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ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL

Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción


Ingeniería en Alimentos

BIOQUÍMICA ALIMENTARIA

GRAN TRABAJO DE INVESTIGACIÓN-


SEGUNDO PARCIAL
Bioquímica de productos lácteos

Integrantes:

Arrata Ademir
Ávila Juan
López Mariana
Tobar Doménica
Veloz Sheryl
Wilmot Douglas

Profesora: MSc. María Fernanda Morales

Fecha: 27/01/2020

II TÉRMINO 2019
COMPOSICIÓN DE LA LECHE
La leche es una compleja mezcla de distintas sustancias, presentes en suspensión o
emulsión y presenta sustancias definidas: agua, grasa, proteína, lactosa, vitaminas y
minerales; a las cuales se les denomina sólidos totales (Agudelo & Bedoya, 2005). Esta
composición varía de acuerdo a muchos factores, tales como raza y edad de la vaca, tipo y
frecuencia de la alimentación, estado de lactación, temperatura ambiente, enfermedades,
época del año y hora de la ordeña (Badui, 2006). La Tabla 1 muestra de manera indicativa,
la composición promedio de leches provenientes de diversas razas de vacas:

Tabla 1. Composición porcentual de la leche de acuerdo a la raza bovina.

Raza Agua Grasa Proteínas Lactosa Ceniza


Holstein 88.1 3.4 3.1 3.6 0.71
Ayshire 87.3 3.9 3.4 3.4 0.73
Suiza café 87.3 3.9 3.3 3.6 0.72
Guernsey 86.3 4.5 3.6 3.7 0.75
Jersey 85.6 5.1 3.7 3.7 0.74

Cuantitativamente, el agua es el componente más abundante e importante en la leche, a los


demás componentes se les conoce como extracto seco total (Gil & Ruiz, 2010).
La fracción lipídica está representada por sustancias solubles en disolventes orgánicos, 96-
98% corresponde a los triacilglicéridos. Por esta razón, las propiedades físicas y químicas
de la leche son un reflejo de los ácidos grasos que contiene. Los triacilglicéridos se
encuentran como pequeñas partículas de 2-8 µm de tamaño, llamadas glóbulos. Presentan
una enorme diversidad de ácidos grasos, en la grasa láctea se han identificado más de 400.
Contienen ácidos saturados, monoinsaturados, poliinsaturados, de cadenas corta, mediana
y larga (Tabla 2), sin embargo, cerca de 96% del total lo forman un grupo de 14 ácidos,
resaltando el mirístico, palmítico y oleico (Badui, 2006).

Tabla 2. Ácidos grasos más comunes en la grasa de la leche de vaca.

Ácidos grasos % en peso


Saturados
Butírico 4:0 3.6
Caproico 6:0 2.5
Caprílico 8:0 1.5
Cáprico 10:0 3.6
Láurico 12:0 4.8
Mirístico 14:0 12.4
Pentadecanoico 15:0 1.4
Palmítico 16:0 35.7
Esteárico 18:0 9.1
Monoinsaturados
Miristoleico 14:1 1.3
Palmitoleico 16:1 2.5
Oleico 18:1 15.2
Poliinsaturados
Linoleico 18:2 2.1
Linolénico 18:3 0.7

La lactosa sólo se encuentra en las leches, representando su principal hidrato de carbono.


Se sintetiza en la glándula mamaria por un sistema enzimático en el que interviene la α-
lactalbúmina para después segregarse en la leche, se forma por la condensación de una
molécula de galactosa y otra de glucosa mediante un enlace glucosídico β (1,4). Ciertos
sectores de la población no toleran la leche por su contenido de lactosa; esto se debe a que
la mucosa del intestino delgado no sintetiza la β-galactosidasa (lactasa), necesaria para la
hidrólisis de este disacárido en el tracto gastrointestinal. La actividad de esta enzima se
incrementa en los primeros meses de la lactancia, y después va disminuyendo
paulatinamente, de tal forma que del 70 al 80% de los adultos carece prácticamente de ella.
En su ausencia, la lactosa llega hasta el colon, donde es fermentada por la flora intestinal,
produciendo hidrógeno, dióxido de carbono y ácido láctico que irritan este órgano. Todo esto
trae como resultado diarrea, flatulencias y calambres abdominales. Para aliviar esta
situación, existen en el mercado derivados lácteos deslactosados, y también se dispone de
una lactasa de origen microbiano (Aspergillus niger, A. oryzae y Kluyveromyces lactis) que
se añade a la leche unos minutos antes de ingerirla (Badui, 2006).
La leche es un buen alimento debido a la alta calidad de sus proteínas, éstas han sido
divididas en dos grandes grupos: las caseínas, que representan 80% del total, y las
proteínas del suero o seroproteínas, que representan el 20% restante. Cabe indicar que la
relación de caseína/proteína de suero en la leche de vaca es aproximadamente 5.9,
mientras que en la leche humana es 0.66; esta situación se debe considerar al desarrollar
leches que imiten a la de la mujer para la alimentación infantil (Badui, 2006).
Las caseínas (del latín caseus, queso) son por definición las fosfoglucoproteínas que
precipitan de la leche descremada a pH 4.6 y 20°C, es decir, son proteínas que contienen
tanto residuos de hidratos de carbono como de fosfatos; estos últimos generalmente
esterifican a los hidroxilos de las serinas. Prácticamente todas las moléculas de caseína
están asociadas entre sí integrando las micelas, pero existe una pequeña cantidad que se
encuentra en solución. Existen cuatro fracciones principales que se diferencian por su
movilidad electroforética: αs, β, κ y γ. A su vez, la αs está constituida por cuatro
componentes (los dos primeros son los principales) αs1, αs2, αs3 y αs4, y la γ por γ1, γ2, y
γ3. La mayoría tiene variantes genéticas en algunas razas de vacas que se designan con
las letras A, B, C, y D; cabe mencionar que una variante genética es una proteína que
cambia su estructura primaria en sólo unos cuantos aminoácidos. la caseína k es soluble en
presencia del calcio natural de la leche, desempeña un papel estabilizador muy importante
ya que previene la precipitación de las caseínas α y β por la acción de este ión divalente
(Badui, 2006).
Las proteínas del suero son compactas, globulares (están enrolladas en formas compactas
y casi esféricas) y son solubles en un intervalo de pH muy amplio (incluso a pH ácidos,
siempre y cuando no se hayan desnaturalizado por el calor). En estado natural no se
asocian con las caseínas, pero en las leches tratadas térmicamente y homogeneizadas, hay
una fracción que sí lo hace. Las proteínas del suero constan por lo menos de ocho
fracciones diferentes, entre las cuales destacan la β- lactoglobulina, la α- lactalbúmina, las
inmunoglobulinas, la albúmina bovina y las proteosa peptonas. La β- lactoglobulina no se
encuentra en la leche materna y se considera como responsable de algunas reacciones
alérgicas que se observan en infantes alimentados con leche de vaca. Por esta razón,
existen productos comerciales que imitan la leche humana con base en el suero de la leche,
al que se le ha eliminado esta fracción proteínica mediante una precipitación selectiva con
polifosfatos o por filtración en gel, para después mezclarla con caseína, aceite de soya,
minerales, vitaminas, lisozima y otros ingredientes. La α- lactalbúmina es, por orden de
importancia, la segunda proteína del suero, y tiene actividad biológica, ya que es parte
constitutiva del sistema enzimático requerido para la síntesis de la lactosa (Badui, 2006).

Tabla 3. Distribución de las proteínas de la leche.

Total de proteínas [%]


Caseínas 80
αs1 34
αs2 8
β 25
κ 9
γ 4
Proteínas del suero 20
β- lactoglobulina 9
α- lactoglobulina 4
Proteosa peptona 4
Inmunoglobulinas 2
Seroalbúminas 1

Las enzimas se encuentran en baja concentración en la leche y se sintetizan en la glándula


mamaria. Se han identificado más de 20 enzimas. La presencia de algunas de ellas se
emplea como índice de calidad en la industria: la fosfatasa alcalina, con pH óptimo de 8.0,
se usa para determinar la eficiencia de la pasteurización de la leche, mientras que la
catalasa se utiliza para medir la mastitis en las vacas. Por otra parte, la acción de las lipasas
tiene implicaciones importantes ya que son responsables de la rancidez hidrolítica al liberar
ácidos grasos de cadena corta; las proteasas, con una actividad semejante a la renina,
ocasionan que la leche evaporada se coagule, ya que son termorresistentes y soportan el
tratamiento de la esterilización, además de que se reactivan en el almacenamiento (Badui,
2006). La Tabla 4 muestra las enzimas que se encuentran en la leche:

Tabla 4. Enzimas más importantes presentes en la leche.

Enzima Características
Responsable de reacciones de rancidez,
sobrevive a la pasteurización y puede
Lipasa
reactivarse en productos esterilizados;
pH óptimo 8.6.
Proteasas Resistencia al calor, pH óptimo 8.8.
Usada como índice de pasteurización.
Fosfatasa alcalina Puede haber reactivación en productos
tratados a altas temperaturas.
Se usa como prueba de mastitis; pH
Catalasa
óptimo 7.0.
La más resistente al calor, usada para
Lactoperoxidasa detectar tratamientos térmicos muy
fuertes; pH óptimo 6.8.
Xantina oxidasa Degrada el flavin-adenin-dinucleótido en
flavin-mononucleótido y riboflavina; tal
vez ésta sea la razón del alto contenido
de riboflavina en la leche.

CARACTERÍSTICAS ANFÓTERAS Y PUNTO ISOELÉCTRICO


Los aminoácidos presentan características que se deben fundamentalmente a su naturaleza
iónica anfotérica ácido-base. También se les conoce como sustancias anfifílicas, anfolitos o
electrolitos anfóteros. Su carácter anfotérico les confiere la capacidad de recibir y de donar
electrones y alcanzar un punto isoeléctrico (pI) cuando presentan el mismo número de
cargas positivas y negativas, por lo que su carga neta es cero. Los aminoácidos pueden
tener, por lo tanto, tres estados que dependen del pH: a pH < pI se encuentran en forma
protonada o catiónica; en el pI su carga es cero, y a pH > pI adquieren una carga negativa o
aniónica. Es decir, no existe un pH en el cual estos anfolitos estén completamente ausentes
de cargas eléctricas, ya que las presentan aun en el pI. En cualquiera de estos tres estados
pueden ejercer fuerzas electrostáticas. El cuadro 3.1 muestra los valores del punto
isoeléctrico de los aminoácidos (Ver Figura 1).

Figura 1. Propiedad anfótera de las proteínas.

Las curvas de titulación de un aminoácido deducen la relación entre su carga eléctrica neta
y el pH de la disolución. Por ejemplo, a un pH de 5.97 (punto de inflexión entre las dos
etapas de su curva de su titulación), la glicina está presente de manera predominante en su
forma dipolar, totalmente ionizada, pero sin carga eléctrica neta. El pH característico en que
la carga eléctrica neta es cero, se denomina punto isoeléctrico o pH isoeléctrico, designado
pI.

Figura 2. Curva de titulación del aminoácido glicina 0.1 M a 25 °C.


En el caso de la glicina, que no tiene grupo ionizable en su cadena lateral, el punto
isoeléctrico es simplemente la media aritmética de los dos valores de pKa, que se definen
como la medida de la tendencia de un grupo a ceder un protón (Nelson & Cox, 2009). El
punto isoeléctrico se calcula a través de la siguiente ecuación (valores para la glicina):
1 1
pI = ( pK 1+ pK 2) = ( 2.34+9.60 )=5.97
2 2

Los valores de pK1 y pK2 de los 20 aminoácidos esenciales necesarios para calcular el punto
isoeléctrico están detallados en la Tabla 5.

Tabla 5. Propiedades asociadas con los aminoácidos encontrados en proteínas.

Valores de pKa
pK1 (-COOH) pK2 (-NH+3) pI
Glicina 2.34 9.60 5.97
Alanina 2.34 9.69 6.01
Prolina 1.99 10.96 6.48
Valina 2.32 9.62 5.97
Leucina 2.36 9.60 5.98
Isoleucina 2.36 9.68 6.02
Metionina 2.28 9.21 5.74
Fenilalanina 1.83 9.13 5.48
Tirosina 2.20 9.11 5.66
Triptófano 2.38 9.39 5.89
Serina 2.21 9.15 5.68
Treonina 2.11 9.62 5.87
Cisteína 1.96 10.28 5.07
Asparagina 2.02 8.80 5.41
Glutamina 2.17 9.13 5.65
Lisina 2.18 8.95 9.74
Histidina 1.82 9.17 7.59
Arginina 2.17 9.04 10.76
Aspartato 1.88 9.60 2.77
Glutamato 2.19 9.67 3.22

PROTEÍNAS PRINCIPALES QUE COMPONEN LA LECHE


Principales proteínas de la leche bovina
Tecnológicamente, las proteínas de la leche son los constituyentes más importantes que
desempeñan un papel en los productos lácteos, excepto mantequilla y leche anhidra.
Proteínas de la leche cumplen roles nutritivos, fisiológicos, fisicoquímicos
Como roles nutritivos comprenden todas las proteínas presentes, fisiológicamente están
incluidas las inmunoglobulinas, lactoferrinas, lacto peroxidasas y fisicoquímicamente
mediante la gelatinización enzimática, acida o termo inducida en formación de queso, leche
fermentada y concentrados y aislados del suero de leche (Hui, 2006).
Caracterización molecular y funcional de las proteínas
La leche contiene dos tipos de proteínas, mismas que puedes ser separadas mediante
acidificación a un pH de 4.6 para obtener las caseínas (proteínas insolubles a pH de 4.4)
que representan el 78% de proteínas en leche bovina mientras que las proteínas solubles
se denomina proteínas del suero el cual contiene dos tipos: albuminas y globulinas que son
transferidas directamente de la sangre.
Proteínas del suero

La principal proteína del suero conocida es la β -lactoglobulina y la α-lactoalbúmina,


inmunoglobulinas y albuminas de la sangre las cuales tienen un uso importante en
productos cárnicos y embutidos además que no forman geles tras la desnaturalización y
acidificación(Younes, 2017) y están fuertemente compactadas y estructuradas con
predominancia de α-hélices y laminas β en su estructura.

Figura 3. Alfa lactoalbúmina.

Figura 4. Beta lactoglobulina.

Caseínas de la leche

Esta fracción de proteínas esta subdividida en α s 1 , α s 2 , β y к -caseínas las cuales son


proteínas fibrosas hidrófobas las cuales se asocian en el ambiente acuoso de la leche en
estructuras complejas llamadas micelas, que contienen miles de moléculas de caseína. Una
micela de caseína está compuesta de varias proteínas similares, formando una estructura
granular que contiene agua más sales (principalmente calcio y fósforo) y se la puede
obtener también por centrifugación (Younes, 2017).
Figura 5. Representación de una micela de acuerdo al modelo de Horne.

La Figura 5 muestra la representación de una micela que, según estudios está compuesta
por submicelas conectadas por sales de calcio y fosfato de forma coloidal.

Figura 6. Foto en microscopía de una micela de caseína.

Figura 7. Principales proteínas presentes en la leche.

Enzimas de la leche
Se encuentran en baja concentración y están distribuidas principalmente en las micelas de
caseína, o de forma libre en el suero y se han identificado más de 70 enzimas en leche
bovina, de las cuales 20 son estudiadas como la lipasa, la proteasa, catalasa, lacto
peroxidasa y xantina oxidasa entre otras. A continuación, unas de las más importantes en la
industria láctea (Allan & Lotte, 2010).
Fosfatasa alcalina
Quizá de las más importantes por si similitud en su cinética de inactivación térmica a la
bacteria Mycobacterium tuberculosis durante la pasteurización (715 segundos), por tanto,
una determinación de ausencia o presencia de la enzima es usada como indicador de una
pasteurización efectiva (Allan & Lotte, 2010).
Lipoproteína lipasa (LPL)
Esta enzima participa en la biosíntesis de la grasa de la leche y es responsable de la
lipolisis enzimática de ácidos grasos a partir de triglicéridos, que de cierta forma los ácidos
grasos liberados pueden dar lugar a sabores rancios por la oxidación de ácidos grasos de
cadena corta, o por su oxidación a cetonas. La LPL en la leche se reduce por
pasteurización, pero una inactivación más completa requiere tratamientos térmicos más
severos (Allan & Lotte, 2010).

DESNATURALIZACIÓN E INACTIVACIÓN DE PROTEÍNAS


Desnaturalizar proteínas, indica que su estructura proteica de aleja de la forma nativa
debido a un importante cambio en su conformación tridimensional, producido por
movimientos de los diferentes dominios de la proteína, que conlleva a un aumento en la
entropía o un desorden de las moléculas (Badui, 2006). La desnaturalización trae consigo la
destrucción de las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias afectando las
interacciones no covalentes que brindan estabilidad a la estructura. En el suero de leche,
sus proteínas son típicamente globulares con una estructura secundaria y terciaria, dichas
proteínas retienen su forma nativa a temperaturas limitadas. Las inmunoglobulinas son las
más lábiles al calor y la α-lactoalbúmina es la más estable al calor de las proteínas del
suero.

ADICIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO COMO EL LIMÓN A LA LECHE

Si en una disolución de proteínas se producen cambios de pH, alteraciones en la


concentración, agitación molecular o variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de
las proteínas puede verse reducida hasta el punto de producirse su precipitación. Esto se
debe a que los enlaces que mantienen la conformación globular de las proteínas se rompen
y esta adopta la conformación filamentosa. De este modo, la capa de moléculas de agua no
recubre completamente a las moléculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre sí
dando lugar a grandes partículas que precipitan. Las proteínas que se hallan en ese estado
no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseñadas, en resumen, no son
funcionales.

Tal es el caso de la proteína de la leche, caseína. La misma que es afectada por la adición
de ácido cítrico del limón que tiene pH de 2.2. El ácido cítrico es capaz de desnaturalizar la
proteína presente en la leche lo que hace que se precipite la caseína y se forma un líquido
en la parte superior.

La acidificación en la leche siempre se da por encima de pH 4, el caso del yogurt por


ejemplo con pH 4.6. Al acidificar mucho el medio lo que se obtiene es una proteína
desnaturalizada por completo por lo que no es posible su re naturalización ya que la
estructura secundaria y terciaria se han desintegrado en su totalidad.
FORMACIÓN DEL YOGURT.

Los productos lácteos acidificados son uno de los alimentos más antiguos y populares del
mundo. Se produce una amplia variedad de productos lácteos acidificados, como yogur,
bebidas de leche ácida o queso ácido fresco. En general, la leche puede acidificarse con
bacterias del ácido láctico, que fermentan la lactosa en ácido láctico, la adición directa de
ácidos, como HCl, o mediante el uso de glucono-delta-lactona (GDL), que puede
hidrolizarse en solución a ácido glucónico. Durante el proceso de acidificación, muchas de
las propiedades fisicoquímicas de las micelas de caseína experimentan cambios
considerables, mientras el fosfato de calcio coloidal se disocia gradualmente de las micelas
de caseína, la carga neta de las micelas de caseína disminuye y las caseínas se liberan a la
fase sérica (porción de leche sin glóbulos grasos y micelas de caseína). La disociación de
caseína depende de la temperatura, mientras que la solubilización mineral se da a 20 o 30 °
C. La extensión de la solubilización mineral aumenta notablemente por debajo del pH 5.6 y
es casi completa a alrededor de pH 5.0. Todo el fosfato inorgánico se solubiliza a pH 5.2, y
la mayoría de los iones de calcio restantes se solubilizan cuando se alcanza el pH 4.6. A
bajas temperaturas (4 ° C), una cantidad significativa de caseína se separa de las micelas
incluso al pH natural de la leche (aproximadamente 6,7), mientras que, a 30 ° C, solo se
produce una disociación limitada incluso cuando se reduce el pH, probablemente debido al
incremento de interacciones hidrofóbicas. Se desconoce si dicha disociación es reversible.

En la superficie de las micelas, la disminución de la carga neta de κ-caseína da como


resultado el colapso de la capa de κ-caseína y una disminución de la estabilidad de las
micelas, ya que las interacciones dentro y fuera de la cadena de péptidos ya no son
suficientes para mantener la fracción proteica extendida en solución. Como resultado, las
micelas pueden difundirse más cerca una de la otra, y se produce la agregación (estado
líquido), lo que conduce a una transición macroscópica solución-gel. En la leche sin
calentar, la agregación ocurre muy cerca del punto isoeléctrico de las caseínas (4.6), a un
pH de alrededor de 4.8.

EMULSIÓN DEL YOGURT

Las bebidas lácteas acidificadas, como las bebidas de yogur y las leches que contienen
zumos de frutas, se producen diluyendo y homogeneizando geles de leche desnatada
fermentada y / o agregando preparaciones de frutas o ácido a la leche desnatada, lo que
significa que pueden considerarse suspensiones de coloides. Fragmentos de gel de
caseína. Debido al bajo pH, el producto resultante puede sufrir sedimentación y
desprendimiento. La pectina se usa a menudo como estabilizadores en bebidas de leche
acidificadas. La pectina y otros polisacáridos, es decir, polisacárido soluble en soja y
carboximetilcelulosa o proteínas se han aplicado en combinación para mejorar aún más la
estabilidad de las bebidas lácteas acidificadas. Se ha demostrado que la pectina se adsorbe
a través de interacciones electrostáticas entre los grupos carboxilato de pectina y los
residuos de aminoácidos catiónicos de la caseína en los sistemas de leche acidificada
diluida donde la adsorción tiene lugar a pH 5 o inferior. La estabilización estérica podría ser
responsable del mecanismo de estabilización, donde la pectina se adsorbe
electrostáticamente a la superficie del agregado de caseína y, mientras tanto, sobresale de
la superficie como bucles y colas colgantes. Se ha demostrado que la pectina enriquecida
con fibra estabiliza adicionalmente la red de gel de caseína como relleno. El pH, la fuerza
iónica, la densidad de carga de polisacárido y la concentración de polisacárido, así como los
factores de procesamiento, se consideran variables importantes para influir en las
interacciones pectina-caseína y, por lo tanto, la estabilidad de las bebidas de leche
acidificadas.

Sin embargo, cuando el pH se redujo de 4,3 a 3,5, el efecto de estabilización se restringió


debido al hecho de que la pectina y la caseína llevaban suficientes cargas netas opuestas,
lo que resulta en neutralización de carga y separación de fases. A una condición de pH muy
bajo (<3.5) cuando estaba cerca o por debajo del valor de pKa de los grupos de ácido
carboxílico en el esqueleto de pectina, la velocidad de adsorción de pectina en las micelas
de caseína disminuyó significativamente o incluso cesó.

CÁLCULO DE CINÉTICA ENZIMÁTICA DE UNA PROTEASA: BROMELINA.

Las proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas usando una
molecula de agua para hacerlo por lo tanto son consideradas como hidrolasas. Una de las
proteasas más producidas a nivel mundial es la bromelina la cual se obtiene de la piña, el
segundo cultivo tropical de importancia mundial después del banano. Esta enzima
bromelina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos de proteínas. Además, es una
glicoproteína del grupo de la cisteína proteasas. Actúa de preferencia sobre los aminoácidos
básicos y aromáticos de las proteínas. Su pH óptimo, varía con el sustrato, en el rango de 4
a 8. Es una proteína constituida por aminoácidos (arginina, aspartato, serina, prolina,
alanina, valina, glicina, metionina, glucosamina) que se encuentran enrollados en dos partes
separadas por un puente que tienen lugar activo con un grupo tiol (-SH) libre.

Para calcular la cinética enzimática, se basó en las ecuaciones de Michaelis & Menten. Al
mezclar las soluciones de sustrato y enzima (caseína y bromelina, 3mL de cada solución)
en presencia del buffer fosfato (1,5mL de buffer 0,1M pH 6), se detuvo la reacción a
intervalos de 30 segundos adicionando un exceso de ácido acético 1M (3mL). La
absorbancia fue medida en un espectrofotómetro Genesys 10UV. A partir de los datos
obtenidos se pudo hallar una velocidad de reacción dividiendo la absorbancia de cada caso
entre el tiempo, de esta forma se halla una expresión de velocidad expresada en unidades
ópticas por segundo (U.O./seg.) Expresión y = 0,2704x + 0,0127;
y= absorbancia
x= concentración

Fig. 1 Variación de la absorbancia con respecto al tiempo.

Para comprobar el pH óptimo de la


bromelina se realizó una curva de
velocidad de reacción (U.O/seg) vs pH con
valores desde 4 hasta 10.
Fig. 2 Dependencia de la actividad enzimática de la
bromelina respecto del pH.

Como se puede ver en la Fig. 2, el rango de pH en el que el enzima tiene máximo


desempeño es entre 6 y 8. Tomando como base un tiempo de tres minutos y el pH 6, se
toman las últimas medidas, dejando actuar el enzima a la misma concentración empleada
inicialmente (4,5x10-5 M), bajo la acción del mismo buffer y deteniendo de nuevo la reacción
con ácido acético 1M. Se puede hallar la velocidad expresada en unidades ópticas por
segundo dividiendo la absorbancia entre el tiempo que para este caso equivale a 180
segundos para todas las muestras. Estas velocidades se muestran en la figura 3 donde se
grafican las velocidades en función de las concentraciones molares de sustrato; esta gráfica
nos lleva al diagrama completo de Michaelis-Menten (Clavijo, et. al, 2012).
Fig. 3. Velocidad vs concentración de sustrato.

En primera instancia se puede decir que la velocidad máxima con que actúa la bromelina
corresponde aproximadamente a 9,83x10-4 U.O./seg. Según la cinética de Michaelis, la
interpolación al eje de las abscisas del valor correspondiente a la mitad de la velocidad
máxima es equivalente a Km (Constante de Michaelis). El valor de Vmax/2 equivale a
4,912x10-4 U.O./seg., dato que da como resultado una constante de Michaelis con el valor
de 7,962x10-4 M (Clavijo, et. al, 2012).

EXPERIMENTACIÓN
“Efecto de la temperatura sobre la acción de ablandadores de carne comerciales en la
desnaturalización de las proteínas de la leche”

Materiales y métodos
Muestra

 Leche entera

Reactivos

 Ablandador de carne comercial

 Solución tampón de fosfato de sodio 0.1 M

 Ácido clorhídrico 0.5 M

 Agua destilada

 Reactivo de Biuret

Equipos

 Espectrofotómetro
 Baño María
 pHmetro

Materiales

 Microplaca de espectrofotometría
 Micropipeta de 100-1000 µl
 Tubos de ensayo
 Tubos de eppendorf
 Probetas
 Vasos de precipitación
 Gotero

Procedimiento
Elaboración de curva de calibración para el método Biuret
Se prepararon soluciones de albúmina sérica bovina a concentraciones de 0.5, 1, 2.5, 5.0,
7.5 y 10 mg/ml. Se añadió 2 ml de reactivo de Biuret en cada una de las muestras. Luego
de 15 minutos, se colocaron 250 µl de cada una de las soluciones de BSA en los pocillos de
la microplaca de espectrofotometría y se realizó la lectura a una longitud de onda de 540
nm. Se realizó el gráfico de Concentración vs. Absorbancia y se obtuvo la ecuación de la
recta, además del coeficiente de correlación para la comprobación del ajuste de curva.
Preparación de solución de ablandador de carnes al 20%
Se pesó 10 g de ablandador de carne comercial y se añadieron en 50 ml de agua de
destilada. La solución fue colocada en un agitador magnético hasta que el ablandador de
carne se disolvió por completo. Finalmente, la solución de ablandador de carnes al 20% fue
almacenada en refrigeración hasta su utilización.
Preparación de diluciones de leche y solución tampón
Se prepararon diluciones de leche al 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%,
0.9%, 1.0% y 2.0%. Se colocaron 330 µl de cada una de diluciones de leche en 4 tubos de
eppendorf y se almacenaron en refrigeración. Además, se prepararon 20 ml de fosfato de
sodio al 0.1 M. El pH de la solución tampón de fosfato de sodio se fijó en 7, añadiendo
alrededor de 25 gotas de ácido clorhídrico 0.5 M.
Lectura del espectrofotómetro
Se colocó 110 µl de solución tampón y 330 µl de solución de ablandador de carnes al 20%
en los tubos de eppedorf con 330 µl de cada una de diluciones de leche. La mitad de los
tubos permaneció a temperatura ambiente y la otra mitad fue colocada en Baño María a una
temperatura de 40°C. Luego de 15 minutos, se añadió 220 µl de reactivo de Biuret en los
tubos eppendorf con las diferentes diluciones de leche y se dejó actuar durante 15 minutos.
Posteriormente, se añadió 250 µl de cada una de las soluciones contenidas en los tubos
eppendorf y se colocaron en los pocillos de la microplaca de espectrofotometría. Además,
se incluyó un pocillo en el que solo se añadió 110 µl de solución tampón, 330 µl de solución
de ablandador de carnes al 20%, y 220 µl de reactivo de Biuret. Finalmente, se realizó la
lectura a 540 nm.
Resultados y discusión
El método de Biuret es una de las técnicas más utilizada para la determinación de
proteínas, ya que se fundamenta en la formación de un complejo coloreado entre el
Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos de las proteínas. De manera que, la
intensidad de coloración observada es directamente proporcional a la cantidad de
enlaces peptídicos presentes en la muestra. De ahí que, este método puede ser
utilizado para la determinación del efecto de la temperatura en la actividad enzimática
de los ablandadores de carne comerciales sobre la hidrólisis de las proteínas de la
leche.
Curva de calibración del método Biuret
Los resultados de absorbancia de las muestras de diferentes concentraciones de
albúmina sérica se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de BSA.

Concentración de BSA (mg/ml) Absorbancia (nm)

0.0 0.064

0.5 0.061

1.0 0.105

2.5 0.213

5.0 0.390

7.5 0.475

10.0 0.409

En la Figura 6 se muestra la curva de calibración del método de Biuret, a partir de la


cual se obtiene la ecuación de la recta para la determinación de la concentración de
enlaces peptídicos presentes en las muestras de leche. La ecuación obtenida presenta
una pendiente de 0.0056 y un índice de regresión lineal R 2 de 0.9973, por lo que
puede considerarse apropiada para el análisis.
Figura 6. Curva de calibración de BSA.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de ablandadores de carne


comerciales
Para observar el efecto de la temperatura en la actividad enzimática de los
ablandadores de carne comerciales sobre la hidrólisis de las proteínas de la leche, se
midió la absorbancia de 10 diluciones de leche que fueron expuestas a dos
condiciones de temperatura diferente. Las Tablas 7 y 8 resumen los valores de
absorbancia de las diluciones de leche expuestas a temperatura ambiente y a 40°C,
respectivamente.

Tabla 7. Absorbancia de las diluciones de leche a temperatura ambiente.

Absorbancia (nm)
Concentración [%] T= 0 min T= 30 min
0,1 0,334 0,259
0,2 0,288 0,302
0,3 0,294 0,275
0,4 0,272 0,269
0,5 0,279 0,252
0,6 0,299 0,280
0,7 0,275 0,288
0,8 0,289 0,275
0,9 0,330 0,303
1,0 0,329 0,302
Blanco 0,260 0,257
EBB 0,255 0,254

Tabla 8. Absorbancia de las diluciones de leche a 40 °C.


Absorbancia (nm)
Concentración (%) T= 0 min T= 30 min
0,1 0,375 0,137
0,2 0,335 0,171
0,3 0,311 0,173
0,4 0,268 0,126
0,5 0,215 0,204
0,6 0,366 0,203
0,7 0,290 0,171
0,8 0,262 0,182
0,9 0,277 0,183
1,0 0,268 0,190
Blanco 0,277 0,222
EBB 0,250 0,253

Al analizar los resultados de las Tablas 7 y 8, se puede notar un decrecimiento en la


absorbancia de las muestras de leche con respecto al tiempo. Además, una
disminución en la absorbancia implica una reducción del sustrato de interés en el
método Biuret, que en este caso son los enlaces peptídicos de las proteínas presentes
en la leche. De manera que, se podría inferir que existe un mayor grado de hidrólisis
sobre las proteínas de la leche por acción del ablandador de carne. Asimismo, se
podría establecer que la actividad enzimática de la bromelina presente en el
ablandador de carne se incrementa en el tiempo, ya que puede notarse que las
muestras en las que el ablandador de carne actuó durante 30 minutos registran los
menores valores de absorbancia, en comparación con las muestras analizadas
inmediatamente después de añadir el ablandador. De igual manera, si se comparan
los resultados de las Tablas 2 y 3, se puede determinar que las muestras expuestas a
una temperatura de 40°C presentaron los menores valores de absorbancia. De modo
que, es posible establecer que la bromelina presente en el ablandador de carne
presenta una mayor actividad enzimática si es sometida a una temperatura 40°C.
A partir de la ecuación de la recta y los valores de absorbancia medidos, se pudo
calcular la concentración de enlaces peptídicos presentes en las distintas muestras de
leche. La Tabla 9 y 10 resumen las concentraciones de proteínas, de manera concreta
de sus enlaces peptídicos, presentes en las diferentes diluciones de leche.
Tabla 9. Concentración de proteína en las diluciones de leche a temperatura ambiente.

Concentración (mg/ml)
Concentración [%] T= 0 min T= 30 min
0,1 48,82 35,43
0,2 40,61 43,11
0,3 41,68 38,29
0,4 37,75 37,21
0,5 39,00 34,18
0,6 42,57 39,18
0,7 38,29 40,61
0,8 40,79 38,29
0,9 48,11 43,29
1,0 47,93 43,11
Blanco 35,81 35,07
EBB 34,71 34,54

Tabla 10. Concentración de proteína en las diluciones de leche a 40 °C.

Concentración (mg/ml)
Concentración [%] T= 0 min T= 30 min
0,1 56,14 13,64
0,2 49,00 19,71
0,3 44,71 20,07
0,4 37,04 11,68
0,5 27,57 25,61
0,6 54,54 25,43
0,7 40,96 19,71
0,8 35,96 21,68
0,9 38,64 21,86
1,0 37,04 23,11
Blanco 38,64 28,82
EBB 33,82 34,36

Al igual que con las absorbancias, se puede notar una disminución en la concentración
de enlaces peptídicos en función del tiempo. El ablandador de carne comercial
utilizado durante esta experimentación está compuesto por sal, azúcar, bromelina,
aceite de canola y fosfato tricálcico. De modo que, es posible establecer que las
proteínas de leche son hidrolizadas por acción de la bromelina presente en el
ablandador de carne, lo que se puede evidenciar en la disminución de la concentración
de proteínas a lo largo del tiempo. De igual forma, se puede notar una considerable
disminución en la concentración de proteína de las muestras de leche tratadas con la
solución de ablandador de carne a 40 °C, en comparación con aquellas tratadas con la
solución de ablandador a temperatura ambiente. Por lo cual, se puede establecer que
la enzima bromelina contenida en los ablandadores de carne comerciales presenta
una mayor actividad enzimática a temperaturas por arriba de los 30 °C. La mayor
diferencia en la concentración de proteínas, y por tanto de enlaces peptídicos, se
puede evidenciar en la muestra de leche al 0,2 % a la que se añadió la solución de
ablandador de carne a 40°C, en la cual la concentración de proteínas se redujo en
42.5 mg/ml; mientras que la máxima reducción en el contenido de proteínas de las
muestras tratadas con la solución de enzima a temperatura ambiente fue de apenas
13.39 mg/ml para la dilución de 0,1 % de leche. Por lo tanto, podría inferirse que, a
esta concentración de sustrato y a estas condiciones de temperatura, la actividad
enzimática de la bromelina mejora considerablemente.
Por otra parte, se puede establecer que los resultados observados concuerdan con la
literatura científica consultada, la cual plantea que la bromelina es una cisteíno-
proteasa que cataliza la hidrólisis de uniones peptídicas. Concretamente, cuando la
bromelina lograr unirse a una proteína para formar el complejo enzima-sustrato, el ión
imidazol interviene para protonar el residuo de aminoácido que será liberado como
producto. De manera que, el sustrato ahora posee un grupo carboxiterminal, el cual
será liberado del complejo enzima-sustrato al añadir una molécula de agua, dando
lugar a la disociación de la enzima y los nuevos compuestos formados. Asimismo, la
temperatura es catalogada como uno de los factores más importantes que afectan la
actividad enzimática. Para que una reacción ocurra a temperatura ambiente sin la
presencia de una enzima, pequeñas proporciones de moléculas reactivas deben tener
niveles de energía suficientes para participar en la reacción. Cuando la temperatura se
eleva por encima de la temperatura ambiente, más moléculas reactivas ganan
suficiente energía para participar en la reacción. La energía de activación no cambia,
pero la distribución de reactivos con suficiente energía se cambia a un nivel de energía
promedio más alto. Cuando una enzima participa en la reacción, la energía de
activación se reduce significativamente y la proporción de moléculas reactivas a un
nivel de energía superior a la energía de activación también aumenta
considerablemente, lo que permite que la reacción ocurra a una velocidad mucho
mayor. Además, los resultados obtenidos concuerdan con publicaciones científicas que
proponen que la bromelina presenta un rango de temperatura óptimo de entre 35 y 55
°C (Hui, 2006).
Finalmente, los datos que presentaron una tendencia diferente se pueden atribuir a los
errores sistemáticos y aleatorios cometidos durante la experimentación. Uno de los
errores sistemáticos que más pudo haber influenciado en los resultados tiene que ver
con la precisión de los operarios a la hora de manipular las micropipetas para preparar
las diferentes diluciones de leche, lo que pudo haber alterado las concentraciones
reales de las muestras y, en consecuencia, las mediciones de absorbancia. En cuanto
a los errores aleatorios, la utilización de microplacas usadas para la lectura de
absorbancia de las muestras también pudo alterar los resultados, ya que estas
almacenan residuos de muestras o reactivos que pueden alterar los datos de
absorbancia de nuestras muestras.

PAPER: Lactose hydrolysis potential and thermal stability of commercial β-


galactosidase in UHT and skimmed milk

RESUMEN DEL PAPER

Se utilizó la enzima comercial Beta-Galactosidasa a partir de Kluyveromyces lactis


(líquido) y Aspergillus oryzae (liofilizado) para investigar por su potencial acción
hidrolítica en sustrato lactosa para leche UHT y leche desnatada a diferentes
concentraciones (0,7; 1,0 y 1,5%), los valores de pH (5,0; 6,0; 6,5 y 7,0), y la
temperatura (30; 35; 40 y 55 ºC). Se observaron altas tasas de hidrólisis para la
enzima a partir de K. lactis a pH 7,0 y 40 ºC, y de A. oryzae a pH 5,0 y 55 ºC. La
enzima de K. lactis mostró velocidades de hidrólisis significativamente más altos en
comparación con A. oryzae. El efecto de la temperatura y la concentración de β-
galactosidasa en la hidrólisis de lactosa en la leche UHT fue mayor que en la leche
desnatada, para todas las temperaturas ensayadas. Con respecto a la estabilidad
térmica, se observó una disminución en la velocidad de hidrolisis a pH 6,0 a 35 ºC
para la enzima a partir de K. lactis, y a pH 6,0 a 55 ºC para la enzima a partir de A.
oryzae. Este trabajo estudia la hidrólisis de β-galactosidasa en UHT y leche
desnatada. El conocimiento de las características de la β-galactosidasa a partir de K.
lactis y A. oryzae permite utilizarlo de manera más eficiente para controlar la
concentración de enzima, la temperatura y pH en muchos procesos industriales y
formulaciones de productos.

CONCLUSIONES DEL PAPER

 Se observaron diferencias significativas para la actividad enzimática tanto de la


levadura K. lactis como del hongo filamentoso A. oryzae en hidrólisis de
lactosa. Las variables concentración de enzima temperatura y el pH afectan
significativamente las reacciones de hidrólisis

 Las actividades enzimáticas más altas se observaron a 40 ºC y pH 7.0 para el


enzima de K. lactis, y a 55 ºC y pH 5.0 para la enzima de A. oryzae cuando se
probó en sustrato de lactosa

 Existió una menor efectividad en la actividad enzimática de la Beta-


Galactosidasa extraída a partir del hongo A. oryzae, debido a que esta es una
enzima que trabaja mejor en pH entre 3 y 5, y los pH utilizados en la
experimentación fueron mayores a 5
 El conocimiento sobre las características de la β-galactosidasa de K. lactis y A.
oryzae permite usarlo de manera más eficiente en muchos procesos
industriales y formulaciones de productos, como pautas para el consumo
directo para individuos intolerantes a la lactosa.

CONCLUSIONES GENERALES
- Las características anfóteras que presentan las proteínas indican que no existe
un pH en el cual éstas vayan a carecer de carga eléctrica, incluso cuando la
carga eléctrica neta es cero, hay un pH característico denominado punto
isoeléctrico, el cual varía de acuerdo al aminoácido presente, así como de
acuerdo a la tendencia que posean sus grupos (amino, carboxilo y R) para
ceder un protón.

- Las proteínas que conforman el suero de la leche posen una mayor resistencia
a la desnaturalización, en su conformación estructural poseen una
predominancia de hélices alfa y beta correspondientes a la α- lactoalbúmina y
la β-lactoglobulina.

- La acidificación extrema en la leche tiene como resultado la desnaturalización


completa de su proteína principal, la caseína. De forma que se pierde la
estructura globular, es decir, se da el rompimiento de enlaces disulfuro que
estabilizan la estructura terciaria de la misma precipitando moléculas de
caseína.

- La inactivación de proteínas de la leche es un tratamiento utilizado como


indicador de una efectiva pasteurización debido a la similitud de la inactivación
térmica de la lacto peroxidasa con la bacteria Mycobacterium tuberculosis y la
LPL causante de rancidez en la leche.

- La adsorción de pectina en las micelas de caseína depende fuertemente del pH


y de la acidez designada (4.3 <pH <5) tales interacciones se convierten en
fuerzas predominantes para estabilizar las bebidas de leche acidificadas.

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