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UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y


BIOTECNOLOGÍA
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE INGENIERÍA DE LAS ENZIMAS

Nivel: Octavo Paralelo: “U”

0
Docente: Cecilia Carpio
Ciclo Académico Septiembre 2019 – enero 2020 CALIFICACIÓN
Integrantes:  Lisette Ramos

10
Wendy Sailema
 Andrés Sánchez
 Juan Solís

“DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA Y DEL CONTENIDO


DE PROTEÍNAS DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS Y ENZIMAS
COMERCIALES”
1. OBJETIVOS
a. Objetivo General
Determinar la actividad enzimática de la invertasa y la glucoamilasa.
b. Objetivos específicos
 Identificar el contenido de proteínas de las soluciones enzimáticas.
 Realizar la curva estándar de glucosa.

2. DATOS Y RESULTADOS

Tabla 1. Curva de calibración estándar de glucosa

Número Volumen Peso Volumen Concentración Absorbancia


Est. (ml) Est. (g) H2O (mg/ml)
(ml)
1 0,000 - - - -
2 0,100 0,0993 0,900 0,201 0,0990
3 0,300 0,2904 0,700 0,592 0,3160
4 0,500 0,4926 0,500 0,998 0,5600
5 0,700 0,6863 0,300 1,391 0,7730
6 0,900 0,8985 0,100 1,794 1,0000

Curva de calibración estándar de


glucosa
1.2

0.8

0.6

0.4

0.2 y = 0.5648x - 0.0152


0 R² = 0.9997
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

Tabla 2. Concentración de Glucosa vs Tiempo Enzima Invertasa Ensayo 1

Absorbancia Tiempo (min) Concentración


(mg/ml)
0,000 0 0,0000
0,084 1 0,1739
0,138 2 0,2691
0,199 3 0,3768
0,292 4 0,5408
0,295 5 0,5461

Tabla 3. Concentración de Glucosa vs Tiempo Enzima Invertasa Ensayo 2

Absorbancia Tiempo (min) Concentración


(mg/ml)
0 0 0,0000
0,064 1 0,1386
0,129 2 0,2533
0,201 3 0,3803
0,242 4 0,4526
0,314 5 0,5796
GRÁFICO 2: ENSAYO 1 Gráfico 3: Ensayo 2 Enzima Invertasa
ENZIMA INVERTASA 0.7
0.6
0.8
0.5
0.6
0.4
0.4 0.3
y = 0.1133x + 0.0174
0.2
0.2 R² = 0.9941
y = 0.1125x + 0.0364 0.1
0 R² = 0.9662
0
0 1 2 3 4 5 6
0 1 2 3 4 5 6

Tabla 4. Concentración de Glucosa vs Tiempo Enzima Glucoaminasa Ensayo 1

ABSORBANCIA TIEMPO (MIN) CONCENTRACIÓN


(MG/ML)
0 0 0,0000
0,115 1 0,2286
0,231 2 0,4332
0,348 3 0,6396
0,444 4 0,8090
0,567 5 1,0259

Tabla 5. Concentración de Glucosa vs Tiempo Enzima Glucoaminasa Ensayo 2

ABSORBANCIA TIEMPO (MIN) CONCENTRACIÓN


(MG/ML)
0,000 0 0,0000
0,150 1 0,2904
ENZIMA PENDIENTE ACTIVIDAD
(MG/ML. MIN) ENZIMÁTICA (UI/ML)
INVERTASA ENSAYO 1 0,1125 12,5000
INVERTASA ENSAYO 2 0,1113 12,3667
GLUCOAMILASA 0,2022 1123,33
ENSAYO 1
GLUCOAMILASA 0,1522 845,555
ENSAYO 2
0,215 2 0,4050
0,298 3 0,5514
0,356 4 0,6537
0,449 5 0,8178

Tabla 6. Actividad enzimática de Invertasa y Glucoamilasa

Gráfico 4: Ensayo 1 Enzima Gráfico 5: Ensayo 1 Enzima


Glucoaminasa Glucoaminasa
1.2 1

1 0.8

0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
y = 0.2022x + 0.0172 y = 0.1522x + 0.0727
0.2 0.2
R² = 0.9985 R² = 0.9715

0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
 Cálculo contenido de Proteínas

Tabla 7. Curva estándar de BSA a partir de datos experimentales previamente obtenido

Std BSA P. total Conc-Std Pepsina Absorbancia


(g) (g) mg/(mL)
0,0000 0,0000 0,00 0,000
0,0518 0,2657 3,79 0,139
0,0996 0,2532 7,66 0,265
0,1430 0,2441 11,40 0,373
0,1907 0,2422 15,32 0,479

Gráfica 6: Curva estándar BSA


0.6

0.5

0.4

0.3

0.2
y = 0.0312x + 0.0133
0.1 R² = 0.9961

0
0 5 10 15 20

Tabla 8. Concentración de proteína pepsina por el análisis de Biuret

Ensayo Absorbancia Promedio Concentración de


por triplicado pepsina (mg/ml)
0,46 0,461 14,339
1 0,458
0,464
0,465 0,462 14,381
2 0,458
0,463
0,473 0,473
3 0,458 14,734
0,488
0,483 0,484 15,076
4 0,481
0,487
Tabla 9. Actividad específica

Actividad Enzimática Concentración de Actividad Específica


(UI/ml) pepsina (mg/ml) (UI/mg)
12,5000 14,339 0,872
12,3667 14,381 0,859
1123,333 14,734 76,341
845,555 15,076 56,086

3. DISCUSIÓN

Las enzimas son proteínas que actúan como aceleradoras de las reacciones bioquímicas
en los sistemas vivos. Estas hacen posible que las reacciones metabólicas se desarrollen
a un ritmo razonable, compatible con la vida (Altamirano 2013). La invertasa, es una
enzima presente en varias isoformas, que tiene la finalidad de hidrolizar la sacarosa en
sus monosacáridos componentes, la glucosa y fructosa (Mungía, 2010). Mientras que la
glucoamilasa es encargada de producir fragmentos de glucosa al romper los enlaces del
glucógeno o almidón (Altamirano, 2013).
Existen algunas formas de hallar la actividad de una enzima, una de ellas es evaluando la
cantidad de producto que se forma cuantificándolo mediante espectrofotometría. Se
determinaron las concentraciones de glucosa, observándose un incremento de estas a
medida del paso del tiempo. Normalmente, a los 5 minutos existe una concentración de
glucosa superior a 1 mg/ml (Novo, 2008), sin embargo, al realizar la práctica, la
concentración de glucosa a los 5 minutos llegó a un valor aproximado a 0,5 y 0,6 mg/ml
en los dos ensayos con invertasa y para la glucoamilasa valores de 1,0259 y 0,8178 mg/ml
como se puede apreciar en las tablas 2,3,4,5. Esta concentración de glucosa se vio
afectada directamente por la actividad de cada enzima, debido a que estuvieron mucho
tiempo extraídas, antes de que se realizaran las mediciones, por lo que no se pudo obtener
un valor mayor de concentración. En la tabla 6, se determinó la actividad enzimática de
las proteínas, en el caso de la invertasa este fue de 12.500 y 12.3667 UI/ml en el ensayo
1 y 2 respectivamente, mientras que para la glucoamilasa los valores obtenidos fueron
1123,33 y 845,555 UI/ml. Con lo que se identifica que la actividad fue bastante superior
en la glucoamilasa, esto debido a que la invertasa realiza una conversión lenta de la
sacarosa, en dos componentes, además de depender del pH, siendo el óptimo entre 4 y 6,
por otro lado, la glucoamilasa se ajusta más a un pH neutro (Fuentes, Quispe, & García,
2018).
Al comparar estos valores de Actividad enzimática con datos bibliográficos se puede
determinar que en el caso de la Invertasa el valor se encuentra muy cercano. Según (Vega,
Farias, Peraca, Augusto, & Valmor, 2017) la actividad es de 15,8 con una variación de
1,63 UI/ml con un nivel de confianza del 95% y los obtenidos en la práctica variaron entre
los 12 UI/ml. Para la glucoamilasa por el contrario, los valores establecidos por algunos
autores no sobrepasaron los 250 UI/ml, notándose que los valores obtenidos durante la
práctica son muy lejanos a los citados bibliográficamente, lo cual puede ser debido a
varios factores que afectaron los resultados como un mal cálculo o una mala extracción
de la enzima, además de una incorrecto manipulación (Hernández, Hernández, Jiménez,
& Cruz, 2019).
Para determinar la cantidad de proteínas en el extracto se aplicó el método de Biuret
basado en la formación de un complejo entre el cobre en ion y los enlaces peptídicos,
dicha reacción crea un color que varía entre azul y púrpura, este es un método muy
preciso, pero poco sensible ya que la abundancia de enlaces es igual en todas las proteínas
(Aragón , Escalona, & Pina, 2004). La concentración se determinó midiendo las
soluciones en el espectrofotómetro a 550 nm, a través de las absorbancias del extracto
para cada grupo por triplicado, en base a la curva estándar de proteínas obtenidas con la
albúmina de suero bovino (BSA), utilizado frecuentemente pero presenta ciertas
limitaciones, ya que al producir una fuerte tinción con el colorante, aparenta tener más
contenido de proteínas, además de no poder ser preparada con un alto nivel de pureza
debido a que se puede unir a otros factores, lo que puede acarrear errores en los resultados
obtenidos (Zamora, Molina, & Chacón , 2011). Mediante este método se obtuvieron
valores que varían desde 14,339 hasta 15,076 mg/ml. Además, según Novo (2008), la
cantidad de proteínas aumenta en el tiempo debido a la actividad catalítica de un mayor
número de enzimas, por lo que la concentración proteica en el extracto aumentó con el
tiempo de reacción, comprobándose con la actividad específica de la proteína, que fue de
0,872 y 0,859 UI/mg con invertasa y 76, 341 y 56,086 UI/mg con glucoamilasa, todos
estos datos se encuentran en la tabla 9. La velocidad catalítica también es un factor para
considerar, pero no se lo tomó en cuenta debido a que no fue parte de la experiencia
práctica.

4. CONCLUSIONES

5. RECOMENDACIONES

6. CUESTIONARIO
- A partir de ¿Qué otra fuente se puede extraer invertasa?

La extracción de la invertasa también se la puede realizar por un proceso de


autolisis, donde la enzima degrada las estructuras celulares y liberan el contenido
citoplasmático al medio extracelular. El proceso de autolisis realizado por shaker
a distintas velocidades de agitación (50 – 350 rpm) y concentraciones de
bicarbonato de sodio a 40 °C por 24 horas. Aquí se usa un diseño experimental
compuesto centras adaptado para dos variables y cinco niveles, así como una
metodología de superficie de respuesta (MSR) y análisis canónico para definir las
condiciones óptimas de extracción de invertasa de S. cerevisiae aislada de puré de
durazno. (Vega, M., Farias, A., Peraca, R., Augusto, W., & Valmor, C. 2017)

- ¿Qué ocurre si no se eliminan todas las partículas del extracto en la


medición de la absorbancia tanto para azúcares reductores como para
cuantificar proteínas?

Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenar en forma de energía


interna. Cuando la luz del espectro es absorbida por una molécula en la
cuantificación de proteínas se origina un salto desde un estado energético basal a
un estado de mayor energía. Cada molécula tiene una serie de estados excitados
que la distingue de otras moléculas. Por lo tanto, si no se eliminan las partículas
del extracto en la medición de la absorbancia hay variaciones directas en los
valores de λmax y εM, lo cual nos dará valores erróneos, y la curva estándar no
proporcionará el resultado esperado. (Nieves, A. Antonio B., Emilio F., Jesús J.,
Isaac T. 2015)

7. BIBLIOGRAFÍA

Altamirano, C. A. (2013). “Optimización de un Método para la Producción de Biomasa


de Saccharomyces cerevisiae empleada en la etapa de Fermentación del Mosto de
Cerveza, desde un nivel de Laboratorio a un nivel Piloto”. Recuperado de
http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/552/1/Altamirano_cc.pdf [7 de
abril de 2018]

Aragón , C., Escalona, M., & Pina, D. (2004). Evaluación del efecto de las condiciones
generadas por Biorreactores de Inmersión temporal sobre enzimas y procesos
clave del metabolismo del carbono en plantas in vitro de plátano. Biotecnología
Vegetal , 147-152.

Fuentes, F., Quispe, I., & García, J. (2018). Estandarización del método de Biuret para
cuantificar proteínas totales en suero antiboprótico polivalente producido en el
Centro Nacional de Productos Biológicos del INS. Instituto Nacional de Salud,
220-224.

Hernández, M., Hernández, A., Jiménez, F., & Cruz, M. (2019). Aprovechamiento del
almidón de Cebada de mala calidad para la producción de enzimas amilolítcas
po A. pollulans . Int. Contam. Ambie, 435-446.

Mungía, L. (2010). “Producción de invertasa de Cellulomonas flavigena y avances en la


síntesis química enzimática de iminoazúcares”. Recuperado de
http://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/19714/Lorena_Mungu%C3%ADa_
Verdi.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Nieves, A. Antonio B., Emilio F., Jesús J., Isaac T. (2015). "Espectrofometría: Espectros
de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas" Recuperado de:
Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas

Novo, J. (2008). “Extracción y ensayo de la actividad invertasa de levadura de panadería


- Estudio
cinético de la actividad invertasa de levadura de panadería”. Recuperado de
https://www.revistavirtualpro.com/biblioteca/extraccion-y-ensayo-de-la-
actividad-invertasa-de-levadura-de-panaderia---estudio-cinetico-de-la-actividad-
invertasa-de-levadura-de-panaderia

Vega, M., Farias, A., Peraca, R., Augusto, W., & Valmor, C. (2017). Extracción
optimizada y purificación parcial de invertasa aislada de S. cerevisiae en puré de
durazno . Revista Brasileira de Fruticultura.

Zamora, M., Molina, M., & Chacón , G. (2011). Evaluación del efecto de la
temperatura, concentración y flujo volumétrico en hidrólisis de sacarosa
mediante una invertasa inmovilizada en un reactor esférico. San José: UCR.