Arabia Diario de Ciencias Biológicas 26 (2019) 1247-1252

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Artículo original

Morfológica, bioquímica y molecular identificación de bacterias hidrocarburos de petróleo de

biodegradación aislados a partir de aceite contaminado suelo en Dhahran, Saud Saudita

Fahad A. Al-Dhabaan
Departamento de Biología, Ciencias y Humanidades College, Universidad de Shaqra, Alquwayiyah, Arabia Saudita

información del artículo resumen

Historia del artículo: La acumulación de hidrocarburos de petróleo residual considerado como un problema ambiental importante en el Reino de Arabia Saudita
Recibido el 20 de de marzo de 2018 Revisado 20 de
causa de los intensos esfuerzos para la detección de aceite. Hasta ahora, en situ biodegradación considera el método más eficaz para la
mayo de 2018 Aceptado el 31 de de mayo de 2018
biodegradación de hidrocarburos de petróleo residual. El objetivo de este estudio es el aislamiento y la identificación de bacterias de capacidad
Disponible en Internet el 31 de mayo de 2018
biodegradable de sitios contaminados en Khurais aceite de campo, Dhahran, Saud Saudita a través de diferentes morfológica y métodos
bioquímicos y moleculares. Además, se evaluaron nivel de degradación en un medio líquido contaminado y el suelo. Tres cepas bacterianas
fueron seleccionados de suelos de petróleo contaminado de Khurais fi aceite ELD en función de su capacidad de crecer en la existencia de
palabras clave:
componentes de hidrocarburos y identi fi ed según morfológica, bioquímica. Curiosamente, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus
Khurais aceite de campo
cereu. árbol filogenético se construyó y similitud genética se calculó de acuerdo a los resultados de alineaciones. patrones de biodegradación
La biodegradación de hidrocarburos
componentes
para diferentes tres cepas fueron reflejados variada capacidad de degradación para los tres aislados con respecto al tiempo de incubación.
Las pruebas bioquímicas Diferentes características fueron estudiados durante tres cepas bacterianas y biodegradar identificada como
características morfológicas

Universal 16S rDNA cebadores

Degradación%

Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus. Notables velocidad de degradación% pautas de hidrocarburos residuales se
registraron para los tres aislamientos con variada.
2018 El Autor. Producción y hospedaje por Elsevier en nombre de la Universidad Rey Saud. Este es un artículo de acceso abierto bajo la
licencia CC BY-NC-ND licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

1. Introducción
Petróleo (crudo) El aceite se ven agravados de la mezcla de miles compuestos. 50-98% de
petróleo crudo es hidrocarburos de petróleo que consideran un componente importante dependiendo
de la fuente del aceite. Diferentes microorganismos se podrían aplicar para la biodegradación de
petróleo de hidrocarburos. Sin embargo, las bacterias consideradas importantes microorganismos
biodegradables que desempeñan un papel crítico en la degradación de hidrocarburos ( Udgire et al.,
2015 ).
Una de la iniciativa e fi ciente, los mecanismos de tratamiento económicos y ambientales para la
biodegradación de petróleo está en situ biodegradación a través de petróleo degrade y otros
hidrocarburos a partir de cultivo a través de microorganismos y ampliamente distribuidas
Producción y hospedaje por Elsevier
CC BY-NC-ND licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ). La revisión por pares bajo la responsabilidad de la Universidad Rey Saud.
aplicada para suelos contaminados con hidrocarburos variados y aguas ( Margesin y Schinner, 1997;
Whyte et al., 1997 ). Así, la evaluación continua de velocidad de biodegradación considera una crítica
necesaria para los diferentes microorganismos biodegradables ( Alquati et al., 2005 ). iluminación
biodegradable Petróleo hidrocarburos depende de los microorganismos autóctonos para transformar
o mineralizar los contaminantes orgánicos ( Figura 1 ). Muchos factores diferentes de caracterizar el
suelo contaminado en hidrocarburos influencia de petróleo de biodegradación bacteriana tales como
pH, conductividad eléctrica, nitrógeno total y de metales pesados ​que son indicadores importantes de
la calidad del suelo, la fertilidad y la productividad. Ocho bacterias degradantes de hidrocarburos se
específica detectaron camente como Alcaligen sp, Bacilo sp, Chromobacterium
sp, Corynebacterium sp, Pseudomonas sp, Aeromonas sp, Serratia
sp, y Flavobacterium sp. ( Gayathiri et al., 2017 ). Recientemente, muchas técnicas de cultivo
dependiente moleculares avanzados (como clon biblioteca, TGGE / DGGE, LH-PCR, RISA,
RT-Q-PCR, FISH, RAPD y RFLP) se desarrollaron y se consideran una herramienta útil para el
aislamiento y identificación de nuevas cepas bacterianas con capacidades de degradación ( Stancu,
2018 ). puntos de gran alcance para Molecular especialmente, ADNr dependientes de métodos para
identificar microorganismos son rapidez, precisión y

Dirección de correo electrónico: aim19806150@gmail.com

https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2018.05.029
1319-562X / 2018 El Autor. Producción y hospedaje por Elsevier en nombre de la Universidad Rey Saud. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia
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Figura 1. condiciones detectable para las tasas de degradación de hidrocarburos en el suelo, el agua dulce y ambientes marinos.

análisis de la fiabilidad de los cultivos microbianos en comparación con las técnicas de cultivo
tradicionales dependientes, bioquímicos, por lo tanto técnica molecular tiene un gran potencial para
bacteriana identificación en una nueva era. 16S rRNA específico marcador molecular se ha
construido para identificar específicos c genes bacterianos ( Wang et al., 1996; Wheeler et al., 1996 ),
Que dedicado a dos métodos. En primer lugar, diseñado para amplificar un amplio espectro de
secuencias bacterianas ( Teske y col., 1996; Marchesi et al., 1998 ).

Esta investigación se llevó a cabo para identificar las cepas microbianas aisladas de los suelos
contaminados con aceite a través del estudio extenso que consiste en método fi toma de huellas
digitales morfológica, bioquímica y molecular. Además, se evaluaron hidrocarburos capacidades de
biodegradación para aislados fi cados a través estimado velocidad de degradación% durante el
tiempo de incubación.

2. Materiales y métodos

2.1. colección de muestras de suelo

En esta investigación, se recogieron aproximadamente 10 g de muestras de suelo contaminadas

Figura 2. Khurais aceite de campo, Dhahran, Arabia Saudita.
por aceite de las diversas ubicaciones de Khurais aceite de campo ( Figura 2 ) Con una superficie de
2.890 kilometros 2, 250 kilometros al suroeste de Dhahran y 150 km al este-noreste de Riad, 25.0715 N,
48,0556 E), Arabia Saudita en 2018. Después de sacar 5 cm de suelo superficial se recogieron a una
y transferir en nutrientes cultivos inclinados de agar para morfológica, bioquímica y molecular
profundidad de 20 cm. bolsas de polietileno de estériles se utilizaron para las muestras de la reserva
identificación.
y almacenados bajo 20 C. Un gramo de suelo fue licuado ed fi en ml diez de agua doblemente
destilada para preparar suspensiones de suelo.

2.3. Bacterial aislamientos identificación y caracterización

2.3.1. caracterización morfológica

2.2. El aislamiento bacteriano de suelo aceite contaminado
Para bacterias degradantes del petróleo crudo aislar, se utilizó la técnica de enriquecimiento a
través añadido 5 g de tierra contaminada con petróleo a 500 ml de medios de sales minerales en
esterilizada Erlenmeyer fl pregunta. única fuente de carbono se aplicó como 2,000 metro l de petróleo
crudo y se incubaron con agitación durante 7 días a temperatura ambiente. Entonces, diez veces
diluciones en serie se realizaron para suspensión de la muestra de enriquecimiento y un mililitro de
cada dilución se vertió en aceite placas de agar a las bacterias que utilizan petróleo crudo aislar y se
incubaron a 30 C durante 3-7 días. Subcultivo repetido de colonias puras seleccionadas en placas de
agar de aceite
Color, la forma, la transparencia y el margen se examinaron y se registran como colonias
características morfológicas según
Cheesbrough (1991) . Las características microscópicas se registraron para todos los aislados mediante el
protocolo de tinción de Gram.
2.3.2. caracterización bioquímica
2.3.2.1. prueba de oxidasa. colonia bacteriana Probado estaba manchada sobre el papel filtro
previamente saturado con el reactivo de oxidasa recién preparado. prueba de oxidasa positiva se
registró como el desarrollo de un color azul-púrpura dentro de los 10 s ( Cheesbrough, 1991 ).
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2.3.2.2. prueba de la catalasa. Burbujas de gas detectar dentro de 10 s después de añadido purificó
cultivo bacteriano a 5 ml de solución de peróxido de hidrógeno, considerado como una prueba de la
catalasa positivo ( Cheesbrough, 1991 ).
2.3.2.3. prueba de ureasa. Inclinados dos mililitros de medio de urea que colocan en botellas de bijou
aplican para la colonia bacteriana se incubaron a temperatura ambiente. El color rojo-rosa en el
medio se consideró como un resultado positivo para la inducción de la ureasa ( Cheesbrough, 1991 ).
2.3.2.4. prueba de indol. Apariencia del color rojo y de color amarillo brillante que compone después
de añadieron 0,5 ml de reactivo de Kovac para cultivo bacteriano se incubó a 35 C durante 24 h en
medios SIM indicado un resultados positivos y negativos, respectivamente ( Cheesbrough, 1991 ).
2.3.2.5. Simmons prueba de citrato. prueba Simmons citrato se realizó a través de inculcar placas
Simmons citrato de agar (TSBA, Himedia) superficie con cultivos bacterianos luego, se incubaron a
37 C hasta 48 h. el cambio de color del material de verde a azul brillante indican reacción positiva.
2.3.2.6. Rojo de metilo prueba (MR). Después de la adición de solución de indicador de rojo de metilo
(TSBA, Himedia) a los medios de cultivo de inoculados y la incubación a 35 C durante un máximo de
4 días, el cambio de color a rojo indicar prueba MR aparición positiva de las bacterias ensayadas ( Color
de Atlas y Libro de texto de diagnóstico Microbiología, 2016 ).
2.3.2.7. la hidrólisis de gelatina. stabmethodwas de gelatina de nutrientes aplicados según Edison et
al. (2012) . inóculos pesada de una bacteria de ensayo se inocularon en tubos que contienen gelatina
de nutrientes, licuefacción de la gelatina es de los resultados positivos para la hidrólisis de gelatina
bacteriana.
Fig. 3. Características morfológicas y de tinción de Gram para tres cepas bacterianas A, B y C aislados a partir de aceite Khurais, Dhahran, Arabia Saudita.
1249
2.3.3. fi Molecular toma de huellas digitales como con fi rmación identificación técnica
EZNA Bacterial DNA Kit (Omega Bio-Tek, D3350-01, EE.UU.) se aplica para extraer el ADN
genómico bacteriano total. cebadores universales 16S ADNr (27 F, 5-AGAGtttGAtcAtGGctcAG-3 y
1492
R, 5-tAcGG ttAccttGttAcGActt-3) se aplicaron para bacteriana identificación mediante la técnica de
PCR con la focalización tamaño de fragmento 1400 pb. condiciones del ciclador térmico se diseñan
como 94 C durante 5 min, 3 ciclos a 94 C durante 45 s, 57 C durante 30 s, 72 C durante 120 s; 3
ciclos a 94 C durante 45 s, 56 C durante 30 s, 72 C durante 120 s; 3 ciclos a 94 C durante 45 s, 55 C
durante 30 s, 72 C durante 120 s; 26 ciclos a 94 C durante 45 s, 53 C durante 30 s, 72 C durante 120
s; y una etapa final fi a 72ºC durante 5 min ( Linderman, 1998 ). 1,5% de gel de agarosa que se aplicó
para detectar amplificado amplicón de fragmento 16S rDNA que eluye (EZN
A. Gel Extraction Kit, Omega Bio-Tek D2500-01, EE.UU.), secuenciado y alineación a través de la
comparación con otras secuencias de base de datos de banco de genes utilizando BLAST ( www.ncbi.nlm.nih.gov/
) Para bacteriana catión identi fi ( Stach et al., 2001 ).
2.4. biodegradación estudios
2.4.1. La degradación en medio líquido
Broth (LB) medio líquido que contiene 1% de aceite bruto se aplicó para el cultivo y la incubación
de tres investigados aislado a 37ºC. velocidad de degradación% se evaluó espectrofotométricamente
de acuerdo con el método descrito por ODU (1972) .
2.4.2. La degradación de los suelos contaminados
Para la obtención de muestra de suelo con la concentración de 1% de petróleo crudo, cinco
gramos de secado, tamizado y esterilización de suelos contaminados, se mezcló con solución de
aceite contaminado y inoculumwas añadió 1% y se cultivó a 30 C durante un mes. tasa de
degradación de aceite se evaluó método de ponderación semanal y el suelo libre de gérmenes se
consideró como el control.
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tabla 1
morfológica colonia cuenta con tres cepas bacterianas.

aislamientos Talla tinción de Gram Color Formar Margen

UN varillas + Blanco crema fl circular en Todo

si barras cilíndricas blanco grande irregular Ondular
C varillas + Blanco crema fl circular en Todo

Tabla 2
Tres aislamientos bacterianos bioquímicos resultado de pruebas.

aislamientos prueba de oxidasa prueba de la catalasa Simmons prueba de citrato prueba de indol Rojo de metilo prueba (MR) prueba de ureasa La hidrólisis de gelatina

Bacillus subtilis Variable (+) (+) () () () (+)

(UN)

Pseudomonas aeruginosa (+) (+) (+) () () () (+)

(SI)
Bacillus cereus () (+) (+) () () () ()
(C)

3. Resultados y discusión Bacilo sp. Por otro lado, positivo para las pruebas de oxidasa y catalasa y negativa para indol y
pruebas de ureasa se refiere a Pseudomonas sp. oxidasa negativo, las pruebas de indol y ureasa y

3.1. aislamiento Strain y identificación prueba de catalasa positiva comentaron tercer aislado como Bacillus cereus. Las pruebas realizadas
morfológica características de las colonias de examen (tinción de Gram, la movilidad y la motilidad,

Se seleccionaron y aislaron de muestras contaminadas de suelo de Khurais aceite de campo, forma y color) y bioquímicos (catalasa, ureasa, las actividades de oxidasa, reducción de nitrato, de

250 km al suroeste de Dhahran y 150 km al este-noreste de Riad, Arabia Saudita e inicialmente producción Idol, producción de gas / ácido a partir de carbohidratos y de fermentación de los

etiquetados como A, B y C. Tres bacterias de degradadores aceite diferentes Fig. 3 y tabla 1 azúcares) para identificar nuestra degradación Hidrocarburos aislamientos se consideraron un
tradicionalmente identi métodos fi cación ( Ventosa et al., 1982; Smibert y Krieg, 1994; Claus y

ilustra las características morfológicas de los aislados. Aislar un fue distinguido con la barra, blanco Berkeley, 1986; Udgire et al., 2015 ).

cremoso, fl circular en y margen entero. Por contrario, B aislados caracteriza por tamaño cilíndrica
varillas, forma grande blanco, irregular, tinción de Gram negativo y el margen ondulado. Varillas de
tamaño, de color blanco cremoso, FL Circular en, margen entero y características positivas tinción de
Gram caracterizan C. aislado 16S rDNA fi método que realiza para identificar hidrocarburos bacterias de degradación toma de
huellas digitales se basa en regiones altamente conservadas, que ayuda en el análisis. Casi 1,4 Kb

Basado en ensayos bioquímicos (como se muestra en Tabla 2 ) Y previ- de amplicones específicos se ampli fi ed, se eluyó y se secuenció ( La Fig. 4 ). En cuanto a las

examen morfológico ous, tres aislados dirigidos refleja diferentes características bioquímicas. características morfológicas, bioquímicas y moleculares para tres aislados de

Positiva para la prueba de oxidasa y negativo para la catalasa, indol y pruebas de ureasa identi fi ed hidrocarburos-degradantes obtenidos (como se muestra por Tabla 3 ), La cepa A fue identificado como

aislar una como ed Bacillus subtilis con 99% de porcentaje de homología y la tensión B era identi fi ed como Pseudomonas
aeruginosa

con 100% y de porcentaje de homología. En tercer lugar aislado (C) fue identi fi ed como Bacillus
cereus con 99% de porcentaje de homología. Como se muestra por una La Fig. 5 , Se construyó árbol
filogenético Vecino a participar basado en secuencias de genes 16S rRNA para nuestra obtención de
tres aislados bacterianos basado en ADNr 16S secuencia de alineaciones resultados. Se detectó la
similitud altamente genética entre nuestros aislados bacterianos (A), (B) y (C), que identi fi ed como Bacillus
subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus y diferentes cepas para

Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus lo que indica nuestros resultados de
identi fi cación. Nuestros obtención de resultados para las secuencias de 16S rRNA aplicados para bacterias
hidrocarbonoclásticas (HCB) fue de conformidad de. Compararon la capacidad limitada de la técnica
basada en la PCR, tal como la lisis celular capacidad sesgos, una variación del número de copias de
rRNA o diferentes plantillas ampli fi cación e fi ciencia con estudios basados ​en la PCR que
considerarse como un procedimiento importante para clasificar la diversidad microbiana. Con base
en los hallazgos anteriores, los genes 16S rRNA consideran un método eficaz para obtener una
asociación entre taxonómica identificación con capacidad de hidrocarburos degradantes. Más apoyo
esta en nuestro sequenc-
La Fig. 4. Ampli producto ed fi de 16S rDNA de tres cepas bacterianas (A), (B), (C) y control negativo (N).

Tabla 3
datos de 16S rDNA secuenciación del aislado cepas A y B de los suelos contaminados en Khurais aceite de campo; Arabia Saudita.

número de cepa Longitud total (pb) Gen adhesión banco no. Identi fi cación % de identidad

UN 1440 KC197028.1 Bacillus subtilis 99

si 1417 MG818964.1 Pseudomonas aeruginosa 100
C 1500 KR071870.1 Bacillus cereus 99
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La Fig. 5. árbol filogenético para tres degradación de aislados bacterianos de petróleo hidrocarburos basa en la secuencia de 16S rDNA.

ING identi fi cación de datos en base a los hallazgos de Wie˛ckowicz (2009) a través de la limpieza e
fi ciencia de una técnica de secuenciación para bacteriana identificación a través de secuencias
alineaciones inferior al 3%. Más luz esta en nuestro hallazgos por Subathra et al. (2013) a través de
aplicarse tanto bioquímicamente y métodos filogenéticamente para identificar 3 bacterias de
biodegradación del petróleo crudo como aislamientos Bacillus subtilis I1, Pseudomonas aeruginosa I5
Degradación%

e Pseudomonas putida I8. Además, nuestros obtención de resultados para la aplicación de pruebas
bioquímicas y secuencias de 16S rRNA para identificar Petróleo-degradantes bacterias estaban de
acuerdo de Godini et al. (2018) . Se identi fi cada

Brevibacillus sp., oxydans Microbacterium, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus warneri, Methylobacterium

persicinum, y Achromobacter xylosoxidans como bacterias degradantes en la luz de los resultados de
identi fi cación bioquímicos y moleculares. 7 14 21 24

la duración de la incubación por día

La Fig. 7. Degradación dendograma de hidrocarburos de petróleo de 7, 14, 21 y 24 días para Pseudomonas

aeruginosa en medio líquido y en el suelo contaminado.
Degradación%

Degradación%

0
7 14 21 24 7 14 21 24

la duración de la incubación por día la duración de la incubación por día

La Fig. 6. Degradación dendograma de hidrocarburos de petróleo de 7, 14, 21 y 24 días para Bacillus subtilis en La Fig. 8. Degradación dendograma de hidrocarburos de petróleo de 7, 14, 21 y 24 días para Bacillus cereus en
medio líquido y en el suelo contaminado. medio líquido y en el suelo contaminado.
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Tabla 4
% De degradación de los hidrocarburos del petróleo de los aislados Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus en medio líquido y en el suelo contaminado después de 7, 14, 21 y 28 días de incubación.
incubación días muestras Degrative
7 Medio líquido
suelos contaminados
14 Medio líquido
suelos contaminados
21 Medio líquido
suelos contaminados
28 Medio líquido
suelos contaminados
3.2. Evaluación de hidrocarburos tasa de degradación%
Se monitorizaron diferentes patrones, registran y detectan para la tasa de degradación de
Hidrocarburos en medios líquidos y el suelo para Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus
cereu, como se muestra Higos. 6-8 y Tabla 4 . En general, la tasa de degradación en el suelo
contaminado era superior en comparación con medios líquidos. Hidrocarburos velocidad de
degradación de Bacillus subtilis fue aumentando gradualmente el tiempo de incubación. velocidad de
degradación% fue de 20, 38, 50, 52 y 25,
30, 55, 70 después de 7, 14, 21 y 28 días de hidrocarburos de la incubación con medios líquidos y
suelo contaminado respectivamente. Curiosamente, Hidrocarburos de incubación en medios líquidos
para 14 días fue superior para la tasa de biodegradación% comparando con hidrocarburos de
incubación de suelo contaminado.
Pseudomonas aeruginosa
observado con baja tasa de degradación de Hidrocarburos% para 14 y 21 días de incubación en
comparación con Hidrocarburos velocidad de degradación de Bacillus subtilis. tasa de degradación
única distingue Hidrocarburos Bacillus cereus con mayor velocidad de degradación% después
21dayes de incubación y disminución repentina después de 28 días de incubación. Nuestros
hallazgos de petróleo crudo residual en comparación cuantitativamente con muestra de control
fueron reflejada variada biodegradación capacidad para diferentes géneros bacterianos para tiempo
de incubación variada ( Mirdamadian et al., 2010 ).
4. Conclusión
Tres cepas bacterianas aislar del suelo contaminado de Khurais fi aceite eld Dhahran, Arabia
Saudita se aislaron y se caracteriza por la capacidad de degradación de los hidrocarburos. Bacterial
identificación se llevó a cabo a pesar de métodos morfológicos y bioquímicos y confirmado a través
de
16S rDNA secuencia fi método toma de huellas digitales como Bacillus subtilis, Pseudomonas
aeruginosa y Bacillus cereus. Se evaluó la capacidad distinguible para la degradación de los
hidrocarburos durante tres aislados que refleja variada velocidad de degradación% patrones.
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Degradación%
Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa Bacillus cereus
20 15 19
25 dieciséis 25
38 20 20
30 32 27
50 30 55
55 38 68
52 56 46
70 68 50
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