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PRACTICA # 5

DETERMINACION DE ANTOCIANINAS EN EXTRACTO DE JAMAICA POR


CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

INTRODUCCIÓN

Los compuestos fenólicos son el grupo más extenso de sustancias no


energéticas presentes en los alimentos de origen vegetal. La capacidad de los
polifenoles para modular la actividad de diferentes enzimas, y para interferir
consecuentemente en mecanismos de señalización y en distintos procesos
celulares, puede deberse, al menos en parte, a las características
fisicoquímicas de estos compuestos, que les permiten participar en distintas
reacciones metabólicas celulares de óxido-reducción. Existen varias clases y
subclases de polifenoles que se definen en función del número de anillos
fenólicos que poseen y de los elementos estructurales que presentan estos
anillos. Los principales grupos de polifenoles son: ácidos fenólicos (derivados
del ácido hidroxibenzoico o del ácido hidroxicinámico), estilbenos, lignanos,
alcoholes fenólicos y flavonoides.
Las antocianinas son pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de
las células vegetales y que otorgan el color rojo, púrpura o azul a las hojas,
flores y frutos. Desde el punto de vista químico, las antocianinas pertenecen al
grupo de los flavonoides y son glucósidos de las antocianidinas, es decir, están
constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se
le une un azúcar por medio de un enlace glucosídico. Sus funciones en las
plantas son múltiples, desde la de protección de la radiación ultravioleta hasta
la de atracción de insectos polinizadores.
La extracción de antocianinas es comúnmente llevada a cabo con metanol o
etanol conteniendo una pequeña cantidad de ácido (15%, HCl 1M) con el
objetivo de obtener la forma del catión flavilio, el cual es estable en un medio
altamente ácido. Respecto a la separación e identificación de las antocianinas,
la técnica empleada más comúnmente hoy en día es la cromatografía líquida
de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) puesto que esta permite la
separación simultánea, la identificación y cuantificación de los compuestos de
antocianinas sin requerir pureza excesiva de los extractos (Escribano-Bailon et
al., 2004). Las columnas (diámetro interno 4.6 mm y largo 100-300 mm) son
usualmente mantenidas a temperatura ambiente, y los sistemas de elusión son
binarios, usando solventes acidificados acuosos tales como ácido acético,
ácido perclórico o ácido fórmico en un solvente orgánico tal como metanol o
acetonitrilo (Zhang et al., 2004; Horbowicz et al., 2008).

OBJETIVO
El alumno comprenderá los siguientes conceptos:
 Maceración para la extracción de flavonoides de material vegetal.
 Evaluación de un gradiente en cromatografía liquida
 Eficiencia de separación de pigmentos.
 Repetibilidad de una técnica cromatografica.
 Acondicionamiento de una columna cromatografica.
MATERIALES Y REACTIVOS
Equipo de cromatografía liquida con detector UV
Rotovapor
Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001
Pipetas de 10 y 5 mL
Vasos de precipitado de 50 y100 mL
Matraz Erlenmeyer de 250 mL
Columnas cromatográficas.
Columna RP-18 DE 250 mm x 4.6 mm ID con un tamaño de partícula de 5 µL
Alumina
Acetonitrilo grado HPLC
Agua grado HPLC
Metanol
Ácido fosfórico

Obtención del extracto (Maceración)

Para ello se pesan 2 g de muestra (Jamaica) y se vierten dentro de un matraz


Erlenmeyer de 250 mL con 10 mL de metanol acidificado al 1% con ácido
fosfórico. Se agita y se deja reposar por lo menos durante 4 horas.
Una vez que termine el tiempo de maceración el extracto se concentra hasta un
volumen de 20 mL mediante rotovapor.

Preparación de una columna cromatografica para la separación de los


pigmentos en el extracto de Jamaica.

Se empaca una columna cromatográfica con 10 g de alúmina activada (para


activar la alúmina se pone en la estufa a 120 °C durante toda la noche).

Método 1
La columna se activa y/o acondiciona con 15 mL de metanol acidificado al 1%
con ácido fosfórico.
Posteriormente se vierten 0.5 mL de extracto de Jamaica concentrado en la
superficie de la columna.
Se lava la columna con 15 mL de agua acidificada al 4% con ácido fosfórico.

Método 2
La columna se activa y/o acondiciona con 15 mL de acetonitrilo.
Posteriormente se vierten 0.5 mL de extracto de Jamaica concentrado en la
superficie de la columna.
Se lava la columna con 15 mL de agua acidificada al 4% con ácido fosfórico.

Evaluación de distintos gradientes

Para establecer las condiciones óptimas para la separación e identificación de


las antocianinas en el extracto de Jamaica se implementaran tres gradientes
distintos para ver cuál de ellos es el más eficiente.
Nota: antes de ser inyectados en el equipo de HPLC los extractos deben ser
filtrados con un filtro de teflón de 4 µm.
Gradiente 1

Tiempo Flujo
Paso %A %B CURVATURA
(min) (mLmin-1)

0 1 1.5 6 94
1 15 0.5 25 75 0
2 20 0.5 25 75 0
3 15 0.5 6 94 0

Fase A: acetonitrilo, fase B: Ácido fosfórico al 4% en agua.

Gradiente 2

Tiempo Flujo
Paso %A %B CURVATURA
(min) (mLmin-1)
0 1 1.5 0 100
1 10 0.5 100 0 0
2 5 0.5 100 0 0
3 15 0.5 0 100 0

Fase A: Ácido fosfórico al 4% en agua fase B: metanol acidificado al 1% con


ácido fosfórico.

Gradiente 3

Tiempo Flujo
Paso %A %B CURVATURA
(min) (mLmin-1)
0 1 1.5 0 100
1 10 0.5 100 0 1
2 5 0.5 100 0 1
3 15 0.5 0 100

Fase A: Ácido fosfórico al 4% en agua fase B: metanol acidificado al 1% con


ácido fosfórico. La longitud del detector debe ser de 520 nm.

Reporte de resultados
Determinar las áreas de cada pico observado. Evaluar la separación de los tres
pigmentos.
Discutir la eficiencia de cada método empleado con base en la separación y
repetibilidad de la técnica.

BIBLIOGRAFIA

Escribano-Bailon M. T., Beulga-Santos C. y Rivas-Gonzalo J. C. 2004.


Anthocyanins in Cereals. Journal Chromatography, 1054:129-141.
Horbowicz M. Kosson R., Grzesiuk A. y Debski H. 2008. Anthocyanins of Fruits
and Vegetables-their occurrence, analysis and role in human nutrition.
Vegetables Crops Research Bulletin, 68:5-22.

Zhang Y., Jayaprakasam B., Seeram N. P., Olson L. K., Dewitt D. y Nair M. G.
2004. Insulin Secretion and Cyclooxygenase Enzyme Inhibition by Cabernet
Suavignon Grape Skin Compounds. Journal Agricultural and Food Chemistry,
52:228-233.