ACCIONES BIOLOGICAS REPORTADAS PARA DITERPENOS

CITOMETRÍA DE FLUJO
Es un método rápido, objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos,
cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión. Esta técnica consiste en
hacer pasar partículas en suspensión (por ejemplo, células) por un haz luminoso. Las
partículas deben estar alineadas y deben pasar de una en una por el haz luminoso. Su
interacción con el haz luminoso genera señales debido a una dispersión de la luz (el
tamaño de la célula, su núcleo, la membrana nuclear, el material granular del
citoplasma, son características celulares que contribuyen a la dispersión de la luz), o a
una emisión de la luz por los fluorocromos con los que se han marcado específicamente
a las partículas. (1)
Estas señales generadas son llevadas a unos detectores que las transforman en impulsos
eléctricos, se amplifican y son transformadas en señales digitales. Un ordenador procesa
estas señales digitales. (1)

METODOLOGÍA
La presente investigación tomó como ejes: uno biológico y otro químico.
La actividad citotóxica de las fracciones, extractos y compuestos aislados de Conyza
trihecatactis, Gnaphalium graveolens y Ageratina vacciniaefolia se evaluó uitilizando
Citometría de Flujo y para evaluar la actividad citotóxica se utilizó la siguiente línea
celular: OCI-AML3 (leucemia aguda). Con el estudio químico se pretendió aislar e
identificar las sustancias activas y proponer las estructuras de las desconocidas. (1)

EJEMPLO:
 Identificación de efecto citotóxico en el fitol
Materiales y métodos Fracciones químicas:
Las partes aéreas de la especie Erythroxylum minutifolium Griseb fue recolectada en la
zona occidental de Cuba (Pinar del Río).
Las fracciones fueron obtenidas a partir de un extracto hidro alcohólico de la especie en
estudio, en el laboratorio de química del Centro de Química Farmacéutica (CQF). La
extracción hidroalcohólica consistió en una maceración a partir de 10 g del material
vegetal de la especie, a la que se le añadió 100 mL de una mezcla etanol: agua (7:3;
v/v). Esta operación demoró tres días, y luego se decantó. El procedimiento de
extracción fue repetido tres veces. El extracto hidroalcohólico reunido fue filtrado,
eliminando el etanol con ayuda del rotor evaporador. Las once fracciones para evaluar y
su composición química se identificaron como:
EM-C (extracto clorofórmico) y EM-CM (extracto cloroformo-metanol)
  Fracción FA-P (fracción polifenólica), FA (palmitato de ß amirina, catequina, ß
sitosterol, ácidos grasos y sus ésteres, fitol, tocoferol y triterpenos)
 FA-1 (palmitato de ß amirina, ß sitosterol), FA-2 (catequina, ácidos grasos y sus
ésteres, fitol, tocoferol y triterpenos), FP (taninos y azúcares), EX1 (ombuin 3
rutinósido 5 glucósido), EX2 (ombuin 3 rutinósido), EX3 (rutina) y P (mezcla de
EX1, EX2 y EX3).
(2)

Cultivos celulares:
Se utilizaron los siguientes sustratos celulares:
Línea celular heteroploide Vero (riñón de mono verde africano) procedente de la
American Type Culture Collection, crecida en medio 199 suplementado con 10 % de
suero bovino fetal inactivado y 1 mg/mL de sulfato de neomicina a razón de un pase
semanal e incubadas a 37oC.
Línea celular diploide FPH (fibroblastos de prepucio humano), procedente del Hospital
Central de Asturias, cultivada en medio mínimo esencial base Hanks suplementado con
glutamina al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 % y SFBI al 10 %, bajo valores de
temperatura de 37 oC , a razón de dos pases semanales.
(2)
Ensayos de citotoxicidad in vitro:
Se evaluó el efecto tóxico de las diferentes fracciones de Ex. minutifolium en las líneas
celulares Vero y FPH, utilizando el medio de cultivo correspondiente a cada línea
celular como disolvente.
Se añadieron, en placas de 96 pozos de fondo plano sembradas con monocapa
confluente de células Vero y FPH, diferentes concentraciones de las fracciones (desde
62,5 hasta 1 000 µg/mL) (cuatro réplicas por concentración).
Se incluyeron pozos controles de células.
Se incubaron por espacio de 72 h.
Posteriormente se procedió a la determinación de la Concentración Citotóxica Media
(CC50) por el método colorimétrico del MTT.
El por ciento de células viables se calculó a partir del valor de absorbancia de los
cultivos tratados con cada concentración de las fracciones, con respecto a Vol. XXI, Nº
1, 2009 27 al control celular
Se determinó la CC50 por análisis de regresión lineal para un coeficiente de
determinación mayor de 0,9.
El experimento se efectuó de la misma manera para ambas líneas celulares.
El ensayo se realizó tres veces.
(3)
Método del MTT:
Se añadieron 20 µL de solución de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-
difeniltetrazolio) por pozo, diluido en solución salina tamponada de fosfato (SSTF) 0.1
M pH= 7, a una concentración de 5 mg/mL
Se incubaron durante 3 h a 37 o C en atmósfera de CO2 al 5 %.
Al cabo de este tiempo, se eliminó el medio de los pozos y se añadieron 100 µL de
dimetilsulfóxido (DMSO) (BDH); las placas se agitaron en un agitador KS 500 a 300
r.p.m. durante 10 min.
La lectura se realizó a 540 nm en lector ELISA.
(5)

Determinación de la actividad citotóxica

Cultivo celular Línea celular OLC AML3 ATCC
Material vegetal
Se investigaron tres especies Conyza trihecatactis, Gnaphalium graveolens y Ageratina
vacciniaefolia
Método
1. Se mantienen las células congeladas a una temperatura de -70ºC el medio
contiene suero fetal bovino.
2. Para la recuperación de las células, los crioviales fueron colocados al baño maría
a 37°C.
3. Una vez descongeladas las células se pasan a una caja con 5 mL de medio L-15,
SFB y antibiótico y se dejaron incubando por cerca de 5 horas a 37°C.
4. Luego se monta en una caja de 48 pozos con un volumen de 300 microlitros
cada pozo a una concentración de 100.000 células / mL.
5. El reconteo se realizó con un colorante de viabilidad llamado azul tripán.
6. Posteriormente se agrega el volumen de extracto necesario para obtener la
concentración final.
7. Se incuba a una temperatura de 37ºC.
8. Identificar mediante observación al microscopio para identificar la actividad
del extracto sobre las células.

Si el extracto presenta actividad durante este tiempo se corre el experimento por

citometría.
(4)
OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS:

Mezcla de hojas y tallos:

secado y molido

Extracción con
éter

Marco 1
Marco 2 Extracción con etanol CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE VACIO

FRACCIONAMIENTO LIQUIDO LÍQUIDO 1.-FRACCION ETER DE PETROLEO

2.- FRACCION CLOROFORMO

Fracción Fracción Extracto 3.-FRACCION ACETATO DE ETILO
con acetato acuoso
cloroformo de etilo 4.- FRACCION ETANOL

Tomado de: Hernández, J. DITERPENOS DE Ageratina vacciniaefolia, Conyza trihecatactis,

Gnaphalium graveolens Y EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIINFLAMATORIO Y
CITOTÓXICO. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA. Bogotá-Colombia, 2014.

Obtención de extractos
Los extractos se obtuvieron de hojas influorescencias, tallos mediante desecación de los
mismos y posteriormente se procedió a la trituración
Se extrajo el material con éter de petróleo para desengrasarlo obteniéndose un extracto
de éter de petróleo y un marco I, que se dejó secar al aire libre y luego se trató con
etanol al 95%, obteniéndose el respectivo extracto etanólico y un marco II.
Posteriormente los extractos se concentraron en un rota evaporador. Los extractos en
etanol fueron fraccionados exhaustivamente líquido/líquido con cloroformo, éter etílico
y acetato de etilo.
Estudio Químico
Se estudiaron los extractos y fracciones activos, tanto antiinflamatorios como
citotóxicos.
(1)
BIBLIOGRAFÍA

(1) Hernández, J. DITERPENOS DE Ageratina vacciniaefolia, Conyza

trihecatactis, Gnaphalium graveolens Y EVALUACIÓN DEL EFECTO
ANTIINFLAMATORIO Y CITOTÓXICO. PONTIFICIA UNIVERSIDAD
JAVERIANA. Bogotá-Colombia [Internet].2014 [Consultado Oct 21 2019].
Disponible en:
https://pdfs.semanticscholar.org/a0ef/ed124405d1d88c553562b2b99aedf64e5fe8
.pdf
(2) Almora, E; Monteagudo, R; Fidalgo, O; Echemendía, O; Bolaños, G; Lago, V;
García, M y González, J. EVALUACIÓN CITOTÓXICA DE FRACCIONES
QUÍMICAS PROVENIENTES DE LA ESPECIE Erythroxylum minutifolium
EN LAS LÍNEAS CELULARES VERO Y FPH. Revista Cubana de Química
[Internet]. 2009[Consultado Oct 21 2019].; 21(1):25-29. Disponible
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(3) Dupuy, A; Bonilla J; Murillo, R; Taylor, P; Abad, M; González, L; et al . Efecto
in vitro de los terpenos lupeol y casearina G sobre células sanguíneas y
tumorales. Rev. méd. Chile. [Internet]. 2013[Consultado Oct 21 2019];141 (9):
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(4) Moo-Puc, R; Robledo, D y Freile-Pelegrin, Y. Actividad citotóxica y
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(5) Muñoz, R y Suárez, L.E. Compuestos citotóxicos de origen vegetal y su relación
con proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP). Rev Colomb Cancerol [Internet].
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