Cuestionario:
¿Qué compuestos se pueden analizar por HPLC?
El HPLC es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose en diferentes
tipos de interacciones químicas entre las sustancias
analizadas y la columna cromatográfica. Existen
diversos Campos de Aplicación de HPLC en las cuales
se pueden analizar diferentes compuestos, por
ejemplo:
Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides,
analgésicos
Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos,
lípidos
Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
Productos de la industria química: Aromáticos
condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre,
narcóticos
Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de
drogas, extractos de orina, estrógenos
Describa el detector y columna empleada en esta
experiencia de laboratorio
Los detectores empleados en HPLC se han diseñado,
adaptado y perfeccionado con el fin de
incorporar celdas de flujo que permitan medir las
bajas concentraciones de analito que hay en el
líquido. Los distintos detectores se clasifican según se
encarguen de medir una propiedad del soluto o de la
disolución.
En esta experiencia el detector utilizado fue el
Detector de Índice de Refracción. Mide la diferencia
en el índice de refracción cuando la fase móvil está
limpia y cuando trae el soluto. En este detector no se
puede hacer cambio de fase móvil durante la corrida.
Sin embargo, no pueden emplearse en elución con
gradiente, sus medidas se ven afectadas por los
cambios de temperatura y no son tan sensibles. Su
límite de detección se sitúa entre 100 y 1.000 ng.
En este caso la columna utilizada fue una columna de
cromatografía de fase reversa que se basa en el
principio de las interacciones hidrofóbicas que
resultan de las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar.
La fuerza conductora en la unión del compuesto a la
fase estacionaria es la disminución del área del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente
3. ¿Qué tipo de inyector y bomba se empleó en la
práctica de laboratorio?
En este laboratorio se empleó un inyector manual
(jeringa): En este tipo de inyectores, la introducción
de la muestra en la columna se realiza por medio de
una jeringa cuya aguja entra en el sistema
cromatógrafo a través de una membrana (´´septum´´),
lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la
columna.
Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su
facilidad de construcción y en que permiten sacar
todo el partido a la eficacia ofrecida por la columna,
por el contrario, son inyectores que presentan una
gran falta de reproducibilidad, tienen una presión de
trabajo limitada y son de gran dificultad de manejo .
Además, se utilizó una bomba isocrática significa que
solo tiene un canal de disolvente; es decir, no se
puede modificar la composición durante un método
porque no hay una válvula de gradiente multicanal
(MCGV).
4. Mencione algunas ventajas del HPLC
El HPLC es un proceso automático que toma sólo unos
pocos minutos para producir resultados. Esta es una
marcada diferencia en la cromatografía líquida que
utiliza la gravedad en lugar de una bomba de alta
velocidad para forzar compuestos a través de un tubo
densamente empaquetado. Los resultados obtenidos
son de una alta resolución y son fáciles de leer, y las
pruebas se reproducen con facilidad a través del
proceso automatizado.
¿Qué tipo de columnas se pueden emplear para el
análisis de carbohidratos?
6. ¿Qué tipo de pretratamiento requieren las
muestras y la fase móvil antes de ser
inyectadas o empleadas en el HPLC?
Las muestras deben ser filtradas y desgasificada por
un sonicador como también a la fase móvil para que
así este no lleve partículas que puedan dañar la
columna del HPLC.
7. Describa brevemente los diferentes tipos de
inyectores y bombas a emplear en un HPLC.
8. Mencione algunos detectores que se pueden usar
en un HPLC.
DETECTOR DE ABSORCIÓN UV-VISIBLE
El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través
de una pequeña celda, de pequeño volumen (entre 1
a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda.
La medida de la absorbancia del líquido que la
atraviesa en función del tiempo constituye el
cromatograma. Su límite de detección oscila entre 0’1
y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de elución
en gradiente.
DETECTOR DE ABSORCIÓN INFRARROJA
Las celdas empleadas en estos detectores
son similares a las empleadas en los detectores de
absorción UV-vis, excepto por las ventanas ópticas,
que en este caso son de cloruro de sodio o de fluoruro
de calcio.
Se emplea en aquellos analitos que absorben
radiación infrarroja (IR, cuya longitud de onda supera
los 700 nm), por lo que se debe prestar atención al
disolvente utilizado, ya que muchos de ellos también
absorben estas radiaciones.
Los detectores más sofisticados se basan en
instrumentos de transformada de Fourier (FTIR). El
límite de detección es de 1.000 ng y también pueden
emplearse en cromatografía de elución en gradiente.
DETECTOR DE FLUORESCENCIA
Se basan en la capacidad de algunos solutos capaces
de emitir fluorescencia, o de aquellos que no lo
son pero pueden hacerlo tras un tratamiento
adecuado (derivatización).
Los más sencillos emplean una fuente de excitación de
mercurio y uno o más filtros para aislar la radiación
fluorescente. Los instrumentos más sofisticados
consisten en una fuente de radiación de xenón y
emplean un monocromador de red para aislar la
radiación fluorescente.
Son muy sensibles, siendo su límite de detección de
0’001-0’01 ng y también se pueden utilizar en elución
con gradiente.
DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN
En este caso miden una propiedad de la disolución,
como es la variación en su índice de refracción como
consecuencia de la presencia de un soluto.
Este tipo de detectores constan de una cubeta con
dos compartimentos separados por una placa de
vidrio, por uno de los cuales solamente pasa fase
móvil, como referencia, y por el otro pasa el eluato
que abandona la columna y que contiene la muestra.
Sobre la cubeta se irradia un haz de luz que se desvía
cuando la muestra aparece en el líquido eluido de la
columna.
Son detectores universales y no dependen del
caudal de fase móvil. Sin embargo, no pueden
emplearse en elución con gradiente, sus medidas se
ven afectadas por los cambios de temperatura y no
son tan sensibles. Su límite de detección se sitúa entre
100 y 1.000 ng.
DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ
La dispersión se produce por la interacción de la
radiación electromagnética con la materia. El eluato
que abandona la columna se nebuliza mediante un
flujo de nitrógeno o de aire y se vaporiza la fase móvil,
quedando únicamente unas finas gotitas de soluto sin
evaporar. La nube de partículas de analito pasa a
través de un haz de láser y la dispersión producida es
detectada por un fotodiodo de silicio.
Este detector responde a todos los solutos menos
volátiles que la fase móvil y su límite de detección se
encuentra entre 0’1 y 1 ng.
DETECTOR ELECTROQUÍMICO
Este tipo de detectores responden a analitos
susceptibles de reducirse u oxidarse, como fenoles,
aminas aromáticas, peróxidos, cetonas, aldehídos,
compuestos halogenados, nitroderivados.
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Estos detectores se basan en los cambios de
conductividad de la fase móvil en presencia de
moléculas de analito. Están formados por una celda
asilada que contiene dos electrodos sobre los que se
aplica una diferencia de potencial, de manera que se
mide la resistencia que ofrece la mezcla eluida, la cual
está relacionada con su concentración.
Este detector es útil para la determinación de analitos
iónicos. Su límite de detección se encuentra entre 0’5
y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no
puede emplearse en elución en gradiente.
DETECTOR ACOPLADO A ESPECTRÓMETRO DE MASAS
El principal problema que surge al acoplar un
espectrómetro de masas al cromatógrafo HPLC es la
enorme cantidad de disolvente que acompaña al
analito, para lo cual se han desarrollado diversas
interfases:
Termovaporizador (termospray): con esta interfase se
vaporiza el eluato y se forma un aerosol, formado por
moléculas de disolvente y de analito. Mediante
un mecanismo de ionización química, se ioniza el
analito y los iones son conducidos hacia el
espectrómetro y el disolvente es expulsado mediante
una bomba. Los analitos deben ser termoestables y
polares.
Interfase de ionización química a presión
atmosférica (APCI): utiliza calefacción y nitrógeno para
convertir el eluato en aerosol, del que se evapora el
disolvente. Mediante una descarga eléctrica el analito
se convierte en iones que son conducidos hacia el
espectrómetro de masas.
Interfase de ionización por
electronebulización (electrospray): el eluato pasa a
través de un capilar metálico, en cuya salida se aplica
un fuerte campo eléctrico a la vez que una corriente
coaxial de nitrógeno gaseoso, con lo que se crea un
fino aerosol de partículas cargadas.
9. ¿Qué significa trabajar en modo isocrático y en
modo gradiente?
Modo isocratico significa que el solvente conserva la
misma concentración durante todo el tiempo de
corrida (muestreo o análisis), sea que se trate de un
solvente puro o de mezclas de solventes.
Modo gradiente Una mejora introducida en la técnica
de HPLC descrita fue la variación en la composición de
la fase móvil durante el análisis, conocida
como elución en gradiente.
10. ¿En qué consiste la cromatografía de reparto en
fase normal y fase reversa?
Cromatografía de fase normal La cromatografía
de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el
primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de
la química, y se caracteriza por separar los
compuestos sobre la base de su polaridad. Esta
técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase
móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de
interés es bastante polar. El compuesto polar se
asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza
de adsorción aumenta a medida que aumenta la
polaridad del compuesto y la interacción entre el
compuesto polar y la fase estacionaria polar (en
comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de
retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los
grupos funcionales del compuesto de interés, sino
también en factores estéricos de forma que los
isómeros estructurales a menudo se pueden
diferenciar el uno del otro. La utilización de
disolventes más polares en la fase móvil disminuye el
tiempo de retención de los compuestos mientras que
los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar
el tiempo de retención.
La NP-HPLC cayó en desuso a los años 1970 con el
desarrollo del HPLC de fase reversa o reversed-phase
HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los
tiempos de retención puesto que los disolventes
próticos cambiaban el estado de hidratación de la
silica o alúmina de la cromatografía.
Cromatografía de fase inversa (o reversa) La
HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad
moderada. Una de las fases estacionarias más
comunes de este tipo de cromatografía es la silica
tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena alquil
tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retención es
mayor para las moléculas de naturaleza apolar,
mientras que las moléculas de carácter polar eluyen
más rápidamente.
El tiempo de retención aumenta con la adición de
disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la
introducción de disolventes más hidrofóbicos. La
cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a
menudo se lo denomina HPLC sin ninguna
especificación adicional. La cromatografía de fase
reversa se basa en el principio de las interacciones
hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión
entre un disolvente relativamente polar, un
compuesto relativamente apolar, y una fase
estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión
del compuesto a la fase estacionaria es la disminución
del área del segmento apolar del analito expuesto al
disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por
el aumento de la entropía, y la consecuente
disminución de la energía libre, asociada con la
minimización de la interfase compuesto-disolvente
polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición
de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el
coeficiente de partición de forma que el compuesto se
mueve por la columna y eluye.
Describa el detector y columna empleada en esta
experiencia de laboratorio.
R// El detector de ionización de llama es
un detector utilizado en cromatografía de gases. Es
uno de los detectores más usados y versátiles.
Básicamente es un quemador de hidrógeno/oxígeno,
donde se mezcla el efluente de la columna (gas portador
y analito) con hidrógeno. Inmediatamente, este gas
mezclado se enciende mediante una chispa eléctrica,
produciéndose una llama de alta temperatura. La
mayoría de compuestos orgánicos al someterse a altas
temperaturas pirolizan y se producen iones y
electrones, que son conductores eléctricos. Este hecho
se aprovecha estableciendo una diferencia de potencial
de unos centenares de voltios entre la parte inferior del
quemador y un electrodo colector situado por encima
de la llama.
la columna es columna capilar La longitud de estas
columnas es variable, de 2 a 60 metros, y están
construidas de acero inoxidable, vidrio, silice fundida
o teflón. Debido a su longitud y a la necesidad de
introducirlas en un horno, las columnas suelen enrollarse
en una forma helicolidal con longitudes de 10 a 30 cm,
dependiendo del tamaño del horno.
¿Cuál es el propósito de la fase móvil? ¿Cuál es la fase
móvil utilizada en este
laboratorio?
R//
Compare y contraste GC con cromatografía líquida de
alto rendimiento (HPLC).
R// La diferencia clave entre HPLC y GC es
que HPLC utiliza una fase estacionaria
sólida y una fase móvil líquida, mientras
que GC utiliza una fase estacionaria
líquida y una fase móvil gaseosa.
HPLC y GC son ambos métodos de
separación de compuestos de una mezcla.
Mientras que HPLC se refiere a la
cromatografía líquida de alta presión, GC
es simplemente cromatografía de gases.
Por lo tanto, la HPLC se aplica a los
constituyentes que son fluidos, pero la GC
es útil cuando los compuestos son
gaseosos o los compuestos que se
vaporizan durante el proceso de
separación. Sin embargo, ambos tienen el
mismo principio subyacente de que las
moléculas pesadas fluyen más lentamente
que las más ligeras
Describa los componentes principales de un GC.
R//
Describa las dos modalidades de inyección en GC.
R//
6. ¿Como puede usted incrementar la volatilidad de
un compuesto para que pueda
analizarlo por GC?
R//
¿Cuál es la función del gas hidrógeno y el aire en GC?
R// Un detector de ionización de llama suele
utilizar una llama de aire o hidrógeno por la
cual se pasa la muestra para oxidar las
moléculas orgánicas y que produce partículas
con carga eléctrica (iones). Los iones se
recogen y se produce una señal eléctrica, que
se mide a continuación.
Como es habitual también en otras técnicas
de cromatografía de gases, se necesita un
gas portador con pocas impurezas de agua y
oxígeno, ya que el agua y el oxígeno pueden
interactuar con la fase estacionaria y
provocar problemas significativos, como un
elevado ruido de línea base y purga de la
columna en el cromatograma de gases de
salida, lo que reduciría la sensibilidad del
analizador y la vida útil de la columna. El
detector de ionización de llama es además
extremadamente sensible a las impurezas de
hidrocarburo del suministro de hidrógeno y
aire de la llama. Estas impurezas pueden
aumentar el ruido de línea base y reducir la
sensibilidad del detector.
¿Qué rol juega la temperatura en GC?
R// La temperatura es un factor clave en CG. Debe
controlarse de forma independiente en las tres zonas
principales del cromatógrafo:
- En el sistema de inyección: Para asegurar
que cuando la muestra entre se volatilice. No
obstante, no debe ser excesivamente elevada pues
podría producirse la descomposición térmica de los
analitos.
- En la columna: Aquí tiene una importancia
decisiva el control de la temperatura para conseguir
una adecuada separación de los componentes de la
muestra. En general cuanto mayor sea la temperatura
de la columna menos retenidos serán los analitos
(menores tiempos de retención). Se puede operar de
formas diferentes:
A Tª cte.- Manteniendo constante la temperatura de
la columna durante todo el proceso. Se utiliza cuando
los componentes de la muestra tienen volatilidades
parecidas.
Con programación de Tª. - Se varia la temperatura de
forma gradual y programada durante el proceso de
separación. Esta forma de operar es adecuada cuando
las volatilidades de los componentes de la muestra
varían en un rango amplio.
- En el detector: Para evitar que los gases que salen de
la columna pudieran condensar en el detector, la
temperatura del mismo debe ser suficientemente
elevada. También es necesario un buen control de
este parámetro para obtener una señal estable y
repetible.