El máximo de absorbancia que vamos a colocar es 1, porque sabemos que el máximo de absorbancia en relación al error

fotométrico debería ser 0,8. Si supera la absorbancia 1, el porcentaje de error relativo va a ser muy elevado, por lo que
quiere decir que esa solución no la puedo analizar; porque al obtener una absorbancia de una solución que supera ese
limite seria perder el tiempo. No aplicamos la absorbancia ideal si ya le estoy colocando el rango; cuando se trabaja en
el área de investigación, si no hay un método descrito y no se la absorbancia de la solución a una determinada
concentración, tendría que recurrir a la utilización de la absorbancia con la constante para determinar la concentración
a la cual debo preparar la solución, para tener mi valor de absorbancia ideal, y de esa manera garantizar el menor
porcentaje de error relativo.
Aplicaciones de la espectrofotometría de Absorción:
Cuantitativo: determinar la concentración del analito, ya sea de materia
Curva de Calibración
prima o de productos terminados 1
M

Absorbancia
1. Método de la Curva de Calibración 0.5

Fundamento: preparar por lo menos 5 soluciones patrones de 0

0
M 5 10 15
diferentes concentraciones del analito de interés, y a su vez preparar 2
o por lo menos 3 muestras, para poder determinar la concentración de Concentración (mg/mL)
la muestra.(al menos 5 puntos). Se hace una interpolación y se
determina a través de la gráfica su concentración
-No está ligada a una técnica analítica, es un método, donde voy a tener diferentes concentraciones y lo que va a
cambiar es la señal, que en este caso va a ser absorbancia; pero puede ser aplicado a otras técnicas analíticas como por
ejemplo la refractometría.
-En el caso de la espectrofotometría de absorción lo que cambia es la respuesta analítica en función de lo que estoy
determinando. Las variables serán: absorbancia vs concentración. Graficamos la concentración en función de la
absorbancia.
En las diluciones siempre usamos material de medición exacta: pipetas volumétricas(de 1-10, luego la de 15, 20, 25, 30,
50 y 100) y balones aforados.(y balanza analítica). Por cada balón una pipeta. La aproximación es el mas cercano que
tenga multiplo.
2. Preparación de una solución patrón de concentración exactamente conocida, y la preparación de una solución de la
muestra de similar concentración. Se leen ambas soluciones a la longitud de onda de máxima absorción del analito de
interes y se aplica la Ley de Beer. A = K.b.C
La constante de la muestra o del patrón es la misma, porque es el mismo analito.
Espectrofotometría se necesitan 3 soluciones: el blanco(el que se utiliza en la ultima dilución)
la muestra y el patron
El factor de dilución es adimensional. El principio activo(mg puros) son los que absorben entonces me enfoco el que uso
para determinar la concentración
La capacidad de la celda son 3 ml. Si tengo un numero pequeño, multiplico ambos por la unidad seguida de 0. El ultimo
balón va a ser el mismo del que yo puse como volumen final( Eso no influye en la dilución, pero se suele hacer asi
Para la preparación del patrón: debo tomar en cuenta la pureza y la cantidad a pesar del patrón, el rango es entre 10 y
100mg. Sino va a tener un error. No puede ser menos de 10 por la sensibilidad de la balanza. Determinar los mg puros a
partir de la pureza en el patrón. En el factor de dilución debo tomar son los gramos puros.
Leo la absorción y me voy a la ley de Beer. Espero que la absorbancia de la muestra y patrón sea 0,434
La concentración que tomo para el patrón es la final. Al final con la concentración de la mx me devuelvo en el esquema
de dilución para obtener la pureza de la mx
3. Sistema de Componentes Múltiples:
Estamos hablando de compuestos que forman parte de un sistema de equilibrio. Tengo un compuesto que puede estar
formando parte de un sistema de equilibrio, en el cual, yo voy a tener quizás los dos compuestos capaces de absorber
radiación en una misma solución. Este sistema también aplica, a un producto con dos principos activos presentes en la
muestra
a)Determinación de Mezclas Binarias: productos que tienen dos PA capaces de absorber radiación. Para poder
determinar la concentración de mezclas binarias, cada una de las sustancias independientes
deben cumplir con la ley de beer. Donde uno presente un maximo de absorbancia, el otro debe
presentar un mínimo y visceversa. La absorbancia es una propiedad aditiva

 Ambos espectros no presentan solapamiento(superponen en el margen de longitudes de onda

de trabajo.) leo a la longitud de onda de máxima absorción el compuesto A y del compuesto B
 Ambos espectros presentan solapamiento en las longitudes de
onda de absorción.

Cálculos del sistema de componentes múltiples:

o En las mezclas binarias tenemos que:

Dos analitos, dos patrones; determino la absorbancia de cada uno a ambas

longitudes de onda de máxima absorción(4abs)

b) Espectrofotometría Diferencial:
Se emplea en los siguientes casos:
Determinación de la concentración de una muestra en presencia de interferentes (generalmente excipientes), sin
recurrir previamente a un método de separación.
 Se prepara 2 soluciones de la muestra (a partir de la solución madre) con la finalidad de que tengan igual
concentración.(variando el diluente para variar el pH)(lo mismo hago con el patrón e igual un diluente acido y uno
básico)
 Se trata diferente a las 2 muestras (variando el pH), esto solo cambiará las características de absorción del analito.
 Se tendrá espectros tanto para la muestra como para el patrón y se obtendrá 4 valores de absorbancia (A).
Lógica: - tengo un compuesto que a un pH y Longitud de onda tiene una absorbancia, y a otro pH va a haber un
desplazamiento y la absorbancia va a cambiar. Si se desplaza la absorbancia disminuye, si a esa longitud de onda mi
compuesto de interés sigue absorbiendo, lo que esta absorbiendo los excipientes. La absorbancia menor corresponde a
la absorbancia de los excipientes nada mas
Determinación de la constante de disociación de un ácido o base débil (pKa y pKb). Trabaja con compuestos en eq
Preparo 3 soluciones
a diferentes pH: uno
a pH acido, básico e
intermedio(buffer
con dos especies en
equilibrio y se
puedan restar una
con la otra). Acido
absorbe la forma no
ionizada
Espectrofotometría Visible
Absorbancia en ph basico
es mayo a la de ph acido,
esta en medio basico
2pH basico: ionizada
Acido: no ionizada
Instrumentacion
Seleccionamos la longitud de onda, las celdas, las lámparas.
1. Fuente de radiación: emite la longitud de onda que voy a necesitar para llevar a cabo el método analítico; en el
rango UV: Deuterio: porque emite radiación a la longitud de onda de 200-400nm. Visible: filamento de
Tugsteno.
2. Sistema de selección de longitud de onda: banda estrecha, sistemas selectores: Filtros y monocromadores.
3. Celdas de absorción: Visible: vidrio; UV: cuarzo(son transparentes en la región, no absorbe radiación, por su
dispersión); IR: se selecciona dependiendo si la mx es líquida, solida(se usa pasta con bromuro de potasio) o gas;
la mx debe estar exenta de agua
Manipulación correcta de las celdas:
-Manipular por la parte superior y limpiar con Sutil(el toallin la raya); sin rotular porque impide el paso de
radiación
-Secar bien, porque los solventes son agresivos y pueden dañar el instrumento; al igual que la huella.
-Se lava de manera correcta dependiendo del tipo de celdas
4. Detector traductor: dice la señal de algo que esta ocurriendo en el equipo, que puede ser absorción
5. Sistema amplificador
6. Sistema de lectura

Requisitos de la Fuente de radiación: permite decir que el análisis cumple con todos los parámetros cuantitativos que
hemos determinado, aplicando la ley de Lambert Beer, con los espectros de absorción del patrón y la muestra.

Se debe garantizar que la radiación genere un haz de luz con suficiente potencia, de tal manera que usted pueda
asegurar que todos los análisis que se están realizando tienen la misma intensidad de luz

Debe hacer que la radiación sea continua; Debe ser estable

Como funciona?

1. Deuterio o de Hidrogeno: radiación UV: el equipo espera a que la lampara este lista( aque ocurra la excitación y
emisión), emita la radiación correspondiente a la región UV y proceda a hacer el análisis.
-Tubo de vidrio en una ventana de cuarzo, se rellena con dos electrones de deuterio, ahí hay excitación de los e- de
deuterio, y cuando ellos vuelven al estado fundamental emiten radiación en el rango correspondiente al espectro UV de
la radiación electromagnética.

-Fundamento: Teoria de cuerpo negro: la emisión de radiación es mas característica de la temperatura que alcanza la
superficie emisora, que de la constitución del material. Calentamiento de un solido hasta la incandecencia, entonces
produce la emisión de radiación caracteristico de la elevada temperatura que alcanza el material de la constitución de la
cual esta hecha. En el colorímetro no hay necesidad de esperar la excitación ni que vuelva al estado fundamental para
emitir radiación; se basan en la teoría de cuerpo negro.

-Region IR: huella digital, aparecen grupor funcionales. Funciona igual al filamento de tugsteno, por el calentamiento de
un solido hasta la incandesencia. El material alcanza temperaturas entre 2500- 2200ºK provocando la emisión de la
radiaciaon. Dependiendo de la región del espectro a trabajar: IR cercano e IR lejano, es decir dependiendo del numero
de onda se clasifican en:

Lampara de Nernst: constituida por oxidos de zirconio e itrico

Lampara de globar: varillas de de carbono y silicio

Se utilizan muestras exentas de agua

Ancho efectivo de banda de una radiación

Ancho de banda: es el rango de longitud de onda donde esa transmitancia es exactamente la mitad de la transmitancia
máxima

Trabajan bandas angostas de longitud de onda por:

 Mayor probabilidad de adhesión a la ley de Lamber Beer: cuando hay anchos de banda, hay desviaciondes de la ley,
reales e instrumentales: debido a la fuente de radiación y a la selección de esa longitud de onda
 Mayor selectividad: estoy seguro que de que solo la que se absorbe es la que esta emitiendo la lampara.
 Mayor sensibilidad: A pequeños cambios de concentración(vemos residuos), grandes cambios

Para seleccionar el ancho de banda efectivo

Selección de la longitud de onda en el espectrofotómetro empleando monocromadores, que regulan el espectro UV,
VIS e IR.

-Monocromadores: desdobla la radiación policromática en las longitudes de onda que lo conforman. Componentes:
Ranura de entrada, Lente colimadora( dirige la radiación hacia el dispersor) y El elemento dispersor que es un prisma o
una red para el desdoblamiento de las longitudes de onda, Lente focalizadora( dirige las longitudes de onda hacia la
ranura de salida). Recordatorio: cuando enciendo la luz, ella emite radiaciones en la región de todo el espectro UV,
desdobla toda las long. de onda y las focaliza en la ranura de salida, es decir a la banda angosta de longitud de onda que
yo seleccione.

-Prisma: la incidencia forma un angulo con la superficie, que se llama angulo de incidencia, que penetra y sale la
radiación nuevamente formando el angulo de desviación(que sufre el rayo incidente al atravesar el prisma); y aquí hay
es el angulo de refracción. Lo importante es que las longitudes de onda menores son mas desviadas

En la dispersión anómala ocurria por esta muy próximo o en la long. de onda donde el compuesto absorbe radiación. A
medida que aumento la longitud de onda, disminuye el índice de refracción, por lo que disminuye el angulo de
desviación(en la normal). En este caso cuando la longitud de onda es menor, el IR es mayor el angulo de desviación es
mayor; por eso son las mas desviadad. En este caso la dispersión máxima se da cuando trabajamos en la dispersión
anómala, por ser la región próxima a su absorción

-Prisma de Comu: prisma de 60º de cuarzo

-Prisma de Littrow: 30º de cuarzo

Ambos e utilizan como monocromadores de prisma para seleccionar ese ancho de banda estrecha

De red: Reflexión y transmisión plana. Se fundamentan en el fenómeno de la difracción( desviación que sufre el haz de
luz cuando pasa por una ranura(superficie) angosta. Consiste en pequeña lamina con pequeños surcos, la radiación
incide por debajo y aquella radiación que sigue la línea recta no tiene ni reflexión ni refracción; pero la que se desvía
tiene difracción, y forman el angulo de desviación. Ocurre entonces una interferencia óptica constructiva

REDES DE REFLEXION: se obtienen rayando una superficie metálica pulida, la radiación incide sobre la superficie
metálica pulida y va a tocar o chocar y parte de ella se refleja y cuando toca o choca con la siguiente radiación hay
interferencia óptica constructiva

Poder de Resolucion: capacidad del sistema monocromador de separar 2 long. de ondas cercanas

Fotocolorímetros: regiones del espectro visible principalmente, utilizan filtros, no monocromadores

-Filtros: fueron los primeros equipos que salieron; hay de absorción(generalmente usados) y de Interferencia

Fundamento para el ancho efectivo, banda estrecha: Son mas sencillos, menos costosos y hecho de material especial
para que absorba cierta longitud de onda y transmita otras. Se seleccionan de acuerdo a la longitud de onda y da el
ancho de banda efectiva.

DE ABSORCIÓN: 1hechos a base de gelatina o vidrio coloreado. 2Funciona por el color complementario: seleccionamos
la long. de onda en base al color que observamos, en el equipo hay un vidrio coloreado que exactamente se coloca en el
que absorbe la radiación, deja pasar un haz. 4 El ancho de banda efectivo es de 30-250nm

DE INTERERENCIA OPTICA: 1. Se fundamentan en la insterferencia óptica(constructiva) para producir bandas estrechas

de longitud de onda

Interferencia: fenómeno que se produce cuando 2 o mas bandas(long. de ondas) llegan simultáneamente al mismo
punto( con la misma frecuencia y longitud de onda) o están separados a un numero entero de longitud d onda se llama:
interferencia constructiva.
Interferencia destructiva: con decimas

Fisica: cuando el haz de luz incide refleja(choca con la siguiente longitud de onda, y aquí se ve si choca en un numero
entero, refuerza el haz de luz( interferenca óptica constructiva) o en decimas) y refracta

Numero de orden de interferencia: es un numero pequeño que determina las diferentes longitudes de ondas que
pueden ser reforzadas.

Para anchos de banda mas estrechos tiene picos que garantizan que la long. de onda es la de absorción y utiliza el
fenómeno de la interferencia óptica para obtener el ancho de banda.

Dectetor Traductor: El selector de long de onda y detector funciona exactamente igual. Si la muestra absorbe va a haber
una señal(espectro de abs. % de tramitancia) y esto lo va a decir el detector.

Caracteristicas:

-Altamente sensible, si hay pequeña concentración debo detectarlo. Trabajamos en un rango de valores de absorbancia,
si la muestra esta muy concentrada no le va a detectar nada, si no es muy sensibe no detecta nada

-Ruido muy pequeño: 1:3, esos ruidos son por la lampara, el voltaje; por eso lo calibramos una sola vez, es sensible.

-Cuantificacion 1:10; Respuesta constante y rápida; producir una señal que pueda ser amplificada

Decterores sensible a fotones: cuando aplico la radiacion, llega a una superficie activa que absorbe lo que la mx no
absorbe, y emite electrones que se convierten en una fotoseñal que es lo que yo registro. Son el fototubo y el
fotomultiplicador.

Fototubo: Colocamos la muestra en la celda, pasa la radiación, lo lógico es que absorba una parte de la radiaicon, y la
otra parte de la radiación se llama poder radiante transmitido. La radiación que transmite choca con la membrana de
cuarzo, entra a un catodo y choca sobre esa superficie activa del catodo, y hay absorción de la radiación y esos fotones
están débilmente unidos se dirigen hacia el anodo y se genera una intensidad de corriente en el sistema, que es
amplificada y por lo tanto es leida. Se utiliza en UV y VIS. La señal llega directamente al amplificardor

Si la muestra es muy concentrada la energía transmitida es muy pequeña, cuando llega al catodo hay pequeña
radicación, pequeña cantidad de e- que van hacia el anodo, por lo tanto la intensidad de corriente es pequeña, la
absorbancia es alta, y el de transmitancia baja. UV VIS

Fotomultiplicador: similar al fototubo, la transmitida va a llegar al detector que es el fotomultiplicador entra por una
ventana de cuarzo y choca con el catodo, pero tiene 9 dinodos. El dinodo 1 es 90V mas positivo que el catodo, entonces
los electrones se dirigen al dinodo 1 en vez del catodo, y va a haber entonces un efecto multiplicador de esos
electrones. el dinodo 2 es 90V mas positivo que el 1, al final tenemos un efecto multiplicador, y tiene 10 a la 6 o a la 7e-
mas en cada dinodo, la respuesta es mucho mas sensible, y rápida que en el fototubo. Problema: su superficie activa
tiende a dañarse mucho mas rápido.

Detectores sensible al calor: utilizados en la región IR del espectro, la radiación llega a cuerpo negro, hay una diferencia
de calor y es lo que el detector va a decirme. Se fundamenta en la teoría del cuerpo negro. Tenemos: termopar,
termocupla, cologenos y las celulas de colagenos. Llega al cuerpo negro.

Termopar o Termocupla: tenemos dos metales, antimonio y bismuto, y estos se soldan con soldadura caliente
generalmente de oro y una fría. Ellos están frios, cuando la radiación IR incide lo hace sobre la soldadura caliente,
provocando un aumento de temperatura, pero la fría se mantiene fría, se apantalla de una manera cuidadosa para
mantenerse fría; si uno aumenta el calor y el otro se mantiene frio hay diferencia de calor y eso es lo que se lee.

Tienen una resistencia que es sensible al calor, la radiación llega a ellos y se provoca un diferencial de T que es lo que
mide el detector

-Celulas de _____ tienen un detector de temperatura, un termómetro sensible.

Sistema de Lectura:

Lectura directa: conformado por un voltimetro, es lo que leemos directamente los valores de absorbancia o %T
Punto nulo: tiene aparte del voltimetro un potenciómetro de voltaje variable, llega la radiación los e- generan
fotoemisión hay intensidad de corriente, se amplifica y va a haber un valor, y hace que este valor en lugar de estar en 0
tenga un valor + o -, eso genera que en el potenciómetro se establezca una lectura exactamente igual pero del signo
contrario, de manera de compensar nuevamente el punto nulo. El potenciómetro genera la diferencia de corriente que
hay en el sistema, de manera de colocar el perímetro de nuevo en punto nulo.

VENTAJA DE UN EQUIPO DOBLE HAZ A UNO DE HAZ SENCILLO

Doble haz: En el espectrofotómetro conectamos la red selecciona la long. de onda y lo calibra en 0. En vez de tener 2
portacelda tiene una sola, pero tiene software interno que almacena la información, el esta calibrado todo el tiempo a
ese blanco. Cada que coloca la mx resta el valor si el blanco absorbe.

Si es simple cada vez que lee debe colocar el blanco