Diapositiva 1: Buenos días compañeros… bla bla bla…

Diapositiva 2: (Enzimas)

Para comenzar, tenemos que saber que son las enzimas, estas son proteínas que
actúan como un catalizador en reacciones enzimáticas de los seres vivos, esto
quiere decir que son sustancias que sin consumirse en una reacción aumenta
notablemente su velocidad al disminuir su energía de activación. Esto tiene como
finalidad que ocurran reacciones que sin catalizador y en condiciones fisiológicas
requieren de condiciones extremas de presión, temperatura y pH. Cabe destacar
que para que esto ocurra, las enzimas se combinan de forma específica y
transitoria con su sustrato, no forman parte de este ni del producto, ellas solo
participan en la reacción y sufren cambios conformacionales. (Explicar imagen de
la diapo)

En cuanto a la estructura enzimática, estas se encuentran conformadas por un

sitio activo, que es donde ocurre la catálisis de la reacción, y un grupo prostético,
vale decir la parte no aminocidica de la enzima, estos pueden ser por ejemplo
cofactores (iones metálicos) o coenzimas (moléculas orgánicas, ejemplo
vitaminas) que se unen covalentemente y transportan grupos químicos entre
enzimas.

La actividad enzimática depende de su conformación proteica y se clasifica según

la reacción catalizada, por ejemplo: catálisis covalentes, por metal ion, unión
preferencial al estado de transición, o por catálisis ácido base que es el caso
de este experimento.

Diapositiva 3: (Efectos del pH en la cinética enzimática)

Las enzimas tienen un pH al cual su conformación es la más adecuada para la

actividad catalítica, teniendo así su actividad máxima, este se denomina pH
óptimo, y al tener valores inferiores o superiores con respecto a este, la actividad
disminuye. Lo que se puede ver expresado de manera gráfica con una campana
de Gaus. Esto ocurre debido a algunas cadenas laterales de aminoácidos que
pueden actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones en el sitio
activo de la enzima y que dependen del mantenimiento de un estado de
ionización, es decir, los cambios de ionización de los radicales de los
aminoácidos se traducen en una alteración en el sitio activo, en la estructura
enzimática y en la desnaturalización enzimática.

Explicación gráfico: aquí se puede observar la campana de Gaus que se forma

dependiente de pH en la catálisis de la reacción, en la cúspide se encontrará la
velocidad máxima de reacción a un pH óptimo, y al variar el pH la actividad
enzimática se ve disminuida.

Explicación imagen: Las interacciones miden la eficiencia catalítica, es decir el

paso de complejo enzima-sustrato a enzima-producto, ambos libres. En estas
reacciones interviene constantes de equilibrio, como la constante catalítica que
mide la obtención de producto y que tan rápido lo hace, la constante de afinidad
que puede verse afectada por el pH debido a que funcionan a condiciones
estándar. Algo que se debe tener claro es que si aumenta la constante catalítica la
afinidad de la enzima por el sustrato baja, es decir, si el Km aumenta la velocidad
disminuye. Donde confluyen ambos parámetros es el pick de la actividad
enzimática. En un pH básico va a aumentar la constante catalítica y en Km por lo
que la afinidad enzima- sustrato disminuye, por lo que la velocidad decrece. En un
pH ácido disminuye el Km por lo que la afinidad enzima- sustrato aumenta,
disminuye la constante catalítica, decreciendo la velocidad de reacción.

Diapositiva 4: (B-galactosidasa)

La enzima que utilizaremos es la b-galactosidasa, que en nomenclatura

enzimática se denomina 3.2.1.23, lo que quiere decir que es una hidrolasa que
actúa sobre enlaces glicosídicos con actividad glucosidasa, actúa a nivel del
enlace B1-4. Es de estructura homotetramerica, en la cual el tercer dominio es el
que contiene el sitio activo.

Esta enzima es conocida también como lactasa y se ubica en las paredes del
intestino donde cataliza la hidrolisis de lactosa a glucosa y galactosa, para que
estas moléculas pequeñas de azúcar puedan ser absorbidas por las células con
mayor facilidad. Su pH óptimo va entre 6 y 8, su temperatura ideal es de 37°C,
posee un Km por su sustrato natural, que sería la lactosa de 1x10 -3, y por un
sustrato sintético que en este caso sería el ONFG (forma galactosa y ONF) de
1x10-4. Sus activadores son el b-mercaptoetanol, el Mg+2 y el Na+ que actúan
como cofactores para mantener la conformación del sitio activo. Y el potasio,
cobre y litio serían ejemplos de sus inhibidores.

La b-galactosidasa cataliza la reacción de hidrolisis de lactosa a glucosa y

galactosa mediante una catálisis ácido-base. En su sitio activo están presentes los
aminoácidos glutamato y cisteína, el ácido glutámico se encuentra desprotonado
(carga negativa) y la cisteína se encuentra protonada con su grupo sulfidrilo, lo
que ocurre es que el carboxilo (COO- ) del glutamato realiza un ataque
nucleofilico al carbono del sustrato y se produce un reordenamiento en donde el
oxígeno se separa del sustrato y se uno con el hidrogeno que presenta el grupo
sulfidrilo de la cisteína, por lo que queda con carga negativa y se libera el primer
‘’producto’’. Luego ingresa una molécula de agua, uniéndose uno de sus
hidrógenos con la cisteína (agua carga parcial + y cisteína carga -) restaurando el
grupo sulfidrilo. El oxígeno e hidrogeno restante de la molécula de agua se unen a
sustrato y ocurre un reordenamiento de electrones, el grupo carboxilo del
glutamato se separa del sustrato (queda con carga negativa) y se libera el
segundo producto. En el caso de la reacción que realizaremos en el laboratorio,
será con ONFG, pero el mecanismo de acción es ‘’similar’’. (Explicar imagen)

Diapositiva 5: (Procedimiento)

Este experimento tiene como objetivo estudiar la influencia de pH en la velocidad

de reacción catalizada por la b-galactosidasa. Para esto se utilizaron los reactivos
Buffers fosfato 0.05 M a pH determinados, enzima b-galactosidasa, sustrato O-
nitrofenil-b-galactosido 0,02 M, carbonato de sodio 1M, ONF (producto) 0.00075M.
(saber en caso de que lo pregunten las disociaciones de fosfato que utilizamos
para hacer los buffers)

Bueno, ustedes deberán preparar 10 tubos a pH distintos (un tubo por cada pH) en
una escala de pH de 4 a 12. Deberán agregarles 0.6 ml de buffer, 0.1 ml de
extracto enzimático, y deberán llevarlo a pre-incubación a 37°C por 2 minutos
aproximadamente, luego de esto agregaran 0.1ml el sustrato que será el O-
nitrofenil-b galactosido y dejarán los tubos incubando a 37°C por 15 minutos,
pasado este tiempo detendrán la reacción agregando 0.2 ml de carbonato de
sodio a cada tuvo, esto realizarlo dentro del baño termorregulador, y finalmente
una vez agregado el carbonato sacan los tubos del baño y agregan la cantidad de
agua suficiente para completar los 2 ml por tubo. Recordar que por cada tubo se
debe hacer un control enzimático, es decir, que contenga la enzima pero no el
sustrato, y un control sustrato, que contenga sustrato pero no enzima. Deben leer
los tubos en el espectrofotómetro a una absorbancia de 405nm.

Además se debe realizar una curva de calibración para ONF que este entre los
rangos de linealidad de 0.02- 0.3 µmoles/ml.

Diapositiva 6: (Resultados)

Una vez obtenidas las absorbancias de cada reacción y la de los controles

respectivos, se debe calcular la velocidad de reacción y la actividad enzimática a
cada pH. Esto se hace multiplicando la absorbancia corregida de cada tubo por el
factor reciproco de calibración obtenido en la curva de calibración, este producto lo
tendremos en 1 ml, pero el volumen final de cada tubo es de 2 ml, por lo que
hacemos la regla de tres para llevarlo al volumen final, esto dará como resultado la
actividad enzimática en 15 minutos de reacción, pero para sacar la velocidad
nosotros queremos saber la actividad enzimática en un minuto, por lo que
realizamos otra regla de tres que nos dé como resultado final la velocidad.

Ej: Tubo 1, pH 4.0

Abs x FRC: 0.025µmoles 1ml

X µmoles 2ml

X: 0.05 µmoles/2ml 15 minutos

X µmoles/2ml 1 minuto

Velocidad: 3.33 x 10-3 µmoles/2ml/min

Diapositiva 7: (Gráficos)

Podemos observar el grafico de la curva de calibración para ONF, la cual para mi

caso dio un R de 0.9991, y un FRC: 0.3302, el cual recordemos que se debe
multiplicar por la absorbancias corregidas de cada tubo para realizar los cálculos
de actividad y velocidad.

Y podemos observar la gráfica de efecto del pH sobre la velocidad de reacción

enzimática de la b-galactosidasa, en la cual es posible observar que la mayor
actividad se encuentra a pH 7.4, lo que estaría dentro del rango de pH para la
enzima. A pH cercano a 12 se puede observar una notoria disminución de la
velocidad enzimática lo que se puede deber a que los aminoácidos del sitio activo
se encuentran ionizados, aumentando la Km y por ende, disminuyendo su afinidad
por el sustrato ONFG, también podríamos esperar a que la enzima haya perdido
su estructura conformacional impidiendo también la unión con su sustrato.

Diapositiva 8,9,10: procedimientos, resultados y gráficos grupo II

Diapositiva 11: (Conclusiones)

La actividad catalítica de una enzima depende de mantenimiento de su estado de

ionización y su respectiva conformación proteica, además de encontrarse en
condiciones óptimas de pH, temperatura que permita su unión con el sustrato. La
b-galactosidasa es una enzima que a pH muy extremos disminuye su capacidad
catalítica por lo que para trabajar con ella es necesario conocer sus condiciones
óptimas.
 Lo que está en negrita y/o subrayado es lo que tenemos que saber si o si, la definición, como actúa,
etc. por si nos preguntan, no es necesario decirlo en la presentación pero si hay que saberlo.