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GUÍAS DE LABORATORIO

PRÀCTICAS DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA


UNIVERDIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
Facultad De Ciencias. Departamento de Farmacia
FITOQUÌMICA Y FARMACOGNOSIA 2015659
PRÁCTICA No 1.
ELABORACIÒN DE EXTRACTOS EXTRACCIÓN

 MARCO TEÒRICO

EXTRACTO
Los extractos vegetales son preparaciones líquidas, semisólidas o sólidas, obtenidas por
extracción selectiva de los principios activos de las drogas vegetales, empleando un solvente o
medio de extracción. Durante el proceso de extracción ocurren dos fenómenos paralelos: la
lixiviación de las sustancias solubles y la disolución y difusión de las sustancias solubles de las
células intactas.
Los principales procesos de extracción de las drogas vegetales se describen brevemente a
continuación:

1. Infusión
La infusión es preparada adicionando agua en ebullición sobre las partes del vegetal que contiene
las sustancias activas o de interés, generalmente hojas, flores y cascaras.
El material se debe dejar en contacto por 5 a 10 min y después filtrar. La cantidad de planta varia
según la especie, siendo normalmente de 5g por cada 100 mL de agua. Es destinada a plantas o
drogas que presentan clases de sustancias volátiles o termolábiles, como aceites esenciales y
alcaloides, también aplica a partes vegetales frágiles como pétalos o hojas membranáceas que
liberan fácilmente sus activos.

2. Decocción
Se coloca la planta fresca o droga vegetal en contacto con agua fría, con posterior calentamiento
hasta ebullición en un recipiente cerrado, dejando ebullir por algunos minutos. Esta técnica es
utilizada con plantas que presentan principios activos de difícil extracción por estar en partes
leñosas de las plantas. Esta metodología también puede ser adaptada por reflujo.

3. Maceración

Es una técnica de extracción que requiere inmersión del material. Se coloca la droga vegetal
pulverizada en contacto con el solvente o liquido extractor por un determinado periodo de tiempo
y agitando el sistema periódicamente. Al final del proceso el extracto líquido es separado. Por su
naturaleza este proceso son lleva a agotamiento total de la droga vegetal debido al proceso de
saturación.
 Maceración estática: es el proceso en que la droga queda en contacto con el solvente
con agitación ocasional.
 Maceración dinámica: la droga vegetal y el solvente son mantenidos en movimiento
constante.
 Maceración por ultrasonido: el material vegetal y el solvente se someten a periodos de
ultrasonido.
4. Digestión
La droga vegetal en contacto con el solvente se mantienen a una temperatura no mayor a 60oC,
con la ayuda de un sistema de reflujo.
5. Percolación
En esta técnica el material vegetal es humedecido y posteriormente colocado en un recipiente
cónico que en la parte inferior cuenta con una llave y que se puede alimentar en la parte superior
con solvente, llamado percolador. El material se deja en contacto con el solvente y transcurrido
un determinado tiempo el solvente es retirado por la parte inferior y se coloca nuevo solvente al
material. Este proceso permite la extracción exhaustiva del solvente.

6. Turbólisis
Este proceso se lleva a cabo empleando un equipo denominado turbolizador, en el que el material
vegetal en el solvente es triturado por un rotoestator, disolviendo el contenido celular.
Extracción por contracorriente
La droga vegetal o planta fresca es extraída por un solvente que se mueve en sentido contrario al
material vegetal

 PROCEDIMIENTO

En esta práctica se realizarán extractos empleando diferentes métodos de extracción.

1. PERCOLACIÓN
Se pesan 50 g de material vegetal según tabla 1. Y se humedecen en un capsula de porcelana.
Una vez humedecido el material se coloca en el percolador al que previamente se le ha colocado
algodón en la base. El material humedecido debe ser colocado y distribuido de tal forma que los
espacios sean mínimos sin llegar a compactar el material.
Una vez colocado todo el material se adiciona Etanol necesario para cubrir el material y dejar un
exceso, como se muestra en la Figura 1.
Dejar en reposo 30 min, transcurrido este tiempo abrir la llave y colectar una cantidad de extracto
de tal forma que el material vegetal este siempre en contacto con solvente, se deben realizar 3
extracciones. Concentrar el extracto empleando un rotavapor
.
2. MACERACIÓN
Se pesan 50 g de material vegetal y se humedecen con etanol en una capsula de porcelana,
posteriormente se pasan a un vaso de precipitados donde se adiciona la cantidad de Etanol
indicado en la tabla 1.

 Maceración-- estática
El material en contacto con el solvente (Etanol) se deja en reposo por 45 min, transcurrido este
tiempo se filtra el sobrenadante a través de un embudo analítico y se coloca nuevamente solvente
al material. Este proceso se repite dos veces más. La última filtración se realiza al vacío
transfiriendo la totalidad del material vegetal.

 Maceración –ultrasonido
El material en contacto con el solvente (Etanol) se coloca en el equipo de ultrasonido por un
periodo de 15min. Transcurrido este tiempo se filtra y se repite el procedimiento dos veces más.
La última filtración se realiza al vacío transfiriendo la totalidad del material vegetal.
 Maceración – digestión
El material en contacto con el solvente (Etanol) se coloca en un baño de maría por debajo de
50oC, por un periodo de 20 min. Transcurrido este tiempo se filtra y se repite el procedimiento dos
veces más. La última filtración se realiza al vacío transfiriendo la totalidad del material vegetal.

 Maceración –agitación
El material previamente pesado (Tabla 1) y humedecido se coloca en contacto con el solvente
(Etanol) en una placa de agitación por un periodo de 30 min. Transcurrido este tiempo se filtra, se
adiciona nuevo solvente al material, se deben realizar dos extracciones en total. La última
filtración se realiza al vacío transfiriendo la totalidad del material vegetal.

3. SOXHLET
El material vegetal se humedece y se colca en un dedal de papel de filtro, el dedal es colocado en
el equipo. En el balón se colocan 250 mL de solvente y una vez ensamblado y con agua circulante
en el refrigerador se calienta a 60oC. Una vez cumplan tres ciclos de extracción (sifón) se deja
enfriar el equipo, se retira el solvente con el extracto y se concentra con ayuda del rotavapor.

Cada grupo debe realizar las siguientes mediciones:


 Solvente empleado para humedecer el material vegetal
 Solvente empleado para la extracción
 Volumen de extracto (antes de concentrar)
 Peso de extracto seco

Estos datos serán registrados en la tabla 1. Y se analizaran los resultados de todos los
grupos.
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PRÁCTICA No 2.
OBTENCIÓN DE ALMIDÓN

 MARCO TEÒRICO

El almidón es un polisacárido de elevado peso molecular mediante el cual las plantas


almacenan éste tipo de carbohidrato como reserva alimenticia. Es un sólido no cristalino
parcialmente soluble en agua, que se encuentra en las plantas en forma de pequeños
gránulos localizados principalmente en las raíces de yuca y arracacha, tubérculos como la
papa y el ñame, rizomas y cereales como el arroz, maíz, trigo y otros.

La papa (Solanumtuberosum, familia Solanaceae) contiene un 2% de proteína, 0.1% de


grasa y 20% de almidón en forma de gránulos sueltos en las células del tubérculo de papa,
lo cual hace que su separación sea relativamente fácil. El almidón se separa de los otros
elementos insolubles que lo acompañan, debido a su alta densidad específica
(Aproximadamente 1.6). El almidón es una mezcla de dos polisacáridos (C6H10O5)n los
cuales son amilosa y amilopectina. Las amilosa constituye alrededor del 25% y está
formada por aproximadamente 300 unidades de α-D-glucopiranosa a través de enlaces
α-1,4 glucosídico, el cual forma una hélice con cerca de seis residuos de glucosa por vuelta.

Fragmento de una molécula de amilosa

La maltosa se hidroliza completamente en la presencia de β-amilasa, mientras en medio


ácido produce α-D-glucopiranosa cuantitativamente. La amilopectina constituye alrededor
del 75% del almidón y está formado por alrededor de 1000 unidades de α -D-glucopiranosa
en forma ramificada a través de enlaces α -1,4 principalmente en las hélices lineales y
parcialmente (3-6%) por enlaces α-1,3 y α-1,6 interlineales, para elaborar la estructura
ramificada.
Cuando se hidroliza, por medio de la amilasa se produce un 55% de maltosa y el resto
permanece como dextrina. La hidrólisis ácida completa produce glucosa solamente.
Muchos reactivos entre ellos el hidrato de cloral, timol, nitro propano y N-butanol se
emplean para la separación de la amilosa de la amilopectina.

Fragmento de una molécula de amilopectina.

 MATERIALES
500g de papa o yuca u otro fuente natural, licuadora, colador, tela de gasa, solución de
cloruro de sodio al 1%, solución de NaOH 0.01 M, papel filtro.

 PROCEDIEMIENTO
500g de papa u otro material pelado y cortado en pequeños pedazos, se licuan en una
conveniente cantidad de NaCl al 1% (solución isotónica). Enseguida la papilla obtenida se
filtra por medio de una tela y se exprime suavemente recolectando el filtrado en una cápsula
de porcelana grande. El residuo del material vegetal se licua de nuevo repitiendo este
procedimiento unas 4 veces. El filtrado se deja en reposo durante una hora para decantar el
almidón. Posteriormente se elimina el líquido sobrenadante volteando cuidadosamente la
cápsula y el almidón que permanece en el fondo, se resuspende con NaCl al 1% y se filtra al
vacío. Se realizan posteriores lavados con agua midiendo el pH a las aguas de filtrado
garantizando un pH neutro, si no es el caso se debe resuspender de nuevo el almidón y
adicionar una solución de NaOH 0.5% hasta obtener un pH neutro. Finalmente se seca el
almidón a una temperatura menor a 50oC se pesa y se calcula el porcentaje de rendimiento
obtenido. Se debe realizar la caracterización microscópica del almidón obtenido.

BIBLIOGRAFÍA
MORRE, J. DALRYMPLE, D. Experimental methods in organic chemistry.V.B Sanders Co,
2Ed. 1976.
TYLER, V.E. SCHUARING, A.E. Experimental Pharmacognosy. Burges Publishing
Company, 1962.
RICHARD F. TESTER, JOHN KARKALAS, XIN QI. Starch—composition, fine structure and
architecture.Journal of Cereal Science 39 (2004) 151–165.
EXTRACCIÓN DE ALMIDÓN

≈500 g de material vegetal

Lavar
Pelar
Picar
Pesar≈ 400 g
Licuar con NaCl 0.9%

Repetir≈ 4 Verificar las partículas. Si es


veces necesario volver a filtrar
Filtrar (gasa)

Material vegetal
Residual Suspension de almidón en NaCl

Sedimentarpor 1 hora

Almidón Sobrenadante

Resuspender con NaCl 0.9% Desechar

Filtrar al vacío

Filtrado Almidón

Lavar con agua

Medir el pH pH ácido

pH neutro

Pesar y calcular el Secar en la estufa


% rendimiento Caja de Petri <50°C Redisolver con agua y adicionar
NaOH 5% Hasta neutralización
Uniformizar el tamaño

Observar al microscopio Lavar con agua Filtrar al vacío


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PRÁCTICA No 4.
ALCALOIDES

 MARCO TEÒRICO

DEFINICIÓN
Los alcaloides son compuestos nitrogenados, que se comportan como bases frente a los
ácidos, formando sales. Presentan notables propiedades fisiológicas y toxicológicas, que se
ejercen fundamentalmente sobre el sistema nervioso central, con predominio en alguno de sus
niveles. Por estas razones muchos de ellos son usados como fármacos. El uso prolongado de
alguno de éstos compuestos produce en el hombre acostumbramiento, que constituyen
verdaderas toxicomanías, con dependencia física y psíquica y un aumento de la tolerancia.

PROPIEDADES
En las plantas los alcaloides pueden encontrarse en estado libre, como sales y como N-óxidos.
Todos los alcaloides contienen carbono, hidrogeno y nitrógeno que generalmente forman parte
de anillos heterocíclicos y algunos contienen además oxígeno y/o azufre. La presencia de
oxígeno en la estructura química determina que la sustancia sea un sólido blanco, de sabor
amargo y cristalizable. Al contrario la ausencia de oxígeno en la estructura química del
alcaloide lo convierte a un compuesto aceitoso, volátil u oloroso. Entre los que no contienen
oxígeno, se pueden citar la Nicotina y la Coniina, los cuales son líquidos. Los alcaloides no
son compuestos coloreados, sin embargo la berberina es amarilla, las sales de la
sanguinarina son de color rojizo. Los alcaloides se comportan como bases combinándose
con ácidos para dar sales, La solubilidad de los alcaloides varía considerablemente
dependiendo de su estructura; las bases libres son escasamente solubles en el agua, pero
se disuelven en los disolventes orgánicos. Por el contrario las sales se disuelven en el agua,
pero no en disolventes orgánicos. Los alcaloides de amonio cuaternario y los N-óxidos son
solubles en agua. Los protoalcaloides o amino alcaloides son compuestos en los cuales el
átomo de nitrógeno no forman parte de anillo heterocíclico, y faltando una o más
propiedades de los alcaloides típicos, entre ellos tenemos la efredina y la colchicina. Otros
compuestos que no concuerdan perfectamente dentro de la definición general, son aquellos
derivados de las fuentes animales y bacterianas y los compuestos sintéticos tales como la
homotropina.Los alcaloides pueden tener átomos de nitrógeno primario (mescalina),
secundario (efedrina),terciario (atropina) o cuaternario (tubocurarina) y pueden
encontrarse en las plantas en estado libre, como sales, como amina o como N-óxido de
alcaloides; por lo tanto, estos factores afectan los procedimientos utilizados para su
aislamiento. Todos los alcaloides son activos óptimamente a luz polarizada y presentan
una fluorescencia característica bajo la luz UV o IR, dando lugar a espectros
característicos.
DISTRIBUCIÓN
Los alcaloides se encuentran ampliamente distribuidos en las plantas, en las familias de
las angiospermas: Leguminoseae, Papaveraceae, Ranunculaceae, Rubiaceae,
Solanaceae y Berberidaceae. Las familias Labiatae y Rosaceae por lo general no contienen
alcaloides. En las gimnospermas es raro encontrar alcaloides. Generalmente las
monocotiledoneas no los producen. Sin embargo, algunos investigadores indican que, por
ejemplo, familias como Amarillidaceae y Liliaceae son prometedoras en la investigación de
alcaloides

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN
Para la investigación de alcaloides en materiales biológicos se requiere de extracción
desde una determinada muestra, una posterior purificación y la aplicación de
metodologías de identificación, dentro de los cuales se consideran reacciones generales,
reacciones de caracterización de alcaloides y técnicas de identificación y
cuantificación mediante cromatografía en capa delgada, de gas y cromatografía liquida de
alta eficiencia (CLAE).
En los métodos de extracción directa en materiales biológicos como sangre, saliva, orina
y otros, la presencia de proteínas facilita la formación de emulsiones entre el agua y
los solventes de extracción, que dificultan la separación de los alcaloides. Por esta
razón se procede a obtener extractos libres de proteínas, para lo cual hay varios métodos.
El más simple y directo consiste en el tratamiento con ácido clorhídrico concentrado y
calentamiento a baño maría durante una hora a 90°C. Todas las sustancias unidas a
proteínas son liberadas, pero el tratamiento es muy enérgico y no es adecuado para
sustancias termolábiles como cocaína, aconitina y atropina. Si se sospecha presencia de
ellas, se intentará un tratamiento con ácido clorhídrico 1N y calentamiento hasta 40°C.
También se dispone de otras técnicas menos enérgicas como el método de Stas-Otto, en
el cual se procede a formar tartratos y oxalatos de alcaloides solubles en agua. La técnica
es laboriosa pero da buenos resultados. Para la cual la muestra se trata con dos
volúmenes de etanol acidificando con ácido tartárico, dejando en maceración una noche.
Si se sospecha que no están presentes alcaloides termolábiles en la muestra, se mantiene
la mezcla a una temperatura de 60 a 70° C durante la maceración. A continuación se filtra
y se procede a la evaporación del etanol, obteniéndose un residuo blando, el cual se
trata nuevamente con un volumen de etanol absoluto tibio, se filtra y se evapora,
obteniéndose un residuo granular seco. Finalmente el nuevo residuo se trata con una
porción de ácido sulfúrico al 5%, obteniéndose un filtrado acuoso libre de proteínas.
También para la eliminación de las proteínas se han probado métodos que involucran el
tratamiento con proteasas, como papaína, tripsina y subtilisina-A, que muestran ventajas
sobre los métodos tradicionales, por ser menos enérgicos y presentar altos
porcentajes de recuperación.

DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN

1. Reactivos de precipitación
Los alcaloides, junto a otros compuestos básicos de interés biológico y/o toxicológico,
tienen un comportamiento análogo frente a un grupo de reactivos de precipitación que
permiten sospechar su presencia. Antes de efectuar las reacciones deben eliminarse
las proteínas y otros compuestos nitrogenados, los cuales dan pruebas positivas con
dichos reactivos de precipitación.
El procedimiento para estos reactivos generales comienza con la evaporación de 2 a 3
gotas del extracto etanólico u otro en vidrio de reloj. Se agregan luego 2 a 3 gotas
de ácido clorhídrico 5% hasta se solubilizan los residuos. A esta solución se agrega una
gota del reactivo correspondiente y se observa los resultados.
Los alcaloides disueltos en un ácido mineral diluido pueden ser precipitados en forma amorfa
con los siguientes reactivos:.

1.1. Reactivo de Mayer produce un precipitado de color crema


1.2. Reactivo de Hager forma un precipitado de color amarillo
1.3. Reactivo de Valser genera un precipitado de color crema
1.4. Acido tánico da un precipitado de color amarillo
1.5. Reactivo de Bouchardat (triyoduro) genera precipitados de color rojo pardo.
1.6. Reactivo de Dragendorff produce un precipitado de color rojo anaranjado
1.7. Reineckato de amonio produce un precipitado de color crema o blanco
El Reineckato de Amonio sirve para detectar la presencia de alcaloides de
amonio cuaternario y N-óxido.

2. Cromatografía en capa delgada


Para la separación de los alcaloides el adsorbente más común es la gel de sílice G,
generalmente neutra o con mezclas de tampones o amortiguadores. Adsorbentes como el
óxido de aluminio o el óxido de magnesio -cloruro de calcio, tienen la ventaja de no requerir la
adición de tampones para lograr una buena resolución de los alcaloides. Entre las mezclas
disolventes usadas, resulta útil para alcaloides de mayor polaridad: metanol-amoníaco (99-1),
n-butanol-ácido acético-agua (4:1:1), ciclohexano-acetona-dietilamina (5:4:1),
cloroformo-acetona-dietilamina(5:4:1) y cloroformo-dietilamina (9:1) v/v. La placa se seca y se
examina con luz ultravioleta de 360 nm y luego se trata con solución de yodoplatinato de
potasio. Si la separación no es eficiente y la identificación es dudosa, La muestra se
puede volver a analizar por cromatografía de capa delgada con cloroformo-metanol (9:1)
sobre alúmina G o gel de sílice G alcalinizada (usando solución de NaOH 0.1N en lugar de
agua). Para la separación por cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice G de
alcaloides de poca o mediana polaridad se obtienen buenos resultados empleando
como fase móvil ciclohexano-dietilamina(9:1) o benceno-acetato de etilo-dietilamina
(7:2:1).El uso de sustancias cromogénicas como el sulfato cérico (solución saturada de
sulfato cérico en ácido sulfúrico al 60%) o cloruro de cobalto al 10% en ácido sulfúrico
2N con calentamiento por 3 minutos a 100°C; incrementa la exactitud de la identificación.

Para la identificación por cromatografía de capa delgada de las p-alquilaminas del tipo de
la efedrina se han usado acetona-metanol-ácido acético (5:4:1) v/vcomo fase móvil. En el
caso de alcaloides de la piperidina se obtiene una buena separación con la fase móvil
etanol-ácido acético-agua (6:3:1). Para los alcaloides del tropano se puede utilizar
etanol-hidróxido de amonio al 25% (8:2). Los alcaloides de la quinolina se han separado
con cloroformo-metanol-dietilamina (80:20:1), en tanto que para los de la isoquinolina
se han obtenido buenos resultados con benceno-metanol (8:2). Los alcaloides indólicos
del tipo de la ergotamina dan buena separación con benceno-N,N-dimetilformamida
(13:1) y con acetato de etilo-etanol-dimetilformamida (13:1:1).Como sustancias
cromogénicas se usa el reactivo de Ehrlich [solución etanólica al 5% de
p-dimetilaminobenzaldehido-ácido clorhídrico concentrado (1:5) v/v, y calentamiento a
90-100°].
Reactivos para la detección de alcaloides en cromatografía de capa delgada
Uno de los reactivos más empleados para detectar alcaloides por cromatografía de
capa delgada ha sido el reactivo de Dragendorff que se prepara de la siguiente manera.

1. Reactivo de Dragendorff: modificación de Munier y Machebouf.

Solución A: se disuelve 0.85 g de nitrato de bismuto en una mezcla de 10 mL de ácido


acético glacial y 40 mL de agua.
Solución B: disolución de 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua.
Para la preparación del reactivo se mezclan 5 mL de la solución A, 4 mL de la solución B
y100 mL de agua). El reactivo es estable por un año.Se rocía la placa cromatográfica con el
reactivo, en ocasiones hay que calentar un poco a 100°C. Se observa en la placa manchas
de color rojo anaranjado sobre fondo amarillo, que debe persistir24 horas.

2. Permanganato de potasio:

Se disuelve 1g de permanganato de potasio en 100 mL de agua y se añaden 100 mL de un


solución al 2% de bicarbonato de sodio. La mezcla debe usarse en el lapso de 6 días.

BIBLIOGRAFÍA
1. Domínguez, Xorge A. "Métodos de Investigación Fitoquímica". 1979. Editorial
limusa. México. P. 219-222.
2. Bilbao, Ma. Del Rosario. "Análisis Fitoquímico Preliminar". 1997. Ed. Universidad
del Quindío. Armenia-Quindío. P. 180.
3. Almanza, C., Barragán Y. "Extracción, Separación y Caracterización de los alcaloides
contenidos en la Especie B. Sanguínea del Altiplano Cundí boyacense'M989. Pag. 41,
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4. http://www.biol.unlp.edu.ar/toxicologia/seminarios/parte 2/alcaloides.htmL
5. http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gpQOOO 11 .nsf/0/4DE2A203QB
26B6FQC1256A790048D68C/$File/web alcaloides.htm

ALCALOIDES DEL TROPANO EN (BrugmansiaSpp.)


INTRODUCCIÓN
Las propiedades farmacológicas de los alcaloides del tropano se conocen desde hace varios
siglos. En la antigua Grecia se usaba la Datura como droga mágica en el templo de Apolo en
delfos. En Europa y en la India se la conocía por sus propiedades toxicas. Las sociedades
aborígenes de América del Sur, especialmente en las regiones andina y amazónica aun hoy
usan las brugmansias como medicina y alucinógeno en las ceremonias religiosas. El uso
medicinal de los alcaloides del tropano ha perdurado hasta nuestros días empleando tanto los
extractos de las plantas como sus componentes aislados y los derivados de amonio
cuaternario y sales.
ESTRUCTURA Y QUÍMICA
Los alcaloides del tropano en su mayoría son esteres formados por alcoholes que contiene el
núcleo tropánico que es el N-metilazabiciclo [3.2.1] octano y ácidos carboxílicos tanto
alifáticos como aromáticos. Los compuestos que presentan mayor interés por su actividad
farmacológica son la cocaina, la atropina y la escopolamina; la atropina es un éster del amino
alcohol tropina y del ácido trópico y la escopolamina es un éster del amino alcohol escopina y
del ácido trópico. La atropina y la escopolamina difieren químicamente en el anillo
epoxidicode la escopolamina entre los carbonos 6 y 7, esta característica estructural les
confiere diferencias notables en su actividad biológica sobre el sistema nervioso central.

Debido al carbono quiral presente en el ácido trópico, estos compuestos presentan


actividad óptica. Las plantas biosintetizan fundamentalmente los isómeros 1 (hiosciamina
e hioscina), los cuales son los responsables de la actividad biológica, pero durante los
procesos de extracción se ocurre la racemización y se producen la atropina (dL
hiosciamina) y la escopolamina que son una mezcla racémica de hiosciamina e hioscina
respectivamente. Las fuentes naturales del tropano se encuentran fundamentalmente en
plantas de géneros de la familia Solanaceae tales como Atropa, Datura, Hyosciamus,
brugmansia y Dubosialas cuales son una fuente potencial de alcaloides tropanicos. En el
Herbario Nacional Colombiano del Instituto de Ciencias Naturales se encuentran
clasificadas las siguientes especies: B. arbórea, B. áurea, B. candida, B. dolichocarpa, B.
insignis, B. molis, B. sanguínea, B. suaveolens y B. versicolor.
Los alcaloides presentes y el contenido de los mismos están sujetos amuchas variables
tales como: género y especie de la planta, órgano de la misma (raíz, flores, frutos, hojas
secas etc.), estado de desarrollo, época de recolección, naturaleza del suelo en el que
crece la planta etc.
 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS CUALITATIVO
Pesar 10 g de las hojas o flores secas y molidas de borrachero (Brugmanciasp.) en un
matraz y agregar 5 mL de amoniaco concentrado. Adicionar 50 mL de una mezcla de éter
etílico-cloroformo (3:1) y calentar a reflujo a 60° C durante 20 minutos, dejar enfriar y filtrar al
vacío. Concentrar el filtrado hasta la mitad de su volumen en un baño maría o en un
evaporador rotatorio. Trasvasar este volumen a un embudo de decantación y extraer con
3 x 20 mL de ácido sulfúrico 0.5 N. Alcalinizar la capa acuosa ácida con amoniaco y extraer
con 4 x 20 mLde cloroformo.

Lavar la capa clorofórmica con 10 mL de agua y luego concentrar hasta 1 mL (solución A).
En una placa de gel de sílice G de 1 0 x 5 cm, colocar 50 uL aproximadamente de una
solución patrón de atropina, hiosciamina y hioscina en 3 aplicaciones separadas, además 2
aplicaciones de diferentes concentraciones de la solución A. Desarrollar la placa
por 8 cm aproximadamente en una cámara saturada con el sistema: metanol-amoníaco
(99-1), n-butanol-ácido acético-agua (4:1:1), ciclohexano-acetona-dietilamina (5:4:1),
cloroformo-acetona-dietilamina (5:4:1), Cloroformo-metanol (18:2) con dos gotas de
amoniaco y cloroformo-dietilamina (9:1) v/v. La placa se seca y se examina con luz
ultravioleta de 360 nm y luego se revela con el reactivo de Dragendorff.

La presencia de los alcaloides se pone de manifiesto por manchas de color rojo anaranjado
conel reactivo de Dragendorff.Observar los resultados, calcular los Rf y compararlos con
los de los patrones y entregar uninforme al profesor.
BIBLIOGRAFÍA
1. M. Martínez, P. Rodríguez. Estudio Preeliminar del contenido de alcaloides de
algunasDaturas_del altiplano cundiboyacense colombiano. Tesis de grado.
Departamento deFarmacia. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de
Colombia. Bogotá. 1986.
2. R.E Schultes. The Botany ans Chemistry of hallucinogens. Charles C.
Thomaspublisher, SpringfíeldIllionois. 1980, p. 264.
3. M.E. Wollf. Burger's medical Chemistry. 4* Edition. Parí III. John Wiley and
Sons.New York. 1980, p. 370-378.
4. L. García, M.T. reguero. Brugmansias Colombianas y Daturas Mexicanas
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mexicana de CienciasFarmacéuticas. 17, 7. 1986.
5. Trease and Evans, Pharmacognosy, llth edition, BaillieréTindall, London, Pag.
527,1978.
6. Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, Egon Stahl, Ann Arbor
SciencePublishers Inc. Michigan. 1973, p. 47.
7. V.E. Tyler, L.R Brady y J.E. Robbers, Pharmacognosy, 7 ed.
Lea Febiger,Philadelphia.1976.
8. J. F. Theilkul, "Introducción al estudio del
MethysticodendronAmesianum(Culebra-Borrachero).1957. Universidad Nacional,
Facultad de Ciencias, Bogotá.
Pesar 5 g de material vegetal ó 1 g
de extracto etanólico, partes
aéreas de especies de borracheros
– Brugmansia spp.

1. Adicionar 2-3 ml NH4OH conc. En 2. Adicionar 50 ml éter etílico-


cabina de extracción cloroformo (3:1)
Poner en digestión a
60 ⁰C
Filtrar al
vacio

Filtrado Residuo

Transvasar a embudo
de decantación

Extraer con 2 X 10
ml H2SO4 1 N

Fase acuosa Fase orgánica

Alcalinizar con ≈ 2 ml NH4OH


pH 8-9

Extraer con 2 X 10
ml CHCl3

Fase orgánica Fase acuosa

Secar con sulfato de sodio Descartar


anhidro/Filtrar
Colocar en 5 tubos de Concentrar aprox. 2mL de FO
ensayo aprox. 1 mL en un vial
Llevar a Realiazr CCD Patrón-
sequedad atropina

Redisolver en 1ml de HCl Fase móvil


2N acetona:NH4OH (98:2)

Adicionar 2 gotas de
reactivos de precipitación Revelar con Dragendorff
(Dragendorff , Valser, para CCD
Meyer, Reinekato)
UNIVERDIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
Facultad De Ciencias. Departamento de Farmacia
FITOQUÌMICA Y FARMACOGNOSIA 2015659
PRÁCTICA No 5.
EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE GLICÓSIDOS ANTRACÉNICOS

 MARCO TEÒRICO

INTRODUCCIÓN
Son un grupo de productos naturales poco distribuidos en la naturaleza. Son derivados
del antraceno y biosintéticamente se originan de la ruta del acetato. El mayor número de
las quinonas naturales están constituidas por las antraquinonas, las cuales tienen
efecto de laxación y regulador del tono intestinal y se emplean como laxante o
catártico en el tratamiento del estreñimiento. La mayoría de ellos fueron hallados en
especies del reino vegetal pero también algunos derivados se encuentran en algunas
especies animales. Los compuestos antraquinónicos son frecuentes en especies de las
familias Rhamnaceae (cáscara sagrada, frangula, Rhamnusspp),Polygonaceae
(ruibarbo), Rubiaceae(Rubia tinctoria), Leguminosae (hojas y frutos de sen), Liliaceae
(aloe o sábila) y también ha sido aislados de líquenes y hongos.
Las antraquinonas y otros compuestos derivados del antraceno como antrona, antranol,
antraquinona, oxantrona, diantrona, diantranol existen en las plantas en forma hidroxilada,
carboxilada o metilada, libres como agliconas o azucarados como glucósidos, lo cual
genera un enorme número de compuestos tales como el crisofanol, emodina, aloe
emodina, reina, senedina, senósido y otros.
La mayoría de los anteriores compuestos existen en la naturaleza como glicósidos o
heterósidos en los cuales los monosacáridos forman una unión etérea con uno o varios
grupos hidroxilos (O- glicósidos) o están ligados por enlaces carbono - carbono con la
aglicona (C-glicósidos).

PARTE EXPERIMENTAL
La detección de los compuestos quinónicos en material vegetal se realiza por la reacción
de Borntrager modificada por Kraus (Reacción de Borntrager- Kraus). Para que los
resultados sean más confiables es aconsejable realizar, además de ésta prueba, un
análisis por cromatografía en capa delgada.

 PROCEDIMIENTO
Se realiza una extracción con 5.0 g del material vegetal pulverizado empleando 50 mL de
etanol al 96% al reflujo por un tiempo de 20 minutos. Dejar enfriar, filtrar y evaporar el
solvente del extracto en un baño de agua caliente o en un evaporador
rotatorio. Disolver el residuo seco delextracto en 10 mL de una mezcla de
etanol-agua (1:7) a 60° C. aproximadamente. Filtrar depositando el filtrado
(SOLUCIÓN 1). Reservar 1 mL de solución. Evaporar a sequedad, redisolver en 1,5
mL de tolueno (SOLUCIÓN 2). Depositar el restante de Solución 1 en un tubo de
ensayo de 20 mL de capacidad, adicionar 1.0 mL de ácido sulfúrico al 50% y 0.5 mL
de agua oxigenada de 20 volumen y calentar en un baño de agua hirviendo durante 10
minutos. Dejar enfriar, transferir el contenido del tubo a un embudo de decantación y
extraer con 2 porciones de 5 mL cada una de tolueno. Deshidratar el extracto de las
capas orgánicas con sulfato de sodio anhidro y concentrar a 2.0 mL aproximadamente
(SOLUCIÓN 3).
 IDENTIFICACIÓN
Las soluciones 2 y 3 se analizan en la siguiente manera:

1. En un tubo de ensayo tomar 1mL de la solución 3, agregar 1mL de una solución de


NaOH al 5% que contiene 2% de NH4OH, agitar y dejar que las dos capas se separen.
La aparición de una coloración roja rosada en la capa alcalina que se intensifica con el
tiempo es positivo para la presencia de compuestos antraquinónicos.

2. Aplicar en una placa cubierta con sílice gel G y desarrollar el cromatograma en una
mezcla de tolueno - acetato de etilo - ácido acético (75:24:1). Dejar secar, observar en
la luz ultravioleta y marcar las manchas fluorescentes. Posteriormente revelar el
cromatograma con una solución de KOH al 10% en etanol. La aparición de manchas de
color naranja, rojo, rosado, las cuales dan en la luz ultravioleta una fluorescencia
amarilla o parda que cambia a rojo, violeta o verde indica la presencia de compuestos
antraquinónicos.

Bibliografía
1. E. J. Shellard, Practical Plant Chemistry for Pharmacy Students, Pitman
MedicalPublishing Co. Ltd, London, 1957, p. 48.
2. N. R. Farnsworth, Biological and Phytochemical Screening of Plants, J. Pharm Sci.
55,225 (1966).
3. C. S. Shah, J. S. Qadry and J. Bhatt, Quantitative evaluation of
antraquinonederivatives in Indian rhubarb, Plantamedica22, 103-108 (1972).
Pesar 5 g de material vegetal ó 1 g de extracto
etanólico de Hojas de Sen

Extraer con 50 ml de Etanol 96% en


reflujo x 20 min

Enfriar, filtrar y concentrar en


rotaevaporador

INICIAR LA PRÁCTICA EN ESTE PUNTO.

Disolver: 1 g de extracto problema


1 g de extracto hojas de Sen
En 10 ml de H2O:etanol (7:3) calentar a 60°C por 5 min.

Reservar 1ml y adicionar Filtrar


1ml de tolueno

• Adicionar 1.0 ml de H2SO4 al 50% y 1 ml H2O2 al 20%


• Calentar en un baño de agua hirviendo x 10 min.
Retirar la fase orgánica • Enfriar
con pipeta Pasteur
• Filtrar si es necesario

Realizar pruebas de
reconocimiento Transvasar a un embudo de decantación.

1/2ml Blanco 1/2ml prueba Extraer con 2 porciones de 5 ml tolueno

Fase orgánica Fase acuosa

Deshidratar con sulfato de sodio anhidro

Concentrar hasta aprox. 3-4ml

• 1ml para el blanco


• 1ml para la prueba
Realizar pruebas de • 1ml para CCD
reconocimiento
Observar a t=0, t=10, t=30 min
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PRÁCTICA No 2.
EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES

 MARCO TEÒRICO

INTRODUCCIÓN
Los flavonoides son compuestos con una estructura básica C6 – C3 – C6 en la cual cada
unidad de C6 es un anillo bencénico. La variación del estado de oxidación de la unidad C3
determina el grupo de flavonoides al cual pertenece cada compuesto. Los flavonoides son
compuestos que se sintetizan mediante las rutas del ácido shikímico y del acetato. En las
plantas se encuentran frecuentemente como glicósidos. En los flavonoides los hidroxilos
más comunes son los que se encuentran en las posiciones 5 y 7 del anillo A, mientras que
en el anillo B los grupos hidroxilos y metoxilos se encuentran en las posiciones 3’ y 4’ del
anillo B. Los O-glicósidos de los flavonoides se pueden formar en cualquiera de los
hidroxilos de la molécula con azúcares, también se encuentran algunos C-glicósidos de
flavonoides como la vitexina.
Los flavonoides se encuentran en todas las partes de la planta, incluyendo frutos, raíces,
polen y madera. Numerosas acciones biológicas se atribuyen a los flavonoides; así algunas
flavonas actúan como estimulantes cardiacos y otras como la hesperidina son útiles en el
tratamiento de la fragilidad capilar de los vasos sanguíneos. Algunas flavonas que son
altamente hidroxiladas pueden actuar como diuréticos y antioxidantes. Existe evidencia que
algunas flavonas pueden actuar como auxinas estimulando la germinación de las semillas.
La posible función como efecto en la coloración en las plantas por los flavonoides es la de
ayudar a la polinización de las flores por los insectos y los pájaros, y en los frutos
comestibles su presencia hace posible la dispersión de las semillas por los animales.
 CARACTERIZACIÓN DE FLAVONOIDES.

1. ENSAYO DEL CLORURO FERRICO: En tubos de muestra colocar 0,5 mL de solución


y adicionar una gota de solución de cloruro férrico 10%. Los compuestos fenólicos dan
coloraciones o precipitados marrón, verde o azúl.

2. ENSAYO DE MAGNESIO-ÁCIDO CLORHÍDRICO: En un tubo de ensayo colocar unos


pocos miligramos de magnesio metálico. Colocar 2 mL de solución. Adicionar gota a
gota HCl concentrado a cada tubo. Una vez finalice la salida de gas. Observar el color
de la solución. Los flavonoides con el núcleo α-benzopirona desarrollan un color
naranja, rojo o violeta. Si el resultado es dudoso, adicionar 0,5 a 1 mL de alcohol
amílico. La capa superior, debe tomar una coloración naranja, roja o violeta.
3. ENSAYO PARA LEUCOANTOCIANIDINAS: En un tubo de ensayo colocar 2 mL de
solución. Adicionar a cada uno 1 mL de HCl concentrado. Calentar por 20 - 30 minutos
a baño maría. Observar el color de la solución. Se considera prueba positiva si se
desarrolla un color naranja, rojo o violeta.

4. CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA

Aplicar las fracciones disueltas en metanol y patrón de flavonoides (rutina o hesperidina


en metanol). Observar las cromatoplacas desarrolladas al visible, a la luz UV a 254
nm y 365 nm antes y después de revelar.
Fase estacionaria: Silica gel 60254F
Fase móvil: acetato de etilo–ácido acético-ácido fórmico-agua (100:11:11:27).
Reveladores:

 Solución de cloruro de aluminio:


- Cloruro de aluminio hexahidratado al 5% en solución metanólica de ácido
acético (5%).
- Asperjar, dejar secar y observar a la luz ultravioleta (365 nm).

 NP-PEG:
- Reactivo A: Reactivo de Productos Naturales (Ácido
difenilbóricoaminoetilester) 1% en metanol
- Reactivo B: Solución de PEG 4000 (5% en etanol)
- Asperjar con el reactivo A. Dejar secar. Asperjar con el reactivo B. Dejar
secar.
- Observar la placa a la luz ultravioleta (365 nm).

 Reactivo de godin:
- Reactivo A: Vainillina 1% (Etanol)
- Reactivo B: Ácido perclórico 3% (Etanol)
- Asperjar la placa con el reactivo A y en seguida con el Reactivo B . Calentar a 100
ºC. Observar a luz día y al UV.

BIBLIOGRAFÍA

IKAN, R.; “Natural products – A laboratory guide” Israel UniversitiesPress. Jerusalem,


1969, p. 8-11.
DOMINGUEZ, X. A. Métodos en Investigación Fitoquímica. Mexico, D.F.: Limusa. 1973.

STALH, E.; SCHILD, W.; “Isolierung und Charakterisierung von Naturstoffen”. Verlag.
Stuttgart. p.102 104, 173.

WAGNER, H; “Phytochemischen Praktikum – Einfürung in die Isolierung von Naturstoffen


und Drogenwertbestimmung”. Universidad de Munich. Munich, 1988. p.36-37.

WAGNER, H.; BLADT, S.; ZGAINSKI, E.M. Plant Drug Analysis: A Thin Layer
Chromatography Atlas. Springer-Verlag, Berlin, 1984. 163 – 193.
Pesar 5 g de material vegetal
Flores de sauco (Sambucusnigra)

Adicionar 40 ml ETOH 96%

Digestión con reflujo X


30 min /Enfriar

Filtrar al vacio

Residuo Filtrado

Concentrar en rotavapor
hasta ≈ 3 ml

INICIAR LA PRÁCTICA EN ESTE PUNTO

Suspender: 1g de extracto problema y el


Extracto de flores de sauco en 15 ml de
H2O:ETOH (7:1)

Transvasar a embudo
de decantación

Extraer con 2 porciones de 10 ml


de acetato de etilo

FASE ACUOSA FASE ORGÁNICA

Extraer con 2 porciones de 10 ml


de n-butanol

Dividir en 5 porciones iguales y llevarlas a sequedad

FASE ACUOSA FASE ORGÁNICA


Disolver 4 porciones en REALIZAR
mezcla EtOH:H2O (1:1) PRUEBAS DE TUBO

Dividir en 5 porciones iguales y llevarlas a sequedad


Disolver en 0,5ml de MeOH

Disolver 4 porciones en REALIZAR PRUEBAS DE


TUBO REALIZAR CROMATOGRAFÍA
mezcla EtOH:H2O (1:1)

Disolver en 0,5ml de MeOH REALIZAR CROMATOGRAFÍA


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PRÁCTICA No 2.
EXTRACCIÓN DE GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS

 MARCO TEÒRICO

INTRODUCCIÓN

Algunos compuestos esteroidales ejercen un efecto poderoso sobre el músculo cardiaco y


se conocen con el nombre de heterósidos o glicósidos cardiotónicos, muchas de estas
sustancias han sido aisladas de especies vegetales y se encuentran también en algunas
secreciones venosas de algunos sapos o bufos. En las regiones tropicales de América del
Sur y África han sido empleadas por los nativos como venenos para las flechas.

Los usos medicinales de algunas de las plantas que contiene estos compuestos ya eran
conocidos por los egipcios desde el año 1500 A.C., los romanos usaban
Escillamaritimacomo diurético, tónico cardiaco, emético y veneno para ratas. En la
actualidad la fuente natural de glicósidos cardiacos está constituida por Digitalis purpurea y
Digitalis lanata. Las propiedades medicinales de Digitalis purpurea se describen ya en el
año de 1250 y botánicamente fue descrita en 1542, sin embargo la composición química y
el mecanismo de acción fue descrito posteriormente.

Los glicósidos cardiotónicos contienen en su molécula uno o más desoxiazúcares solos o


con monosacáridos normales unidos siempre al C3 por sustitución del grupo hidroxilo. Por
hidrólisis enzimática o hidrólisis ácida se generan los azúcares libres, una aglicona o genina
esteroidal que puede ser del tipo cardenólido o bufadienólido. Los cardenólidos son
esteroides de 23 átomos de C y poseen una lactona de 5 miembros α, insaturada
β en C17 y
un grupo OH en C14. Los bufadienólidos son esteroides de 24 átomos de C y poseen una
lactona de 6 miembros con doble insaturación α , β,γ insaturada en C17 y un grupo OH en
C14.

Los glicósidos cardiotónicos pueden ser detectados por pruebas sencillas como la prueba
de Lieberman–Buchard para compuestos esteroidales, la reacción de Keller–killiani para
detectar lactonas, pruebas para desoxiazucares y CCD empleando reveladores
específicos.

Estructuras Químicas
Composición química de los principales glicósidos cardiacos de Digitalis purpurea

GLICOSIDO AGLICONA AZÚCAR


Purpurea glicósido A Digitoxigenina DX-DX-DX-GL
Purpurea glicósido B Gitoxigenina DX-DX-DX-GL
Glucogilatoxina Gitaloxigenina DX-DX-DX-GL

REACCIONES PARA LA DETECCIÓN DE HETERÓSIDOS CARDIOTÓNICOS

1. REACCIÓN DE LIEBERMAN BURCHARD PARA ESTEROIDES

A una solución de muestra problema en anhídrido acético, se le agrega una gota de ácido
sulfúrico concentrado, observándose un cambio de color rosado pasando por el rojo violeta,
azul y verde.

2. REACCION DE KEDDE O RAYMOND


A la muestra problemasin solvente, se le agrega 1 ml delreactivo de kedde. Si la prueba es
positiva la solución toma una coloración rojo-violeta en 5 minutos.

El reactivo se prepara de la siguiente manera:


Solución 1: Se disuelven 0,1 g de ácido 3,5 dinitrobenzóico en 10 mL de metanol que debe
estar recién preparada.
Solución 2: Una solución de NaOH al 10% en etanol

Se mezclan 2 mLde la solución 1 con 1 mL de la solución 2.

3. ENSAYO PARA LA DIGITOXOSA O PRUEBA DE XANTIDROL (2,6


desoxiazúcares)

En un tubo de ensayo se evaporan 5 mL del extracto clorofórmico hasta sequedad en baño


maría, al residuo se le agregan 3 mL del reactivo de xanthidrol-ácido clorhídrico, la mezcla
se calienta durante 3 min en baño maría, la prueba se considera positiva si la reacción
toma una coloración roja.

El reactivo de xanthidrolestá compuesto por:


A 100 mL de ácido acético al 96% se le agrega 1 mL de HCl concentradoy a la mezcla se le
adiciona 0,1 mL de xanthidrol al 10%.

4. PRUEBA DE KELLER-KILLIANI (DESOXIAZUCARES)

En un tubo de ensayo el glicósido se disuelve en ácido acético glacial que contiene trazas
de cloruro férrico. Empleando una pipeta se deja caer hasta el fondo del tubo ácido sulfúrico
que contiene igualmente trazas de cloruro férrico. Los glicósidos de Neriumoleander y
Escilla generan coloraciones rojas, mientras que los de Adonis, Apocynum y
Digitalisgeneran un color verdoso intenso que se desarrolla en la superficie de los dos
reactivos esparciéndose gradualmente a la capa superior del ácido acético.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

Fase movil: Éter de petróleo: acetato de etilo (70:30), Cloroformo : Metanol (9:1)
Revelador: Reactivo deKedde o Raymond y Vainillina.
Fase estacionaria Sílica gel
1 g de Extracto muestra problema
1 g de Extracto hojas de Digitalis sp
(15 g Hojas de Digitalis sp.)

Adicionar 50ml
H2O

Extraer con 2 porciones de 10ml


de Éter de petróleo

Fase orgánica Fase acuosa

Adicionar 50ml
Descartar
Acetato de plomo

Calentar 15 min

Verificar la precipitación de
Filtrar las clorofilas

Transvasar filtrado a embudo


de decantación

Extraer con 2 porciones de 20ml de


Cloroformo:Metanol (90:10)

Fase Orgánica Fase acuosa

Adicionar Sulfato de sodio anhidro

Filtrar

Concentrar filtrado

Dividir en 5 porciones
iguales
CCD: se revelan dos
Realizar pruebas de placas cromatográficas,
detección con vainillina y Kedde.

Xanthidrol, Keller-killiani, Kedde,


Liberman Burchard