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SISTEMAS COMERCIALES Y AUTOMATIZADOS DE

IDENTIFICACIÓN BACTERIANA (MICROTÉCNICAS):

1.- SISTEMAS COMERCIALES:

El material y los reactivos para la realización de estas multipruebas


microtécnicas, se encuentran comercializados en Kits.
Existen en el comercio diversos sistemas de este tipo tanto en tiras como
en tubos (tiras API, Enterotube, etc.), todos ellos tienen un fundamento común.

Fundamento:

Los medios, deshidratados o no, se encuentran contenidos en microtubos


que se rehidratan o siembran mediante una suspensión bacteriana y luego se
cultivan. Más tarde se incuban y en este proceso el metabolismo del
microorganismo genera cambios en el medio de cultivo que se aprecian por un
cambio de color de éste o al añadir reactivos. Los cambios ocurridos se
interpretan mediante tablas de lectura o mediante un programa de ordenador.

1.- A.- TIRAS API:

Las tiras API son un sistema comercial de identificación de


microorganismos. Existen diferentes tiras para distintos grupos de
microorganismos, agrupados en grupos o familias que tienen una serie de
características comunes entre ellos y muy diferentes a las de otros grupos.
Entre las pruebas que llevan cada tira se han elegido las más adecuadas para
poderlos diferenciar entre sí. Así hay tiras API para enterobacterias, anaerobios,
Neisseria-Haemophilus, estafilococos-estreptococos, etc.
Las tiras API 20E son un sistema para la identificación de enterobacterias
y otros bacilos Gramnegativos, mediante 23 test estandarizados y
miniaturizados, y una base de datos.

Fundamento:

Las galerías API 20E constan de 20 microtubos que contienen los


sustratos deshidratados. Los test se inoculan con una suspensión bacteriana
que rehidrata los medios. Durante la incubación el metabolismo de la bacteria
puede producir o no, cambios de color espontáneos o bien al añadir los
reactivos. Esto depende de que el microorganismo posea o no la enzima
buscada. La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la tabla de
lectura de la página 40, y la identificación mediante unas tablas de identificación
o un programa de ordenador.
Estas galerías se conservan en nevera, así como los reactivos. El reactivo
de la oxidasa (OX), debe conservarse en la oscuridad, por lo que se debe
envolver el frasco en papel de aluminio.

Material y reactivos:

- Galerías API 20E, cámaras de incubación, hojas de resultados y


medio de suspensión (agua destilada estéril).
- Reactivos para triptófano desaminasa (TDA), indol (James o IND),
Voges-Proskauer (VP1 y VP 2), nitritos (NIT1 y NIT 2) y Zn, oxidasa (OX). En
algunas casos también se precisa medio OF y medio para ver movilidad .
- Aceite de parafina, pipetas Pasteur estériles.
- Cultivo puro del microorganismo problema.

Técnica:

Se deben seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante.

1.- Preparación de la galería:

- Preparar una cámara de incubación con su tapa correspondiente y


repartir unos 5 ml de agua en los alvéolos para proporcionar una atmósfera
húmeda.
- Identificar la muestra en la lengüeta lateral de la cubeta.
- Sacar la galería de su bolsa hermética y colocarla en la cámara de
incubación.

2.- Preparación del inóculo:

- Tomar una colonia bien aislada del microorganismo problema y realizar


una suspensión de las bacterias en un tubo con 5ml de agua estéril,
mezclándolo bien.
- Paralelamente realizar el test de la oxidasa con el reactivo, siguiendo la
técnica de la página 19.
3.- Inoculación de la galería:

- Llenar el tubo y la cúpula de los test CIT , VP y GEL , con la


suspensión anterior.
- Llenar los tubos pero no las cúpulas de los demás test.
- Llenar la cúpula de los test ADH, LDC, ODC, H2S y URE, con aceite de
parafina para obtener anaerobiosis.
- Cerrar la cámara de incubación e incubar a 35-37ºC durante 18-24
horas.

4.- Lectura de la galería:


- Después de incubar debe hacerse la lectura según la tabla anterior.
- Anotar en la hoja de resultados los colores de las reacciones
espontáneas.

- Si la glucosa da positivo y/o 3 o más tests son positivos, efectuar el


revelado de los tests que requieren reactivos:
 Test VP: añadir una gota de VP1 y VP2. Esperar 10 minutos. Un
color rojo o rosa brillante indica una reacción positiva.
 Test TDA: añadir una gota de reactivo TDA. Un color marrón oscuro
indica una reacción positiva.
 Test IND: añadir una gota de reactivo IND y esperar dos minutos.
La aparición de un anillo rojo indica que la reacción es positiva. En
caso de que no dispongamos de ese reactivo, se puede añadir en
su lugar una gota de reactivo JAMES, en ese caso la aparición
inmediata de una coloración rosa indica que la reacción es positivo
 - Añadir a la hoja de resultados los colores obtenidos después de
echar los reactivos y esperar tiempo indicado.

5.- Identificación:

- Mediante la tabla de lectura de la página anterior, comparar las


reacciones de la hoja de resultados con los de la tabla.
- Del conjunto de reacciones debe obtenerse un perfil numérico de la
siguiente forma: en la hoja de resultados los test están en grupos de tres y cada
uno de ellos tiene asignado el valor 1, 2 ó 4. La galería API 20E consta de 20
test, los números en el interior de cada grupo corresponden a las reacciones
positivas. El test de la oxidasa es el nº 21, y si es positivo se le asigna el valor 4.
A los negativos se les da el valor 0. Sumando los números de cada una de las
pruebas dentro de cada grupo, se obtiene un código de 7 cifras.
- En algunos casos, el perfil de 7 cifras no es suficiente para identificar el
microorganismo. En estos casos deben realizarse los test complementarios:
 Test NO2-: añadir dos gotas de reactivo NIT1 y NIT2 en el tubo
GLU. Un color rojo indica una reacción positiva. Una reacción
negativa puede deberse a la reducción de los nitratos a N2
(acompañada muchas veces de la formación de burbujas). Añadir
de 2 a 3 mg de Zn. Si después de 5 minutos el tubo permanece
amarillo indica una reacción positiva. Si la reacción da color rosa o
rojo, el resultado es negativo.
 Movilidad (MOB).
 Cultivo en Mc Conkey (McC).
 Oxidación de la glucosa (OF-O).
 Fermentación de la glucosa (OF-F).
- En este caso las reacciones correspondientes a estas últimas pruebas se
codifican según el criterio anterior, obteniéndose un perfil de 9 cifras.
- El perfil obtenido se compara con las tablas de identificación o con el
APILAB, con lo que obtenemos la siguiente información:
 Nombre de la especie identificada.
 Porcentaje de identificación.
 Los test en contra (si los hay) con el porcentaje de reacciones
positivas que se observa normalmente para esta especie.
 Comentario sobre la calidad de la identificación.
 En los casos de “poca discriminación” entre dos o tres taxones, nos
indica los test que pueden diferenciarlos.
6.- Esterilización:

Después de utilizar todo el material, éste debe ser incinerado o


esterilizado en autoclave.