En diciembre de 2019, un grupo de pacientes con neumonía de causa desconocida fue

vinculado a un mercado mayorista de mariscos en Wuhan, China. Un previamente desconocido

El betacoronavirus se descubrió mediante el uso de secuenciación imparcial en muestras de

pacientes con neumonía. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se utilizaron para

aislar un nuevo coronavirus, llamado 2019-nCoV, que formó otro clado dentro

el subgénero sarbecovirus, subfamilia Orthocoronavirinae. Diferente de ambos

MERS-CoV y SARS-CoV, 2019-nCoV es el séptimo miembro de la familia de

coronavirus que infectan a los humanos. Vigilancia mejorada y mayor investigación.

están en curso (Financiado por el Programa nacional clave de investigación y desarrollo de

China y el Proyecto Nacional Principal para el Control y Prevención de Infecciosos

Enfermedad en China.)

Los patógenos emergentes y reemergentes son desafíos globales para

salud pública.1

Los coronavirus son virus de ARN envueltos que se distribuyen

en general entre humanos, otros mamíferos y aves y que causan enfermedades respiratorias,
entéricas, hepáticas y neurológicas2,3. Se conocen seis especies de coronavirus

causar enfermedad humana.4

Cuatro virus - 229E, OC43, NL63 y HKU1 - son

prevalente y típicamente causa síntomas de resfriado común en individuos inmunocompetentes.4

Las otras dos cepas: coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo

(SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) - son

de origen zoonótico y se han relacionado con enfermedades a veces fatales.5

SARS-CoV fue

el agente causal de los brotes de síndrome respiratorio agudo severo en 2002 y

2003 en la provincia de Guangdong, China.6-8 MERS-CoV fue el patógeno responsable

para brotes de enfermedades respiratorias graves en 2012 en el Medio Oriente.9

Dado lo alto

prevalencia y amplia distribución de coronavirus, la gran diversidad genética y

recombinación frecuente de sus genomas y aumento de la interfaz humano-animal

actividades, es probable que surjan nuevos coronavirus periódicamente en humanos debido a

frecuentar infecciones cruzadas entre especies y eventos de contagio ocasionales.5,10

A fines de diciembre de 2019, varios centros de salud locales informaron grupos de pacientes con
neumonía de causa desconocida que estaban vinculados epidemiológicamente a un

mercado mayorista de mariscos y animales húmedos en Wuhan, provincia de Hubei, China.

31 de diciembre de 2019, el Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (China

CDC) envió un equipo de respuesta rápida para acompañar a Hubei provincial y Wuhan

autoridades de salud de la ciudad y para llevar a cabo una investigación epidemiológica y

etiológica.

Reportamos los resultados de esta investigación, identificando la fuente de los grupos de

neumonía,

y describa un nuevo coronavirus detectado en

pacientes con neumonía cuyas muestras fueron

probado por los CDC de China en una etapa temprana de la

brote. También describimos las características clínicas de

La neumonía en dos de estos pacientes.

Métodos

Métodos de diagnóstico viral

Cuatro muestras del tracto respiratorio inferior, que incluyen

líquido de lavado broncoalveolar, se recogieron de

pacientes con neumonía de causa desconocida que

fueron identificados en Wuhan el 21 de diciembre de 2019,

o más tarde y que había estado presente en el Huanan

Mercado de mariscos cerca de la época de su clínica

presentación. Siete líquido de lavado broncoalveolar

Se recogieron muestras de pacientes en Beijing

hospitales con neumonía de causa conocida para

servir como muestras de control. Extracción de nucleico

los ácidos de muestras clínicas (incluidos los cultivos no infectados que sirvieron como controles
negativos) fueron

realizado con un ácido nucleico viral alto puro

Kit, según lo descrito por el fabricante (Roche).

Las muestras de ácido nucleico extraídas se analizaron para

virus y bacterias por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando el kit

RespiFinderSmart22

(PathoFinder BV) y el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.12 Se analizaron muestras para

22 patógenos (18 virus y 4 bacterias) como se detalla en el Apéndice complementario.

Adicionalmente,

secuenciación imparcial de alto rendimiento, descrita

anteriormente, 13 se usaba para descubrir secuencias microbianas no identificables por los

medios descritos

encima. Se usó un ensayo de PCR de transcripción inversa en tiempo real (RTPCR) para detectar el
ARN viral al apuntar a una región RdRp consenso de pan β-CoV, como

descrito en el apéndice complementario.

Aislamiento de virus

Las muestras de líquido de lavado broncoalveolar se recogieron en vasos estériles a los que se
transportan los virus.

Se añadió medio. Luego se centrifugaron las muestras para eliminar los restos celulares. El
sobrenadante

fue inoculado en células epiteliales de las vías respiratorias humanas, 14

que se había obtenido de muestras de vías aéreas

resecado de pacientes sometidos a cirugía por

cáncer de pulmón y se confirmó que estaban libres de patógenos especiales por NGS.13

Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se expandieron

en sustrato plástico para generar células de paso 1

y posteriormente se platearon a una densidad de

2.5 × 105
células por pocillo en soportes TranswellCOL permeables (diámetro de 12 mm). Vía aérea humana

Se generaron cultivos de células epiteliales en un

Interfaz aire-líquido durante 4 a 6 semanas para formar

Cultivos polarizados bien diferenciados que se asemejan al epitelio mucociliar pseudoestratificado

in vivo.

Antes de la infección, las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias
humanas se lavaron tres veces.

veces con solución salina tamponada con fosfato; 150 μl de

sobrenadante del líquido de lavado broncoalveolar

las muestras se inocularon en la superficie apical

de los cultivos celulares. Después de una incubación de 2 horas a

37 ° C, el virus no unido se eliminó lavando con

500 μl de solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos; las células epiteliales de las
vías respiratorias humanas se mantuvieron en una interfaz aire-líquido incubada a

37 ° C con 5% de dióxido de carbono. Cada 48 horas

Se aplicaron 150 μl de solución salina tamponada con fosfato.

a las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas, y después de
10 minutos de incubación

a 37 ° C las muestras fueron cosechadas. Las células de epitelio mucociliar seudoestratificadas se

mantuvieron en este entorno; muestras apicales fueron

pasados en un vial diluido 1: 3 a células nuevas.

Las células fueron monitoreadas diariamente con microscopía óptica, para efectos citopáticos, y
con RT-PCR, para

La presencia de ácido nucleico viral en el sobrenadante. Después de tres pasajes, muestras

apicales y

las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se prepararon para

microscopio de transmisión por electrones.

Microscopio de transmisión por electrones

Sobrenadante de células epiteliales de las vías respiratorias humanas

Se recogieron cultivos que mostraron efectos citopáticos, inactivados con paraformaldehído al 2%.
durante al menos 2 horas, y ultracentrifugado a

partículas de virus de sedimentos. El sobrenadante enriquecido se tiñó negativamente en rejillas

recubiertas con película.

para examinación. Células epiteliales de las vías respiratorias humanas.

mostrando efectos citopáticos fueron recogidos y

fijado con paraformaldehído al 2% - glutaraldehído al 2.5% y luego fijado con osmio al 1%

tetróxido deshidratado con etanol de grado incrustado con resina PON812. Secciones (80 nm)
fueron

cortado del bloque de resina y teñido con uranilo

acetato y citrato de plomo, por separado. Lo negativo

Se observaron rejillas teñidas y secciones ultrafinas bajo microscopía electrónica de transmisión.

Secuenciación del genoma viral

El ARN extraído del líquido de lavado broncoalveolar y los sobrenadantes de cultivo se usaron
como plantilla para clonar y secuenciar el genoma. Nosotros

usó una combinación de secuenciación Illumina y

secuenciación de nanoporos para caracterizar el virus

genoma Las lecturas de secuencia se ensamblaron en

mapas de contig (un conjunto de segmentos de ADN superpuestos)

con el uso del software CLC Genomics, versión

4.6.1 (CLC Bio). Posteriormente se diseñaron cebadores específicos para PCR, y 5'- o 3′- RACE

(amplificación rápida de extremos de ADNc) se utilizó para

llenar los huecos del genoma de la secuenciación convencional de Sanger. Estos productos de PCR
fueron purificados

de geles y secuenciado con un kit de secuencia de ciclo BigDye Terminator v3.1 y un 3130XL

Analizador genético, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Alineación de secuencia múltiple del 2019-

Se realizaron nCoV y secuencias de referencia

con el uso de músculo. Análisis filogenético de

los genomas completos se realizaron con

RAxML (13) con 1000 réplicas de arranque y

un modelo general reversible en el tiempo utilizado como modelo de sustitución de nucleótidos.

Resultados

Pacientes

Tres pacientes adultos presentaron neumonía grave y fueron ingresados en un hospital de Wuhan
el 27 de diciembre de 2019. El paciente 1 era un

Mujer de 49 años, paciente 2, de 61 años.

hombre, y el paciente 3 era un hombre de 32 años.

Los perfiles clínicos estaban disponibles para los pacientes 1 y

2. El paciente 1 informó que no tenía subyacente

condiciones médicas crónicas pero fiebre reportada

(temperatura, 37 ° C a 38 ° C) y tos con

molestias en el pecho el 23 de diciembre de 2019. Cuatro

días después del inicio de la enfermedad, su tos y

las molestias en el pecho empeoraron, pero la fiebre fue

reducido; se basó un diagnóstico de neumonía

en tomografía computarizada (TC). Su ocupación era minorista en la venta al por mayor de

mariscos.

mercado. El paciente 2 informó inicialmente fiebre y

tos el 20 de diciembre de 2019; dificultad respiratoria desarrollada 7 días después del inicio de la
enfermedad

y empeoró en los próximos 2 días (ver cofre

radiografías, Fig. 1), momento en que mecánica

Se inició la ventilación. Había sido un frecuente

visitante al mercado mayorista de mariscos. Pacientes

1 y 3 se recuperaron y fueron dados de alta del hospital el 16 de enero de 2020. El paciente 2

falleció el

9 de enero de 2020. No se obtuvieron muestras de biopsia.

Detección y aislamiento de una novela.

Coronavirus

Se recogieron tres muestras de lavado broncoalveolar del Hospital Wuhan Jinyintan el 30 de

diciembre de 2019. No hay patógenos específicos (incluidos HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 y

HCoV-HKU1) se detectaron en muestras clínicas

de estos pacientes por RespiFinderSmart22kit. El ARN extraído del líquido de lavado

broncoalveolar de los pacientes se usó como plantilla para clonar y secuenciar un genoma usando
un

combinación de secuenciación Illumina y secuenciación de nanoporos. Más de 20,000 lecturas

virales

de muestras individuales se obtuvieron, y

la mayoría de los contigs coinciden con el genoma del linaje B del género betacoronavirus -
mostrando

Más del 85% de identidad con un murciélago tipo SARS

CoV (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1) genoma

publicado anteriormente. Los resultados positivos también fueron

obtenido con el uso de un ensayo de RT-PCR en tiempo real

para ARN dirigido a una región de consenso RdRp

de pan β-CoV (aunque el valor del umbral del ciclo

fue superior a 34 para las muestras detectadas). Virus

El aislamiento de las muestras clínicas se realizó con células epiteliales de las vías respiratorias
humanas y

Líneas celulares Vero E6 y Huh-7. El virus aislado

fue nombrado 2019-nCoV.

Para determinar si las partículas de virus podrían ser

visualizado en la vía aérea humana infectada con nCoV 2019

células epiteliales, infectadas de forma simulada y 2019-nCoV–

los cultivos epiteliales de las vías respiratorias humanas infectadas fueron

examinado con microscopía de luz diariamente y con

microscopía electrónica de transmisión 6 días después

inoculación. Se observaron efectos citopáticos 96

horas después de la inoculación en capas superficiales de humanos células epiteliales de la vía
aérea del hombre; falta de cilio

la paliza se vio con microcopias de luz en el

centro del foco (Fig. 2). No se observaron efectos citopáticos específicos en el Vero E6 y

Líneas celulares Huh-7 hasta 6 días después de la inoculación.

Micrografías electrónicas de tinción negativa

Las partículas 2019-nCoV fueron generalmente esféricas

con algo de pleomorfismo (Fig. 3). El diámetro varió de aproximadamente 60 a 140 nm. Partículas
de virus tenían

picos bastante distintivos, de aproximadamente 9 a 12 nm, y

dio a los viriones la apariencia de una corona solar.

Partículas virales libres extracelulares e inclusión

Se encontraron cuerpos llenos de partículas virales en vesículas unidas a la membrana en el

citoplasma en el

secciones ultrafinas epiteliales de la vía aérea humana. Esta

la morfología observada es consistente con el

Familia Coronaviridae.

Para caracterizar aún más el virus, secuencias de novo del genoma 2019-nCoV de muestras clínicas
(líquido de lavado broncoalveolar) y humanos

se obtuvieron aislados de virus de células epiteliales de las vías respiratorias

por Illumina y secuenciación de nanoporos. La novela

se identificó coronavirus de los tres pacientes.

Dos secuencias de coronavirus casi completas

se obtuvieron del líquido de lavado broncoalveolar

(BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-04/2020, BetaCoV /

Wuhan / IVDC-HB-05/2020 | EPI_ISL_402121), y

se obtuvo una secuencia de longitud completa de un

virus aislado de un paciente (BetaCoV / Wuhan /

IVDC-HB-01/2020 | EPI_ISL_402119). Secuencias completas del genoma de los tres nuevos

coronavirus

fueron enviados a GASAID (BetaCoV / Wuhan /

IVDC-HB-01/2019, ID de acceso: EPI_ISL_402119;

BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-04/2020, ID de acceso:

EPI_ISL_402120; BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-05/2019, ID de acceso: EPI_ISL_402121) y tener un

86,9%

identidad de secuencia de nucleótidos a un CoV similar a SARS de murciélago previamente

publicado (bat-SL-CoVZC45,

MG772933.1) genoma. Los tres genomas 2019-nCoV se agruparon y formaron un subclade

independiente dentro del subgénero sarbecovirus, que muestra el típico virus betacoronavirus

organización: una región 5 'no traducida (UTR),

complejo replicasa (orf1ab), gen S, gen E, M

gen, gen N, 3 'UTR, y varios no identificados

marcos de lectura abiertos no estructurales.

Aunque 2019-nCoV es similar a algunos betacoronavirus detectados en murciélagos (Fig. 4), es

distinto de SARS-CoV y MERS-CoV. El tres

Coronavirus 2019-nCoV de Wuhan, juntos

con dos cepas similares al SARS derivadas de murciélagos, ZC45

y ZXC21, forman un clado distinto en el linaje B de

El subgénero sarbecovirus. Cepas de SARS-CoV

de humanos y genéticamente similares al SARS

los coronavirus de los murciélagos recolectados del suroeste de China formaron otro clado dentro
del

sarbecovirus subgénero. Dado que la identidad de secuencia en dominios de replicasa

conservados (ORF 1ab) es

menos del 90% entre 2019-nCoV y otros

miembros del betacoronavirus, el 2019-nCoV -

El probable agente causante de la neumonía viral.

en Wuhan - es un nuevo betacoronavirus perteneciente

al subgénero sarbecovirus de Coronaviridae

familia.
Discusión

Reportamos un nuevo CoV (2019-nCoV) que fue

identificado en pacientes hospitalizados en Wuhan,

China, en diciembre de 2019 y enero de 2020. La evidencia de la presencia de este virus incluye

identificación en líquido de lavado broncoalveolar en

tres pacientes por secuenciación del genoma completo, PCR directa y cultivo. La enfermedad que
probablemente tenga

causado por este CoV se denominó "nueva neumonía infectada por coronavirus" (NCIP).
Completar

genomas fueron enviados a GASAID. El análisis filogenético reveló que 2019-nCoV cae en

el género betacoronavirus, que incluye coronavirus (SARS-CoV, CoV similar a SARS de murciélago,
y

otros) descubiertos en humanos, murciélagos y otros

animales salvajes.15 Reportamos el aislamiento del virus.

y la descripción inicial de sus efectos citopáticos específicos y su morfología.

Se han utilizado técnicas moleculares como identificar con éxito agentes infecciosos para muchos

años. La secuencia imparcial de alto rendimiento es

una herramienta poderosa para el descubrimiento de patógenos.14,16 La secuenciación de última

generación y la bioinformática están cambiando la forma en que podemos responder

a brotes de enfermedades infecciosas, mejorando nuestro

comprensión de la aparición y transmisión de enfermedades, acelerando la identificación de

patógenos y promoviendo el intercambio de datos. Describimos

en este informe el uso de técnicas moleculares

e imparcial secuenciación de ADN para descubrir un

nuevo betacoronavirus que probablemente haya sido

La causa de la neumonía severa en tres pacientes.

en Wuhan, China.

Aunque establecer cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas requiere mucho
trabajo, parecen

ser una valiosa herramienta de investigación para el análisis de patógenos respiratorios

humanos.14 Nuestro estudio mostró
esa propagación inicial de secreciones respiratorias humanas en cultivos de células epiteliales de
las vías respiratorias humanas, seguida de microscopía electrónica de transmisión y secuenciación
completa del genoma del cultivo

sobrenadante, se utilizó con éxito para la visualización y detección de nuevos coronavirus

humanos

eso posiblemente puede eludir la identificación mediante enfoques tradicionales.

Desarrollo adicional de precisión y rapidez

Todavía se necesitan métodos para identificar patógenos respiratorios desconocidos. Sobre la

base del análisis de

tres genomas completos obtenidos en este estudio,

diseñamos varios ensayos específicos y sensibles

dirigido a las regiones ORF1ab, N y E del 2019-

Genoma nCoV para detectar ARN viral en clínica

especímenes Los conjuntos de cebadores y los procedimientos operativos estándar se han

compartido con el

Organización Mundial de la Salud y están destinados a

Vigilancia y detección de la infección 2019-nCoV a nivel mundial y en China. Datos más recientes

mostrar detección de 2019-nCoV en 830 personas en

China.17

Aunque nuestro estudio no cumple con el de Koch

postulados, nuestros análisis proporcionan evidencia que implica 2019-nCoV en el brote de

Wuhan. Evidencia adicional para confirmar el signo etiológico importancia de 2019-nCoV en el
brote de Wuhan

incluir la identificación de un antígeno 2019-nCoV en

El tejido pulmonar de los pacientes mediante análisis inmunohistoquímico, detección de IgM e IgG

anticuerpos antivirales en las muestras de suero de

un paciente en dos puntos de tiempo para demostrar seroconversión y experimentos con

animales (monos)

para proporcionar evidencia de patogenicidad. De crítica

importancia son las investigaciones epidemiológicas para

Caracterizar los modos de transmisión, el intervalo de reproducción y el espectro clínico resultante
de la infección para informar y refinar estrategias que puedan prevenir, controlar y detener la
propagación de 2019-nCoV.