Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímica

en Patología Neuromuscular: utilidad

diagnóstica

Soraya Barrera Cabañeros ( TEAP)

Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología. Hospital Meixoeiro

Complexo Hospitalario Universitario de Vigo – CHUVI
Instituto de Investigación Biomédica de Vigo
 ¿QUÉ SON LAS ENFERMEDADES
NEUROMUSCULARES?

• Son enfermedades crónicas de evolución variable

• La mayoría son de origen genético y algunas adquiridas
• Se caracterizan por debilidad muscular, miotonía,
calambres…
• Afectan al SNC, SNP, unión n-m y fibra muscular
• Pueden afectar a otros órganos
• Su aparición puede ser en cualquier etapa de la vida
SARCÓMERO: Unidad contráctil del músculo
Enfermedades Neuromusculares
 Biopsia muscular + Historia clínica
Datos paraclínicos

Laboratorio Miopatología

Disección - Orientación

M/E Congelación Banco de Tejidos

Inmunogold

Cortes criostato Extracción de DNA Banco de DNA

Histoquímica Wb PCR multiplex

Inmunohistoquímica Bioquímica RFLP
Microscopía Confocal Secuenciación
Otras

DIAGNÓSTICO Consejo genético

250-300 biopsias de músculo y nervio/año
(85% de la Comunidad Gallega)
 Histoquímica
Inmunohistoquímica
Morfología

Microscopía electrónica
Estudio de proteínas

Estudio genético Estudio bioquímico

 ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS I

TAMAÑO Y FORMA
 Fibras atróficas, anguladas o no
 Fibras hipertróficas
 Fibras hipercontraídas
 Fibras redondeadas
 Figuras de “splitting”

NÚCLEOS
 Múltiples
 Internalizados
 Agregados (“clumps”nucleares)
ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS II

CITOPLASMA
 Degeneración – necrosis
 Miofagia
 Vacuolización: lípidos, glucógeno, vacuolas autofágicas
 Invasión parcial

ESPACIO EXTRACELULAR
 Infiltrados inflamatorios
 Fibrosis
 Sustitución adiposa
 TRICRÓMICO DE GOMORI
(Modificado por Engel y Cunningham, 1963)

 Patrón intermiofibrilar

 Mitocondrias (RRF)

 Bastones nemalínicos

 Cuerpos citoplásmicos

 Retículo sarcoplásmico

 Vacuolas autofágicas
Fibras(“ragged red fibers”) Bastones nemalínicos

Vacuolas ribeteadas
 TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS

1- Valorar el exceso de un sustrato determinado:

glucógeno, lípidos

2- Mostrar cambios estructurales no visibles con

técnicas histológicas

3- Evaluar los tipos de fibras musculares:

1, 2A, 2B, 2C

4- Ausencia de un enzima determinado

 OIl RED
Gotas lipidicas, lipofucsina

PAS
Tipos de fibras
Glucógeno (lisosomal, libre)
 HISTOQUÍMICA. PRINCIPIOS BÁSICOS IV

ENZIMAS OXIDATIVAS

• NADH (Nicotinamida adenina

dinucleótido)
– Patrón intermiofibrilar:
• Retículo sarcoplásmico
• Mitocondrias

• SDH (Succino-Deshidrogenasa)
– Mitocondrias

• COX-SDH (Citocromo oxidasa )

– Mitocondrias
 NADH

Central core Fibras apolilladas

Targets Fibras anulares

Miopatía mitocondrial

HE Gomori

SDH COX-SDH
Miopatía por agregados tubulares

HE TRI

NADH SDH
ATP-asas

9.4 4.6

Fibras Fibras Fibras Fibras

tipo 1 tipo 2a tipo 2b tipo 2c

ATPasa Marrón Marrón Marrón Marrón

9.4 claro oscuro oscuro oscuro
ATPasa Marrón Blancas Marrón Marrón
4.63 oscuro claro claro
ATPasa Marrón Blancas Blancas Marrón
4.35 oscuro claro

4.3
Atrofia por denervación

4.3
Atrofia neurógena
 HE PAS

Miofosforilasa Miofosforilasa
 Mioadenilato Desaminasa

CONTROL (MAD+) MAD NEGATIVO

Miopatía por déficit de MAD
 INMUNOHISTOQUÍMICA

• Permite visualizar y localizar proteínas específicas

 déficit primario
 déficit secundario

• Debe valorarse conjuntamente con las técnicas

histológicas e histoquímicas
 Guillaume- Benjamin
Amand Duchenne
(1806-1875)

1868: Paralysie pseudo-hypertrophique,

or myosclerotique, de l’Enfance
(Archives Générales de Médecine)
 ANTICUERPOS

• Espectrina • Merosina
• Distrofina (Dys 1, 2 y 3) • Alfa2-laminina
• DRP1 • Emerina
• DRP2 • LAMP2
• Alfa-SG • Caveolina
• Beta-SG • Miotilina
• Gamma-SG • Miosina (slow, fast)
• Delta-SG • Troponina PGP 9.5
• Alfa-DG • Colágeno VI
• Beta-DG • Notch 3
• Disferlina • Serie linfoide, desmina,
• Calpaína 3 marcadores vasculares,
actina, etc
 Duchenne

Distrofina

Espectrina Utrofina (DRP2, Control) Utrofina

 Becker

Dystrophin DRP
CMD

Merosin Spectrin
Emery Dreyfuss

Emerin Emerin, Control

 Emery Dreyfuss

Emerina, Control EDMD

Emerina, Control EDMD

 -DISTROGLICANO

Control

Antibody: clon VIA4 (glycosylated epytope)

 INMUNOHISTOQUÍMICA
DIFICULTADES DE INTERPRETACIÓN Y SOLUCIONES

• Interacción de varias proteínas (distrofina-sarcoglicanos;

disferlina-otras)

• Pueden obtenerse falsos resultados si se usa un único

anticuerpo

• La ausencia de una proteína puede dar lugar a la

sobreexpresión de otras (distrofina y dystrophin-related
protein)

• Las proteínas nucleares se expresan en cualquier tipo

de célula (emerina, lamina A/C)
 PRINCIPIOS PARA EL MANEJO DE LAS MUESTRAS

• LA MUESTRA DEBE SERVIR PARA TODOS LOS ESTUDIOS

• CUALQUIER MUESTRA DEBE PODER RETOMARSE EN EL

FUTURO (Bancos de tejidos y ADN)