EL ZINC ESTIMULA DIRECTAMENTE LA SECRECIÓN DE COLECISTOQUININA DE LAS

CÉLULAS ENTEROENDOCRINAS Y REDUCE EL VACIAMIENTO GÁSTRICO EN RATAS.

Autores: Nakajima,S; Hira, T; Iwaya, T and Hara, H.

I. INTRODUCCIÓN

La secreción de colecistoquinina (CCK) se desencadena por componentes dietéticos

a través de la activación de receptores específicos (Psichas et al., 2015). Los
segundos mensajeros intracelulares como el calcio (Ca2 +) y el monofosfato de
adenosina cíclico median estas secreciones de CCK inducidas por estímulos (Psichas
et al., 2015). Es bien sabido que los receptores CCK (CCK1R y CCK2R) reconocen que
la CCK secretada regula la motilidad gastrointestinal, la supresión de la ingesta de
alimentos y la secreción de enzimas pancreáticas (Liu et al., 2015). El zinc es un
elemento mineral esencial que regula varias funciones fisiológicas, como la actividad
enzimática, la síntesis de proteínas, la actividad neuronal y la función inmunológica
(Cho et al., 2014).Potencial de receptor transitorio ankyrin 1 (TRPA1), fue
identificado como un sensor de zinc en las neuronas sensoriales (Hu et al., 2009).
Curiosamente, la TRPA1 se expresa abundantemente en células productoras de CCK
y está implicada en la secreción de CCK inducida por lípidos peroxidados y aldehídos
insaturados (Cho et al., 2014). Entre los elementos minerales, se ha dilucidado el
papel del calcio extracelular en la secreción de CCK (Psichas et al., 2015).

II. OBJETIVOS

2.1. Determinar si el zinc muestra actividad liberadora de CCK a través de la

activación de TRPA1 en la línea celular enteroendocrina duodenal murino, STC-1.
2.2. Probar el efecto de la administración oral única de zinc en el vaciado
gástrico que está controlado por CCK en ratas.

III. METODOLOGÍA
3.1. Medición de la secreción de CCK a partir de células STC-1
 Células STC-1 (derivadas de duodeno murino).
 Las células se incubaron con ZnCl2(30, 100, 500 Y 1000 uM).
 Se utilizara tampón HEPES como vehículo.
 La peptona β-conglicinina (βconP), se utilizó como control positivo para la
secreción de CCK.
 Quelante de zinc etilendiamina (TPEN).
 Antagonista de TRPA1 (HC-030031; Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.).
 La concentración de CCK en los sobrenadantes se midió utilizando un kit
comercial de inmunoensayo enzimático (EIA).
3.2. Concentraciones intracelulares de Ca+2 + y Zn+2
 El Ca2 + citoplásmico y el Zn2 + en las células se determinaron con un
indicador de Ca2 + (Fura-2-AM)y un indicador de Zn2 + (Fluozin-3-AM) disuelto
en un tampón HEPES.
 Para la medición de Ca2 +, la intensidad de fluorescencia se midió a una
longitud de onda de emisión de 510 nm y longitudes de onda de excitación de
340 y 380 nm. ; para la medición de Zn2 +, la intensidad de fluorescencia se
midió a una longitud de onda de emisión de 494 nm
 Los datos se expresaron como cambios en la intensidad de fluorescencia de los
niveles basales antes de la exposición a los agentes de prueba.
3.3. Animales
 Se compraron ratas Sprague-Dawley macho (7 semanas de edad).
 La dieta consistió en 250 g / kg de caseína, 602.5 g / kg de sacarosa, 50 g / kg
de aceite de -soja, 50 g / kg de celulosa, 35 g / kg de mezcla mineral (AIN-93G),
10 g / kg de mezcla de vitaminas (AIN- 93G), y 2,5 g / kg de bitartrato de colina.
 Los experimentos se realizaron en una habitación con temperatura controlada
mantenida a 23 ± 2 ° C con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (8: 00-20: 00,
período de luz).
 Las ratas pudieron acceder a la dieta, excepto durante la prueba de vaciado
gástrico, y tuvieron acceso libre al agua durante todo el experimento.
 A las ratas en ayunas se les administró por vía oral ZnCl2 a 0,5 mg / kg de peso
corporal o su vehículo (8 ml / kg de peso corporal, solución salina).
 inyección intraperitoneal de devazepida (0,5 mg / kg de peso corporal)
 La concentración de zinc en la sangre portal se determinó mediante una
prueba de Zn.
3.4. Mediciones de tasa de vaciamiento gástrico y nivel de portal CCK

 El rojo de fenol (5 mg / kg de peso corporal) se administró por vía oral a ratas

inmediatamente después de la administración de cinc o vehículo como
marcador no absorbible (Feldman y Gibaldi, 1968).
 El contenido gástrico, incluido el rojo de fenol, se recogió en un tubo de 50 ml
mediante lavado con solución salina fría. la concentración de rojo de fenol se
midió espectrofotométricamente a 560 nm. La tasa de vaciamiento gástrico
(%)se calculó de la siguiente manera:
 Tasa de vaciado gástrico (%) = [{la cantidad de rojo de fenol administrada (mg)
- la cantidad de rojo de fenol que permanece en el estómago (mg)} / la
cantidad de rojo de fenol administrada (mg)] × 100
 La concentración de CCK en plasma se midió con un kit EIA.
IV. RESULTADOS
4.1. El zinc extracelular desencadena la liberación de CCK en células STC-1

La aplicación de zinc extracelular produjo un aumento significativo de la

secreción de CCK de las células STC-1, especialmente, el ZnCl2 100 µM
mostró la mayor actividad liberadora de CCK entre las diversas
concentraciones analizadas. La secreción de CCK inducida por ZnCl2 100 µM
fue mucho mayor que la inducida por βconP (Fig.1) . Los niveles de Zn2 +
intracelular aumentaron de forma dependiente de la dosis mediante el
tratamiento con zinc extracelular (Fig.2). Para aclarar si se requiere Zn2 +
intracelular para la secreción de CCK, las células STC-1 se trataron con TPEN,
un quelante de zinc permeable a la membrana celular, antes de la aplicación
de zinc extracelular. La secreción de CCK extracelular inducida por zinc se
eliminó mediante el tratamiento previo con TPEN (Fig. 3).

Figura 1. Efectos dependientes de la dosis

de zinc extracelular sobre la secreción de
CCK en células STC-1
Figura 2. El nivel de Zn2 + intracelular Figura 3. Secreción de CCK ( ZnCl2 30
(494 nm) se incrementó después de la µM) a células STC-1 con o sin
exposición al zinc extracelular tratamiento previo del quelante de Zn2
+ intracelular

4.2. El Ca2 + intracelular participa en la secreción de CCK extracelular inducida

por zinc
La exposición a zinc extracelular dependiente de la dosis induce la
movilización de Ca2 + intracelular en células STC-1 (Fig. 4).El efecto del zinc
sobre la secreción de CCK se probó en ausencia de calcio extracelular.La
movilización de Ca2 + intracelular inducida por zinc y la secreción de CCK se
eliminaron mediante la eliminación del calcio extracelular (Fig.5 y 6).

Figura 4. Efecto del zinc extracelular (30 y

100 µM) sobre los niveles de Ca2 +
intracelular.
 Figura 5. Movilización de Ca2 + Figura 6. El efecto del zinc sobre la
intracelular inducida por zinc en secreción de CCK en presencia (CaCl2
presencia (CaCl2 1.2 mM) o ausencia 1,2 mM) o ausencia de cal extracelular.
de calcio extracelular.
4.3. TRPA1 participa en la movilización de Ca+2 intracelular inducida por zinc y
en la secreción de CCK.

El canal TRPA1 se expresa en células STC-1 y media las secreciones de CCK

inducidas por AITC y aldehído insaturado (Nakajima et al 2014). Se ha
demostrado que el zinc aumenta el Ca2 + intracelular a través de la
activación del dominio intracelular de TRPA1 (Hu et al., 2009). La
movilización de Ca2 + intracelular inducida por 30 µM y 100 µM de zinc se
eliminó mediante un tratamiento previo con el antagonista TRPA1, HC-
030031 (Fig. 7). Las secreciones de CCK inducidas por zinc extracelular y
AITC (Sigma-Aldrich) se redujeron mediante el tratamiento con
antagonistas (Fig. 8).

Figura 7. Movilización
intracelular de Ca2 +
en respuesta al zinc en
presencia o ausencia
de antagonista de
TRPA1, HC-030031.
 Figura 8. Secreción de CCK en respuesta al zinc
en presencia o ausencia de HC-030031

4.4. El zinc induce el vaciamiento gástrico a través de la liberación de CCK en

ratas.

La dosis oral de ZnCl2 (0.5 mg / kg de peso corporal, suministrada con 0.24

mg de zinc / kg de peso corporal). En ratas tratadas con zinc, los niveles de
zinc portal y CCK / gastrina fueron significativamente más altos que en ratas
tratadas con solución salina (Fig. 9). La prueba de rojo fenol (marcador no
absorbible) confirmó el efecto inhibitorio de la administración oral de zinc
sobre la tasa de vaciado gástrico (Fig. 10). Sin embargo, tras el tratamiento
con el devazepida antagonista de CCK1R, el zinc oral no redujo la tasa de
vaciado gástrico (Fig. 10). La tasa de vaciamiento gástrico en el grupo
tratado con zinc / vehículo se correlacionó negativamente con los niveles
de CCK / gastrina portal (r = -0.91, P = 0.0018); sin embargo, no se observó
tal correlación en el grupo tratado con zinc / devazepida (Fig. 11).

Figura 9. Niveles de zinc de portal

(C) y CCK / gastrina (D)
después de la administración de
ZnCl2 (0,5 mg / kg de peso
corporal, se suministraron 0,24 mg
de zinc / kg de peso corporal)
Figura 10.El vaciamiento gástrico Figura 11. Correlación entre el nivel de CCK / gastrina
retrasado con cinc se canceló en plasma y la tasa de vaciado gástrico en el grupo
mediante inyección administrado solo con zinc (F) y devazepida
coadministrado g
intraperitoneal de antagonista de
V. (devazepida,
CCK1R DISCUSIÓN 0,5 mg / kg de ausencia de calcio extracelular.
peso corporal).
La señalización intracelular de Zn2 + desempeña un papel en la secreción de
.
hormonas como la insulina y el glucagón (Liu et al., 2015). Se ha demostrado
que el zinc intracelular activa el dominio citosólico de TRPA1 (Hu et al., 2009).
En el epitelio intestinal, TRPA1 se expresa principalmente en células
productoras de CCK y 5-HT (Cho et al., 2014). En las células productoras de CCK,
los agonistas de TRPA1 inducen la movilización de Ca2 + intracelular y la
subsiguiente secreción de CCK ( Nakajima et al., 2014). La señal de Zn2 + induce
la movilización de Ca2 + intracelular (Hu et al., 2009), que es uno de los
principales segundos mensajeros para la secreción de la hormona intestinal
(Psichas et al., 2015). Los resultados encontrados sugieren que la señalización
intracelular de Zn2 + está relacionada con la señalización intracelular de Ca2 + y
la secreción de CCK a través de la activación de TRPA1 en células productoras
de CCK.
La colecistocinina (CCK), una hormona intestinal, tiene un papel en la motilidad
gastrointestinal (vaciamiento gastrico) (Psichas et al., 2015). La cantidad
fisiológica de ZnCl2 (0,5 mg / kg de peso corporal, suministrado 0,24 mg de
zinc) retrasó significativamente el vaciado gástrico a través de la señalización
de CCK , lo que indica que el zinc luminal tiene un alto potencial para reducir el
vaciado gástrico a través de la secreción de CCK. Estos resultados actuales
 sugieren que la motilidad gastrointestinal está modulada por la administración
de zinc a través de una mayor secreción de CCK. Aunque el ensayo ELISA
utilizado en este estudio reacciona de forma cruzada con la gastrina de
acuerdo con el manual del fabricante, los resultados obtenidos mediante el uso
de un antagonista específico de CCK1R apoyan firmemente la idea de que el
zinc oral induce la secreción de CCK. Además, el zinc extracelular incrementó
el Ca2 + intracelular en las células STC-1 derivadas del duodeno murino, lo que
apoya que las células enteroendocrinas proximales sean responsables de la
detección lumínica del zinc.
VI. CONCLUSIONES
6.1. TRPA1 media la secreción de CCK inducida por zinc a través de la
entrada de calcio extracelular.
6.2. La administración oral única de zinc retrasa el vaciado gástrico a
través de la señalización CCK en ratas.

VII. BIBLIOGRAFÍA
 Cho H.J., Callaghan B., Bron R., Bravo D.M., Furness J.B., 2014.
Identification of enteroendocrine cells that express TRPA1 channels in
the mouse intestine. Cell. Tissue. Res. 356, 77.
 Feldman S., Gibaldi M., 1968. Effect of bile salts on gastric emptying and
intestinal transit in the rat. Gastroenterology. 54, 918-9.
 Hu H., Bandell M., Petrus M.J., Zhu M.X., Patapoutian A., 2009. Zinc
activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat. Chem. Biol. 5, 183-190.
 Liu Y., Batchuluun B., Ho L., Zhu D., Prentice K.J., Bhattacharjee A.,
Zhang M., Pourasgari F., Hardy A.B., Taylor K.M., Gaisano H., Dai F.F., Wheeler
M.B., 2015. Characterization of Zinc Influx Transporters (ZIPs) in Pancreatic β
Cells: ROLES IN REGULATING CYTOSOLIC ZINC HOMEOSTASIS AND INSULIN
SECRETION. J. Biol. Chem. 290, 18757-18769.
 Moran, TH.2006. Hyperphagia and obesity in OLETF rats lacking CCK-1
receptors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. EE.UU.361p.
 Nakajima,S; Hira, T; Iwaya, T and Hara, H. 2016.Zinc directly stimulates
cholecystokinin secretion from enteroendocrine cells and reduces gastric
emptying in rats.Molecular and Cellular Endocrinology.Japan.
 Nakajima S., Hira T., Yahagi A., Nishiyama C., Yamashita T., Imagi J., Hara H.,
2014. Unsaturated aldehydes induce CCK secretion via TRPA1 in STC-1 cells.
Mol. Nutr. Food. Res. 58, 1042-1051.
 Psichas A., Reimann F., Gribble F.M., 2015. Gut chemosensing mechanisms. J.
Clin. Invest. 125, 908.