeridas entre 0 a 6 horas
Pelos Uñas Arsénico / plomo
El caso de las intoxicaciones por plomo dentro de esta óptica , puede observarse la
crónica o la aguda, de origen accidental y raramente homicida. Debe recomendarse el
agregado de heparina como anticoagulante dado que otros anticoagulantes quelan al plomo
como lo hace el EDTA.
En el caso de ser necesario el análisis de metales puede circunscribirse al ámbito

veterinario, existiendo referencias de valores normales de algunos metales en sangre para
diferentes animales , tales como: caballo, vaca, cerdo, perro, gatos, monos, entre otros, para
considerar luego con los valores obtenidos en que estado de la problemática toxicológica se
encuentra el profesional veterinario en la evaluación del caso. Se transcribe a continuación
algunos ejemplos de lo mencionado aquí de algunos animales.
500
ug/dl Caballo Vaca Cerdo Perro Gato Mono

Plomo 5- 25 0-24 -------- 0 –50 ------- -------
Zinc ------- ------- --------- -------- ------- 79
Toxicología Laboral.
Dependiendo de la actividad laboral , y su relación con el uso en el ámbito de trabajo

con metales y sus sales se impone el monitoreo ocupacional , en medios biológicos tales como
sangre y orina , como el del ambiente laboral..
Considerando las condiciones del muestreo, en cuanto al tipo de bomba, caudal,

volumen mínimo y máximo a procesar, tipo de filtros o tubos, etc. se determinan diversos
metales importantes en toxicología ocupacional. La muestra, generalmente nieblas, vapores,
etc que afectan la calidad del aire laboral, es retenida por un filtro que retiene material
articulado total para el caso de determinación del contaminante.
El plomo es un elemento que consideramos particularmente por su implicancia de

intoxicación crónica, el saturnismo. Para su determinación puede utilizarse la extracción del
elemento por medio de pirrolidinditiocarbamato de amonio con metil isobutil cetona a pH 2,5.
No obstante si se cuenta con horno de grafito es preferible esta ultima dado su mayor
sensibilidad, sin tratamiento previo, que permite el análisis de este analito en sangre y orina.
Desde el punto de vista instrumental, la longitud de onda 217 nm es una de la preferidas por
ser la mas sensible, seguida de 283,3 nm la cual es 2,5 veces menos sensible que la anterior.
El análisis de este elemento en sangre es el mas utilizado para el monitoreo biológico a la
exposición laboral. En relación al análisis por horno de grafito el método brinda limites de
detección muy bajos, del orden de 0,01 mg/litro en sangre
Debe tenerse en cuenta la legislación laboral en cuanto a los limites de exposición

máximos permitidos a través de las concentraciones máximas permitidas en aire del ambiente
501
laboral (CMP) para considerar con ello , los tiempos de muestreo en función del limite de
detección del método empleado.
También en este tipo de intoxicaciones debe considerarse los valores para los cuales se
establece que conjuntamente con la aparición de síntomas podemos hablar de saturnismo; los
guarismos se encuentran por encima de los 70 microgramos por ciento en sangre. Los valores
entre 40 a 70 microgramos % en sangre, están hablando de una exposición, de la cual puede
retirarse al individuo de la faceta laboral en contacto con este toxico.
El mercurio es otro elemento que aparece en este escenario conflictivo del mundo
laboral, dado que aquel por su extrema volatilidad , en el caso de manipular el metal, el cual es
susceptible de ser incorporado por vía inhalatoria y posterior oxidación y daño subsecuente . la
orina es una muestra de interés para su análisis y evaluación
Respecto a los métodos de control en el ambiente de trabajo se recomienda la

utilización de las normas NIOSH , como por ejemplo: 6009 y 7082 , para el mercurio y plomo
respectivamente.
Conclusiones.
La técnica de absorción atómica tiene numerosos campos de aplicación dentro de las

diferentes ramas de la Toxicología. Su correcta utilización , técnicas de aislamiento
convenientemente aplicadas para asegurar la calidad del resultado analítico y la correcta
interpretación , permiten hacer de la misma un arma muy útil en el campo de la química de los
metales y no metales de numerosos elementos de la tabla periódica , para la resolución y
respuestas que aquellas ramas necesitan . Debe además considerarse algunos casos en que
no se cuente con lámpara de cátodo hueco , y que dependiendo del potencial de ionización
del elemento a determinar que puede utilizarse el equipo como fotómetro de llama.
En muchos casos y en particular de los elementos considerados en este trabajo , los

limites de detección son mas bajos por la técnica de horno de grafito que por ejemplo de
plasma de argón inducido (ICP) , tal como se muestran en la siguiente tabla):
502
Elemento AA (nm) ICP (nm) ICP LLama Llama Cámara grafito

límite límit conc. límite µg/L
µg/L µg/L caract.
µg/L
Arsénico 193.7 188.98 12 300 500 0.5
Mercurio 253.7 184.950 8.5 200 1500 7.5
Plomo 217.0 220.353 14 10 100 0.28
nm – longitud de onda expresada en nanómetros
Bibliografía:
Aplicación de la Espectrofotometría de Absorción Atómica a la Toxicología y Criminalistica.

Revista de la Facultad de Ciencias Exactas Químicas Naturales. Universidad de Morón. Vol
I pag. 21-32 . C. Colangelo y col. 1996.
Espectroscopia de Absorción Atómica . L.X. Herraiz . Publicaciones Analíticas .1980.
Análisis Químico Cuantitativo . I.M. Kolthoff y col. Librería y Editorial Higar SRL:; 4ta Edición.
1969
Tratado de Química Analítica Cuantitativa. 2da Edición. F. Bermejo Martínez. Ed. Seminario
Conciliar. 1963
Analytical Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry. A

Laboratory Guide. G. Schelmmer and B. Radziuk, Ed. Birkhauser Verlag 1999
Toxicología de Postgrado. M. Repetto. Universidad de Sevilla- España, 2002
Toxic Metals and their Analysis . E. Berman. Ed. Heyden. 1980
503
Manual de Toxicología Analítica. E. Fonseca Moraes y col. Ed. Roca. 1969
Atomic Absorption Spectrometry in Occupational and Environmental Health Practice. Vol. III.
D.L. Tsalev. CRC Press. 1995.
Tratado de Criminalistica . Tomo II. La Química Analítica en la Investigación del Delito.

Gobbi, E. y colaboradores. Ed Policial. 1983
Tabla de Valores de Referencia en Fluidos Biológicos. Repetto M. R. - Repetto, M.
(2000).Instituto Nacional de Toxicología de Sevilla y Área de Toxicología de la Universidad
de Sevilla. España
Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man. Baselt – Cravey. Ed. Year Book Medical
Publishers, Inc. 3rd Edition. 2000
Jervis, R.F. et al. Nutr. Res. Suppl. I, 627-633.. 1985
Bull. Envion. Contam. Toxicol., 31, 267 – 277, 193. Yamauchi, H et al.
Acta Chim. Hung, 125, 777-784, 1988. Matusiewicz, H. et al.
Sci. Total Environ, 42, 223- 235. 1985, Subramanian, K.S. et al .
Int. J. Environ. Anal. Chem. , 41, 27-38, 1990. Yoshinaga, J, et al.
Standard Methods for the examination of water and wastewater 20th Edition . 1998
Sitio Web : http://www.cepis.ops-oms.org/
Diagnostico Clínico por el Laboratorio. Todd- Sanford. Ed. Salvat. 1982
Department of Clinical Pathology. University of California. Kaneko, J.J. 1973
Toxicología industrial e intoxicaciones profesionales. R. Lauwerys. Ed. Masson. 1994.
504
Toxicología Laboral. Criterios para la vigilancia de los trabajadores expuestos a sustancias

químicas peligrosas . N.Albiano. Ed. Polemos. 1999
Sitio web relacionado con el muestreo en ambientes de trabajo : www.skcinc.com
National Institute of Occupational and Safety Health. Su Sitio Web : www.niosh.gov
Toxicología. L.V. Fungairiño. Primera Edición. Graficas Aguirre Campano. 1977
Methodology for Analytical Toxicology. I. Sunshine. Ed. CRC Press. Inc. 1987
Analytical Methods in Toxicology . Stahr, H.M. John Wiley Sons. 1991
Ley 19587. Decreto Reglamentario 371/79 . Ley de Higiene y Seguridad en el Trabajo.
Sitio Web con numerosas aplicaciones para la aplicación de Absorción Atómica

www.shimadzu.com.br/analitica/esp/Aplicación/aa.htm
Sitio Web : www.icm.csic.es/quimic/polarografia_y_absorcion_atomica.htm
505

Manual Toxicologia Editado Oct 2006 Luis Ferrari

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Toxicologia Editado Oct 2006 Luis Ferrari

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología.

Manual de Técnicas Analíticas

Luis Alberto Ferrari

Lic. Miriam G. Arado.

Leda Giannuzzi-Luis Alberto Ferrari

“Inmensa es la gracia poderosa que reside en

Agradeceremos cualquier crítica o sugerencia que nos permita mejorar la obra.

Leda Giannuzzi y Luis Alberto Ferrari

Capítulo 2: Recolección y almacenamiento de las muestras en el laboratorio de

Capítulo 3: Toxicología Analítica.

Capítulo 4: Tóxicos Volátiles y Gaseosos.

Capítulo 5: Abuso de sustancias volátiles

Capítulo 6: Detección de sustancias no permitidas en caballos de carrera SPC (Sangre

Capítulo 8: Tóxicos Metálicos.

Capítulo 9: Estudio de restos de deflagración de pólvoras por métodos químicos e

Capítulo 12: Documentos Cuestionados.

Capítulo 13: Ficotoxinas.

Capítulo 14: Micotoxinas.

Capítulo 16: Investigación de Drogas de Abuso y Sustancias de Corte.

Capítulo 17: Espectrofotometría de Absorción Atómica.

Editores: Leda Giannuzzi – Luis A. Ferrari.

Capítulo 1: Aspectos de seguridad en el laboratorio de

Autor: Dra. Leda Giannuzzi.

Los análisis llevados a cabo en un laboratorio de toxicología emplean compuestos químicos

Otro ejemplo lo constituye la manipulación de ácidos y bases. Se sabe que al preparar

El trabajo en el laboratorio debe realizarse respetando normas e indicaciones que

1.1 Pautas generales sobre el cuidado personal.

a) No fumar, comer, beber ni almacenar alimentos o bebidas en el laboratorio.

1.2 Sobre el laboratorio.

a) Usar campanas de extracción de gases.

1.2 Precauciones en un laboratorio biológico.

2) Todos los elementos (envases, materiales descartables, algodones, papeles absorbentes,

3) Las muestras biológicas ya procesadas deben descartarse en lavandina.

4) Las muestras de orina ya procesadas pueden eliminarse sin tratamiento previo.

5) Los operadores deben recibir las vacunas de la hepatitis A y B.

Los accidentes en un laboratorio que maneja muestras biológicas inevitablemente

En casos de contaminación directa de piel intacta con muestras de sangre, debe

1.2.2. Derrames o roturas de envases conteniendo material biológico.

En casos de derrames de líquidos se debe absorber el material mediante el uso de papel

1.3 Métodos de descontaminación del material biológico.

1.3.1 Métodos químicos.

Muchos elementos (tubos conteniendo muestras orgánicas, jeringas, etc., deben

1.3.2 Método físico (Esterilización).

La esterilización es el método físico que destruye bacteria, hongos, levaduras y virus en

1.4 Rotura en la centrífuga de tubos con material infeccioso.

1.5 Riesgo asociado al manejo de sustancias químicas en el

Un laboratorio de toxicología debe emplear reactivos de grado analítico. Los niveles

Las planillas de seguridad de las sustancias químicas pueden ser encontradas en

• Bases de datos de compuestos químicos

• Entidades relacionadas con seguridad química:

Corrosivos: productos químicos de pH menor a 2 o mayor de 12. Los ácidos y bases se

Sustancias tóxicas: venenos, irritantes y asfixiantes. No interactúan directamente con los

Los productos químicos mutágenos y terátogénicos ocasionan aberraciones

Los productos inflamables y combustibles presentan riesgo de incendio. Además muchos

Los reactivos explosivos se descomponen con rapidez y producen gases en expansión lo

Los compuestos reactivos tienen estructuras moleculares de alta reactividad. Es probable

La reactividad de los productos químicos es un concepto relacionado tanto con sus

Otro aspecto que debe considerarse entre los cuidados en el laboratorio es la

El ácido clorhídrico en contacto con sulfuros, desprende sulfuro de hidrógeno, con

Algunas sustancias químicas presentes en forma de monómeros pueden polimerizarse

Existe la posibilidad que durante el almacenamiento prolongado de productos inestables

En caso de quemaduras de tipo químicas proceder de la siguiente manera:

- Quitar la ropa de la zona afectada.