Manual Análisis Clínicos 2009

UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR
ESCUELA DE QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ANALISIS CLINICOS

2a. Edición
AUTOR: QBP. C. ESMERALDA LOPEZ FERRER
México, D. F. ENERO 2009

UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR
ESCUELA DE QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
LABORATORIO DE ANALISIS CLINICOS
NOMBRE:
GRUPO: EQUIPO:
INDICE
Página
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE ANALISIS
CLINICOS GENERALES iii
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO vii
1. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO

DE ANALISIS CLINICOS 1
1.1. Determinación del volumen mínimo de lectura y observación
del “efecto menisco”. 5
1.2 Evaluación de la precisión y de la exactitud analítica. 7
2. QUIMICA SANGUINEA DE 6 ELEMENTOS. 9

2.1. METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
A) Determinación de glucosa. 10
2.2. METABOLISMO DE COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTEICOS

A) Determinación de Nitrógeno ureico (BUN). 27
B) Determinación de Ácido úrico. 50
C) Determinación de Creatinina. 67
2.3. METABOLISMO DE LIPIDOS

A) Determinación de colesterol 89
B Determinación de triacilgliceroles 101
C) Determinación de lípidos totales 116
3. EVALUACION DE LA FUNCION RENAL

3.1. ELECTROLITOS SERICOS 121
A) Determinación de sodio 121
B) Determinación de potasio 127
C) Determinación de cloro 132
D) Determinación de fósforo 140
E) Determinación de magnesio 149
F) Determinación de calcio 154
i
3.2. EXAMEN GENERAL DE ORINA. 164
A) Examen Físico. 165
B) Examen Químico 167
C) Examen Microscópico 169
4. METABOLISMO DE PROTEÍNAS 176

4.1 Determinación de proteínas totales. 177
4.2 Determinación de albúmina. 179
5. ENZIMOLOGIA CLINICA 182

5.1 Efecto de la concentración de sustrato y velocidad inicial en el estudio de
la cinética de una reacción. 185
5.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática y fase de retardo.
187
+ +
5.3 Espectro de absorción del NAD (NADP ) y de sus formas reducidas.
189
6. VALORACION DE LA FUNCION HEPATICA. 192

6.1. Determinación de aminotransferasas (Transaminasas) 192
A. Determinación de aspartato-aminotransferasa. (AST, ASAT. GOT) 193
B. Determinación de alanino-aminotransferasa. (ALT, ALAT, GPT) 208
6.2. Fosfatasa alcalina (ALP) 224
2.3. Bilirrubinas. 238
7. VALORACION DE LA FUNCION CARDIACA 254

7.1. Determinación de aspartato-aminotransferasa. (AST, ASAT. GOT) 254
7.2. Determinación de lactato deshidrogenasa. (LDH) 264
7.3. Determinación de isoenzimas de la Creatina fosfocinasa 277
A. Determinación de la Creatina fosfocinasa (CPK total) 277
B. Determinación de Creatina fosfocinasa fracción MB (CPK-MB) 294
8. VALORACION DE LA FUNCION DEL PANCREAS. 303

8.1 a-Amilasa (Amy) 303
8.2 Lipasa (Lip) 308
ii
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE ANALISIS CLINICOS.
I. SOBRE LA ENTRADA AL ALBORATORIO.

1.1 Los alumnos deberán presentarse a sus prácticas de laboratorio con bata
blanca.
1.2 Los alumnos deberán entrar con el cabello recogido.
1.3 Los celulares y equipo de radio comunicación deberán permanecer
apagados dentro del laboratorio durante el tiempo que dure la práctica.
1.4 Para la entrada al laboratorio, habrá una tolerancia de DIEZ minutos.
1.5 El alumno deberá cumplir con el material especializado y de uso personal que
el maestro le solicite.
1.6 Cada alumno deberá contar con lo siguiente:
• Material de limpieza.
• 1 fibra verde.
• 1 toalla para limpiar o secar.
• Jabón o detergente.
1.7 La materia prima, especímenes biológicos y medicamentos utilizada en las
prácticas de laboratorio deberá ser aportada por el alumno.
1.8 La entrada a áreas de balanzas será por medio de registro, anotando los datos
correspondientes y entregando la credencial de laboratorios de la USB, al
laboratorista.
II: SOBRE EL COMPORTAMIENTO DENTRO DEL LABORATORIO.
2.1 Al iniciar cada semestre la coordinación de laboratorios asignará a los

estudiantes las gavetas, llenando el formato correspondiente.
2.2 Los estudiantes deberán poner candado a la gaveta asignada y entregar una
copia de la llave, bien identificada a la coordinación de laboratorios.
2.3 La puerta del laboratorio deberá permanecer cerrada el tiempo que dure la
práctica.
2.4 Queda estrictamente prohibido fumar, comer o ingerir bebidas.
iii
2.5 Colocar todos los objetos personales en los cajones de las mesas o alejados
del área de trabajo.
2.6 Estrictamente queda prohibido, utilizar el laboratorio como sitio de
reuniones sociales.
2.7 Los alumnos deberán permanecer en el laboratorio durante todo el tiempo que
dure la práctica.
2.8 Queda estrictamente prohibido sentarse en mesas y equipo de laboratorios.
2.9 Se prohíbe tirar desechos sólidos en los canales o tarjas, en cajones y fuera
del bote de basura.
2.10 Queda estrictamente prohibido extraer material, equipo y reactivos de las
áreas correspondientes y de la USB.
2.11 El usuario es responsable de cualquier daño que cause a instalaciones,
equipo y material proporcionado.
2.12 El material, equipo y reactivos, deberán ser solicitados por el profesor antes
de iniciar el semestre y por los alumnos ocho días naturales antes de cada
práctica.
2.13 Todo préstamo de material (equipo, cristalería, reactivos, ejemplares y
preparaciones de colección), se harán una vez llenado el vale correspondiente
(forma 1).
2.14 La forma 1, la credencial de laboratorio de la persona que se hace
responsable, serán entregados a la persona encargada del laboratorio, la cual
devolverá la credencial en el momento en que se regrese el material.
2.15 El solicitante revisará y recibirá el material constatando que se encuentra en
buen estado, de lo contrario dará aviso al laboratorista.
2.16 El material de trabajo deberá ser tratado de la manera adecuada,
entregándolo limpio, seco completo y en buen estado.
2.17 El material que se encuentre dentro de estufas, hornos refrigeradores y
congeladores deberá ser identificado perfectamente por medio de etiqueta.
2.18 No almacenar material en estufas, hornos, refrigeradores, congeladores, ni
fuera de ellos.
iv
2.19 El material que no cumpla con el punto anterior será desechado y la
coordinación de laboratorios no se hace responsable de dicho material.
2.20 Dar aviso al profesor de cualquier accidente que ocurra.
2.21 La coordinación de laboratorios no se hace responsable del material que
permanezca en las áreas de uso común después de las prácticas.
2.22 Se prohíbe a los alumnos la entrada de cubículos, bodegas y almacenes.
2.23 La entrada a las áreas de preparación se hará únicamente bajo la supervisión
de algún profesor.
2.24 Se prohíbe experimentar fuera de las fechas y los horarios normales de cada
materia, a menos que sea por autorización de la coordinación y bajo la vigilancia
del maestro responsable de la práctica.
2.25 Queda estrictamente prohibida la entrada a personas ajenas a los
laboratorios.
2.26 Al término de cada sesión el laboratorio deberá permanecer limpio, colocar
los bancos debajo de las mesas y lavarse las manos al salir de cada laboratorio.
2.27 Al finalizar el semestre, las gavetas deberán permanecer limpias y abiertas,
en caso de lo contrario se abrirán los candados y la coordinación de laboratorios
no se hace responsable de su contenido.
2.28 Al escuchar la alarma de emergencia, los alumnos y profesores deberán
participar activamente en los simulacros organizados por el comité de protección
civil de la USB, teniendo en cuenta las siguientes instrucciones: cerrar las llaves
de gas y apagar cualquier aparato con el que se esté trabajando, salir rápida y
ordenadamente del laboratorio hacia el sitio de repliegue.
III. SOBRE SANCIONES.

3. Disciplinarias.
3.1.1 Si cualquiera de los puntos 1 y 2 no son cumplidos perderá automáticamente
el derecho a presentar exámenes prácticos.
3.2 Económicas.
3.2.1 Los daños ocasionados al material de prácticas tendrán que ser reparados
por cuenta y gastos de la (s) persona (s) involucrada (s) en el daño, en un plazo
v
no mayor a diez días hábiles. Se firmará un vale (forma 2) indicando el material y
sus especificaciones y se retendrá la credencial del responsable.
3.2.2 Los importes causados por la reparación e instalación del equipo serán
cubiertas por la (s) persona (s) involucrada (s) en el daño.
3.2.3 Por incumplimiento de los puntos 3.2.1 y 3.2.2, se negará el derecho al uso
de las instalaciones de laboratorio de la materia en la que ocurrió el deterioro o
daño material o equipo mencionado.
3.2.4. El alumno que al terminar el ciclo escolar tiene algún adeudo, no tendrá
derecho a presentar exámenes finales.
3.2.5 El mal uso del equipo será motivo para aplicar una sanción económica
equivalente al 30% del valor del mismo.
IV. Las autoridades de la USB se reservan el derecho de analizar y dictaminar

sobre las cuestiones no contempladas en éste reglamento.
vi
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO.
De manera general, puede considerarse que los riesgos que existen por el
trabajo en el laboratorio, pueden evitarse con el uso de una buena técnica de
trabajo. De cualquier manera las muestras, los reactivos, el material y los aparatos
que se utilicen deben ser manipulados de forma correcta, pues los accidentes
leves que no se traten correctamente, pueden resultar de consecuencias graves.
En el laboratorio pueden presentarse accidentes tales como incendios o
explosiones por el uso de solventes flamables, por ello, este tipo de productos
deben guardarse y usarse en lugares frescos y bien ventilados y a prueba de
fuego. No deben manejarse cerca de flamas ni lugares cerrados, donde los
vapores pueden acumularse y formar en el aire mezclas explosivas.
Los vapores de algunos reactivos en éste curso de laboratorio, son sumamente
tóxicos, ya que pueden penetrar a través de la piel y causar irritación o erupción,
tanto de esta como de ojos, nariz y garganta, por lo que deben medirse con
propipeta, bulbos de hule o despachadores especiales para agregar reactivos
peligrosos y utilizarse en lugares bien ventilados.
Los reactivos venenosos, corrosivos o cáusticos, aunque la mayoría no tiene
efecto sobre la absorción de la piel, su ingestión es sumamente peligrosa, tal es el
caso de los cianuros, alcohol metílico, arsénicos, mercurio, etc. Por ello debe
insistirse la importancia de rotular los envases que los contengan.
En caso de ingerir ácidos tales como clorhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico,
acético o hidróxidos como NaOH o KOH, el tratamiento que se recomienda es el
uso rápido de emulsentes como la leche o la clara de huevo, lavado gástrico y los
eméticos están contraindicados. La neutralización química (uso de álcalis o ácidos
diluidos según el caso) genera una reacción exotérmica que empeora las lesiones
existentes.
En el laboratorio deberá existir un bote rojo con hipoclorito para neutralizar las
muestras biológicas utilizadas. La mayoría de estas son sueros potencialmente
infecto-contagiosos del virus del síndrome de inmunodeficiencia adquirida,
hepatitis B o C, por lo que también deberá de usarse guantes para el manejo de
las mismas, así como cubrebocas y gogles para evitar contagio.
vii
1. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE ANALISIS CLINICOS
INTRODUCCION:
Los análisis clínicos se empezaron a practicar a mediados del siglo pasado,

aunque el desarrollo más importante se llevó a cabo en los últimos 70 años.
En 1947, Belk y Sunderman indicaron la necesidad de mejorar la calidad de los
laboratorios clínicos pues según sus estudios realizados a 150 laboratorios de
Canadá, el 56.7% de ellos reportaban resultados inaceptables
En 1950 Levey y Jennings introdujeron el control de calidad interno en los
laboratorios clínicos de Estados Unidos de Norteamérica.
En 1970, un grupo de trabajo de la Oficina Regional Europea de la Organización
Mundial de la Salud, concluyó que los gobiernos de los países deberían intervenir
estableciendo programas de aseguramiento de la calidad tendientes a mejorar la
calidad analítica de los laboratorios clínicos, situación que se ha formalizado en
varios países.
En México en 1969 el establecimiento del control de calidad interno se inició en
el Instituto Mexicano del Seguro Social y de manera continua ha prevalecido es el
de los Institutos Nacionales de Salud organizado por el Instituto Nacional de la
Nutrición Salvador Zubirán.
En la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas se inició como un proyecto de
investigación, en octubre de 1990 el Programa de Evaluación de la Calidad entre
Laboratorios (PECEL) cuya aceptación fue importante. Este programa incluyó más
de 500 laboratorios de casi todos los estados de la república.
En 1998 se publicó en el diario oficial la norma oficial mexicana que obliga a los
laboratorios clínicos a participar en los programas de evaluación externa de la
calidad que entro en vigor el 4 de enero del 2001 (NOM-166-SSA).
Con la introducción de esta norma hoy en día los laboratorios que cumplen con
la evaluación externa e interna de la calidad de manera meticulosa se certifican lo
que asegura que esos laboratorios proveen de estudios clínicos seguros y
1
confiables. Es por ello que el control de la calidad y el aseguramiento de la misma
ha sido siempre un componente importante en los laboratorios clínicos.
En el pasado los laboratorios se enfocaban en el análisis de los métodos de las
pruebas que realizaban, en el corrimiento de controles internos y externos. Hoy en
día, sin embargo, la consolidación de los laboratorios y las demandas de los
clientes han forzado a tener más cuidado en utilizar otros modelos de
aseguramiento de la calidad que les permitan reducir costos.
La gran mayoría de los laboratorios clínicos hoy reconocen que regular la
revisión de los procedimientos analíticos y el reporte de los métodos es esencial
para producir resultados con alta calidad. Pero, ¿Cómo pueden los laboratorios
integrar todos estos elementos dentro de un sistema de normas que establezca
sus necesidades? La organización internacional de estándares (IOS) desarrolló
una serie de normas denominadas ISO 9000, las cuales establecen un sistema de
aseguramiento de la calidad y unifica y estandariza todas sus actividades.
La norma ISO por medio de la cual los laboratorios se certifican es la ISO 9002,
la cual consiste en englobar todos los requisitos necesarios para establecer un
control de calidad interno, externo y diferentes metodologías que permiten el
aseguramiento del mismo de tal manera que pueden corregirse y evitarse errores
durante los análisis.
CONCEPTOS BASICOS DE CONTROL DE CALIDAD
El propósito de realizar análisis de una muestra biológica es la de proporcionar

datos cualitativos o cuantitativos que ayuden al diagnóstico, tratamiento y
prevención de enfermedades humanas. Para poder cumplir con este objetivo es
necesario considerar que durante tales determinaciones pueden existir diferentes
fuentes de variación que nos impida obtener el resultado adecuado.
Para el estudio de estas fuentes de variación existen tres fases que componen
las diferentes determinaciones que son la preanalítica, analítica y postanalítica.
Algunos ejemplos de fuentes de variación preanalítica y que no son debidos a
2
enfermedad son: a) el tipo y cantidad de alimentos que se ingieren en los días
previos, b) las variaciones cíclicas diarias, mensuales, estacionales o anuales, c)
los cambios provocados por medicamentos, d) la actividad física previa al estudio,
e) la toma de la muestra y f) el manejo inadecuado y conservación de los
especímenes. Estos factores se deben considerar al comparar los resultados con
los valores de referencia.
Las variaciones analíticas se pueden considerar ficticias ya que son producidas
por la incapacidad para medir la concentración real del componente de interés.
Estas variaciones pueden llegar a ser grandes y para disminuir su efecto, en la
valoración de las variaciones debidas a las patologías, se deberán seleccionar los
métodos de análisis, que basados en los criterios de practicabilidad (rapidez,
costo, requerimientos, dependencia y seguridad) y veracidad (precisión, exactitud,
especificidad, sensibilidad), resulten mejores. También se debe llevar a cabo un
control interno de la calidad analítica, comprobando los resultados a través de
procedimientos de evaluación externa.
Entre las variaciones postanalíticas se encuentran los siguientes errores: a)
informar un resultado por otro, b) omitir un factor de dilución, c) transponer dígitos,
d) omitir un punto decimal, entre otros.
Las buenas prácticas de laboratorio y el control de calidad ayudan a prevenir,
identificar y corregir errores, permitiendo así la corrección de los mismos. La
federación internacional de Química clínica (IFCC) define al control de calidad,
como el estudio de aquellos errores que son responsabilidad del laboratorio y los
procedimientos usados para encontrarlos y minimizarlos, en los que se incluyen
todas las instrucciones que se le dan al paciente antes de la toma de muestra,
hasta la entrega e interpretación de los resultados obtenidos.
La IFCC clasifica al control de calidad en interno (CCI) y externo (CCE). El CCI
se define como el procedimiento en el cual se utilizan los resultados de un sólo
laboratorio con el propósito de controlar su calidad y el CCE como el
procedimiento en el cual se analizan los resultados de varios laboratorios que que
estudian un mismo espécimen con el objeto de que estos resultados sean entre sí
lo más cercano a lo real.
3
Los indicadores de la calidad en clínica son la precisión y la exactitud de las
diferentes mediciones realizadas en el laboratorio. La precisión se define como la
concordancia entre mediciones repetidas de un mismo espécimen y se mide en
forma indirecta a través de la imprecisión o variabilidad, esta se calcula con el
coeficiente de variación (CV), es decir el porcentaje de la media aritmética que
ocupa la desviación estándar de los resultados. La exactitud se define como la
concordancia de la media aritmética de los resultados de varias mediciones
realizadas en una muestra o de una sola medición, con el valor real de la misma;
se mide indirectamente a través del porcentaje de error, éste se calcula con el
cociente de 100 veces la diferencia (error analítico) entre la media aritmética de
los resultados (o el valor obtenido) y el valor real, entre el valor real. La precisión
se afecta por errores aleatorios y la exactitud se afecta por errores sistemáticos.
Cabe señalar que para lograr exactitud se requiere de tener precisión, es posible
tener precisión pero carecer de exactitud.
4
1.1 DETERMINACION DEL VOLUMEN MINIMO DE LECTURA Y OBSERVACION
DEL “EFECTO MENISCO”.
En las determinaciones fotométricas es de vital importancia que el volumen que

se deposita en la celda de lectura sea el adecuado para asegurar que el rayo de
luz atraviesa completamente la solución.
El manejo de volúmenes inferiores al volumen mínimo requerido ocasiona
lecturas erróneas y como consecuencia resultados incorrectos.
Cuando se coloca una cantidad insuficiente de solución en la celda, el rayo de
luz atraviesa por el menisco de la misma y por el efecto de difracción se obtienen
lecturas elevadas.
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO.
Espectrofotómetro.
5 mL de solución de dicromato de potasio al 0.08%.
Agua destilada.
Papel higiénico.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Ajustar el aparato a cero con aire, a una longitud de onda de 500 nm.
2. Colocar 0.1 mL de la solución y tomar la primera lectura.
3. Agregar 0.1 mL de la solución nuevamente y registrar la lectura.
4. Repetir la adición de la misma cantidad de solución tomando las lecturas hasta
que permanezca constante.
5. Determinar el volumen mínimo de lectura.
5
PREPARACION DE REACTIVOS.
SUSTANCIAS: Dicromato de potasio
1. SOLUCION DE DICROMATO DE POTASIO AL 0.08%.
Pesar 0.08 g de dicromato de potasio y disolverlo en 15 mL de agua destilada en

un vaso de precipitados de 25 mL. Vaciar el contenido del la solución de dicromato
cuantitativamente en un matraz aforado de 100 mL. Llevar hasta el volumen
indicado para tal matraz.
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1.2 EVALUACION DE LA PRECISION Y LA EXACTITUD ANALITICA.
INTRODUCCION.
Para iniciar el control de calidad interno en los laboratorios, es recomendable

que cada laboratorio evalúe la variación en la condiciones óptimas (VCO), ya que
si la variación es grande con equipo calibrado, reactivos nuevos, pipetas limpias y
adecuadas, etc., seguramente será mayor la variación en condiciones de rutina
(VCR). En general, la VCR no debe ser el doble de la VCO.
También es recomendable que se evalúe la VCO, primero con un método
sencillo, es decir, de pocos pasos y sin dificultad analítica y, una vez logrado un
coeficiente de variación pequeño (CV<2.5%), se puede probar con un método
complejo, ya que si también se logra un CV pequeño, es probable que lo mismo
suceda con cualquier otro método.
OBJETIVO.
El alumno determinará la imprecisión y la inexactitud, de las mediciones que se

realizaran en el laboratorio.
FUNDAMENTO.
La medición de la VCO se realiza midiendo un componente en una muestra

problema mínimo 20 veces, utilizando equipo calibrado, reactivos y calibradores
nuevos, material (tubos de ensaye y pipetas) limpio y adecuado. Con los
resultados se calcula el coeficiente de variación, que corresponde a la VCO.
CV= Desviación estándar X 100

Media aritmética
7
El porcentaje de error o índice de inexactitud se establece por comparación de la
media de una serie de mediciones contra el valor real del componente, la
diferencia entre ambos se expresa como porcentaje del valor real:
% de error = Valor esperado-Valor real X 100

Valor real
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Cada alumno determinará un analito en varias muestras problema, con un

método de dos pasos, simultáneamente analizará un estándar y un blanco de
reactivos. El procedimiento será indicado por el profesor.
2. Al finalizar, los resultados se presentarán en el pizarrón y el profesor indicará

los resultados indicados.
TRATAMIENTO DE LOS DATOS
1. Con la información obtenida, cada estudiante calculará su CV y el % de error,

para obtener la imprecisión y la inexactitud, respectivamente.
2. Se realizará un análisis comparativo de los resultados de los diferentes

alumnos, se calculará el CV (se considerará a cada alumno como un laboratorio) y
se identificarán los valores mínimo y máximo. Esto es equivalente a lo que se
realiza en los programas externos de calidad.
3. Se discutirán las fuentes de variación y como disminuirlas y controlarlas.
8
2. QUMICA SANGUINEA DE 6 ELEMENTOS.
INTRODUCCION.
El organismo lleva a cabo diferentes funciones que le permite actuar de forma
adecuada. Todas las reacciones que se llevan a cabo tanto de síntesis como
degradación están perfectamente reguladas, tal es el caso que no toda la
información codificada en los genes se está sintetizando continuamente de
manera que se evita el gasto innecesario cuando ciertas enzimas no se requieren.
Tal es el caso que puede priorizar entre las reacciones centrales necesarias para
toda función y las que son no necesarias en determinado momento.
El metabolismo central está constituido por el metabolismo de carbohidratos,
lípidos y proteínas. Una manera de determinar el buen funcionamiento de estas
vías metabólicas es mediante la determinación de determinados metabolitos que
conforman la química de 6 elementos, como son la determinación de glucosa,
metabolitos nitrogenados no proteicos y lípidos. Cuando una de estas vías falla el
organismo trata de compensar dicha falla, por lo que en clínica se monitorean
estas vías principales para saber el buen funcionamiento del organismo y en caso
de alguna falla administrar ciertos fármacos que permitan la corrección de estas
vías. A continuación se detalla cada uno de estos metabolitos que conforman la
química sanguínea de 6 elementos.
9
2.1 DETERMINACION DE GLUCOSA: METODO ENZIMATICO. TRINDER
GLUCOSA-OXIDASA-PEROXIDASA (GOD-POD).
El diagnóstico de los trastornos del metabolismo de los carbohidratos se apoya

en parte en al medición de la glucosa plasmática, ya sea en ayunas o tras
estimulación o pruebas de supresión. La sangre venosa es la muestra de elección
para el análisis de la glucosa.
Los métodos para la determinación de glucosa pueden dividirse en dos grupos:
químicos y enzimáticos. La mayoría de las determinaciones químicas de la
glucosa se basan en sus propiedades reductoras, y debido a la ausencia de
especificidad no son demasiado utilizadas. El método de ortotoluidina es el único
procedimiento químico utilizado todavía ampliamente; se basa en la concentración
de los aldosacáridos tales como la glucosa con una amina aromática y ácido
acético glacial. Posteriormente se mide por espectrofotometría el color verde que
da lugar. Este método puede utilizarse con plasma, orina o líquido cefalorraquídeo
sin precipitación alguna.
Los métodos proporcionan una especificidad máxima en cuanto a las
estimaciones de glucosa. Esta puede medirse por su reacción con la glucosa
oxidasa, en el que se producen ácido glucónico y peróxido de hidrógeno. El
peróxido de hidrógeno reacciona a continuación con un aceptor de oxígeno del
tipo de la ortodianisidina, la fenilamín-fenazona u otros aceptores cromogénicos,
en una reacción catalizada por la peroxidasa para dar color.
Existen otras metodologías como el de la glucosa-oxidasa-oxígeno el cual utiliza
la primera reacción descrita y con electrodos se mide el oxígeno liberado en la
reacción.
Otro método que proporciona un alto grado de especificad para la determinación
de la glucosa es el de la glucosa-hexocinasa, pues utiliza una serie de reacciones
en la que se acoplado al NADPH + H+.
Los resultados de la glucosa plasmática pueden clasificarse como
hiperglicémicos o hipoglicémicos. Existe una gran gama de enfermedades y
síndromes que se relacionan a altos y bajos valores de glucosa, cuyo
10
padecimiento primario se encuentra la Diabetes mellitus, en tal enfermedad se
encuentran valores elevados de glucosa en ayunas por arriba de 140 mg/dL. Por
otro lado, también se pueden encontrar valores bajos de la glucosa sanguínea en
padecimientos como hiperinsulinemia, hipoadrenalismo e hipotiroidismo.
OBJETIVO:
El alumno determinará glucosa en suero, líquido cefalorraquídeo y orina por el

método de glucosa oxidasa (método colorimétrico de punto final Hycel o de
Spinreact)
FUNDAMENTO:
Este reactivo está destinado para la determinación cuantitativa –in vitro- de

glucosa en suero o plasma sanguíneo libre de hemólisis, orina o líquido
cefalorraquídeo.
IMPORTANCIA CLINICA.
La exactitud en la cuantificación de glucosa en los líquidos corporales es

importante para el diagnóstico y tratamiento de la diabetes, hipoglucemia,
disfunciones adrenales entre otros padecimientos. Las determinaciones de
glucosa se realizan por lo general junto con varias pruebas se tolerancia después
de la administración de leucina, insulina, glucágon o glucosa.
METODOLOGIA Y PRINCIPIOS QUIMICOS.
El método más común de glucosa oxidasa (GOD-POD) para la determinación de

glucosa en sangre, se publicó en 1956 por A. Keston, usando o-dianisidina como
cromógeno para la determinación colorimétrica. A pesar de que éste método tenía
un uso muy frecuente en laboratorios clínicos de todo el mundo, la inestabilidad de
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éste cromógeno y su posible efecto carcinogénico, provocaron la búsqueda de un
sustituto. Se han recomendado varios cromógenos en los últimos años, pero
ninguno demostró ser mejor, hasta que P. Trinder, publicó su método en 1969,
sustituyendo la o-dianisidina por fenol-4-aminofenazona como receptor de
oxígeno.
Pennock y col., realizaron un intenso estudio para verificar el funcionamiento de
éste método. Pennock comparó el método trinder con otros seis métodos de
azúcar en sangre, llegando a la conclusión que éste método presentaba alta
confiabilidad en cuanto a precisión y exactitud.
REACCION:
-
O
O
OH OH
OH
O O HO
GOD GOD
OH HOH
+ O2 + H 2O OH O HO OH
+ H2O2
HO HO
HO HO OH
Gluconolactona Gluconato
H3C
NH2
H3C N O
POD NH
2H2O2 + + HN O N + 4H2O
N
OH CH3
H3C
Fenol
(2,4-Diclorofenol) 4-Aminofenazona O
(Ampirona) Antipiril-quinonimina
(4-Aminoantipirina)
La intensidad del complejo colorido en la reacción es directamente proporcional

a la concentración de glucosa y puede ser medida fotométricamente a la longitud
de onda de 520 nm.
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MARCA HYCEL (METODO ENZIMATICO-COLORIMETRICO, DE PUNTO
FINAL, TRINDER GOD-POD)
COMPOSICION DEL REACTIVO (Una vez diluido)
CONCENTRACION APROXIMADA
*Glucosa oxidasa (Aspergillus) 20000 U/L
* Peroxidasa (Rábano picante) 1250 U/L
* 4- aminofenazona 2 mM
*Fenolato de sodio 10 mM
*Regulador de fosfatos 100 mM
*Excipientes y estabilizadores (pH 7.5 + 0.1)
PREPARACION DEL REACTIVO.
Preparar las soluciones del reactivo con agua destilada o desionizada libre de
contaminantes a temperatura ambiente. Añadir al contenido de cada frasco la
cantidad de agua indicada en la etiqueta (9.77 g de liofilizado en 500 mL de agua
destilada o desionizada).
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO.
Antes de ser reconstituido se conserva entre 2 y 8 ºC y protegido de la luz, el

reactivo es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Una vez
reconstituido el reactivo es estable durante por lo menos 30 días entre 2 y 8 ºC o
durante 14 días a 25 ºC. Eliminar todo reactivo que se encuentre turbio o que sea
obvia la presencia de contaminación bacteriana.
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TOMA Y MANEJO DE LA MUESTRA.
Las muestras se obtienen por punción venosa. Se prefiere la obtención de

suero, plasma con EDTA, Fluoruro de sodio, Oxalato de calcio, Citrato o Heparina.
Se recomienda inmediatamente la separación del suero o plasma del paquete
celular para evitar hemólisis o utilización de la glucosa. La glucosa tanto del suero
como del plasma es estable durante 4 horas a temperatura ambiente y durante 24
horas en refrigeración. Las muestras pueden almacenarse por varias semanas si
se congelan a -10 ºC.
EQUIPO PARA LA DETERMINACION.
El equipo necesario para la determinación consta de un espectrofotómetro

manual o automático capaz de medir la absorbencia a 520 nm, con estabilidad de
temperatura, cubetas o celdillas de 1 cm de paso de luz, un cronómetro, pipetas
graduadas o automáticas para la adición del reactivo y la muestra.
PROCEDIMIENTO.
PARAMETROS.
Temperatura 37 ºC
Longitud de onda 520 nm
Intervalo de absorción 0–2A
Paso de luz de la cubeta 1.0 cm
Volumen de reactivo 1.25 mL
Volumen de muestra 0.010 mL
1. Marcar un tubo de ensaye o una cubeta para el reactivo blanco, uno para cada
estándar y uno para cada muestra problema.
14
2. Añadir 1.25 mL de reactivo completamente disuelto a cada tubo o cubeta y
llevarlos a la temperatura indicada. Preincubar las muestras a 37 ºC.
3. Añadir 0.010 mL de agua al reactivo blanco, 0.010 mL de cada estándar y
problema al tubo correspondiente y mezclar con suavidad.
4. Transcurridos 10 minutos, leer la absorbencia de cada tubo o cubeta contra el

reactivo blanco a 520 nm.
CALCULOS:
mg de Glucosa= Absorbencia del problema X concentración del estándar (mg/dL)

Absorbencia del estándar
NOTAS:
Las muestras por arriba de 750 mg/dL deben diluirse con solución salina
isotónica y volverse a realizar la determinación. Al final del ensayo multiplicar por
el factor de dilución utilizado.
LIMITACIONES.
La glucosa oxidasa es una enzima que reacciona específicamente con la b-D-

glucosa. La adición de grandes cantidades de cisteína y ascorbato interfiere ene la
reacción. Esta determinación es lineal hasta 759 mg/dL de glucosa.
VALORES DE REFERENCIA
70- 110 mg/dL
15
MARCA SPINREACT (METODO ENZIMATICO-COLORIMETRICO, TRINDER
GOD-POD)
FUNDAMENTO DEL METODO.
La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de la glucosa a ácido glucónico. El
peróxido de hidrógeno (H2O2), producido se detecta mediante un aceptor
cromogénico de oxígeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa en
la muestra ensayada.
COMPOSICION DEL REACTIVO.

R1 TRIS pH 7.4 92 mmol/L
Regulador Fenol 0.3 mmol/L
R2 Glucosa oxidasa (GOD) 15,000 U/L
ENZIMAS Peroxidasa (POD) 1000 U/L
Ampirona 2.6 mmol/L
Glucosa Cal Patrón primario acuoso de Glucosa 100mg/dL
PREPARACION.
Reactivo de trabajo (RT): Disolver (®) el contenido de un vial de R2 enzimas en
un frasco de R1 Regulador.
Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad: 1 mes entre 2-8 °C o 7 días a temperatura ambiente (15-25 °C).
CONSERVACION Y ESTABILIDAD.
Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados entre 2-8°C,
protegidos de la luz y se evita su contaminación durante su uso.
No usar los reactivos fuera de la fecha de caducidad indicada.
GLUCOSA CAL.
16
Una vez abierto, es estable por un mes si se mantienen los viales bien cerrados
entre 2-8°C, protegidos de la luz y se evita su contaminación durante su uso.
Indicadores del deterioro de los reactivos

-Presencia de partículas y turbidez.
-Absorbencia (A) del blanco a 505 nm ³0.10.
MATERIAL ADICIONAL.
-Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 505 nm.
-Cubetas de 1.0 cm de paso de luz.
-Equipamiento habitual de laboratorio.
MUESTRAS.
Suero o plasma libre de hemólisis y LCR. El suero debe separarse lo antes posible
del coágulo.
Estabilidad: La glucosa en suero o plasma es estable 3 días entre 2-8°C.
PROCEDIMIENTO.
PARAMETROS.
1. Condiciones del ensayo:
Temperatura 37 ºC (15-25°C)
Longitud de onda 505 nm (490-550 nm)
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

3. Pipetear en tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
17
Blanco Patrón Muestra
RT(mL) 1.0 1.0 1.0
Patrón (µL) --- 10 ---
Muestra (µL) --- --- 10
4. Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C o 30 min a temperatura ambiente (15-

25°C).
5. Leer la absorbencia (A) del patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El

color es estable como mínimo 30 minutos.
CALCULOS:
mg/dL de Glucosa= Absorbencia de la muestra X concentración del estándar

Absorbencia del patrón
CONTROL DE CALIDAD.
Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados:
SPINTROL H Normal y Patológico (Ref. 1002120 y 1002210).
Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de tolerancia, revisar el
instrumento, los reactivos y el calibrador.
Cada laboratorio debe disponer su propio control de calidad y establecer
correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias.
VALORES DE REFERENCIA.
Suero o plasma:
70- 110 mg/dL
LCR:
60-80% del valor sanguíneo.
18
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca
sus propios valores de referencia.
CARACTERISTICAS DEL METODO.

INTERVALO DE MEDIDA. Desde el límite de detección de 0.04 mg/dL hasta el
límite de linealidad de 500 mg/dL.
Si la concentración es superior al límite de linealidad, diluir la muestra con solución
salina fisiológica y multiplicar por el factor de dilución.
PRECISION.
Intraserie(n=20) Interserie (n=20)
Media(mg/dL) 96.8 241 98.4 248
SD 0.81 1.43 1.55 3.73
CV(%) 0.83 0.59 1.58 1.50
Sensibilidad analítica: 1mg/dL=0.0036 A.

Los reactivos SPINREACT (y) no muestran diferencias sistemáticas significativas
cuando se comparan con otros reactivos comerciales (x).
Los resultados obtenidos con 50 muestras fueron los siguientes:
Coeficiente de correlación (r): 0.99

Ecuación de la recta de regresión: y=1.0x + 0.12.
Las características del método pueden variar según el analizador utilizado.
INTERFERENCIAS
No se ha observado interferencias con: hemoglobina hasta 4 g/dL, bilirrubina hasta
20 mg/dL, creatinina hasta 100 mg/dL, galactosa hasta 1 g/L.
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la
determinación de la glucosa.
19
NOTAS
1. La calibración con el patrón acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en
métodos automáticos. En este caso, se recomienda utilizar calibradores séricos.
2. Usar puntas de pipeta desechables limpias para ser dispensadas.
3. SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de
este reactivo en distintos analizadores.
20
MARCA STANBIO-LICON GLUCOSA LIQUICOLOR (PARA LA
DETERMINACION CUANTITATIVA DE GLUCOSA ENZIMATICA-
COLORIMETRICA EN SUERO, PLASMA O LCR).

4-aminoantipirina 0.2 mmol/L
Glucosa oxidasa 15.0 mmol/L

(GOD)
Peroxidasa (POD) 1.2 U/L
Fenol 4.0 mmol/L
No contiene ingredientes reactivos ni preservativos.
ESTANDAR DE GLUCOSA (100mg/dL)

100 mg/dL de Glucosa en solución acuosa de benzoico.

El reactivo y el estándar están listos para usarse.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO.

El reactivo y el estándar son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados entre 2-8°C, protegidos
de la luz y se evita su contaminación durante su uso.
No usar los reactivos fuera de la fecha de caducidad indicada.
Ambos reactivos deben llevarse a temperatura ambiente antes de utilizarse.
MATERIAL ADICIONAL.
21
RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA:
SUERO: Remover el coágulo antes de 30 minutos de su recolección para prevenir
la glicolisis.
PLASMA: Se recomienda utilizar un anticoagulante que no contenga flúor, sin
embargo se puede utilizar otro anticoagulante común. Centrifuge y separe el
plasma rápidamente de las células.
LCR: No requiere preparación especial.
Estabilidad de la muestra: La glucosa en suero o plasma es estable 3 días entre 2-
8°C. El LCR debe analizarse inmediatamente para evitar contaminación bacterina.
PROCEDIMIENTO.
PARAMETROS.
Temperatura 37 ºC
Tipo de reacción Punto final.
Relación muestra/reactivo 1:100
Absorbencia inicial <0.300
Linealidad 500 mg/dL
pH 7.0 ± 1.0
Estándar 100 mg/dL
22
Reactivo Blanco Estándar (E) Muestra (M)

(RB)
Reactivo (mL) 1.0 1.0 1.0
Estándar (µL) --- 10 ---
Muestra (µL) --- --- 10
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C o 30 min a temperatura ambiente (15-25°C)

por 10 min.
5. Leer la absorbencia (A) de E y M frente a RB de reactivo a 500 nm. El color es

estable por 60 minutos.
CALCULOS:
mg/dL de Glucosa= Absorbencia de la muestra X concentración del estándar

Absorbencia del estándar
CONTROL DE CALIDAD.
Se deben de incluir dos sueros control con niveles de glucosa conocidos
determinados por este método o por el procedimiento de hexocinasa en cada serie
de pruebas. Se recomienda el uso de Suero Control Normal Ser-T-F y I y Suero
Control Anormal Ser-T-F y II para cada ensayo.
Si la concentración es superior al límite de linealidad (> 500 mg/dL), diluir la

muestra con solución salina fisiológica y multiplicar por el factor de dilución.
Suero o plasma:
70- 110 mg/dL
23
LCR:
40-75 mg/dL.
sus propios valores de referencia, teniendo en cuenta las diferencias que existen
entre instrumentos, laboratorio y población local.
CARACTERISTICAS:
PRECISION:
Utilizando un suero que contenga glucosa en un intervalo normal y uno con
valores elevados, se realizara una serie de 5 pruebas durante 5 días. Los
coeficientes de variación (CV) del intraensayo fueron de 1.6 y 1.2%, y en el
intersayo fueron de 3.0 y 2.0% respectivamente.
CORRELACION:
Determinación de glucosa por el procedimiento descrito (Y) y por el método de
hexocinasa/método (X) en 40 sueros (intervalo:56-582 mg/dL) mostraron un
coeficiente de correlación (r) 0.995 y una ecuación de regresión de y=0.98x-1.99.
LINEARIDAD:
Cuando se realiza directo, este método es lineal de 0-500 mg/dL.
BIBLIOGRAFIA.
1. Friedmar, R. et al. Clin. Chem. 26(4), 1980.
2. Tietz, N. Fundamentals of Clinical Chemistry . W. B. Saunders Co. Philadelphia.

1998.
3. Murray, R. K., Granner, D.K., Mayes, P. A. y Rodwell, V. W. (2001). Bioquímica

de Harper. 15a. ed. Ed. El Manual Moderno. México.
24
4. Voet, D y Voet, J. G. (1995) Biochemistry. 2a. ed. Ed. John wiley and Sons. Inc.
Estados Unidos.
5. Tierney, L M., McPhee, S. J. y Papadakis, M. A. (2000) Diagnóstico Clínico y

Tratamiento. 35a. ed. Ed. El Manual Moderno. México
6. Henry, J.B. (1997) Diagnóstico y tratamiento clínicos por el laboratorio. 9ª. ed.
Ed. Ediciones Científicas y Técnicas, S.A.
25
2.2 DETERMINACION DE COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTEICOS
A) NITROGENO UREICO
La urea es el producto final del catabolismo de los aminoácidos y cuya síntesis

tiene como objetivo la destoxificación del amonio generado durante la degradación
de aminoácidos en el hígado puesto que éste ión resulta ser muy tóxico en el
organismo.
La urea una vez sintetizado se elimina principalmente a través de la orina en un
95% y a través de las heces el otro 5% restante.
La determinación de la urea sanguínea, es el análisis que más frecuentemente
se usa para evaluar la función renal.
Existen un sinnúmero de metodologías para la determinación de urea sérica, un
número importante de ellos se fundamenta en la reacción que se lleva a cabo
entre la urea y la diacetilmonoxima misma que fue descrita por Fearon en 1939,
pero esta técnica descrita resulta ser muy inestable debido a la dependencia que
tiene con respecto a la temperatura, así como la toxicidad de los reactivos. Debido
a esto se han buscado otras metodologías que permitan la determinación más
eficiente. Así por ejemplo, Wybenga y col. propusieron en el año de 1971 un
método en la que ajustando el pH, las concentraciones de diacetilomonoxima,
tiosemicarbazida y utilizando sulfato de cadmio se puede determinar la urea
sérica. Pero poco a poco esta metodología ha sido desplazada por los métodos
enzimáticos los cuales involucran la utilización de la enzima ureasa, que degrada
a la urea en amonio y en monóxido de carbono, y que a su vez por métodos
colorimétricos, espectrofotométricos, potenciométricos pueden determinarse
cualquiera de estos componentes resultantes de esta reacción.
OBJETIVO:
El alumno determinará el nitrógeno ureico presente en muestras séricas y orina

aplicando un método químico y un método cinético enzimático-químico.
26
SPINREACT
Urea
Determinación cuantitativa de urea
IVD
PRINCIPIO DEL MÉTODO

La urea presente en la muestra reacciona con el o-ftalaldehído en medio ácido
originando un complejo coloreado que puede cuantificarse
espectrofotométricamente:
Urea + o-ftalaldehído H+ Isoindolina
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de urea en la

muestra ensayada.
SIGNIFICADO CLÍNICO
La urea es el resultado final del metebolismo de las proteínas; se forman en el
hígado a partir de su distribución.
Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en dietas con exceso de
proteínas, enfermedades renales, insuficiencia cardíaca, hemorragias gástricas,
hipovolemia y obstrucciones renales.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y
de laboratorio.
REACTIVOS
R1 o-Ftalaldehído 4,8 mmol/L
R2 Solución borato 87 mmol/L
UREA CAL Patrón primario acuoso de urea 50 mg/dL
PREPARACIÓN
Todos los reactivos están listos para su uso.
CONSERVACIÓN Y ESBILIDAD
27
en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC,
protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar reactivos fuera de la
fecha indicada.
UREAL CAL
Una vez abierto, es estable 1 mes si se mantienen los viales bien cerrados a 2-
8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación
Indicadores de deterioro de los reactivos:
-Absorvancia (A) del blanco a 510 nm > 0,20.
MATERIAL ADICIONAL
MUESTRAS
-Suero o plasma heparinizado: No usar sales de amonio o fluoruro como

anticoagulantes.
-Orina: Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado
obtenido por 50 (factor de dilución). Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo
el pH < 4
La urea es estable 5 días a 2-8ºC.
PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: ……………….............510 nm (500-550)
Cubeta: ……………………………………1 cm paso de luz
Temperatura: ……………………………..37ºC
28
A) Cinética
1. Pipetear en tubos de ensayo:

R 1 (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón (uL) -- 50 --
Muestra (uL) -- -- 50
2. Mezclar e incubar 1 minuto y añadir:
R 2 (mL) 1,0 1,0 1,0
3. Mezclar, incubar a 37ºC y leer las absorbencias a 1 minuto (A1)

y a los 2 minutos (A2).
4. Calcular el incremento de la absorbencia AA=A2-A1.
Cálculos
(AA) Muestra
(AA) Calibrador x 50 (Conc. Calibrador)= mg/dL de urea en la muestra
B) Punto final
1. Pipetear en una cubeta:
R 1 (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón (uL) -- 25 --
Muestra (uL) -- -- 25
2. Mezclar y añadir:
R 2 (mL) 1,0 1,0 1,0
29
3. Mezclar e incubar 15 minutos a 37ºC.
4. Leer la (A) del calibrador y la muestra, frente al blanco de reactivo.
CÁLCULOS
(A) Muestra
(A) Calibrador x 50 (Conc. Calibrador)= mg/dL de urea en la muestra
10 mg/L urea BUN dividido por 0,466 = 21 mg/dL de urea = 0,36 mmol/L urea.
Factor de conversión: mg/dL x 0,1665 = mmol/L.
CONTROL DE CALIDAD
Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L)
Orina: de 20 a 35 gr/24 horas
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

Rango de medida: Desde el límite de detección de 0,70 mg/dL hasta el límite de
linealidad de 200 mg/dL.
30
Si la concentración es superior al límite de linealidad, diluir la muestra 1:2 con
NaCl 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.
PRESICIÓN
Intraserie (n=20) Interserie (n=20)

Media (mg/dL) 43.2 145 41.9 147
SD 1.51 1.10 0.80 2.83
CV(%) 3.49 0.76 1.92 1.91
Sensibilidad analítica: 1 mg/dL = 0.00459 A.

Exactitud: Los reactivos SPINREACT (y) no muestran diferencias sistemáticas
significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales (x).
INTERFERENCIAS
Como anticoagulante se recomienda la heparina. En ningún caso deben utilizarse
sales de amonio o fluoruro.
determinación de la urea.
NOTAS
1. El material empleado así como el agua destilada que se utilice debe estar
libres de amoniaco y/o sus sales.
3. Usar puntas de pipeta desechables limpias para su dispensación.
31
NITROGENO DE UREA (BUN) LIQUI-UV MARCA STANBIO-LICON. (PARA
DETERMINACION CUANTITATIVA CINETICA DE NITROGENO DE UREA [BUN]
EN SUERO).
FUNDAMENTO.
Este procedimiento es una modificación del método descrito por Sampson. La

urea se convierte catalíticamente a carbonato de amonio por acción de la ureasa.
La velocidad de reacción depende de la concentración de la glutamato
deshidrogenasa. La velocidad de ésta segunda reacción es dependiente de la
primera y puede medirse por la velocidad de conversión de NADH a NAD por el
cambio de absorbencia a 340 nm.
REACTIVOS.
REGULADOR DE BUN (R1)
COMPOSICION:
Tris pH 7.8 120 mmol/L

2-Alfacetoglutarato 7.0 mmol/L
ADP (sal monosódica) 0.6 mmol/L
Tris, pH 7.5 80 mmol/L
Ureasa 6000 U/L
GDH 10,000 U/L
32
ENZIMA BUN (R2)
COMPOSICION:
NADH (Sal sódica) 0.25 mmol/L
ESTÁNDAR DE BUN (30 mg/dL)
Solución de urea con trazas de estabilizador. El estándar está referido contra

material NIST.
PRECAUCIONES: Para su uso diagnóstico In Vitro. Tome las precauciones

normales para el manejo de reactivos de laboratorio. Los reactivos contienen azida
de sodio que puede ser tóxico si se ingiere.

El regulador y los reactivos enzimáticos están listos para su uso.
Prepare el reactivo de trabajo en una proporción de 5 partes de regulador (R1) y
una parte de enzima (R2), (Por ejemplo 25 mL de regulador y 5 mL de enzima).
Antes de utilizarse mantener el reactivo de trabajo a temperatura ambiente 15-
25°C por lo menos 30 minutos.
fecha indicada. Los reactivos deben de verse claros y sin color. Descartar si se ve
turbio o si tiene partículas. El reactivo de trabajo es estable por 4 semanas a 2-8ºC
o 5 días a temperatura ambiente. El reactivo de trabajo deberá desecharse si la
absorbencia inicial, leída contra agua a 340 nm es menor a 1.000.
MATERIAL ADICIONAL.
33
-Baño de temperatura constante a 37°C.

El suero no hemolizado es la muestra de elección. Siempre que sea posible, las
muestras deben de ser separadas y analizadas el mismo día que se recolectan.
Se deben evitar los anticoagulantes que no contengan amonio o sales de flúor.
La urea en el suero es estable por 24 h a temperatura ambiente, varios días si se
refrigera o por lo menos de 2-3 meses cuando se congela a -20°C. Niveles de
bilirrubina por arriba de 40 mg/dL, hemoglobina por arriba de 200 mg/dL y niveles
de triglicéridos por arriba de 2000 mg/dL no muestran interferencia con esta
prueba.
SUSTANCIAS INTERFERENTES.
Además de la hemólisis, el flúor en concentraciones elevadas y el amonio pueden
causar interferencias.
PROCEDIMIENTO.
PARAMETROS.
Temperatura 37 ºC
Tipo de reacción Cinética.
Absorbencia inicial 1.000
34
pH 7.0 ± 1.0
Estándar 30 mg/dL
2. Prepare el reactivo de trabajo de BUN de acuerdo al instructivo.

3. Ajustar el espectrofotómetro a cero a 340 nm frente a agua destilada.
Blanco (B) Estándar (E) Muestra (M)
Reactivo de 1.0 1.0 1.0
trabajo (mL)
Incubar a 37 °C por 3 minutos. Adicionar al tubo correspondiente:
Muestra (µL) --- --- 10
5. Mezclar y leer y anotar la absorbencia después de 30 segundos (A1), sin dejar

de incubar a 37°C
6. Exactamente leer y anotar la absorbencia a los 60 segundos (A2) a 37°C.
7. Calcule el cambio de absorbencia por minuto (DA) mediante la resta (A1- A2).
CONTROL DE CALIDAD.
Se deben de incluir dos sueros control con niveles de BUN conocidos
determinados por este método o por cualquier otro método en cada serie de
pruebas. Se recomienda el uso de Suero Control Normal Ser-T-F y I y Suero
RESULTADOS.
Los valores se derivan de la comparación del cambio de absorbencia (DA) de la
muestra (M) con la del estándar (E):
BUN en suero (mg/dL)= (DAM) X 30

(DAE)
35
Donde AM y AE son los cambios de absorbencia (decrementos) de la muestra y
del estándar, respectivamente y 30 es la concentración del estándar (mg/dL)
Ejemplo: DAM=0.045, DAE= 0.090
BUN en suero (mg/dL)= (0.045) X 30=15

(0.090)
LIMITACIONES.
Si la concentración de BUN es superior al límite de linealidad (> 140 mg/dL), diluir

al doble (1+1) la muestra con solución salina fisiológica y multiplicar por el factor
de dilución 2. Los valores de BUN en pacientes neonatos no han sido establecidos
en este procedimiento.
Suero o plasma:
BUN 8-23 mg/dL

UREA 17-40 mg/dL
Estos valores son sólo orientadores. Es recomendable que cada laboratorio

establezca sus propios valores de referencia, teniendo en cuenta las diferencias
que existen entre instrumentos, laboratorio y población local.
CARACTERISTICAS:
Las siguientes características de funcionamiento fueron llevadas a cabo utilizando
un equipo Epos 5060.
COMPARACION.
36
Un grupo de 68 muestras dentro de un intercalo de BUN de 11-97 mg/dL, se
realizó por el método de BUN descrito y por otro similar comercialmente
disponible. Con la comparación de resultados se obtuvo un coeficiente de
correlación de 0.999 y con una ecuación de regresión de y=1.012x -0.47 (La
comparación de estudios se llevó a cabo de acuerdo a la guía tentativa NCCLS
EP9-T).
PRECISION:
La precisión intraensayo se realizó mediante 20 ensayos con tres diferentes

niveles de sueros controles comerciales. Los valores de precisión total se
obtuvieron por el ensayo de tres controles comerciales por 5 días consecutivos.
INTERENSAYO
SUERO 1 SUERO 2 SUERO 3
MEDIA 22 45 54
BUN(mg/dL)
SD (mg/dL) 0.6 0.8 0.6
CV(%) 2.6 1.8 1.2
PRECISION TOTAL
MEDIA 15 46 70
BUN(mg/dL)
SD (mg/dL) 0.4 0.6 0.7
CV(%) 3.0 1.2 1.0
Se llevaron a cabo estudios de precisión de acuerdo con la guía tentativa NCCLS,

EP5-T.
37
LINEALIDAD
Este método es lineal de 2-140 mg/dL. De acuerdo a la guía NCCLS EP6-P.
SENSIBILIDAD.
En base a la resolución del instrumento de A=0.001, éste método muestra una
sensibilidad de 2.0 mg/dL. Los valores por debajo de 2.0 mg/dL deben reportarse
como < 2.0 mg/dL.
UREA
AGENTE DE DIAGNOSTICO
Uso in vitro
METODOLOGIA:
Diacetilmonoxima
FUNDAMENTOS:
La urea reacciona con la diacetilmonoxima en presencia de tiosemicarbazida en
medio ácido formando un derivado diazínico de color rosa púrpura.
La concentración de la urea presente en la muestra es proporcional a la intensidad
del color formado.
CARACTERISTICAS:
El método propuesto es altamente específico para la urea y permite su
semiautomatización. El producto formado en la reacción carbamido-diacetilo es
estabilizado por la acción de la tiosemicarbazida y por el ión férrico, que disminuye
su fotosensibilidad e inhibe la interferencia de la hidroxilamina, linealizando la
reacción. Pueden utilizarse las mismas muestras de sangre empleadas para hacer
38
otras determinaciones, ya que los anticoagulantes y conservadores comúnmente
empleados en bioquímica clínica, no interfiere en la reacción.
MUESTRAS:
Suero. plasma (con fluoruro, oxalato, heparina, o EDTA), orina.
REACTIVOS:
No 1.- Diacetilmonoxima: Solución concentrada
No 2.- Tiosemicarbazida: Solución concentrada
No 3.- Reactivo ácido: Solución concentrada
No 4.- Patrón: 80 mg/100 ml.
Todos estos reactivos son estables a la temperatura ambiente por 2 años.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS DE USO:
Reactivo de color: Transferir 40ml del reactivo No. 1 (diacetilmonoxima) y 20 ml

del reactivo No. 2 (tiosemicarbazida) a un matraz volumétrico de 500 ml,
completar con agua destilada hasta la marca. Homogeneizar bien y almacenar en
frasco ámbar a temperatura ambiente. Estable por un año.
Reactivo ácido: Transferir 125 ml del reactivo No. 3 (reactivo ácido) a un matraz
volumétrico de 500 ml y completar hasta la marca con agua destilada.
Homogeneizar bien y conservar en frasco de color ámbar a temperatura ambiente.
Estable por 1 año.
A.- METODO DIRECTO:
Se usa para plasma o suero.
39
1.- Marcar 3 tubos de ensayo: B (Blanco), M (Muestra) y P (Patrón) y proceder
como sigue:
BLANCO MUESTRA PATRON
Reactivo de color 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
Suero o plasma 0.02 ml -
Agua destilada 0.02 ml - -
Patrón - 0.02 ml
Reactivo ácido 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
2.- Mezclar bien y colocar en baño de agua en ebullición durante 10 minutos.

Transferir a un baño de agua fría durante 3 minutos.
3.- Determinar las absorbencias de la muestra y del patrón a 520 nm, o con filtro
verde, ajustado a cero con el blanco. La coloración es estable por 60 minutos.
CALCULOS:
mg/100 mL=Absorbencia de la muestra x 80

Como la reacción colorida sigue la Ley de Lambert y Beer, puede ser usado el
factor para calcular los resultados:
Factor (F) = 80___________

Absorbancia del patrón
(mg/100 mL) = Absorbancia de la muestra x F.
B. METODO DE DESPROTEINIZACION: Para cuantificar la urea utilizando la

sangre total, sueros lechosos (quilosos), hemolizados con hemoglogina superior a
100 mg/100 mL o con bilirrubina mayor a 25 mg/100 mL.
40
Desproteinizar el suero, plasma o sangre total, utilizando los métodos de Somogy
o de Folin-Wu, diluyéndolo 1:10.
Diluir el patrón 1:10 con agua destilada y usar 0.2 mL de agua destilada en el
blanco 0.2 mL de filtrado en la muestra y 0.2 mL del patrón diluido 1:10. El resto
de la técnica y los cálculos son los mismos que los del método directo.
C) TECNICA PARA LA ORINA:
1. Preparación: Homogeneizar bien la orina de 24 horas y medir su volumen en

mL.
Diluir una alícuota 1:50 del siguiente modo: 0.1 mL de orina + 4.9 mL de agua
destilada. Esta muestra diluida será usada en el paso siguiente.
2. Colorimetría. Seguir las mismas instrucciones del método directo sustituyendo

el plasma por la orina diluida 1:50.
3. Cálculos: Seguir las recomendaciones del método directo multiplicando el valor

obtenido por 50 para expresar el resultado en mg/24 h.
COMPORTAMIENTO DE LA REACCION (Linealidad):
La reacción es lineal hasta 150 mg/100 mL. Para resultados mayores de este
valor, diluir el suero o plasma con agua destilada, hacer nueva determinación y
multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.
VALORES LIMITES DE REFERENCIA
Sangre, suero o plasma: 15 a 40 mg/100 mL
Orina: 24 a 43 g/24 h
41
RECOMENDACIONES IMPORTANTES:
1. Para obtención de resultados precisos y exactos es importante seguir

estrictamente la metodología propuesta.
2. Colocar los tubos en el baño de agua solamente cuando ésta esté en ebullición.
El nivel de agua en el baño hirviente debe ser superior al nivel alcanzado por los
reactivos en los tubos de ensayo.
3. Para detectar alguna alteración en la respuesta del espectrofotómetro, es

conveniente comprobar periódicamente su calibración, sobre aquellas técnicas en
las cuales se emplea una curva o un factor de calibración.
4. Es importante usar material de vidrio limpio y seco, libre detergentes.
5. El uso de sueros controles sebe ser práctica rutinaria del laboratorio para
comprobar la precisión y exactitud de las determinaciones. El error máximo
establecido no debe ser mayor del 10%.
PRESENTACION:
Reactivo No. 1 1 Frasco con 40 mL

La versatilidad de la técnica permite reducir los volúmenes de los reactivos y de la

muestra proporcionalmente.
El equipo sirve para 200-400 determinaciones.
42
BIBLIOGRAFIA.
1. Ceriotti, G; Clin. Chem. 17, 400 (1972).

2. Foster, L. B. y Hochholzer, J. M. Clin. Chem. 17, 921 (1971).
3. Marsh , W. H. Figerhurt, B., Miller, H. Clin. Chem. 17, 891 (1971).
4. Wybenga, D. R. ; Di Giorgio, J. y Pillaggi, V. J. Clin. Chem. 17, 891 (1971).
UREA HYCEL
METODO DE UREASA-BERTHELOT. (METODO ENZIMATICO

COLORIMETRICO DE PUNTO FINAL)
FUNDAMENTO.
Este equipo de reactivos se utiliza para la determinación cuantitativa in vitro de

urea en suero, plasma y orina.
SIGNIFICADO CLINICO.
La urea es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y

aminoácidos; se genera en el hígado por el ciclo de la urea y es eliminada por los
riñones en un 90%, también es excretada en cantidades mínimas en el sudor y es
degradada por las bacterias intestinales. La urea es el principal compuesto
nitrogenado no proteico del plasma, en donde representa aproximadamente un
45% del total.
Una elevación en los niveles de urea se considera una disfunción renal, sin
embargo la consentración sérica de la urea varía bastante en los individuos
normales y está influida por factores tan diversos como la ingestión dietética de
proteínas y el estado de hidratación.
43
METODOLOGIA.
La urea del suero, plasma y orina se hidroliza por la acción de la ureasa, dando
lugar a amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco, mediante la acción de fenol-
hipoclorito de Berthelot, utilizando como catalizador nitroprusiato sódico produce
azul de indofenol, la intensidad del color que se desarrolla es proporcional a la
concentración de urea y puede medirse fotométricamente a 540 nm.
REACTIVOS.
1. Fenol-nitroferricianuro de sodio.
2. Hipolcorito de sodio concentrado.
3. Estándar de Urea 60 mg/dL.
4. Ureasa.
PRECAUCIONES.
No ingerir los reactivos. Evitar el contacto con la piel y ojos . Si se derrama, lavar
con abundante agua.
Los reactivos son para uso in vitro. El fenol es tóxico e irritante.
REACTIVO 1. Disolver el contenido del frasco con agua destilada de acuerdo a las
indicaciones del rótulo, mezclar por inversión hasta disolución completa. Colocar
fecha de elaboración.
44
REACTIVO 2. Diluir el contenido del frasco con agua destilada de acuerdo con las
indicaciones del rótulo, mezclar por inversión hasta disolución completa. Colocar
fecha de elaboración.
ESTANDAR Y UREASA. Listo para ser usados.
Los reactivos son estables entre 2-8ºC, hasta la fecha de vencimiento indicada en
la etiqueta.
Los reactivos 1 y 2 son estables un año a partir de la fecha de preparación de 2-8

ºC.
INDICIOS DE DETERIORO DE LOS REACTIVOS.
Las contaminaciones con vapores amoniacales producen deterioro de los

reactivos. Lecturas del Blanco superiores a 0.150 unidades de absorbencia indican
contaminación por amoniaco. Deben desecharse estos reactivos.
Deben emplearse diferentes pipetas para los reactivos 1 y 2 y no intercambiarse
las tapas de los frascos, ya que la contaminación de un reactivo con el otro
produce su deterioro definitivo.
SUERO, PLASMA Y ORINA: Recolectarlo de la manera usual.
Almacenamiento: Las muestras de suero o plasma con urea, son estables por
varios días en refrigeración o 6 meses si se congelan. Las muestras de orina de
pH inferior a 4 son estables de 4-5 días 2-8 ºC.
45
EQUIPO ADICIONAL REQUERIDO PERO NO PROVISTO.
Espectrofotómetro.
Micropipetas.
Baño de agua a 37ºC.
Cronómetro.
CONDICIONES DE REACCION.
Temperatura 37 ºC
Tiempo de reacción 20 minutos
Volumen de reacción 12 mL
Volumen de muestra 20 µL
PROCEDIMIENTO.
Marcar 3 tubos como B (Blanco), ST (Estándar) y M (Muestra)

TECNICA EN SUERO O PLASMA.
Colocar una a dos gotas de agua en cada tubo de ensayo, luego pipetear
sobre el fondo de los tubos:
B ST M
Estándar --- 20 µL ---
Suero o Plasma --- --- 20 µL
Ureasa 1 gota 1 gota 1 gota
Mezclar por agitación suave e incubar 5 min a 37ºC y agregar:
Reactivo 1 1 mL 1 mL 1 mL
Reactivo 2 1 mL 1 mL 1mL
Mezclar por agitaciónsuave e incubar 5 min a 37ºC y agregar:
Agua destilada 10 mL 10 mL 10 mL
Retirar del baño y mezclar por inversión. Dejar reposar 10 min y leer 540 nm,
ajustando a cero con el Blanco.
46
TECNICA EN ORINA.
Se sigue la misma técnica que para suero utilizando orina diluida con agua
destilada o con solución salina fisiológica. Como el contenido de urea está
relacionado con la densidad, es conveniente diluir según el siguiente esquema:
Densidad hasta 1.015 Diluir 1:10

Densidad hasta 1.016 a 1.025 Diluir 1:20
Densidad mayor de 1.025 Diluir 1:40
Como la orina contiene cantidades variables de amoniaco debe efecturarse un

Blanco de orina (BO), dicho blanco se trabaja igual que el Blanco de reactivo, con
la diferencia que, después de agregar el reactivo 1 y antes del 2, se agregar 20 µL
de la orina diluida. Llevar el instrumento a cero con el Blanco de reactivos (B) y
leer el estándar (ST), el Blanco de orina (BO) y la muestra.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL.
El color de la reacción final es estable por 12 horas, por lo que la absorbencia

debe ser leída en ese intervalo.
CALCULOS.
SUERO O PLASMA
UREA (mg/dL)= M x Factor
Factor=60 mg/dL
ST
BUN (mg/dL)= M x Factor
47
Factor=28 mg/dL
ST
ORINA
UREA (mg/dL)= (M-BO) x 60 x dilución

ST
Suero o plasma:
Adultos de 8-23 mg/dL de BUN
Niños de una semana de 3-25 mg/dL de BUN
Orina:
7-16 g de BUN/24 h
BUN= Urea x 0.467

Urea= BUN x 2.14
LIMITACIONES.
1. Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la acción de la ureasa.

2. La hemólisis intensa puede producir resultados falsamente elevados que no
sobrepasan el 5%. Esta interferencia puede corregirse con un Blanco del suero.
3. No se observan interferencias por hemólisis ligeras o moderadas y bilirrubina

hasta 400 mg/dL.
48
4. Evitar contaminaciones con amoniaco provenientes del ambiente (humo de
cigarrillo, vapores amoniacales).
LIMITE DE DETECCION.
Cuando el intervalo obtenido sobrepasa los 1.5 g de urea, debe diluirse a una
solución 1:3 empleando como diluyente Blanco de reactivos y efectuando la
lectura de 10 min de efectuada la dilución. El resultado obtenido deberá
multiplicarse por la dilución efectuada.
BIBLIOGRAFIA.
1. Tietz. Texbook of Clinical Chemistry. 3ª, ed, 35: 1239-1838 (1999).
2. Henry, Bernard. Diagnóstico clínico por el laboratorio 8: 145-146 (1993).
49
B) ACIDO URICO.
El ácido úrico es el resultado del catabolismo de las bases nitrogenadas como

adenina y guanina a través de diversos intermediarios metabólicos.
La excreción neta del ácido úrico total en personas sanas es, en promedio, de
400 a 600 mg/24 h. Los uratos son mucho más solubles que el ácido úrico. La
orina con un pH de 5.0, puede disolver sólo un décimo del total de uratos (15
mg/dL), en tanto que la orina con un pH de 7.0 disuelve muchos más (150-200
mg/dL) y el pH normal de la orina está por debajo de 5.8.
La determinación de hiperuricemia es la concentración de uratos que excede los
límites de solubilidad. Los cristales de uratos de sodio en tejidos blandos y
articulaciones, forma depósitos llamados tofos, que causan una reacción
inflamatoria, denominada artritis gotosa.
La mayoría de los procedimientos fotométricos de tipo químico para la
determinación del ácido úrico, se fundamentan en la reducción del fosfotungstato
por el ácido úrico en solución alcalina y dando lugar a la formación de un complejo
de color azul. Pero el inconveniente de usar esta metodología se debe a la
toxicidad que presentan los reactivos y otras metodologías utilizan sales de
cianuro para formar un complejo más estable.
Los métodos enzimáticos emplean a la uricasa y a la peroxidasa para la
determinación de uricemia.
OBJETIVO.
El alumno determinará ácido úrico en muestras como suero y orina humano

mediante un método enzimático Spinreact o Stanbio-Licon.
50
ACIDO URICO. (URICASA-POD. ENZIMATICO-COLORIMETRICO).
SPINREACT.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE ACIDO URICO.
El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno

(2H2O2) que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2, 4
Diclorofenol sulfonato (DCPS) forma un complejo rojizo:
URICASA
1. Ácido úrico + O2 + H2O Alanotoína + CO2 + H2O2
PEROXIDASA
2. 2H2O2 + 4AF + DCPS quinoneimina + 4H2O
El cambio de la absorbencia a 520 nm es proporcional a la concentración de

ácido úrico en la muestra.
El ácido úrico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En
una insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de ácido urea,
ácido úrico y creatinina.
Niveles altos de ácido úrico son indicativos de patología renal y generalmente se
asocia a gota.
de laboratorio.
51
REACTIVOS.
R1 Fosfatos pH 7.4 50 mmol/L

Tampón 2,4 Diclorofenol sulfonato 4 mmol/L
(DCPS)
R2 Uricasa 60 U/L
Enzimas Peroxidasa (POD) 660 U/L
Ascorbato oxidasa 200 U/L
4- Aminofenazona (4-AF) 1 mmol/L
URIC ACID CAL Patrón primario acuoso de Ácido úrico 6 mg/dL
PRECAUCIONES.
Todos los reactivos químicos son tóxicos e irritantes a la piel. Usar guantes
adecuados y proteger cara y ojos. En caso de accidente o malestar, acudir
inmediatamente al médico.
PREPARACION.
Reactivo de Trabajo (RT): Disolver (®) el contenido de un vial de R2 (Enzimas) en

un frasco de R1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su
contenido.
Estabilidad del reactivo: 1 mes en refrigeración o 10 días a 15-25ºC.
fecha indicada.
URIC ACID CAL.

52
-Absorbencia (A) del blanco a 520 nm ≥ 0.16.
MATERIAL ADICIONAL
-Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.
MUESTRAS
-Suero o plasma.
Estabilidad del ácido úrico de 3-5 días a 2-8ºC y 6 meses a -20ºC
-Orina (24 h) : La estabilidad del ácido úrico:3 días a temperatura ambiente a pH >
8.
Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado
obtenido por 50 (factor de dilución); si la muestra presenta turbidez, calentarla a
60ºC 10 min para disolver los precipitados de urato y ácido úrico. No refrigerar.
PROCEDIMIENTO
Temperatura: ……………………………..37ºC/15-25ºC

RT (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón (µL) -- 25 --
Muestra (µL) -- -- 25
53
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC o 10 min a 15-25 ºC.
5. Leer la absorbencia (A) del patrón y la muestra, frente al blanco de reactivo. El
color es estable como mínimo 30 minutos.
Cálculos
Suero o plasma.
(A) Muestra x 6 (Conc. Calibrador)= mg/dL de Ácido úrico en la muestra

(A) Patrón
Orina 24 h:
(A) Muestra x 6 (Conc. Calibrador) x vol(dL)/24 h= mg/24 h de Ácido úrico (A)
Patrón en la muestra.
Factor de conversión: mg/dL x 59.5 = µmol/L.
CONTROL DE CALIDAD
Suero o plasma
Hombres: 3.6-7.7 mg/dL
Mujeres: 2.5-6.8 mg/dL
Orina: 250-750 mg/24 horas
54
Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.

Si la concentración es superior al límite de linealidad, diluir la muestra ½ con NaCl
9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.
PRESICIÓN

Media (mg/dL) 4.74 11.4 4.72 11.2
SD 0.03 0.06 0.07 0.15
CV(%) 0.63 0.56 1.58 1.36
Sensibilidad analítica: 1 mg/dL = 0.0347 A

Los resultados obtenidos en 50 muestras fueron los siguientes:
Coeficiente de correlación(r): 0.99
Ecuación de la recta de regresión: y=1.005x+0.0005.
INTERFERENCIAS
No se ha observado interferencia con hasta 130 mg/dL de hemoglobina, y con
bilirrubina hasta 170 µmol/L y de ácido ascórbico hasta 570 µmol/L
determinación de ácido úrico.
55
NOTAS
2. Usar puntas de pipeta desechables listas para su uso.
BIBLIOGRAFIA.
1. Schultz, A.Uric Acid. Kaplan, A, et al Clin. Chem. The C.v. Mosby Co. St. Louis.
Toronto. Princeton 1984; 1261-1266 y 418.
2. Young D.S. Effects of drugs on clinical labs tests. 4th ed AACC Press 1995.
STANBIO-LIQUICOLOR ACIDO URICO-PAP MARCA STANBIO-LICON. (PARA

DETERMINACION CUANTITATIVA ENZIMATICA COLORIMETRICA DE ACIDO
URICO EN SUERO, PLASMA U ORINA.
RESUMEN Y PRINCIPIO.
La uricasa actúa sobre el ácido úrico para formar peróxido de hidrógeno y
alantoína. El peróxido de hidrógeno se lee cuantitativamente por su reacción con
el ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzosulfónico (DCHB) en presencia de peroxidasa y
4 aminofenazona, para formar un complejo quinoneimina de color rojo.
FUNDAMENTO.
URICASA
URCA + AGUA ALANTOINA + PEROXIDO + CO2
PEROXIDO PEROXIDASA N-(4-ANTIPIRIL)-3-CLORO-5-SULFATO-p-BENZOQUINONEIMIDA

DCHB + AGUA
4AF
56
REACTIVOS.
ACIDO URICO ENZIMATICO (LIQUIDO)
COMPOSICION:
Regulador de Fosfatos pH 7.0 50 mmol/L
ácido 3,5-dicloro-2- 4.0 mmol/L
hidroxibencensulfónico
4-aminofenazona 0.3 mmol/L
Peroxidasa >1000 U/L
Uricasa >200 U/L
Estabilizadores y activadores en solución reguladora
ESTANDAR DE ACIDO URICO ENZIMATICO (8mg/dL)

Solución acuosa de ácido úrico, con estabilizadores y solubilizadores.
PRECAUCIONES: Para su uso diagnóstico In Vitro. Tome las precauciones

normales para el manejo de reactivos de laboratorio. Los reactivos contienen azida
de sodio que puede ser tóxico si se ingiere.
El reactivo y el estándar están listos para su uso.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO Y EL ESTANDAR.
El reactivo de ácido úrico y el estándar son estables, hasta la fecha de caducidad

indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-
8ºC, protegidos de la luz. Una vez abierto evite su contaminación. NO
CONGELAR. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Con el tiempo el
57
reactivo puede tomar un color rosado que no afecta los resultados. Llevar los
reactivos a temperatura ambiente antes de usarse.
NOTA: Para prevenir la contaminación del reactivo enzimático, coloque dentro de

un frasco por separado un volumen ligeramente mayor al requerido. No regrese la
porción no utilizada al frasco original.
MATERIAL ADICIONAL.
-Cronómetro.

Se recomienda utilizar suero o plasma con heparina o EDTA. Evite la hemólisis.
Una orina de 24 h debe colectarse añadiendo 10 mL de NaOH al 5% para prevenir
la precipitación del ácido úrico. Si está turbio, una parte bien mezclada debe
calentarse a 60°C por 10 min para disolver los uratos precipitados. Diluir la orina
1:10 (1+9) con agua destilada. La orina así diluida se analiza y el resultado se
multiplica por el factor de 10.
ESTABILIDAD DE LA MUESTRA.
El ácido úrico en suero, plasma u orina se reporta estable por 2 o 3 días a
temperatura ambiente (15-30°C), de 3-7 días a temperatura de refrigeración (2-
8°C) y de 6-12 meses cuando se congela. La orina debe refrigerarse para evitar el
crecimiento bacteriano.
Niveles hemoglobina por arriba de 100 mg/dL y de bilirrubinas por arriba de 20
mg/dL afectan los resultados. El ácido ascórbico puede dar falsos resultados bajos
58
de ácido úrico. En tanto que las muestras que presentan lipemia dan resultados
falsos elevados. Evite el formaldehído.
PROCEDIMIENTO.
PARAMETROS.
Temperatura 37 ºC
Dirección de reacción Incremento.
Linealidad 20 mg/dL
pH 7.5 ± 1.0
Estándar 8.0 mg/dL
Límite de absorción del blanco 0.090A
Máxima absorbencia 0.700

Reactivo (mL) 1.0 1.0 1.0
Muestra (µL) --- --- 20
3. Mezclar e incubar a 37 °C por 5 minutos.

4. Ajustar el espectrofotómetro a cero a 520 nm frente a blanco de reactivos.
59
5. Leer y anotar la absorbencia de la muestra y el estándar de 15 minutos.
CONTROL DE CALIDAD.
Se deben de incluir dos sueros control con niveles de ácido úrico conocidos,
determinados por este método o por cualquier otro método en cada serie de
pruebas. Se recomienda el uso de Suero Control Normal Ser-T-F y I y Suero
RESULTADOS.
Calcule los resultados usando la siguiente ecuación:
Ácido úrico en suero o plasma (mg/dL)= (AM) X 8

(AE)
Donde AM y AE son las absorbencias de la muestra y el estándar,
respectivamente y 8 es la concentración del estándar (mg/dL).
Ácido úrico en orina (mg/dL)= (AM) X 80

(AE)
Donde AM y AE son las absorbencias de la muestra y el estándar,
respectivamente y 80 es la multiplicación de la por el factor de dilución de la orina
(1+9) 10.
Suero o plasma: Hombres: 3.5 - 7.0 mg/dL
Mujeres: 2.5 – 5.0 mg/dL
Orina: 0.5-1.0 g/día

(Dependiente del contenido de purinas en la dieta)
60
CARACTERISTICAS:
REPRODUCIBILIDAD.
Se realizó un estudio de suero control normal (media=4.5 mg/dL) y con control
anormal (media=8.6 mg/dL) los cuales fueron determinadas 5 veces en 5 días
consecutivos. El CV intraensayo fue de 2.8% y 1.6% y el interensayo de 3.4% y
3.8 % respectivamente.
COMPARACION.
La determinación de ácido úrico por el procedimiento aquí descrito (y) y por el
método de referencia de acetaldehído-deshidrogenasa-UV (x) en 49 sueros
(intervalo de 2.5-11.4 mg/dL) mostró un coeficiente de correlación (r) de 0.982 y
una pendiente de y= 1.001 x + 0.4.
LINEARIDAD
Este método tal y como se describe es lineal de 0-20 mg/dL.
ACIDO URICO. (METODO ENZIMATICO-COLORIMETRICO DE PUNTO FINAL

EN SUERO Y ORINA). MARCA HYCEL.
FINALIDAD.
Este reactivo se usa para la determinación cuantitativa in vitro de acido úrico en

orina y suero humano.
El ácido úrico es un metabolito de las purinas, de los ácidos nucleicos y de las
nucleoproteínas y por consiguiente los niveles anormales indican un desorden en
el metabolismo de estas moléculas. La hiperuricemia se puede presentar en
enfermedades como disfunciones renales, gota, leucemia, policitemia
aterosclerósis, diabetes, hipotiroidismo o en algunas enfermedades genéticas. Los
niveles bajos se presentan en la enfermedad de Wilson.
61
METODOLOGIA
Este reactivo se basa en los métodos de Trivedi y Kabasakalian con una

modificación de la prueba de peroxidasas de Trinder, usando ácido 2-4-6 Tribromo
hidroxibenzoico (TBHB).
La serie de reacciones involucradas en el sistema son:
URICASA
1. Ácido úrico + O2 + H2O Alanotoína + CO2 + H2O2
PEROXIDASA
2. H2O2 + 4AAP* + TBHB quinoneimina + H2O

ácido úrico en la muestra.
EL EQUIPO CONTIENE.
Reactivo de ácido úrico. 1 x 100 mL

Estándar de ácido úrico 6.0 mg/dL 1 x 5 mL
COMPOSICION DEL REACITVO.
*4-aminoantipirina 0.5 mmol/L

TBHB 1.75 mmol/L
Uricasa (Bacillus sp) >120 U/L
Peroxidasa (rábano picante) >500 U/L
Regulador de Tris 50 mmol/L
62
PREPARACION DEL REACTIVO
El reactivo se encuentra listo para usarse.
El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta cuando

se almacena en refrigeración.
RECOLECCION DE LA MUESTRA.
SUERO O PLASMA
Se obtiene por punción venosa para obtener suero o con EDTA cuando se
obtiene plasma sin hemolizar.
ORINA.
Es recomendable que se agregue 15 mL de NaOH 2 M al recipiente recolector

de la muestra, antes de esto registrar el pH, el cual si es menor de 8.0 debe ser
ajustado con NaOH. Se debe realizar una dilución 1:10 de orina. No olvidar al final
de la prueba multiplicar por el factor de dilución.
ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA.
Las muestras de suero son estables por lo menos 3 días a temperatura

ambiente y por lo menos 6 meses cuando se congelan.
EQUIPO ADICIONAL

63
METODOLOGIA
Estas instrucciones son para instrumentación manual, pero pueden ser

adaptadas para instrumentación automatizada.
PARAMETROS.
Temperatura 37 ºC
Longitud de onda primaria 520 nm
Tipo de ensayo Punto final
Dirección Ascendente
Relación muestra reactivo 1:50
Tiempo de incubación 5 min
Linealidad 0.5 -25.2 mg/dL
PROCEDIMIENTO.
1. El reactivo de trabajo y las muestras deberán de estar a temperatura ambiente

al momento de realizar la prueba.
2. Pipetear en tubos de ensayo el reactivo de ácido úrico y preincubar a 37 ºC
Blanco Estándar Muestra

Reactivo de ácido 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
úrico
Agua destilada 20 µL ------ -----
Estándar ----- 20 µL -----
Muestra ----- ----- 20 µL
64
3. Añadir la muestra, mezclar e incubar por 5 min.
4. Leer la absorbencia a 520 nm.
CALCULOS.
Los resultados son calculados normalmente de manera automática por el

instrumento de la siguiente manera.
Ácido úrico = Absorbencia de la muestra X Concentración del estándar

Absorbencia de la muestra
NOTAS.
1. Los volúmenes de reactivo y muestra pueden modificarse proporcionalmente a

otros requerimientos espectrofotométricos.
2. El color desarrollado es estable por 15 minutos.
3. Las muestras con concentraciones mayores de 25.2 mg/dL deben diluirse con
solución salina fisiológica y volverse a analizar. Multiplicar los resultados por el
factor de dilución.
MUJERES 2.5 – 5.0 mg/dL

HOMBRES 3.5 – 7.0 mg/dL
ORINA 250-750 mg/dL
LINEARIDAD
0.5 – 25.2 mg/dL
65
BIBILIOGRAFIA

Estados Unidos.

66
C) CREATININA
El músculo es un tejido que requiere mucha energía, por lo que posee dos
sistemas enzimáticos importantes para la correcta contracción muscular, el
catalizado por la adenilato ciclasa y el de la creatin fosfocinasa, en éste último
sistema enzimático se genera la creatina muscular que a su vez se transforma en
creatinina.
En el hombre se producen diariamente en forma constante 2 gramos de
creatinina a partir de una fuente común endógena de fosfato de creatina y
creatina, la cual permanece constante tanto en dietas extremas como en
condiciones fisiopatológicas; cuando hay una pérdida de creatinina ésta es
repuesta en el mismo porcentaje por biosíntesis endógena o a través de la dieta.
La concentración de creatinina sérica es proporcional a la masa muscular, por lo
cual la concentración normal es más baja en la mujer que en el hombre.
La determinación de creatinina sérica tiene gran importancia clínica debido a que
es un producto final controlado del metabolismo de creatina, en mamíferos la
creatinina no puede ser metabolizado nuevamente por lo que se excreta a través
de riñón. Debido a ello su concentración en suero y su excreción en la orina son
menos influenciados por los cambios de dieta, por lo cual es un índice más exacto
de la filtración glomerular lo que constituye una medida directa de la función renal.
OBJETIVO.
El alumno determinará creatinina en suero, plasma u orina mediante la

metodología descrita por Spinreact.
CREATININA-J (JAFFE. COLORIMETRICO-CINÉTICO). SPINREACT.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE CREATININA.
67
El ensayo de la creatinina está basado en la reacción de la creatinina con el

picrato alcalino descrito por Jaffe.
La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo rojizo. El
intervalo de tiempo escogido para las lecturas permite eliminar gran parte de las
interferencias conocidas del método. La intensidad del color formado es
proporcional a la concentración de creatinina en la muestra ensayada.
La creatinina es el resultado de la degradación de la creatina, componente de los

músculos y puede ser transformada en ATP, fuente de energía de las células.
La producción de creatinina depende de la masa muscular. Varía poco y los
niveles suelen ser muy estables.
Se elimina a través del riñón. En una insuficiencia renal progresiva hay una
retención en sangre de urea, creatinina y ácido úrico.
Niveles altos de creatinina son indicativos de patología renal.
de laboratorio.
REACTIVOS.
R1 Ácido pícrico 17.5 mmol/L

Reactivo Pícrico
R2 Hidróxido de sodio 0.29 mol/L
Reactivo alcalinizante
CREATININA CAL Patrón primario acuoso de Creatinina
2 mg/dL
68
PRECAUCIONES.
PREPARACION.
Reactivo de Trabajo (RT). Mezclar volúmenes iguales de R1 (Reactivo Pícrico) y

R2 (Reactivo alcalinizante).
Estabilidad del reactivo: 10 días a 15-25ºC.
fecha indicada.
CREATININE CAL.
-Absorbencia (A) del blanco a 492 nm ≥ 1.80.
MATERIAL ADICIONAL
69
MUESTRAS
-Suero o plasma heparinizado.

Estabilidad de la creatinina: al menos 24 horas a 2-8ºC
-Orina: Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado

obtenido por 50 (factor de dilución).
La estabilidad de la creatinina:7 días a 2-8ºC.
PROCEDIMIENTO
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente al blanco de reactivo.

R 1 (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón (µL) -- 100 --
4. Mezclar y poner en marcha el cronómetro.

5. Leer la absorbencia (A1), al cabo de 30 segundos y al cabo de 90 segundos
(A2) de la adición de la muestra.
6. Calcular el incremento de la absorbencia ∆A=A2-A1.
Cálculos
(∆A) Muestra x 2 (Conc. Calibrador)= mg/dL de creatinina en la muestra
(∆A) Patrón
70
Factor de conversión: mg/dL x 88.4 = µmol/L.
CONTROL DE CALIDAD
Suero o plasma
Hombres: 0.7-1.4 mg/dL
Mujeres: 0.6-1.2 mg/dL
Orina:
Hombres: 15-25 mg/kg/24 horas
Mujeres: 8-18 mg/kg/24 horas

referencia.

71
PRESICIÓN

Media (mg/dL) 1.06 3.58 1.03 3.31
SD 0.22 0.06 0.04 0.06
CV(%) 2.07 1.54 3.97 1.75
Sensibilidad analítica: 1 mg/dL = ∆A 0.03/min.mg/dL.

Ecuación de la recta de regresión: y=0.975x+0.047
INTERFERENCIAS
Interfiere hemoglobina (1g/dl), Bilirrubina (55 mg/dL).
determinación de la creatinina.
NOTAS
BIBLIOGRAFIA.
1. Murray, R. L. Creatinine. Kaplan, A, et al Clin. Chem. The C.v. Mosby Co. St.
Louis. Toronto. Princeton 1984; 1261-1266 y 418.
72
EQUIPO PARA LA DETERMINACION DE CREATININA (METODO CINETICO)

MARCA TECO DIAGNOSTICS.
FINALIDAD.
El reactivo de creatinina se usa para la determinación de creatinina en suero

humano.
INTRODUCCION.
La creatinina, anhídrido de la creatina, es un producto de excreción que se forma

en el riñón por deshidratación espontánea. Una gran cantidad de creatinina se
encuentra en el músculo esquelético, el cual se encuentra como fosfato de
creatina y sirve como un almacén de compuestos de alta energía debido a que se
transforma en ATP. Las concentraciones de creatinina en suero y orina son
independientes de la dieta, estos niveles dependen exclusivamente de su
excreción por el riñón. Por tal motivo sus niveles altos son indicativos de la
deficiente funcionalidad de éste órgano. Este ensayo de creatinina se basa en la
reacción en presencia de picrato alcalino como se describió por Jaffe. Se han
realizado una serie de modificaciones a ésta reacción como es el ensayo cinético,
el cual es rápido, simple y se evita las interferencia como se desarrolla en éste
método.
FUNDAMENTO.
Álcali
Creatinina + Picrato de sodio Complejo de picrato-creatinina
73
(amarillo-naranja)
La creatinina reacciona con ácido pícrico en condiciones alcalinas para formar un

complejo colorido amarillo-naranja, el cual absorbe a 510 nm. La velocidad de
formación del color es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra.
REACTIVOS.
1. Reactivo ácido pícrico-creatina. Solución conteniendo 10 mM de ácido pícrico.

2. Reactivo de hidróxido de sodio-creatinina. Solución conteniendo 240 nM de
NaOH.
3. Estándar de creatinina (5mg/dL). Una solución conteniendo creatinina en HCl,
como conservador.
PRECAUCIONES.
1. Este reactivo es para diagnóstico in vitro únicamente.

2. El reactivo ácido pícrico creatinina es un agente fuertemente oxidante. Evitar
contacto con la piel
3. El reactivo de hidróxido de sodio-creatinina es un álcali fuerte.

Combinar volúmenes iguales del reactivo ácido pícrico-creatinina y de hidróxido de
sodio-creatinina y mezclar bien.
CONSERVACION Y ESTABILIDAD DEL REACTIVO.
1. Ambos reactivos se almacenan a temperatura ambiente (15-30°C).
2. La mezcla de reactivos es estable por alrededor de un mes a temperatura
ambiente, protegidos de la luz y si se evita su contaminación.
3. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Descartar los reactivos si
presentan turbidez o si los controles probados caen fuera de los valores
establecidos.
74
SUERO, PLASMA Y ORINA: Recolectarlo de la manera usual.
Almacenamiento: Las muestras de suero o plasma con creatinina, son estables
por 24 h a temperatura ambiente y varios días en refrigeración o meses si se
congela a -20°C, protegidas de evaporación y contaminación. Las muestras de
orina son estables con 15 g de ácido bórico por 24 h.
Un número de sustancias afectan la exactitud de la determinación de la creatinina.
Consultar la lista obtenida por Young et al.
Espectrofotómetro.
Micropipetas.
Cronómetro.
Temperatura 37 ºC
Volumen de reacción 1.050 mL
Cubeta 1 cm de paso de luz
PROCEDIMIENTO.

1. Marcar 3 tubos como B (Blanco), E (Estándar) y M (Muestra)
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente al blanco de reactivo a 510 nm.
3. Pipetear de acuerdo a los tubos marcados:
75
Reactivo de 1,0 1,0 1,0
trabajo (mL)
4. Mezclar y poner en marcha el cronómetro.

5. Leer y anotar la absorbencia (A1), al cabo de 30 segundos de haber adicionado
el patrón o la muestra.
6. Al cabo de 60 segundos después leer y anotar la absorbencia (A2) de la adición
de la muestra o el estándar.
7. Calcular el incremento de la absorbencia después de 60 segundos ∆A=A1-A2.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL.

El color de la reacción final es estable por 12 horas, por lo que la absorbencia
debe ser leída en ese intervalo.
CALCULOS.
SUERO O PLASMA
Los valores de creatinina se derivan de la comparación del cambio de absorbencia
(DA) de la muestra (M) con la del estándar (E):
Creatinina en suero (mg/dL)= (DAM) X 5

(DAE)
Donde AM y AE son los cambios de absorbencia (incrementos) de la muestra y del
estándar, respectivamente y 5 es la concentración del estándar (mg/dL)
Creatinina en suero (mg/dL)= (0.020) X 5 = 2

(0.050)
76
LIMITACIONES.
La albúmina en una concentración de 10 mg/dL contribuye a un aumento de 0.2

mg/dL al valor de creatinina, hemólisis moderada (0.2mg/dL Hb), muestras
fuertemente ictéricas o lipémicas producen valores muy elevados. El acetoacetato
por arriba de 10 mg/dL interfiere con los resultados.
CALIBRACION.
Se recomienda el uso de estándares acuosos.
CONTROL DE CALIDAD.
La integridad de la reacción debe ser monitoreada usando controles séricos
normal y anormal con valores de creatinina conocidos.
Suero o plasma:
HOMBRE: Hasta 1.4 mg/dL
MUJER: Hasta 1.2 mg/dL

CARACTERISTICAS:
LINEARIDAD
Este método es lineal hasta 25 mg/dL.
COMPARACION.
En un estudio realizado entre este procedimiento y una cinética similar produjeron
un coeficiente de correlación de 0.99 con una ecuación de regresión de y=0.96x
77
+0.06. Los sueros control y las muestras de creatinina determinadas estuvieron
entre el intervalo de 0.9 a 8.3 mg/dL.
PRECISION:
La precisión intraensayo se realizó mediante 20 ensayos con tres diferentes

niveles de sueros controles comerciales. Los valores de precisión total se
obtuvieron por el ensayo de tres controles comerciales por 5 días consecutivos.
INTRASERIE
MEDIA SD CV
1.9 0.05 2.6
8.2 0.6 7.3
INTERSERIE
MEDIA SD CV
2.0 0.2 10.0
8.2 0.4 4.6
CREATININA DIRECTA LIQUICOLOR (PARA DE LA DETERMINACION

CINETICA CUANTITATIVA DE CREATININA EN SUERO U ORINA) MARCA
STANBIO-LICON.
En 1886 Jaffe describe un método para la determinación de creatinina haciendo

reaccionar un filtrado libre de proteínas con ácido pícrico en una solución alcalina.
78
Aunque desde entonces se han descrito muchos métodos, la reacción clásica de
Jaffe es la más utilizada.
Esta reacción está sujeta a interferencias a causa de varias sustancias, como
proteínas y glucosa.
Para combatir esta desventaja se han desarrollado algunas modificaciones. Los
métodos cinéticos son los más utilizados por ser más rápidos, simples y sin
interferencias. El presente método se basa en una modificación de reacción de
Fabina y Eringshausen.
Álcali
Creatinina + Ácido Pícrico Complejo de picrato-creatinina
(amarillo-naranja)
La creatinina reacciona con ácido pícrico en condiciones alcalinas para formar un

complejo colorido amarillo-naranja, el cual absorbe a 510 nm. La velocidad de
formación del color es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra.
REACTIVOS.
Creatinina Ácida.
Solución acuosa de ácido pícrico, 3.6 mmol/L.
Creatinina Base
Solución acuosa de NaOH, 240 mmol/L
Estándar de Creatinina 5 mg/dL.

Solución acuosa de creatinina con cloruro de zinc, 5.0 mg/dL
PRECAUCIONES.
1. Este reactivo es para diagnóstico in vitro únicamente.
79
2. El reactivo ácido pícrico es un agente fuertemente oxidante. Evitar contacto con
la piel. Limpie cualquier salpicadura ya que el ácido pícrico seco es explosivo.
3. El reactivo de hidróxido de sodio es un álcali fuerte que debe manejarse con
cuidado por ser cáustico.

Mezcle una parte del reactivo creatinina ácida (ácido pícrico) y una parte del
reactivo creatinina base (hidróxido de sodio) para preparar el “Reactivo de
Trabajo”. Mezclar bien. El estándar y el reactivo de trabajo están listos para
usarse.

Los frascos de reactivo y el estándar de creatinina sin abrir son estables a
temperatura ambiente (15-30°C) hasta su fecha de caducidad.
La mezcla de reactivos es estable por alrededor de un mes a temperatura

ambiente, protegidos de la luz y si se evita su contaminación.
No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Descartar los reactivos si presentan

turbidez o si los controles probados caen fuera de los valores establecidos.
No utilice los reactivos si estos están turbios.

Espectrofotómetro.
Micropipetas.
Cronómetro.
Agitador.
RECOLECCION Y MANEJO DE LA MUESTRA.
80
SUERO.
Separar rápidamente el suero del coágulo para prevenir la hemólisis.
ORINA.
Recolecte la orina de 24 h, diluya la muestra 1:20 con agua destilada y mezcle
bien.
La creatinina sérica es estable por 24 h si se almacena entre 2-8°C y por varios
meses -20°C, en recipientes bien cerrados y protegidas de evaporación y
contaminación. Las muestras de orina deben conservarse añadiendo 15 g de
ácido bórico. La orina es estable de 4-7 días a temperatura ambiente.
Un número de sustancias afectan la exactitud de la determinación de la creatinina.
Consultar la lista obtenida por Young et al.
Espectrofotómetro.
Micropipetas.
Cronómetro.

Tipo de reacción Cinética
Dirección de la reacción Incremento
Temperatura de reacción. 37 ºC
81
Límite de absorbencia del blanco >0.200
Linealidad 20 mg7dL
pH 12.4±1.0
Valor del estándar 5 mg/dL
PROCEDIMIENTO.
1. Marque 3 tubos como estándar, muestra y controles.
2. Lleve a cero el espectrofotómetro con un blanco de agua a 510 nm.
3. Pipetee 1 mL del reactivo de trabajo en cada tubo de ensaye y preincube por 3
min a 37°C
4. Transfiera 0.05 mL (50µL) del estándar en el tubo correspondiente, mezcle
inmediatamente y pase a una celda.
5. Transcurrido exactamente 20 segundos, lea y registre la absorbencia (A1).
6. Exactamente a los 60 segundos después de la lectura inicial lea y registre la
absorbencia final (A2).
7. Calcule el cambio de absorbencias DA restando (A2 - A1).
8. Corra los controles y las muestras de los pacientes como se indica en los pasos
del 1-7.
CONTROL DE CALIDAD.
Incluya en cada corrida de muestras un suero control y/o orina con valores
conocidos analizados por este método.
RESULTADOS.
Los valores resultan de comparar el cambio de absorbencia (DA) de la muestra
(M) con el estándar (E) tratado de forma idéntica.
82
Creatinina en suero (mg/dL)= (DAM) X 5
(DAE)
Donde AM y AE son los cambios de absorbencia (incrementos) de la muestra y del
estándar, respectivamente y 5 es la concentración del estándar (mg/dL)

Creatinina en suero (mg/dL)= (0.020) X 5 = 2
(0.050)
Creatinina urinaria (mg/dL)= (DAu) X 5X20 (Factor de dilución)

(DAE)
Creatinina urinaria (mg/L)= Creatinina urinaria (mg/dL) X 10
Creatinina urinaria (mg/L/24h)= Creatinina urinaria (mg/dL) X 24h (mL)

1000
Hombres (Suero) 0.9-1.5 mg/dL

(Orina) 1000-2000 mg/24h
Mujeres (Suero) 0.7-1.4 mg/dL

(Orina) 600-1500 mg/24h
CARACTERISTICAS DE FUNCIONAMIENTO.
LINEALIDAD
Hasta 20 mg/dL. Muestras que excedan de estos valores deberán diluirse al doble
con solución salina, repetir el ensayo y multiplicar el ensayo por 2.
CORRELACION.
Muestras de suero y control (n=38) con valores de creatinina entre 0.6-25 mg/dL
fueron analizados por el método aquí descrito y por otro procedimiento cinético
83
similar. El análisis estadístico reveló un coeficiente de correlación (r) de 0.998, con
una ecuación de regresión de y= 0.96x + 0.046.
PRECISION.
INTRASERIE
MEDIA SD CV
0.9 0.08 4.0
8.6 0.09 2.1
INTERSERIE
MEDIA SD CV
1.1 0.08 4.8
8.4 0.16 2.6
EXACTITUD.
Se analizaron muestras de suero y/o control con valores de creatinina entre 0.6-
2.0 mg/dL por el método descrito y por el procedimiento cinético.
SENSIBILIDAD.
Basada en la resolución del instrumento de A=0.001, el método presentado
muestra una sensibilidad de 0.16 mg/dL.
CREATININA (METODO COLORIMETRICO EN SUERO, PLASMA Y ORINA).

MARCA HYCEL.
FINALIDAD.
Para la determinación cuantitativa de creatinina en suero, plasma y orina.
FUNDAMENTO.
84
La determinación se basa en la reacción de Jaffe. En medio alcalino, la
creatinina y otros cromógenos presentes en el plasma y suero reaccionan con el
ión picrato dando un complejo de color amarillo-rojizo. En estas condiciones , la
formación del complejo colorido creatinina picrato es máxima, cuantificándose
fotométricamente.
PRINCIPIO
Álcali
Creatinina + Picrato de sodio Creatinina-Complejo de picrato
(amarillo-naranja)
REACTIVOS.
1. Desproteinizante 1 x 100 mL
2. Ácido pícrico 0.040 M 1 x 100 mL
3. Hidroxido de sodio 0.75 M 1 x 100 mL
4. Estándar de creatinina 2 mg/dL 1 x 20 mL
PREPARACION DE LOS REACTIVOS.

El reactivo se encuentra listo para usarse.
El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta cuando
se almacena en refrigeración.
SUERO O PLASMA
Se obtiene por punción venosa para obtener suero o con EDTA cuando se
obtiene plasma sin hemolizar. El paciente debe encontrarse en ayuno.
85
ORINA.
Se debe recolectar orina de 24 h (eliminando la primera del día e incluyendo la
primera del día siguiente).
ALMACENAMIENTO.
Las muestras de suero son estables por lo menos 3 días a temperatura
ambiente y por lo menos 6 meses cuando se congelan.
EQUIPO ADICIONAL
PROCEDIMIENTO
PARAMETROS.
Volumen de muestra 1 mLl
Volumen de reactivos 3 mL
Temperatura 25 ºC
Linearidad 0.5 10 mg/dL
SUERO Y PLASMA
DESPROTEINIZACION. 8 mL de agua + 1 mL de desproteinizante + 1 mL de
muestra.
Mezclar y centrifugar a 2500 rpm/5 min, separar el sobrenadante libre de
proteínas.
86
Preparar la siguiente serie de tubos de ensaye limpios y secos:
Agua destilada 3.0 mL 2.7 mL -----
Estándar ----- 0.3 mL -----
Muestra (filtrado) ----- ----- 3 mL
Ácido pícrico 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
NaOH 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Reposar por 20 min a temperatura ambiente y leer a 520 nm ajustando a cero de
absorbencia con el blanco. La reacción es estable por 30 minutos.
Para la determinación con orina se recomienda trabajar con una dilución 1:100
utilizando la metodología anteriormente plantada. Al final del análisis multiplicar
por el factor de dilución realizado.
CALCULOS.
Los resultados son calculados normalmente de manera automática por el
instrumento de la siguiente manera.
Creatinina en mg/dL= Absorbencia de la muestra X Concentración del estándar

Absorbencia de la muestra
Para determinar el valor de creatinina en mg/24 h: Multiplicar creatinina en mg/dL
x el volumen de orina de 24 h en mL / 100
Hombres hasta 1.4 mg/dL
Mujeres hasta 1.2mg/dL
LINEARIDAD.
La reacción es lineal hasta 10 mg/dL, valores mayores de esta concentración
diluir la muestra con solución salina fisiológica y realizar la misma metodología
multiplicando al final el valor obtenido por el factor de dilución realizado.
87
BIBLIOGRAFIA
2. Voet, D y Voet, J. G. (1995) Biochemistry. 2a. ed. Ed. John Wiley and Sons. Inc.
Estados Unidos.
88
2.3 METABOLISMO DE LIPIDOS.
A) DETERMINACION DE COLESTEROL
INTRODUCCION
Se han descrito una infinidad de metodologías para la determinación de
colesterol, sin embargo, los métodos fotométricos son los más utilizados. Al igual
que otros esteroides el colesterol produce colores intensos cuando se trata con
reactivos ácidos. Liebermann en 1885 describió la reacción del colesterol con el
ácido sulfúrico y el anhídrido acético. Burchard describió esta reacción en
cloroformo. A partir de entonces se han publicado una variedad de técnicas
basadas en la metodología descrita por estos investigadores.
El estudio de los niveles de colesterol sérico ha sido asociado a través de
estudios de población con diversos padecimientos como el infarto al miocardio, la
hipertensión arterial, el hipotioridismo, la Diabetes mellitas, la gota y desde luego
la arteriosclerosis.
Pueden encontrarse niveles aumentados (hipercolesterolemia) en condiciones
fisiológicas como el embarazo, la lactancia y debido a dietas ricas en grasa de tipo
animal.
Valores disminuidos de colesterol sérico (hipocolesterolemia) se encuentran en
la desnutrición, la insuficiencia hepática, el hipertioridismo, algunas enfermedades
hepáticas e insuficiencia corticosuprarrenal (enfermedad de Addisson) y en el
tratamiento con insulina y ACTH.
COLESTEROL. (ENZIMATICO CHOD-POP). SPINREACT.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE COLESTEROL (TEST ENZIMATICO-

COLORIMETRICO).
89
La colesterol esterasa (CHE) hidroliza los ésteres de colesterol presentes en la
muestra dando colesterol libre y ácidos grasos, una posterior oxidación enzimática
por la colesterol oxidasa (CHOD)formando peróxido de hidrógeno (H2O2) y
colesterona . El H2O2 se valora por la reacción de Trinder, mediante la pressencia
de fenol y 4-aminofenazona (4-AF) en presencia de peroxidasa (POD) formando
una quinoneimina un complejo rojizo, que es proporcional a la concentración de
colesterol presente en la muestra.
CHE
1. Esteres de colesterol + H2O Colesterol + ácidos grasos
CHOD
2. Colesterol + O2 4-Colesterona + H2O2
POD
3. H2O2 + 4AF + Fenol Quinoneimina + H2O

colesterol en la muestra.
REACTIVOS.
Reactivo 1 Pipes pH 6.9 50 mmol/L

Tampón Fenol 26 mmol/L
Reactivo 2 Peroxidasa 1250 U/L

Enzimas Colesterol esterasa 300U/L
Colesterol oxidasa 300U/L
4- Aminofenazona 0.4 mmol/L
ESTANDAR Patrón primario de colesterol 200 mg/dL
PRECAUCIONES.
90
PREPARACION.
Reactivo de trabajo (RT) Disolver con agitación suave, el contenido del vial de
enzima R2 con un poco de regulador R1.Una vez disuelto el liofilizado regresar al
frasco original de tampón, homogeneizar la solución. Esta solución es estable 4
meses en refrigeración o 40 días a temperatura ambiente y protegido de la luz.
fecha indicada.
ESTANDAR DE COLESTEROL.
INDICADORES DE DETERIORO DE LOS REACTIVOS.

-Absorbencia (A) del Blanco a 505 nm ³ 0.1.
MATERIAL ADICIONAL
MUESTRAS
-Suero o plasma heparinizado o con EDTA.
Estabilidad del colesterol de 3-5 días a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC
PROCEDIMIENTO
91
Blanco Estándar o Patrón Muestra

Muestra(µL) -- -- 10
Reactivo de 1,0 1,0 1,0
trabajo (mL)

5. Leer la absorbancia (A) de 505 nm del patrón y la muestra, frente al blanco de
reactivo. El color es estable como mínimo 60 minutos.
Cálculos
Suero o plasma.
(A) Muestra x 200 (Conc. Calibrador)= mg/dL de Colesterol en la muestra

(A) Patrón
CONTROL DE CALIDAD
Suero o plasma:
92
Evaluación del riesgo.
Menos de 200 mg/dL NORMAL
Valores sospechosos a partir de 220 mg/dL MODERADO
Elevados a partir de 260 mg/dL ALTO
referencia.

Intervalo de medida: Desde el límite de detección de 0.6 mg/dL hasta el límite de
PRECISION.
Media (mg/dL) 90.1 175 90.4 175
SD 0.64 1.16 1.12 1.84
CV(%) 0.71 0.67 1.24 1.10
Sensibilidad analítica: 1 mg/dL = 0.002A

Ecuación de la recta de regresión: y=1.004x+0.931
INTERFERENCIAS.
No se han observado interferencias de hemoglobina hasta 5 g/L y bilirrubina hasta
10 mg/dL.
No interfieren en el ensayo los siguientes compuestos y concentraciones:
93
Acido úrico 1.5 mmol/L Glucosa 28 mmol/L
Acido salicílico 3.6 mmol/L Cafeína 52 µmol/L
Paracetamol 0.66 mmol/L Nicotina 0.16 mmol/L
Fenobarbital 0.4 mmol/L Cortisona 5 mmol/L
NOTAS
STANBIO COLESTEROL LIQUICOLOR (PARA DE LA DETERMINACION

CUANTITATIVA-ENZIMATICA-COLORIMETRICA DE COLESTEROL TOTAL Y
COLESTEROL HDL EN SUERO O PLASMA). MARCA STANBIO LICON.
El método enzimático para colesterol fue introducido en 1973 por Flegg y
Richmond utilizando colesterol oxidasa de origen bacteriano seguida de
saponificación química de los ésteres de colesterol. Roeschlau modificó esta
técnica y Allain y col. Publicaron los primeros ensayos enzimáticos completos,
combinando colesterol oxidasa y colesterol esterasa. Este método se basa en el
de Allain y utiliza estas enzimas en combinación con el reactivo peroxidasa/fenol-
4-antipirina, de Trinder.
La colesterol esterasa (CE) hidroliza los ésteres para originar colesterol libre y
ácidos grasos. El colesterol libre así producido más el colesterol preformado se
oxidan en presencia de colesterol oxidasa (COx) para dar colest-4-en-ona y
peróxido de hidrógeno. Un cromógeno quinoneimida, con absorción máxima de
500 nm, se produce cuando el fenol se acopla oxidativamente con 4-
aminofenazona, en presencia de peroxidasa (POD) con peróxido de hidrógeno. La
intensidad de color rojo final es proporcional a la concentración total de colesterol.
94
CE
1. Esteres de colesterol + H2O Colesterol + ácidos grasos
COx
2. Colesterol + O2 Colest-4-en-3ona + H2O2
POD
3. H2O2 + 4aminofenazona + Fenol Quinoneimina + 2 H2O
El reactivo de precipitación stanbio de lipoproteínas de alta densidad (HDL) debe

adquirirse por separado.
REACTIVOS.
Colesterol enzimático (Líquido).

El reactivo contiene los siguientes ingredientes activos a esta concentración.
4-Aminofenazona 0.025 mmol/L
Fenol 25.0 mmol/L
Peroxidasa >5.0 U/mL
Colesterol esterasa >0.15 U/mL
Colesterol oxidasa >0.2 U/mL
Reguladores y estabilizadores.
Estándar de Colesterol 200 mg/dL.

Solución acuosa de colesterol con estabilizadores surfactantes y conservadores.
PRECAUCIONES.
Este reactivo es para diagnóstico in vitro únicamente.

El reactivo y el estándar están listos para su uso.

El reactivo y el estándar sin abrir son estables a temperatura ambiente (15-30°C)
hasta su fecha de caducidad.
95
El reactivo y el estándar son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos
de la luz. Una vez abierto evite su contaminación. NO CONGELAR. No usar
reactivos fuera de la fecha indicada. Con el tiempo el reactivo puede tomar un
color rosado que no afecta los resultados. Llevar los reactivos a temperatura
ambiente antes de usarse. Descartar el reactivo si la absorbencia contra el blanco
es superior a 0.3 a 500 nm.
NOTA: Para prevenir la contaminación del reactivo enzimático, coloque dentro de

un frasco por separado un volumen ligeramente mayor al requerido. No regrese la
porción no utilizada al frasco original.
MATERIAL ADICIONAL.
-Cronómetro.

La sangre debe ser colectada seguida de 12 h de ayuno. La muestra puede ser
suero o plasma con EDTA como anticoagulante. Evite la hemólisis.
El colesterol total y el colesterol HDL se reportan estables por 4 días a
temperatura refrigeración (2-8°C) y cuando se congela a -20°C alcanzan una
mayor estabilidad, por 3 meses el total y 7-14 días para el HDL. De ser posible las
muestras deben separarse y analizarse el mismo día de su extracción.
96
Los anticoagulantes como fluoruros y oxalatos dan valores bajos falsos. La prueba
no interfiere con niveles hemoglobina de hasta 200 mg/dL y de bilirrubinas de
hasta 10 mg/dL. Sin embargo, muestras muy ictéricas y hemolizadas se pueden
corregir usando un blanco de suero o plasma.

Tipo de reacción Punto final
Límite de absorbencia del blanco 0.30
Máxima absorbencia 2.000A
Linearidad 750 mg/dL
pH 7.3 1.0
PROCEDIMIENTO.

2. Pipetear de acuerdo a los tubos marcados como se muestra en la tabla:

Reactivo (mL) 1,0 1,0 1,0
97
3. Mezcle e incube a 37°C por 5 min o 10 a temperatura ambiente.
4. Lleve a cero el espectrofotómetro con el blanco a 500 nm. Lea y anote las
lecturas obtenidos de los tubos marcados como estándar y muestra antes de 60
minutos.
CONTROL DE CALIDAD.
Utilice un suero control o un pool de sueros, previamente analizados y divididos en
alícuotas congeladas e incluya en cada corrida de muestras un suero control o el
pool de sueros con valores conocidos analizados por este método.
RESULTADOS.
Los valores resultan de la siguiente ecuación:
Colesterol total en suero (mg/dL)= (AM) X 200

(AE)
Donde AM y AE son las absorbencias de la muestra y del estándar,
respectivamente y 200 es la concentración del estándar (mg/dL)
Cuando se requiera de un blanco del suero (muestra ictérica o hemolizada) incluya

otro tubo como blanco del suero (BS). Añada 1 mL de solución salina 0.01 mL del
suero, mezcle por inversión, transfiera a la celda y lea la absorbencia contra agua
destilada a 500 nm. Use estos valores para corregir los de la muestra como sigue:
Colesterol total sérico (mg/dL)= AM-BS x 200

AE
NOTA: La muestra con valores de colesterol mayores a 750 mg/dL se diluyen 3

veces (1+2) con solución salina fisiológica, se repite el ensayo y el resultado se
multiplica por 3.
98
Los datos recientemente presentados muestran “intervalos normales” de acuerdo
a la edad para colesterol total y HDL y, como riesgo coronario de enfermedades
del corazón (CDH) para colesterol HDL expresados como un porcentaje del
colesterol total. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios
intervalos de valores esperados en vista de que existen diferencia entre
instrumentos, laboratorios y población local.
COLESTEROL TOTAL mg/dL

Cordón 45-100
Recién nacido 53-135
Infante 70-175
Niños 120-200
Adolescentes 120-210
Adultos 140-310
Ideal para adultos 140-200
RIESGO DE CHH (HDL COMO % TOTAL)

Riesgo HOMBRE MUJER
Peligroso <7 <12
Alto 7-15 12-18
Medio 15-25 18-27
Medio Bajo 25-37
Probable protección >37 >40
COLESTEROL HDL
EDAD HOMBRE MUJER
0-14 30-65 30-65
15-19 30-65 30-70
20-29 30-70 30-75
30-39 30-70 30-80
>40 30-70 30-85
Media 45 55
Raza negra: aproximadamente 10 mg/dL más altos
REPRODUCIBILIDAD.
Se realizó un estudio de control (media=128 mg/dL) y un suero de pacientes
(media=367 mg/dL), el cual consistió en una serie de 5 ensayos durante 5 días
99
consecutivos. El coeficiente de variación (CV) del intraensayo de 2.5% y 1.0% y el
interensayo 3.5% y 2.9% respectivamente.
CORRELACION.
La determinación del colesterol por el procedimiento aquí descrito (y) y por el

Boeringer-Manheim “BMC Colesterol Monotest” (x) en 66 sueros (variación 125-
550 mg/dL) dio un coeficiente de correlación (r) de 0.991, con una ecuación de
regresión de y= 1.04x + 10.3
LINEALIDAD
Cuando se realiza como indica, el método es lineal de 0-750 mg/dL.
BIBLIOGRAFIA.
1. Schultz, A.Cholesterol. Kaplan, A, et al Clin. Chem. The C.v. Mosby Co. St.
Louis. Toronto. Princeton 1984; 1261-1266 y 418.
100
B) DETERMINACION DE TRIACILGLICEROLES.
INTRODUCCION.
Los lípidos se definen generalmente como una mezcla heterogénea de

compuestos insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos.
Los lípidos son transportados en el plasma y otros compartimentos
extracelulares en el organismo en forma de lipoproteínas.
Se ha desarrollado una amplia gama de métodos para medir los triglicéridos
plasmáticos, pero los más utilizados con fines clínicos son los basados en la
hidrólisis del triacilgicerol y la medición del glicerol o los ácidos grasos por
diferentes metodologías. De manera general, se puede considerar que existen tres
maneras para determinar los triacilgliceroles en el suero: calcular la concentración
por diferencia (triacilgliceroles = lípidos totales-fosfolípidos-colesterol total),
medirlos mediante un método nefelométrico o cuantificarlos con base a glicerol
derivado de ellos.
Una vez liberado el glicerol puede medirse mediante métodos químicos o
enzimáticos. Los resultados con los métodos químicos para la detección del
glicerol son muy exactos y precisos pero las manipulaciones y el tiempo necesario
para las reacciones los hacen poco prácticos, por lo que los métodos enzimáticos
los hace muy recomendables.
OBJETIVO: El alumno determinará de manera cuantitativa en muestras séricas

triacilgliceroles por el método de Hyce, Spinreact o Stanbio.
MARCA HYCEL
Los triacilgliceroles son una familia de lípidos que se absorben de la dieta y son
producidos en forma endógena a partir de los carbohidratos. Su cuantificación es
importante para el diagnóstico y el tratamiento de las hiperlipidemias. Estas
101
enfermedades, pueden ser de origen genético o secundario a otros desórdenes
como nefrosis, Diabetes mellitus y padecimientos endócrinos. El aumento de los
triglicéridos ha sido identificado como un factor de riesgo para la aterosclerosis.
La estimación de triglicéridos debe realizarse en sangre recolectada a parir de
un ayuno entre 10 y 12 h. Una variación en la estimación de triacilgliceroles a
variación biológica y analítica, por lo tanto antes de que se dé el diagnóstico se
recomienda que se tomen 3 muestras por lo menos una cada semana.
No se recomienda la recolección de la muestra en tubos lubricados con glicerol.
ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS.

Los triacilgliceroles son estables por 3 días a 4 ºC y por varias semanas a -20
ºC. Las muestras pueden ser almacenadas por periodos largos a -70 ºC
METODOLOGIA.
Este procedimiento se basa en el método de Wako y en las modificaciones de

McGowan y col. y Fossati y col.
Las reacciones involucradas en el sistema son:
LIPASA
1. Triacilgliceroles + H2O Glicerol + Ácidos grasos
GLICEROL CINASA
2. Glicerol + ATP Glicerol-3-Fosfato + ADP
GLICEROL FOSFATO OXIDASA

3. Glicerol-3-Fosfato + O2 DAP + H2O2
PEROXIDASA
4. H2O2 + *4AAP + **3,5-DHBS Quinoneimida
* 4-AMONIOANTIPIRINA
**3,5DICLORO-2-HIDROXIBENCEN-SULFONATO
102
CONTENIDO DEL EQUIPO.
Reactivo de triacilgliceroles 100 mL
Estándar de triacilgliceroles 200 mg/dL 5 mL

CONCENTRACION
ATP 2.5 mmol/L
Mg+2 2.5 mmol/L
4-aminoantipirina 0.8 mmol/L
3,5-DHBS 1.0 mmol/L
Peroxidasa >2000 UI/L
Glicerolcinasa (microbiana) >550 U/L
Glicerol fosfato oxidasa >8000 U/L
Lipoprotein lipasa (microbiana) >3500 U/L
Regulador 53 mmol/L

El reactivo se encuentra listo para ser usado.
El reactivo almacenado en refrigeración entre 2 y 8 ºC es estable hasta la fecha
de caducidad indicada en la etiqueta.
PARAMETROS.
Temperatura 37 ºC
Longitud de onda primaria 520 nm
Longitud de onda secundaria 660 nm
Relación muestra-reactivo 1:100
Tiempo de incubación 5 minutos
103
PROCEDIMIENTO.
1. El reactivo de trabajo y las muestras deberán estar a temperatura ambiente al
momento de realizar la prueba.
2. Pipetear en tubos de ensayo el reactivo de triglicéridos y preincubar a 37 ºC.
3. Seguir la tabla:

Reactivo de 1.0 mL 1.0 mL 1.0mL
triacilgliceroles
Agua destilada 10 µL ----- -----
Estándar ----- 10 µL -----
Muestra ----- ----- 10 µL
4. Añadir la muestra, mezclar e incubar durante 5 min.

5. Leer la absorbencia a 520 nm.
CALCULOS.
Triacilgliceroles= A de la muestra X Concentración del estándar

A del estándar
NOTAS:
1. Los volúmenes de reactivo y muestra pueden ser modificados

proporcionalmente a otros requerimientos espectrofotométricos.
2. El color desarrollado es estable durante 15 minutos a 37 ºC.
3. Las muestras con concentraciones de triacilgliceroles mayores de 885 mg/dL,
deben diluirse con solución salina y volverse a correr.
4. Multiplicar el resultado por el factor de dilución.
104
LIMITACIONES.
La contaminación con glicerol puede afectar esta prueba, lo cual puede resultar
en la clasificación de pacientes de estatus riesgoso.
Hombres 40-160 mg/dL
Mujeres 35-135 mg/dL
LINEARIDAD.
Cuando se trabaja como está indicado, el método es lineal hasta 885 mg/dL. Las
muestras con valores mayores a 885 mg/dL deben ser diluidos con solución salina
y repetir el ensayo. Multiplicar los resultados por el factor de dilución.
TRIGLICERIDOS LQ. GPO-POD. LIQUIDO MARCA SPINREACT.

(DETERMINACION CUANTITATIVA DE TRIGLICERIDOS)
PRINCIPIO DEL METODO.

Los triglicéridos incubados con lipoproteínlipasa (LPL) liberan glicerol y ácidos
grasos libres. El glicerol es fosforilado por la glicerolfosfato deshidrogenada (GPO)
y ATP en presencia de glicerol cinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato (G3P) y
adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona
fosfato (DAP) y peróxido de hidrógeno (H2O2) por GPO.
Al final el peróxido de hidrógeno (H2O2) reacciona con la 4-aminofenazona (4-AF)
y p-clorofenol reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloración
roja.
LPL
1. Triacilgliceroles + H2O Glicerol + Ácidos grasos
GLICEROL CINASA
2. Glicerol + ATP G3P + ADP
105
GPO
3. G3P + O2 DAP + H2O2
POD
4. H2O2 + 4AF + p-Clorofenol Quinoneimida + H2O
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de triglicéridos

presentes en la muestra ensayada.
Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula. Al igual que el
colesterol son transportados a las células del organismo por las lipoproteínas de la
sangre. Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los
niveles de triglicéridos.
Su aumento es relativamente inespecífico. Diversas dolencias, como ciertas
disfunciones hepáticas (cirrosis, hepatitis, obstrucción biliar) o Diabetes mellitus
pueden estar asociadas con su elevación.
de laboratorio.
REACTIVOS.
R GOOD pH 7.5 50 mmol/L

p-Clorofenol 2.0 mmol/L
Lipoprotein lipasa (LPL) 150000 U/L
Glicerolcinasa (GK) 500 U/L
Glicerol-3-fosfato oxidasa (GPO) 3500 U/L
4-aminofenazona (4AF) 0.1 mmol/L
Peroxidasa (POD) >2000 U/L
ATP 0.1 mmol/L
+2
Mg 2.5 mmol/L
TRIGLICERIDOS Calibrador primario de triglicéridos 200 mg/dL

CAL
106
PREPARACION.
El reactivo y el calibrador están listos para su uso.
fecha indicada.
ESTANDAR DE TRIGLICERIDOS (TRIGLICERIDOS CAL).

-Presencia de partículas y turbidez son indicativos de contaminación.
-Absorbencia (A) del Blanco a 505 nm ³ 0.40.
MATERIAL ADICIONAL
MUESTRAS
-Suero o plasma heparinizado o con EDTA.
Estabilidad de la muestra: 5 días de 2-8ºC o 3 meses a -20ºC
PROCEDIMIENTO
107

R (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón (µL) -- 10
Muestra(µL) -- -- 10

5. Leer la absorbencia (A) de 505 nm del patrón y la muestra, frente al blanco de
reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.
Cálculos
Suero o plasma.
(A) Muestra x 200 (Conc. Calibrador)= mg/dL de Triglicéridos en la muestra

(A) Patrón
CONTROL DE CALIDAD
Suero o plasma:
Hasta 170 mg/dL
Estos valores son orientadores. Es recomendable que cada laboratorio establezca

108
Intervalo de medida: Desde el límite de detección de 5.85 mg/dL hasta el límite de

PRECISION.
Media (mg/dL) 123 205 124 204
SD 3.08 1.63 4.89 4.28
CV(%) 2.49 0.79 3.92 2.09
Sensibilidad analítica: 1 mg/dL = 0.011A

INTERFERENCIAS.
No se han observado interferencias de hemoglobina <10 g/L y bilirrubina <170
µmol/L.
NOTAS
1. LCF (Lipid Clearing Factor) está integrado en el reactivo.
4. SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de este
reactivo en distintos analizadores.
109
STANBIO TRIGLICERIDOS LIQUICOLOR GPO-PAP (PARA LA
DETERMINACION CUANTITATIVA-COLORIMETRICA ENZIMATICA DE
TRIGLICERIDOS EN SUERO O PLASMA
La determinación de los niveles de triglicéridos, cuando se lleva a cabo en

conjunto con otros ensayos de lípidos, proporciona una ayuda en el diagnóstico de
hiperlipoproteinemia primaria y secundaria. También es útil para dar seguimiento a
la diabetes mellitas, nefrósis, obstrucción biliar y varias anormalidades metabólicas
que resultan de disturbios endócrinos.
1. El glicerol y los ácidos grasos se forman en una primera etapa por la acción
de la lipasa sobre los triglicéridos.
Triacilgliceroles + H2O Glicerol + Ácidos grasos
2. El glicerol se fosforila por el adenosin-5´-Trifosfato (ATP) para producir

glicerol-3-Fosfato (G3P) y adenosin-5´-difosfato (ADP) en una reacción
catalizada por la glicerol-cinasa (GK).
Glicerol + ATP G3P + ADP
3. La G3P se oxida por la glicerolfosfato oxidasa (GPO) produciendo

dihidroxiacetona fosfato (DAP) y peróxido de hidrógeno.
G3P + O2 DAP + H2O2
4. Los peróxidos reaccionan com 4-aminoantipirina y 4-p-clorofenol bajo la

influencia catalítica de la peroxidasa (POD) para formar la quinoneimina de color
rojo.
H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-p-Clorofenol Quinoneimina + 4H2O +HCl
110
REACTIVOS.
REACTIVO DE TRIGLICERIDOS ENZIMATICO LIQUIDO.
REACTIVO CONCENTRACION
ATP 2.0 mM
Sal de magnesio 5.0 mM
4-aminoantipirina 0.7 mM
Ácido m-hidroxibenzoico 5.0 mM
Glicerolfosfato oxidasa >7000 U/L
Azida de sodio 0.1%
Lipasa >200,000 U/L
Glicerol-cinasa >1000 U/L
Peroxidasa >2000 U/L
Regulador 50 mM
pH 7.3±0.1
REACTIVO DE TRIGLICERIDOS ACTIVADOR.

Concentrado enzimático activadores y estabilizadores.
ESTANDAR DE TRIGLICERIDOS 200 mg/dL

Contiene glicerol con surfactante equivalente a 200 mg/dL de triglicéridos con
trioleína. Azida de sodio 0.1% como conservador.
PRECAUCIONES.
Este reactivo es para diagnóstico in vitro únicamente.

Adicione 50 µL del activador a cada 5 mL de regulador. Mezcle previamente muy
bien. Después de activar el reactivo de trabajo manténgalo a temperatura
ambiente por lo menos durante 15 minutos antes de utilizarlo.
111
NOTA:
Para añadir adecuadamente el activador coloque el frasco verticalmente a 90
grados del reactivo. Permita que el contenido del frasco entre en contacto con el
tapón gotero del frasco activador antes de oprimirlo. Esto evitará formación de
espuma del activador y producir una gota de tamaño adecuado.

El regulador de triglicéridos es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta cuando se almacena a temperatura de refrigeración (2-8°C). Una vez
activado es estable por 6 semanas de 2-8°C o 3 días a temperatura ambiente (15-
25°C) y protegido de la luz. El activador es estable hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta cuando se conserva en refrigeración. Mantenga los
reactivos y el estándar a temperatura ambiente antes de usar.
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO INCLUIDOS.

-Cronómetro.

La sangre debe ser colectada seguida de 12 h de ayuno. La muestra puede ser
suero o plasma con EDTA como anticoagulante. Evite la hemólisis.
Se ha reportado estable los triglicéridos hasta por 10 días a temperatura
refrigeración (2-8°C). No conserve la muestra a temperatura ambiente ya que los
fosfolípidos pueden hidrolozarse y formar glicerol libre que pueden provocar
elevaciones falsas de los resultados de triglicéridos.
112
Para la recolección de sangre no debe usarse material que contenga glicerol
(glicerina), como aquellos que puedan tener un tapón lubricado. Valores altos de
de bilirrubinas o muestras muy hemolizadas, darán resultados altos falsos. Varias
drogas y otras sustancias interfieren en la determinación por éste método.
La interferencia con muestras ictéricas y muy hemolizadas se pueden corregir
usando un blanco de suero o plasma.
Tipo de reacción Punto final
Límite de absorbencia del blanco 0.500
Máxima absorbencia 2.000A
Linearidad 1000 mg/dL
pH 7.7 1.0
PROCEDIMIENTO.

2. Pipetear de acuerdo a los tubos marcados como se muestra en la tabla:

Reactivo (mL) 1,0 1,0 1,0
113
3. Mezcle e incube a 37°C por 5 min o 10 min a temperatura ambiente.
4. Lleve a cero el espectrofotómetro con el blanco a 500 nm. Lea y anote las
lecturas obtenidos de los tubos marcados como estándar y muestra antes de 60
minutos.
CONTROL DE CALIDAD.
Utilice un suero control o un pool de sueros, previamente analizados y divididos en
alícuotas congeladas e incluya en cada corrida de muestras un suero control o el
pool de sueros con valores conocidos analizados por este método.
Los controles deben analizarse de la misma manera que las muestras problemas.
RESULTADOS.
Los valores resultan de la siguiente ecuación:
Triglicéridos en suero (mg/dL)= (AM) X 200

(AE)
Donde AM y AE son las absorbencias de la muestra y del estándar,
respectivamente y 200 es la concentración del estándar (mg/dL)
Cuando se requiera de un blanco del suero (muestra ictérica o hemolizada) incluya

otro tubo como blanco del suero (BS). Añada 1 mL de solución salina 0.01 mL del
suero, mezcle por inversión, transfiera a la celda y lea la absorbencia contra agua
destilada a 500 nm. Use estos valores para corregir los de la muestra como sigue:
Triglicéridos en suero (mg/dL)= AM-BS x 200

AE
NOTA: La muestra con valores de colesterol mayores a 1000 mg/dL se diluyen 5

veces (1+4) con solución salina fisiológica, se repite el ensayo y el resultado se
multiplica por 5.
Hasta 170 mg/dL
114
REPRODUCIBILIDAD.
Se realizó un estudio de control (media=57 mg/dL) y un pool de pacientes
(media=327 mg/dL), el cual consistió en una serie de 10 ensayos durante 5 días
consecutivos. El coeficiente de variación (CV) del intraensayo de 1.8% y 0.88% y
el interensayo 1.96% y 0.88% respectivamente.
CORRELACION.
La determinación de triglicéridos por el procedimiento aquí descrito (y) y por el
GPO método de Boeringer-Manheim (x) en 57 sueros (intervalo 47-950 mg/dL) dio
un coeficiente de correlación (r) de 0.999, con una ecuación de regresión de
y=1.029x - 7.46.
LINEALIDAD
Cuando se realiza como se indica, el método es lineal de 0-1000 mg/dL.
BIBLIOGRAFIA.
1. Stein, E.E. y Myers “Lipids, lipoproteins and apolipoproteins. Tietz Clinical
Chemistry. 2da. ed. (1994), 23 1002-93

Estados Unidos.

115
C) LIPIDOS TOTALES
METODO DE SULFOFOSFOVAINILLINA DE ZOLLNER Y KIRSCH PARA LA
DETERMINACION DE LIPIDOS TOTALES. MARCA HYCEL
FINALIDAD.
Equipo de reactivos para la determinación colorimétrica de lípidos totales en suero
y plasma (EDTA).
Los principales lípidos del plasma humano son el colesterol, los triglicéridos, los
fosfolípidos y los ácidos grasos libres.
Las más importantes propiedades biológicas de lípidos son estructurales,

nutricionales y hormonales. Casi todas las clases de lípidos son usados como
componentes estructurales de las membranas. El uso más frecuente de las
determinaciones de lípidos sanguíneos se relaciona con el diagnóstico y
tratamiento de las perturbaciones del transporte de lípidos plasmáticos.
Al igual que muchos otros parámetros clínico-químicos, los lípidos séricos no
poseen un límite exacto entre los valores normales y patológicos, ya que además
de la metodología empleada, la dieta definitivamente sus niveles, así como las
edad, sexo, peso corporal y hábitos de vida.
METODOLOGIA.
PRINCIPIO.
Los lípidos reaccionan con el ácido sulfúrico concentrado caliente y posteriormente
con la vainillina en medio ácido para producir compuestos de color rosa. El color
formado es proporcional a la concentración de lípidos totales y se mide a 530 nm.
REACTIVOS.
1. Reactivo de color.
(Solución de vainillina y ácido fosfórico)
116
2. Estándar 1000 mg/dL.

Los reactivos se encuentran listos para su uso.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO
Cuando los reactivos se almacenan entre 15-30°C son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta. Es aconsejable mantener el frasco del estándar
bien cerrado para evitar la evaporación del solvente.
PRECAUCION.
Los reactivos son corrosivos. NO PIPETEAR CON LA BOCA. Evitar el contacto
con piel y ojos. Enjuagar con abundante agua en caso de derrame y consultar al
médico.

Ácido sulfúrico concentrado.
Espectrofotómetro capaz de medir la absorbencia a 530 nm
Cronómetro.
Agitador mecánico.

Obtener la muestra después de un ayuno de 12-14 h. Homogeinizarla bien antes
de analizarla. La determinación debe ser realizada en el mismo día. Si no es
posible, debe conservarse la muestra en refrigeración.
PROCEDIMIENTO.
1. Marcar tres tubos como Blanco, Estándar y Muestra.
117
BLANCO (B) ESTANDAR(E) MUESTRA(M)

ESTANDAR --- 0.05 mL ---
MUESTRA --- --- 0.05mL
AC. SULFÚRICO --- 2.0 mL 2.0 mL
CONCENTRADO
Mezclar bien, cerrar los tubos o colocar una torunda de algodón e incubar 10 min en
baño de agua hirviendo.
Colocar por 5 min en baño de agua fría.
De las mezclas anteriores pasar a otra serie de tubos las siguientes cantidades:
BLANCO(B) ESTANDAR(EA) MUESTRA (MA)
ACIDO ACIDA
ESTANDAR(EA) --- 0.1 mL ---
ACIDO
MUESTRA (MA)
ACIDA --- --- 0.1 mL
AC. SULFÚRICO
CONCENTRADO 0.1 mL --- ---
REACTIVO DE
COLOR
2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL
Mezclar bien con vórtex o varilla mezcladora e incubar a 37°C por 15 min o 30 min a
temperatura ambiente.
Leer las absorbencias a 530 nm, ajustando a cero con el Blanco. El color es estable por
30 min.
CALCULOS.
LIPIDOS TOTALES=Absorbencia de la muestra x concentración del estándar.

mg/dL Absorbencia del estándar
118
NOTA:
El reactivo de color y el ácido sulfúrico son muy viscosos por lo que se deben
pipetear sobre el fondo del tubo. Por la misma razón la precisión y la exactitud al
pipetear tiene grandes repercusiones en la recuperación de valores.
VALORES NORMALES.
450-1000 mg/dL.
(Después de un ayuno de 12 h).
LINEARIDAD.
La reacción es lineal hasta 2500 mg/dL.
Para valores diluir el suero con solución salina fisiológica. Multiplicar el resultado
por el factor de dilución.
OBSERVACIONES.
1. Guardar los reactivos protegidos de la luz.
2. El material de vidrio debe estar perfectamente limpio. Este material debe
lavarse por separado. Si se usan solventes alcohólicos para lavar la vidriería, usar
solo el etanol o metanol. Alcoholes con una cadena de carbón mayor de 2
interferirán con le prueba. También interfieren el heptano, etil benceno y
tetrahidrofurano. Si se usan detergentes o jabones, enjuagar perfectamente para
eliminar todo rastro de ellos. El material debe estar completamente seco, sin
importar el procedimiento de limpieza que se use.
3. Los tubos deben colocarse en el baño de agua cuando está en ebullición; el
nivel de agua del baño debe ser superior al de los reactivos en los tubos.
4. Con el tiempo el reactivo de color puede volverse ligeramente colorido, este no
interfiere con las determinaciones.
119
BIBLIOGRAFIA.
1. Frings, C. S.; Frendley, T. W., Dunn, R. T. y Queen, C. A. Clin. Chem. 18, 673
(1972).
2. Kinight, A. J. Anderson, S y Rawle, J.M. Clin. Chem. 18, 199 (1972).
3. Zollner, N. Y. Kirsch, K.Z. Ges. Exp. Med. 135, 545 (1962).
4. Gradwohl. Sonnenwirth Jarret, Met. y Diag. del Lab. Clin. 8ª. Ed. 1986.
5. Kaplan, Clinical Chemistry. Theory, analisis, correlation.3a. ed., 1996.
120
3. EVALUACION DE LA FUNCION RENAL.
3.1 ELECTROLITOS SERICOS.

Es importante mantener un equilibrio de electrolitos en el cuerpo, debido a que
ellos afectan la cantidad de agua corporal, la acidez de la sangre (pH), la acción
de los músculos y otros procesos importantes. Los electrolitos se pierden durante
la transpiración y deben ser reemplazados ingiriendo líquidos. Su hemostasia se
mantiene por la acción coordinada de adaptación hormonal, renal y vascular.
El agua total del organismo constituye del 50-75% de la masa corporal y su
proporción depende del sexo, edad y el contenido de grasa.
En el organismo está distribuido entre el espacio extracelular (LEC) y constituye el
20-25% del peso, lo que es un tercio del agua e intracelular (LIC) el cual constituye
el 30-40% del peso equivalente a las dos terceras partes del volumen de agua.
El LEC constituye el plasma (5%), el instersticio (15%) y el agua transcelular (1-
3%)
Las necesidades basales tanto de electrolitos como de agua, dependen de la tasa
metabólica y no del peso
Los electrolitos están presentes en la sangre como ácidos, bases y sales (como
sodio, calcio, potasio, cloro, magnesio y bicarbonato) y se pueden medir por medio
de estudios de la sangre en el laboratorio, y pueden alterarse sus niveles por
varias causas, entre las más importantes se encuentran el vómito, la fiebre,
deshidratación extrema, que son manifestaciones de enfermedades como son
nefropatías por pérdida de electrolitos e insuficiencia suprarrenal, renal y cirrosis,
entre otras.
OBJETIVO: Determinará los electrolitos más importantes presentes en el

organismo mediante técnicas colorimétricas de Stanbio-Licon, Spinreact y Randox.
A) SODIO.
Es el principal electrolito del LEC y sus valores están entre 135-148 mEq/L sus
niveles se deben a los sistemas de transporte activo de membrana. La
121
disminución de los niveles de sodio sérico (hiponatremia) es uno de los trastornos
más comunes (1), los cuales dependen del grado de la pérdida de este ión y se
producen cambios sutiles de tipo mental, en el nivel de energía o bien profundos
desórdenes neurológicos hasta convulsiones generalizadas (2). Si la pérdida por
sodio es paulatina (en un periodo de días hasta semanas): se presenta laxitud,
respuestas mentales o físicas lentas, nausea, malestar general y espasmos
musculares; si la pérdida del ion es en cuestión de horas, se presentan
convulsiones, desorientación marcada, confusión y coma (3). El incremento de
sodio (hipernatremia) se produce por la pérdida de agua excesiva con respecto al
ion, aumento en la concentración de sodio y causas de tipo renal, en la diurésis
osmótica, sudoración profusa, diarreas sin reposición de líquidos, diabetes insípida
y nefrogénica, síndrome de Cushing e hiperaldosterismo.
DETERMINACION CUANTITATIVA COLORIMETRICA DE SODIO EN SUERO Y

ORINA. METODO DE STANBIO.
Anteriormente al fotómetro de flama y los electrodos ión selectivo, el método más

popular para la determinación de sodio en los fluidos corporales involucra su
precipitación como una sal triple de acetato de zinc uranilo sódica. Esta técnica fue
introducida por Kolthoff en 1927, con la subsecuente utilización del precipitado en
varias formas. Una aproximación fue la determinación colorimétrica del residuo
solubilizado, ya sea directamente como el reportado por Albanese y Lein2 o por el
monitoreo de la disminución del color del sobrenadante amarillo después de la
precipitación como lo descubrió Bradbury3.
El método presentado es esencialmente una adaptación del último esquema3, en
donde el sodio se precipita del sobrenadante libre de proteínas como sal triple. La
disminución resultante de la absorbencia de la mezcla de reactivo de color-
sobrenadante es proporcional al contenido de sodio de la muestra.
122
REACTIVO.
REACTIVO DE COLOR DE SODIO.

Solución de acetato de uranilo, 5.3 g/dL y acetato de zinc, 15.4 g/dL, en solución
acuosa ácido-acético-etanol.
REACTIVO PRECIPITANTE.
Solución acuosa de ácido tricloroacético (TCA), 10g/dL.
ESTANDAR DE SODIO.
Cloruro de sodio 4.091 g/dL en solución de TCA. Equivalente a un valor de sodio
de 140 mmol/L cuando se utiliza como se indica en éste método.
PRECAUCIONES.
Para uso de diagnóstico In Vitro. Tenga cuidado en el manejo del reactivo
precipitante y el estándar de sodio ya que son medianamente cáusticos.

Todos los reactivos son estables de 25-30°C hasta la fecha de caducidad.
RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA.

Suero: Remueva el coágulo pronto y con cuidado para evitar la hemólisis.
Plasma: Utilice como anticoagulante heparina de litio o de amonio u oxalato de
litio.
Orina: Diluya una porción de orina de 24 h (1:10) con agua destilada.
Dependiendo del contenido de sodio, se puede requerir una dilución de 1:5 o 1:2.
ESTABILIDAD E LA MUESTRA.
Los niveles de sodio permanecen estables por lo menos 14 días de 20-25°C.
123
INTERFERENCIAS.
El material de vidrio contaminado es la principal fuente de error. Todo el material
se debe lavar con ácido nítrico al 10-20%, se enjuaga con agua destilada, se seca
y se almacena en un área que no contenga polvo
PROCEDIMIENTO.
PREPARACION DEL SOBRENADANTE LIBRE DE PROTEINAS.
1. Añada 0.5 mL de suero, plasma u orina diluida a tubos adecuadamente

marcados.
2. Añada 0.5 mL del reactivo precipitante gota a gota cada tubo con agitación
vigorosa (se sugiere usar vórtex).
3. Déjelo reposar por 5 minutos, después centrifugue a alta velocidad por 5-10
min.
PROCEDIMIENTO.
1. Pipetee en los tubos marcados los siguientes volúmenes (mL), agitando

rápidamente después de cada adición del reactivo de color.
BLANCO (B) mL ESTANDAR (E) MUESTRA (M)

mL mL
Agua destilada 0.5 ---- ----
Estándar ---- 0.5 ----
Sobrenadante ---- ---- 0.5
Reactivo de color 2.5 2.5 2.5
124
2. Nuevamente mezcle el contenido de todos los tubos.
3. Incube los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Después del periodo de incubación, mezcle fuertemente y centrifugue a alta
velocidad por 5 minutos.
5. Transfiera con cuidado el sobrenadante de cada tubo a la celdilla apropiada.
6. Con el espectrofotómetro a 420 nm calibre a cero el instrumento con agua
destilada. Lea y registre la absorbencia del blanco, del estándar y de la muestra en
un periodo de 30 min.
CONTROL DE CALIDAD.
Se debe incluir en cada serie de ensayos un suero control y orina analizado para
el contenido de sodio por éste método, fotometría de llama o electrodo ión
selectivo. Para esta prueba se recomienda correr los controles Ser-T.Fy I y II de
Stanbio.
RESULTADOS.
Los valores se derivan del siguiente cálculo:
Sodio en suero, plasma u orina en mEq/L= AB - AM x 140

AB - AE
Donde AB, AM y AE; representan la absorbencia del blanco, muestra y estándar

respectivamente y 140 es el valor del estándar de sodio en mEq/L.
Ejemplo: Una muestra de suero probada por el método descrito da una

absorbencia de 0.936 con una lectura del blanco de reactivo 1.385 y una lectura
del estándar de 0.967. Por lo tanto:
Sodio en mEq/L= 1.385-0.936 X 140 = 150

1.385-0.967
125
NOTA: Los valores de orina se deben multiplicar por el factor de dilución
apropiado.
Sodio en orina (mEq/L/24h)= Sodio en orina X volumen de 24h (mL)

1000
Suero/plasma: 135.00-148.00 mEq/L

Orina 75.00-200 mEq/24h
PRECISION. Múltiples ensayos (n=20) en un pool de sueros (media=100.7 mEq/L)

durante un periodo de 11 días revelaron una desviación estándar (SD) de 1.5
mEq/L y un coeficiente de variación (CV) de 1.4%.
CORRELACION. Cada uno de los 6 pools de sueros fue analizado para sodio por
espectrofotometría de llama (intervalo de 126-149 mEq/L). Los análisis por
duplicado (n=6) utilizando el método presentado revelaron una desviación
promedio del método de referencia de 1.5 mEq/L.
LINEALIDAD. Cuando se realiza como indica, él método es lineal de 0-160.00

mEq/L.
REFERENCIAS.
1. Kolthoff, I. M. Zanal. Chem. 70:397, 1927.

2. Albanesee, A. A., Lein, M. D. J. Lab. Clin. Med. 33:246, 1948.
3. Bradbury, J. T. J. Lab. Clin. Med. 31: 1257, 1946.
126
B) POTASIO.
Es el catión principal del LIC sus valores de referencia se encuentran entre 3.50-
5.1mEq/L cualquier cambio en sus concentraciones produce trastornos
relacionados en el sistema neuromuscular y miocardio (arritmias). Se le atribuye
funciones importantes como activador de enzimas, los niveles bajos de este ión
(Hipocaliemia). Se presenta en alcalosis terapéutica insulínica. El aumento de la
concentración sérica de potasio (hipercalcemia) se debe a acidosis metabólica, y
lesiones celulares.
METODO PARA LA DETERMINACION DE POTASIO DE STANBIO-LICON.
El método presentado para la determinación de potasio se basa en la técnica
turbidimétrica publicada publicada por Hillman y Beyer en 1967, siendo modificada
a través del uso de TCA como reactivo precipitante. Los resultados coincidían
favorablemente con aquellos obtenidos por fotometría de llama y fueron
adecuados para la detección rápida de hiper e hipocaliemia en ausencia de un
fotómetro de llama o electrodo ión selectivo.
Los iones potasio en un medio alcalino libre de proteínas reaccionan con el
tretrafenilborato de sodio para producir una suspensión turbia finamente dispersa
de tetrafenilborato de potasio. La turbidez producida es proporcional a las
concentraciones de potasio.
REACTIVOS.
REACTIVO DE BORATO DE POTASIO.

Solución acuosa de tetrafenilborato de sodio 0.2 mol/L
REACTIVO DE HIDROXIDO DE SODIO.

Hidróxido de sodio acuoso 0.2 mol/L
127
REACTIVO DE TCA PRECIPITANTE.
Solución acuosa de ácido tricloroacético (TCA) 0.3 mol/L.
ESTANDAR DE POTASIO (EQUIVALENTE A 4.0 mEq/L).

Solución de cloruro de potasio en TCA acuoso (0.3 mEq/L)
NOTA:
Estándar equivalente. Los valores establecidos se aplican solamente cuando se
utiliza como se indica en este método.
PRECAUCIONES.
Para uso de diagnóstico In Vitro. Tenga cuidado en el manejo del reactivo
precipitante y el estándar de potasio ya que son cáusticos.
PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO.

Mezcle un volumen de borato de potasio con 1 volumen de hidróxido de sodio.
Déjelo reposar por un tiempo mínimo de 15-30 minutos antes de utilizarse.

El reactivo de trabajo es estable por 30 días a temperatura ambiente y 60 días en
refrigeración a 4°C. Todos los demás reactivos son estables de 25-30°C hasta la
fecha de caducidad mostrada en la etiquetada.

Suero: Remueva el coágulo pronto y con cuidado para evitar la hemólisis.
litio.
Orina: Diluya una porción de orina de 24 h (1:10) con agua destilada. Mezcle bien
y utilice 0.1 mL de ésta muestra para preparar la muestra libre de proteínas.
Dependiendo del contenido de potasio, se puede requerir una dilución de 1:5 o
1:2.
128
Los niveles de potasio en el suero permanecen estables por lo menos 14 días de
20-25°C.
INTERFERENCIAS.
y se almacena en un área que no contenga polvo. La hemólisis puede elevar de
forma falsa los niveles de potasio en suero debido al alto contenido de éste
elemento en los eritrocitos.
PROCEDIMIENTO.
PREPARACION DEL SOBRENADANTE LIBRE DE PROTEINAS.

1. Añada 0.5 mL de suero, plasma u orina diluida a tubos adecuadamente
marcados.
2. Añada 0.5 mL del reactivo precipitante gota a gota cada tubo con agitación
vigorosa (se sugiere usar vórtex).
3. Déjelo reposar por 5 minutos, después centrifugue a alta velocidad por 5-10
min.
PROCEDIMIENTO.
1. Pipetee en los tubos marcados los siguientes volúmenes (mL):

mL mL
Estándar ---- 0.1 ----
trabajo
129
2. Mezcle el contenido de todos los tubos.
3. Incube los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Transfiera con cuidado la mezcla de reacción a la celdilla apropiada.
5. Con el espectrofotómetro a 580 nm calibre a cero el instrumento con el blanco
de reactivos. Lea y registre la absorbencia del estándar y de la muestra en un
periodo de 60 min.
CONTROL DE CALIDAD.
Stanbio.
RESULTADOS.
Potasio en suero, plasma u orina en mEq/L= AM x 4

AE
Donde AM y AE; representan la absorbencia de la muestra y estándar

respectivamente y 4 es el valor del estándar de potasio en mEq/L.

apropiado.
Potasio en orina (mEq/L/24h)= Potasio en orina X volumen de 24h (mL)

1000
Suero/plasma: 3.50-5.10 mEq/L
130
Orina 26.00-123.00 mEq/24h (varía con la dieta).
PRECISION. Determinaciones por duplicado realizadas en 19 pacientes

proporcionaron una media y una desviación estándar (SD) de 4.2 y 0.11 mEq/L
respectivamente. El coeficiente de variación (CV) para estos datos fue de 2.6%.
CORRELACION. La determinación de potasio en 20 sueros por el método descrito

y por el fotómetro de llama de Beckman mostró un coeficiente de correlación (r) de
0.962.
LINEALIDAD. Cuando se realiza como indica, él método es lineal de 0-10 mEq/L.
REFERENCIAS.
1. Hillman, Von G., Beyer, G., Zbklin Chem Klin Biochem 5:93, 1967.
2. Tietz, N. W. In fundamentals of clinical chemistry, 2nd ed. Ed. Saunders Co.

Philadelphia pp 876-877, 1976.
3. Henry, R.J. Clinical Chemistry, Principles and Techniques, 2nd ed. Ed. Harper
and Row, p.525, 1974.
131
C) CLORO.
Principal anión extracelular y su contenido sérico está entre 98-107 mEq/L, su

regulación es pasiva al sodio, su excreción es de tipo renal, su función es la
regulación del equilibrio hidroelectrolítico y ácido base, así también mantiene el
contenido de HCl del intestino.
La hipocloremia, se le denomina a la disminución de los niveles séricos de cloro, la
cual se produce por: dietas bajas en sal, vómitos, perdidas gastrointestinales
(HCl), cetoacidósis diabética, exceso de mineralocorticoides, perdida renal, niveles
altos de bicarbonato (acidosis metabolica o respiratoria). La hipercloremia (altos
niveles de cloro en suero), se presenta en: pérdidas por bicarbonato, acidósis
tubular renal, mineralocorticoides, hiperparatiroidismo.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE IONES CLORURO FUNDAMENTO.

METODO DE SPINREACT.
Los iones cloruro de la muestra reaccionan con tiocianato de mercurio

desplazando al ión tiocianato. El tiocianato libre en presencia de iones férrico
forma un complejo colorido medible colorimétricamente:
2 Cl- + Hg(SCN)2 HgCl2 + 2SCN-
SCN- + Fe +3 FeSCN
La intensidad del color es proporcional a la concentración de iones cloruro

presente en la muestra ensayada.
El control de la concentración de iones cloruro tiene gran interés clínico dada su
importancia en el equilibrio ácido-base y la regulación osmótica del fluido
extracelular. Valores altos se relacionan con pérdidas excesivas de agua o
132
alteraciones del flujo renal y fibrosis quística. Valores bajos nos indican acidosis
metabólica, trastornos gastrointestinales o alteración de los mecanismos renales.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos
y de laboratorio.
REACTIVOS.
Tiocianato de mercurio 2 mmol/L
R Nitrato de hierro 40 mmol/L
Tiocinato-Hg Nitrato de mercurio 0.15 mmol/L
Ácido nítrico 45 mmol/L
Calibrador de Patrón primario acuoso de 125 mmol/L
cloruros cloruros
PRECAUCIONES.
R: Es un reactivo altamente tóxico por inhalación, ingestión y por contacto con la
piel. En caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con abundante agua
y acudir al médico. Quitarse inmediatamente la ropa manchada. En caso de
contacto con la piel, lavarla de inmediato con abundante agua y acudir al médico.
PREPARACION
Reactivo y patrón están listos para su uso.
Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC,
protegidos de la luz y se evita su contaminación.

• Presencia de partículas y turbidez.
• Absorbencia (A) del blanco a 480 nm ≥ 0.15
133
MATERIAL ADICIONAL
• Espectrofotómetro o analizador con cubetas para lecturas a 480 nm
• Cubetas de 1.0 cm de paso de luz
MUESTRAS.
• Suero, líquido cefalorraquídeo, sudor y otros líquidos libres de hemólisis.
Separar lo antes posible de los hematíes. No usar oxalatos o EDTA como
anticoagulantes ya que interfieren en los resultados.
• Orina. Efectuar la recolecta de orina de 24 horas en recipientes libres de
cloruros. Diluir la orina 1:2 en agua destilada para su análisis. Mezclar
perfectamente. Multiplicar el resultado obtenido por 2 (Factor de dilución).
Los iones cloruro son estables una semana a temperatura ambiente (15-25ºC),
en refrigeración (2-8ºC) dos semanas y congelación (-20ºC) por un mes.
PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: 480 nm (440-500 nm)

Temperatura 37ºC/ 15-25 ºC

BLANCO PATRON MUESTRA
R(mL) 1.0 1.0 1.0
Patrón (µL) ---- 10 ---
Muestra (µL) ---- ---- 10
134
4. Mezclar e incubar 5 minutos.
5. Leer la absorbencia (A) del patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
El color es estable por 30 minutos.
CALCULOS.
(A)MUESTRA= X 125 (Concentración del patrón)= mmol/L de iones cloruro
(A) PATRON
ORINA 24 h. (A)MUESTRA= X125 x vol. (dL)orina/24 h= mmol/24 h de iones
cloruro
FACTOR DE CONVERSION: mmol/L=mEq/L
Suero o plasma: 98.00-107.00 mEq/L
Orina: 110.00-250.00 mEq/24 h
NOTA: Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de

referencia.

INTERVALO DE MEDIDA: Desde el límite de detección de 1.13 mmol/L hasta el
límite de linealidad de 130 mmol/L.
Si la concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir 1:2 con

agua destilada y multiplicar el resultado por dos.
PRECISION.
Media (mmol/L) 90.7 106 91.6 108
SD 0.64 0.73 0.69 0.81
CV 0.70 0.69 0.76 0.74
135
SENSIBILIDAD ANALITICA: 1 mmol/L=0.006 A.
EXACTITUD. Los reactivos no muestran diferencias sistemáticas significativas

cuando se comparan con otros reactivos comerciales.
INTERFERENCIAS.
Hemólisis y anticoagulantes.
Bilirrubina hasta 120 mg/dL, albúmina bovina hasta 150 g/L y triglicéridos hasta
6g/L no alteran significativamente los datos del ensayo.
Se han descrito varias drogas y otras sustancias que interfieren con la
determinación de cloruros, consultar la lista en: Young D.S. Effects of Drugs on
Clinical Lab Tests. 4th. Ed AACC 2001.
NOTAS.
1. Se recomienda utilizar material de plástico de un solo uso para evitar
contaminaciones. En caso de utilizar material de vidrio deberá lavarse con
una solución de H2SO4-K2Cr2O7, enjuagar varias veces con agua destilada
y secar antes de su uso.
2. La mayoría de detergentes destinados al uso de laboratorio contienen

detergentes quelantes. Trazas de los mismos, como consecuencia de un
mal enjuague del material, invalida la determinación.
3. Evitar el contacto con partes metálicas.
4. La calibración con el Patrón acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos

en métodos automáticos. En éste caso se recomienda utilizar calibradores
séricos.
5. Utilizar puntas de pipeta desechables limpias para su uso.
136
BIBLIOGRAFIA.
1. Miller, W.G and Kaplan, A. Chloride. Clin Chem The Mosby co. St Louis.
Toronto. Princeton 1984. 1059-1062.
2. Schoenfeld, R.G. et al Clin Chem. 1964 (10):533-539.
3. Young D.S. Effects of Drugs on Clinical Lab Tests. 4th. Ed AACC 2001.
DETERMINACION DE IONES CLORURO. METODO DE TIOCIANATO

MERCURIOSO (II). MARCA RANDOX.
METODO COLORIMETRICO.
PRINCIPIO.
Los iones cloro reaccionan con tiocianato mercurioso para formar perclorato y
tiocianato.
El tiocianato liberado forma un complejo rojo con el cloruro férrico en presencia de
ácido nítrico.
MUESTRA.
Suero o plasma con EDTA o plasma heparinizado, fluido cerebroespinal, fluido
amniótico, orina.
REACTIVOS.
COMPONENTES CONCENTRACION DE LOS
REACTIVOS.
Reactivo tiocianato
Nitrato férrico (III) 22.2 mmol/L
Nitrato de mercurio 1.89 mmol/L
Cloruro de amonio 1.1 mmol/L
Tiocianato de amonio 2.72 mmol/L
Ácido nítrico 28.0 mmol/L
Patrón 100 mEql/L
137
1. Reactivo de tiocianato.
Listo para usar. Estable hasta la fecha de caducidad cuando se conserva entre 15-
25ºC.
PROCEDIMIENTO.
Cubeta 1 cm de espesor.
Temperatura 37ºC.
Medición Frente blanco de reactivo.
Pipetear en tubos marcados como:

Agua destilada 10µL ---- ----
Patrón ---- 10µL ----
Muestra ---- ---- 10µL
Reactivo 1000µL 1000µL 1000µL
Mezclar e incubar durante 5 minutos a 37ºC. Medir la absorbencia de la muestra o

el patrón frente al blanco de reactivo.
CALCULOS.
Concentración de cloro en la muestra = Amuestra X concentración del patrón.
A del patrón
Suero: 98.00-107.00 mEq/L.
Dado que pueden ocurrir variaciones debido a la edad, sexo, dieta y situación
geográfica, recomendamos que cada laboratorio establezca sus propios intervalos
de referencia.
138
CONTROL DE CALIDAD.
Para un control de exactitud y reproducibilidad:
Multisueros normal y elevados analizados.
Para un control de reproducibilidad:

Multisueros bajo, normal y elevado.
Un control (nivel 1 o 2) debe analizarse después de cada 10 muestras. Los valores

obtenidos deben caer dentro del intervalo especificado. Si estos valores están
fuera del intervalo, para excluir el error es necesario revisar los siguientes puntos.
1. Revisar la fuente de luz del instrumento.

2. Limpieza de puntas y pipetas.
3. Calidad del agua, evitar contaminación.
4. Checar la fecha de caducidad del equipo comercial.
LINEALIDAD.
Este método es lineal entre concentraciones de cloro de 60.00 y 140.00 mEq/L.
PRECAUCIONES.
Únicamente para diagnóstico in vitro. No pipetear con la boca, respetar las
precauciones normales necesarias que se requieran al manejar los reactivos de
laboratorio.
BIBLIOGRAFIA.
Fried, R. et al. J. Clin. Chem. 1972; 10:280.
139
D) FOSFORO.
Al igual que el calcio el fósforo es de los elementos más abundante en el cuerpo.

Existen de 500-600 g de los cuales el 85% se encuentra en los huesos en forma
de hidroxiapatita. El resto del fósforo se encuentra unido a lípidos, proteínas, CH y
otras sustancias orgánicas, para formar parte de la membrana, ácidos nucleicos,
nucleótidos (moléculas para obtener energía). En el LEC, se encuentra como
fosfato inorgánico (HPO4-2 y H2PO4-1). A pH fisiológico se encuentran cantidades
insignificantes de PO4-3. La forma iónica depende obviamente del pH, los valores
de referencia van de 2.50-4.90 mg/dL. En niños se encuentra de 4.00-7.00 mg/dL.
La ingestión de alimentos puede alterar los niveles de fosfato inorgánico, pero la
comida rica en carbohidratos la disminuye. Se presentan valores bajos durante la
menstruación.
En su homeostasis interviene tres órganos importantes el intestino delgado,
riñones y esqueleto, los cuales funcionan como reservorio. No existen deficiencias
debido a que todos los alimentos las contienen. El fosfato inorgánico de la dieta en
exceso se excreta por las heces en compuestos insolubles de calcio. La absorción
requiere energía, se aumenta también por la vitamina D (A su vez la hormona
paratiroidea) y por la Hormona del crecimiento.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE FOSFORO INORGANICO. METODO DE

SPINREACT.
FUNDAMENTO.
El método directo para la determinación de fósforo inorgánico.
El Fósforo inorgánico reacciona en medio ácido con molibdato de amonio
formando un complejo fosfomolibdato de color amarillo.
La intensidad del complejo formado es proporcional a la concentración de fósforo
inorgánico presente en la muestra.
140
El fósforo es esencial para la formación del tejido óseo y el metabolismo
energético celular. Aproximadamente un 85% se encuentra en el hueso y en los
dientes.
Niveles bajos de fósforo pueden ser debidos a hipervitaminosis D, hipertiroidismo
primario, desórdenes renales, ingestión de antiácidos o mala absorción.
Niveles altos son atribuidos a la diera, metástasis de huesos, alteraciones en el
hígado, alcoholismo, diarreas y vómitos.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta los datos clínicos y de
laboratorio.
REACTIVOS.
Molibdato de amonio 0.40 mM
R Ácido sulfúrico 210 mM
Molíbdico Detergente
Calibrador de Fósforo Patrón primario acuoso de 5 mg/dL
Fósforo
PRECAUCIONES.
Ácido sulfúrico. Corrosivo, provoca quemaduras.
En caso de contacto con los ojos, lávese inmediatamente con abundante agua y
acudir al médico.
PREPARACION.
Reactivos y patrón listos para usarse.
CONSERVACION Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados de 2-8 ºC,
141
protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso. No usar reactivos
fuera de la fecha de caducidad indicada,
CALIBRADOR DE FOSFORO.
Una vez abierto es estable un mes si se mantienen los viales bien cerrados de 2-
8 ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación.

• Presencia de partículas y turbidez.
• Absorbencia (A) del blanco a 340 nm ≥ 0.54
MATERIAL ADICIONAL
• Espectrofotómetro o analizador con cubetas para lecturas a 340 nm
• Cubetas de 1.0 cm de paso de luz
MUESTRAS.
• Suero libre de hemólisis. Separar lo antes posible de los hematíes.
Estabilidad 7 días de 2-8 ºC.
• Orina. Efectuar la recolecta de orina de 24 horas en recipientes con 10 mL

de ácido clorhídrico al 10% (V/V) para evitar la precipitación de fosfatos.
Ajustar a pH 2.0. Diluir la orina 1:10 en agua destilada para su análisis.
Mezclar perfectamente. Multiplicar el resultado obtenido por 10 (Factor de
dilución). Estabilidad 10 días de 2-8 ºC.
PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: 340 nm (440-500 nm)

142
Temperatura 37ºC/ 20-25 ºC

R(mL) 1.0 1.0 1.0
Patrón (µL) ---- 10 ---
Muestra (µL) ---- ---- 10
4. Mezclar e incubar 5 minutos.

5. Leer la absorbencia (A) del patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El
color es estable por 30 minutos.
CALCULOS.
Suero:
(A)MUESTRA= X 5 (Concentración del patrón)= mg/dL de fósforo
(A) PATRON
ORINA 24 h. (A)MUESTRA= X 5 x vol. (dL)orina/24 h= mg/24 h de fósforo
FACTOR DE CONVERSION: mg/dL= 0.323 mmol/L
Suero:
Niños 4.50- 5.50 mg/dL
Adultos 2.50-4.90 mg/dL
Orina:
Adultos 0.40-1.30 g/24 h
143
NOTA: Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.

INTERVALO DE MEDIDA: Desde el límite de detección de 0.07 mg/dL hasta el
límite de linealidad de 15.00 mg/dL.
Si la concentración de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1:2 con
agua destilada y multiplicar el resultado por dos.
PRECISION.
Media (mg/dL) 3.44 5.84 3.45 5.83
SD 0.02 0.04 0.02 0.04
CV (%) 6.64 0.64 0.72 0.68
SENSIBILIDAD ANALITICA: 1 mg/dL=0.053 A.

EXACTITUD. Los reactivos no muestran diferencias sistemáticas significativas
INTERFERENCIAS.
No realizar la prueba en muestra hemolizadas ya que los hematíes contiene una
alta concentración de ésteres de fósforo orgánico, que es hidrolizado a fósforo
inorgánico durante su conservación el incremento es de 4-5 mg/dL por día. Se han
descritovarias drogas y sustancias que interfieren en la determinación de fósforo.
NOTAS.
1. La mayoría de detergentes utilizados en el laboratorio contienen quelantes

y fosfatos que interfieren en el ensayo. Se recomienda limpiar el material
con ácido nítrico diluido y enjuagar con abundante agua destilada.
2. Usar puntas y pipetas limpias para su uso.
144
BIBLIOGRAFIA.
1. Daly J.A. Clin. Chem. 1972:18 (3):263-265.

2. Young D.S. Effects of Drugs on Clinical Lab Tests. 4th. Ed AACC 2001.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE FOSFORO. METODO DE

FOSFOMOLIBDATO DE RANDOX.
FUNDAMENTO.
El fósforo inorgánico reacciona con el molibdato de amónico en presencia de ácido
sulfúrico para formar un complejo fosfomolibdato que se mide a 340 nm.
MUESTRA.
Suero o plasma (con EDTA o fluoruro). Evitar muestras hemolizadas ya que la
ruptura de glóbulos rojos interfiere en la prueba.
Orina: diluir la orina 0.5 mL más 9.5 mL (1:20). No olvidar multiplicar el resultado
por 20.
REACTIVOS.
REACTIVOS EN LA PRUEBA.
1. Reactivo blanco
Ácido sulfúrico 0.36 mol/L
Cloruro de sodio 154 mmol/L
Detergente
2. Reactivo de Molibdato 3.5 mmol/L
Ácido sódico 0.36 mol/L
Cloruro de sodio 154 mmol/L
3. PATRON
Fósforo 1.61 mmol/L (5 mg/dL)
145
Todos los reactivos están listos para usar. Estables hasta la fecha de caducidad
cuando se conservan entre 15-25ºC.
Reactivo de trabajo. Mezclar una botella de Reactivo blanco 1 con una botella de
reactivo de Molibdato 2 (300mL de reactivo de trabajo).
Para volúmenes más pequeños preparar el reactivo para el análisis según la tabla
siguiente:
REACTIVO BLANCO MOLIBDATO

7.0 mL 3.0 mL
14.0 mL 6.0 mL
28.0 mL 12.0 mL
El reactivo en mezcla es estable durante 8 semanas entre 15-25ºC.
PROCEDIMIENTO.
Longitud de onda 340 nm Hg 334 nm
Temperatura 20-25ºC/37ºC.
Medida Frente blanco de reactivo.

Patrón ---- 10µL ----
Reactivo de 1000µL 1000µL 1000µL
trabajo
146
Mezclar e incubar durante 10 minutos a 20-25ºC o 5 minutos a 37ºC. Medir la
absorbencia de la muestra o el patrón frente al blanco de reactivo.
CALCULOS.
Concentración de Fósforo
Inorgánico en la muestra = A muestra X concentración del patrón.
A del patrón
Suero: 2.50-4.90 mg/dL (0.87-1.45 mmol/L).

Orina: 75.00-195.00 mg/24h (25.00-65.00 mmol/24 h).
de referencia.
CONTROL DE CALIDAD.


LINEALIDAD.
Este método es lineal entre concentraciones de cloro de 20.00 mg/dL (6.50
mmol/L).
147
Las muestras con concentraciones superiores deberán diluirse 1+4 y repetir la
prueba. Multiplicar el resultado por 5, que es el factor de dilución.
NOTA:
Muestras ictéricas y ligeramente lipémicas requieren una muestra blanco .Usando
el mismo esquema, para pipetear mezclar 10 µL de muestra con 1000 µL del
reactivo de trabajo, en éste caso debe restarse la absorbencia de la muestra
blanco (Amuestra blanco) de la absorbencia de la muestra (Amuestra).
PRECAUCIONES.
laboratorio.
Las soluciones 1 y 2 contienen ácido sulfúrico. Evitar la ingestión o el contacto con
la piel y mucosas.
La solución 3 tiene azida de sodio. Evitar su ingestión o el contacto con la piel y
mucosas. En caso del contacto con la piel, lavar inmediatamente al área afectada
con agua abundante. En caso de ingestión o contacto con los ojos llamar
inmediatamente a un médico.
BIBLIOGRAFIA.
1. Henry, R.J. Clinical Chemistry, Principles and Techniques, 2nd ed. Ed. Harper
and Row, p.525, 1974.
2. Tietz, N. Clinical Guide to Laboratory Tests. W.B. Saunders Co. Philadelphia

1983: 5:384.
148
E) MAGNESIO.
El magnesio es uno de los principales cationes intracelulares en el organismo. Su
acción está relacionada íntimamente al calcio. La deficiencia de magnesio,
hipomagnesemia, puede producir varios desórdenes neuromusculares, debilidad,
temblores, tetania y convulsiones. Se asocia con hipocalcemia, terapia
intravenosa, Diabetes mellitus, diálisis, alcoholismo y embarazo.
El aumento de los niveles de magnesio, hipermagnesemia, están asociados con
deshidratación, acidosis diabética severa y enfermedad de Addison. Cualquier
condición que interfiera como un resultado con la filtración glomerular como la falla
renal provocará la retención de magnesio y elevación, por lo tanto, de los niveles
en suero.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE MAGNESIO. METODO DE AZUL DE

XILIDIL DE RANDOX.
Este reactivo está diseñado para la determinación cuantitativa In Vitro de

magnesio en el suero, plasma y orina.
FUNDAMENTO.
Los iones magnesio reaccionan con el azul de xilidil en medio alcalino para formar
un quelato rojo-púrpura soluble, la intensidad del color es proporcional a la
concentración de magnesio en la muestra. El calcio se excluye de la reacción por
complejos con EGTA.
RECOLECCION DE LA MUESTRA Y ALMACEN.

Esta determinación se realiza en suero y orina. Las muestras de orina de 24 h
pueden contener sedimentos que absorben el magnesio, por lo tanto adicionar
algunas gotas de HCl concentrado (pH3-4) para disolver el sedimento y diluir con
agua 1:5. Multiplicar el resultado por 5, que es el factor de dilución utilizado en la
determinación.
149
REACTIVOS.
REACTIVOS.
1. REACTIVO DE COLOR.
Azul de xilidil 0.1 mmol/L
Regulador de Tris 0.2 mmol/L
Carbonato de potasio 77 mmol/L
EGTA 0.04 mmol/L
2. Patrón 2.43 mg/dL (1.00 mmol/L)
PRECAUCIONES.
indicaciones normales necesarias que se requieren al manejar los reactivos de
laboratorio.
La solución 1 contiene azida de sodio. Evitar la ingestión o el contacto con la piel y
mucosas. En caso del contacto con la piel, lavar inmediatamente al área afectada
con agua abundante. En caso de ingestión o contacto con los ojos llamar
inmediatamente a un médico.

cuando se conservan entre 15-25ºC.
NOTA.
Todo el equipo usado debe estar libre de la contaminación por magnesio.
Fluctuaciones en los valores del blanco del más del 10% en una serie se deba
principalmente a la contaminación del equipo con magnesio. Lavar el material con
Tritón X100, sumergir en HCl o con HNO3 diluido por 1-2 h y lavar enjuagando
con agua destilada. Dejar secar el material.
150
PROCEDIMIENTO.
Temperatura 20-25ºC.
Medida Frente blanco de reactivo.

Reactivo de color 1000µL 1000µL 1000µL
Patrón ---- 10µL ----
Mezclar e incubar durante 5 minutos a 20-25ºC o 5 minutos a 37ºC. Medir la

absorbencia de la muestra o el patrón frente al blanco de reactivo. El color es
estable por 3 horas a temperatura ambiente.
CALCULOS.
Concentración de Magnesio
Sérico en la muestra = A muestra X concentración del patrón (2.43 mg/dL)
A del patrón
Suero: 1.30-2.10 mg/dL (0.70-1.10 mmol/L).
de referencia.
151
CONTROL DE CALIDAD.

LINEALIDAD.
Este método es lineal entre concentraciones de magnesio de 4.9 mg/dL (2.0
mmol/L).
Las muestras con concentraciones superiores deberán diluirse 1:2 y repetir la
prueba. Multiplicar el resultado por 2, que es el factor de dilución.
NOTA:
Muestras ictéricas y ligeramente lipémicas requieren una muestra blanco .Usando
el mismo esquema, para pipetear mezclar 10 µL de muestra con 1000 µL del
reactivo de trabajo, en éste caso debe restarse la absorbencia de la muestra
blanco (Amuestra blanco) de la absorbencia de la muestra (Amuestra).
SENSIBILIDAD
El nivel mínimo detectable es de 0.07 mmol/L.
PRESICION.
INTRAENSAYO.
MUESTRA NIVEL 2 NIVEL 3
Media (mmol/L) 0.95 1.98
SD 0.016 0.028
CV (%) 1.64 1.39
n 20 20
152
INTERENSAYO.
MUESTRA NIVEL 2 NIVEL 3
Media (mmol/L) 0.94 1.99
SD 0.02 0.031
CV (%) 2.14 1.56
n 20 20
COMPARACION DE METODOS.
El método randox (Y) se comparó con otro equipo disponible comercialmente (X).
35 muestras de pacientes con valores que iban en el intervalo de 0.60-1.91
mmol/L se probaron. El análisis de regresión lineal de los datos resultó en la
siguiente ecuación:
Y=1.084 X-0.082
Con un coeficiente de correlación, r=0.992.
BIBLIOGRAFIA.
1. Mann, C.K., Yoe, J.H., Anal. Chem. (1956), 28:202-205.
2. Mann, C.K., Yoe, J.H., Anal. Chem. (1957), 16:155-160.
3. Ogata, H. Hiroi, L. Anal.Chem. (1959), 8:21.
4. Bohuon, C., Clin. Chim. Acta. (1962), 7:811-817.
5. Rice, E.N., Lapara, C. Z., Clin. Chim. Acta. (1964), 10:369.
6. Teitz, N.W. Clinical Guide to laboratory Tests. W.B. Saunders Co. (1983)
153
F) CALCIO.
El calcio es el elemento mineral más abundante en el cuerpo humano, con
aproximadamente el 99% principalmente en los huesos como hidroxiapatita. El
resto del calcio es distribuido entre varios tejidos y fluidos extracelulares. El calcio
está asociado a la coagulación de la sangre, conducción neuromuscular,
excitabilidad del esqueleto y músculo cardiaco y la actividad enzimática.
Los niveles de calcio en el suero se controlan por medio de hormonas paratiroidea
y vitamina D. Un desequilibrio en cualquiera de estos moduladores, puede dar
lugar a alteraciones del nivel de calcio en el suero.
Los aumentos en suero de pH o vitamina D se asocian normalmente con
hipercalcemia, la cual pude dar lugar a mieloma múltiple y otras enfermedades
neoplásicas. La hipocalcemia se observa en hipoparatiroidismo, nefrosis y
pancreatitis.
DETERMINACION DE CALCIO METODO DEL ARZENAZO III DE RANDOX.
FUNDAMENTO.
El arzenazo III se une específicamente al calcio formando un complejo colorido a
650 nm.
Ca+2 + Arzenazo III Complejo colorido.
La cantidad de calcio presente en la muestra es directamente proporcional a la
intensidad del complejo colorido formado.
MUESTRA.
Suero o plasma.
NOTA: NO USAR oxalato sódico, EDTA o fluoruro sódico como anticoagulantes,
ya que interfieren en el análisis, por lo que deberán ser evitados. El suero es
estable durante 8 horas a temperatura ambiente o 24 h cuando se conserva entre
2-8°C.
154
REACTIVOS.
COMPONENTES CONCENTRACION DE LOS INICIAL DE

LOS REACTIVOS.
1. Reactivo arzenazo III
Acetato sódico 90 mmol/L, pH 5.9
Arzenazo 348 µmol/L
Estabilizadores no reactivos

cuando se conservan entre 15-25°C.
PROCEDIMIENTO.

Temperatura 25/30/37ºC.
Medición Frente al aire.

Patrón ---- 15µL ----
Reactivo 1 1000µL 1000µL 1000µL
Mezclar e incubar durante 5 minutos a 37ºC. Medir la absorbencia de la muestra o

el patrón frente al blanco de reactivo.
155
CALCULOS.
Concentración de cloro en la muestra = Amuestra X concentración del patrón.
A del patrón
NOTAS.
Las interferencias no especificadas de la absorbencia se corrigen añadiendo reactivo
EDTA, el cual elimina el calcio del complejo colorido Arzenazo cálcico III y permite la
medición exacta del blanco de muestra.
CONTROL DE CALIDAD.

Un control (nivel 1 o 2) debe analizarse después de cada 10 muestras. Los valores

obtenidos deben caer dentro del intervalo especificado. Si estos valores están
fuera del intervalo, para excluir el error es necesario revisar los siguientes puntos.
LINEALIDAD.
Este método es lineal hasta 17.0 mg/dL (4.25mmol/L). Para muestras superiores,
diluir 1:2 y repetir la prueba. Multiplicar el resultado por 2.
PRECAUCIONES.
laboratorio.
156
NIÑOS (HASTA 1 MES) 7-11.5 mg/dL (1.75-2.87 mmol/L)

1 MES-1 AÑO. 8.6-11.2 mg/dL (2.15-2.79 mmol/L)
ADULTOS 8.5-10.5 mg/dL (2.05-2.54 mmol/L).
BIBLIOGRAFIA.
1. Teitz, N.W. Clinical Guide to laboratory Tests. W.B. Saunders Co. (1983).
2. Michaylova, V. y Ilikova, P. Anal. Chem. Acta, 53:194 (1971).
3. Jacobs, D. S. Laboratory Test Handbook. 2nd ed. 1990.
4. Young, D. y Pestaner, L. Clin. Chem. 21:5 (1975).
METODO DE LA DETERMINACION DE CALCIO TOTAL LIQUICOLOR. METODO

PARA LA DETERMINACION COLORIMETRICA CUANTITATIVA DE CALCIO TOTAL
EN SUERO, PLASMA U ORINA DE STANBIO.
A excepción del método de electrodo ión selectivo (Calcio libre) y de la

espectrofotometría de absorción atómica (Calcio total), los cuales son sofisticados
y costosos, el método más simple y barato para la determinación de calcio total
está basado en la combinación directa de algunos reactivos, tales como el de orto-
cresoftaleína complejona (OCPC), para formar una reacción de color estable. Tal
procedimiento elimina la precipitación de calcio o proteína, como se requería en un
principio según los reportes de Stern y Lewis y de Connerty y Briggs.
El método presentado esta basado esencialmente en el micrométodo de Sarker y
Chauhan, donde el calcio se disocia de las proteínas en solución ácida, seguido
por una reacción directa con el OCPC. En un subsecuente medio alcalino el
157
complejo Ca-OCPC forma un color púrpura, el cual posteriormente se mide a 550
nm. La cantidad de calcio en la muestra es proporcional al color desarrollado en la
reacción. La interferencia de magnesio se bloquea por la 8-hidroxiquinoleína y
otros metales pesados son controlados por el cianuro de potasio.
REACTIVOS.
REACTIVO DE COLOR PARA CALCIO TOTAL.

Solución de o-Cresoftaleína complejona 7.5 mg/dL y 8-hidroxiquinoleína, 250
mg/dL en ácido clorhídrico diluido.
REACTIVO BASE DE CALCIO TOTAL.

Solución de 2-amino-2-metil-1-propanol en cianuro de potasio acuoso 50 mg/dL.
ESTANDAR DE CALCIO TOTAL (10 mg/dL).
PRECAUCIONES.
Para uso de diagnóstico In Vitro. No pipetee el reactivo de color y el de base con
la boca.

Se deben mezclar volúmenes iguales de reactivo base y de color para preparar el
reactivo de trabajo. Permitir que el reactivo se estabilice por 15 minutos antes de
utilizarlo. El reactivo de trabajo es estable por 7 días cuando se almacena a
temperatura ambiente o por 14 días cuando se mantiene en refrigeración.

El reactivo de color, el reactivo base y el estándar de calcio, almacenados en
refrigeración son estables hasta la fecha de caducidad que marca la etiqueta.
Llevar a temperatura ambiente antes de su uso.
158
Suero: Remueva el coágulo pronto y con cuidado para evitar la hemólisis, en un

periodo no mayor a 2 horas.

litio.
Orina: Las muestras de orina (24 h de su recolección) deberán mantenerse a un

pH ácido para prevenir la precipitación, para tal efecto utilice 10 mL de HCl 6 N, en
el recipiente de recolección de la muestra. En muestras de orina precipitadas
puede redisolverse por acidificación de una alícuota bien mezclada a un pH de 1
con HCl concentrado.
El plasma o el suero refrigerados o congelados deben llevarse a temperatura
ambiente y mezclarse bien antes de su análisis. Las muestras que presenten un
precipitado no deben ser analizadas, ya que el calcio se puede combinar con los
ácidos grasos o las proteínas.
Los niveles de sodio permanecen estables por lo menos 14 días de 20-25°C.
INTERFERENCIAS.
y se almacena en un área que no contenga polvo. Debe evitarse el uso de agentes
quelantes del calcio como son oxalatos y el EDTA. Concentraciones elevadas de
bilirrubinas y hemoglobina pueden dar como resultado concentraciones falsas
bajas de calcio.
159
PARAMETROS DE LA PRUEBA.
Longitud de onda 550 nm.

Dirección de la reacción Incremento.
Temperatura de la reacción 37°C.
Relación de la muestra/reactivo 1:100.
Tiempo de equilibrio 4 segundos.
Tiempo de lectura 3 segundos.
Tiempo lag 60 segundos.
Absorbencia límite del blanco 0.200 A.
Máxima absorbencia 2.000 A.
Linealidad 15 mg/dL.
pH 10 ± 1.0
Absorbencia inicial < 0.200.
Estándar 10 mg/dL.
PROCEDIMIENTO MANUAL.
1. Pipetee en los tubos marcados los siguientes volúmenes (mL):

mL mL
Estándar 10 ---- 0.01 ----
mg/dL
trabajo
2. Mezcle el contenido de todos los tubos.
160
3. Incube los tubos por 1 minuto a 37°C.
4. Transfiera con cuidado la mezcla de reacción a la celdilla apropiada.
5. Con el espectrofotómetro a 550 nm calibre a cero el instrumento con el blanco
de reactivos. Lea y registre la absorbencia del estándar y de la muestra en un
periodo de 60 min.
NOTA.
Las muestras de orina con valores de absorbencia que exceden del límite de
linealidad (15 mg/dL) deben ser diluidos 1:3, repetir el ensayo y multiplicar por el
factor de dilución de 3.
CONTROL DE CALIDAD.
Stanbio.
RESULTADOS.
Calcio en suero, plasma u orina en mEq/L= AM x 10

AE
Donde AM y AE; representan la absorbencia de la muestra y estándar

respectivamente y 10 es el valor del estándar de potasio en mEq/L.

apropiado.
161
Calcio en orina (mg/24h)=Calcio en orina X factor de dilución X volumen de 24h
(mL)
100
Suero/plasma: 8.5-10.5 mg/dL
Orina 100.00-240.00 mg/24h (varía con la dieta).
REPRODUCIBILIDAD.
Se realizó un estudio sobre un pool de muestras con un valor promedio de 10.5
mg/dL, se repitió en 20 ocasiones durante 10 días siguiendo el método descrito,
encontrándose una desviación estándar (SD) de 0.04 mg/dL y un coeficiente de
variación (CV) de 0.4%.
CORRELACION. La determinación de Calcio en 27 pacientes por el método

automatizado SMA 12/60 de O-cresoftaleína complejona (x) y por el método
descrito (y) se obtuvieron respectivamente valores promedio de calcio de 10.1 y
10.5 mg/dL (intervalo de 7.7-11.6 mg/dL) respectivamente. El análisis estadístico
mostró un coeficiente de correlación (r) de 0.935 con una ecuación de regresión
y=0.913x + 0.887.
LINEALIDAD. Cuando se realiza como indica, él método es lineal hasta 15 mg/dL.

Las muestras que excedan este valor tendrán que diluirse y multiplicar el resultado
por el factor de dilución.
162
REFERENCIAS.
1. Stem, J. Lewis, W.H.P. Clin. Chem. Acta. 2:576, 1957.
2. Connerty, H. V. Briggs, A.R., Am J Clin Pathol. 45:290, 1966.
3. Sarkar, B. C. R. Chauhan, U. P. S. Anal. Biochem. 20: 155, 1967.
4. Weissmen, N. Pileggi, V.J. In clinical chemistry-Principles and Technics. 2nd ed.

Ed. Harper and Row, Hagerstown. 1974, pp 646-669.
163
3.2. EXAMEN GENERAL DE ORINA.
INTRODUCCION.
Las muestras líquidas de orina se han descrito como una biopsia líquida de lso
tejidos del tracto urinario, obtenida de forma indolora. Se trata de un material que
permite obtener una considerable información, de forma rápida y económica. Al
igual que cualquier otro método de laboratorio, los análisis de orina deben llevarse
a cabo de manera cuidadosa y perfectamente controlada.
El estudio de las muest5ras de orina puede plantearse desde dos puntos de
vista: el diagnóstico y tratamiento de enfermedades renales o del tracto urinario, y
la detección de enfermedades metabólicas o sistémicas no directamente
relacionadas con el sistema urinario.
El estudio de la orina se compone de tres tipos de exámenes que son: el físico
cuyo objetivo principal es la de conocer el aspecto en la que se encuentra esa
orina la cual involucra el color, el pH, peso específico, densidad, el químico en el
dual se detectan diferentes componentes que no deben presentarse en la orina
como glucosa, proteínas totales, hemoglobina, bilirrubinas, etc., y el examen
microscópico en el cual se involucra la observación del sedimento urinario en el
cual pueden encontrarse cristales, bacterias, levaduras, células como glóbulos
rojos, blancos o bacterias.
Hace algún tiempo las características químicas se estudiaban
independientemente una de otras, lo que hacía una metodología muy laboriosa,
hoy en día se cuenta con tiras reactivas de las marcas como Bililabstix, N Multistix
SG, de Ames Company, Combur test de Boehringer han simplificado y disminuido
el tiempo de análisis, los cuales dan una apreciación cualitativa de la presencia de
algún metabolito, por lo que si salen positivas deben cuantificarse por otras
metodologías.
IMPORTANCIA CLINCIA.
Algunos padecimientos renales y extrarrenales de las vías urinarias modifican
las características normales de la orina. Por esto, el examen proporciona
164
información valiosa del estado en el que se encuentra el riñón. Por lo que esta
metodología esta indicada en pacientes que presentan padecimientos como: la
Diabetes mellitus, diabetes insípida, hiperinsulinismo, hipertiroidismo, acromegalia,
síndrome de Cushing, hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca congestiva,
insuficiencia hepática, ictericia, patologías biliares, cirrosis, trastornos renales
como síndromes renales y de vías urinarias.
OBJETIVO.
El alumno determinará las características físicas, químicas y microscópicas de la

orina y algunos de los factores que pueden modificarlos en condiciones
fisiológicas normales y patológicas.
Orina de emisión reciente, se prefiere la primera muestra de la mañana.
PROCEDIMIENTO.
A) EXAMEN FISICO.
Las características físicas de la orina no son diagnósticas pero pueden sugerir
las pruebas que serán necesarias realizar en la muestra, cuando se presentan
anormalidades.
COLOR.
La orina posee un color amarillo claro o ámbar, debido al urobilinógeno en mayor
proporción y pequeñas cantidades de urobilina y uroeritrina. El color de la orina
varía dependiendo de la concentración de los pigmentos resultantes de la dieta, de
medicamentos y de la presencia o ausencia de sangre.
Algunas causas de las diferentes coloraciones de la orina se enlistan a
continuación.
165
COLOR CAUSA DE TAL COLORACION
Lechosa Partículas de grasa o pus.
De amarillo a ámbar Urobilina, vitaminas del complejo B,
bilirrubina
De amarillo oscuro a café rojizo Concentración urinaria, cloroquina.
Rojo Uroporfirinas, coproporfirinas,
hemoglobina, mioglobina.
Rojo-café Sangre, ferrotiazidas.
Café a café-negro Hematina, melalina, catecolaminas.
Amarillo-verdoso a café verdoso Pigmentos biliares.
Azul-verdoso Antidepresivos tricíclicos.
Negro u obscuro Fierro oral o inyectable, levodopa,
metildopa, metronidazol.
ASPECTO.
La orina normalmente es transparente y clara, la turbidez puede ser debida a

diferentes factores, tomando en cuenta que la orina se vuelve turbia cuando sus
componentes solubles se tornan insolubles debido a un cambio en el pH,
temperatura o a algún otro factor. Si la muestra tiene un pH alcalino la turbidez
puede deberse a la precipitación de fosfatos o carbonatos; si es ácida la turbidez
es ocasionada por la presencia de células sanguíneas y epiteliales o moco.
PESO ESPECIFICO O DENSIDAD.

El peso específico esta dado en la orina por la cantidad de sustancias sólidas
disueltas, normalmente es de 1.003 a 1.035 g/mL. Este parámetro se puede
determinar con un densitómetro o un refractómetro.
VOLUMEN.
El volumen de 24 horas generalmente oscila entre 800 y 1500 mL.
166
B) EXAMEN QUIMICO.
Esta fase del estudio de la orina se realiza mediante tiras reactivas de química
seca en la cual se encuentran impregnados los reactivos dentro de los cuales
miden lo siguiente.
DENSIDAD.
Mediante este ensayo se comprueba la concentración iónica de la orina y

correlaciona bien con el método de refractometría; se basa en la liberación de
protones por un formador de complejos en presencia de cationes. Esto provoca un
cambio de color del indicador, azul de bromotimol, de azul a verde azulado hacia
amarillo.
pH.
El reactivo para la medición del pH contiene los indicadores rojo de metilo y azul
de bromotimol. Esta combinación origina nítidas graduaciones cromáticas del
naranja al azul, pasando por el verde, en la zona de pH de 5 a 9.
GLUCOSA.
Se basa en la reacción específica de glucosa oxidasa. La D-glucosa se oxida

enzimáticamente a gluconato más peróxido de hidrógeno. La peroxidasa cataliza
la hidrólisis del peróxido de hidrógeno, con lo cual se oxida el indicador y se forma
un complejo colorido.
PROTEINAS.
167
Las tiras reactivas contienen una mezcla del regulador y el indicador 3’,3’’,5’,5’’-
tetraclorofenol-3,4,5,6-tetrabromosulfoftaleína, que en presencia de proteínas se
produce un vire del amarillo al verde pasando por el verde claro, según la
concentración de la proteína.
CETONA.
La prueba se basa en que el ácido aceto-acético y la acetona reaccionan con el

nitroprusiato y glicina en medio alcalino, se forma un complejo de color violeta. La
reacción es específica para estas dos cetonas.
HEMOGLOBINA.
La reacción se basa en el efecto peroxidásico de la hemoglobina o la mioglobina

que catalizan la oxidación del indicador cromático mediante un hidroperóxido
orgánico a un compuesto azul verdoso que sobre el papel reactivo amarillo
produce un cambio al color verde. Los eritrocitos intactos se hemolizan sobre el
papel reactivo la hemoglobina resultante inicia la reacción alrededor de los
eritrocitos originando puntos verdes visibles.
NITRITOS.
La reacción se basa en la prueba de Griess. La sulfanilamida reacciona en

presencia de un regulador ácido, con los nitritos presentes formando una sal de
diazonio, que a su vez reacciona con el tetrahidrobenceno-hidroxiquinolina para
formar un colorante azoico. La intensidad de la coloración roja constituye una
medida de la concentración de los nitritos presentes en la orina.
LEUCOCITOS.
Para esta prueba en el cojinete se tiene un éster de indoxilo que es convertido
por las esterasas que contienen los leucocitos, .que se oxida bajo la acción del
168
oxígeno del aire a azul índigo, por lo que se produce un cambio de color amarillo a
azul.
UROBILINOGENO.
La sal de diazonio (p-metoxibencenodiazoniofluoroborato), reacciona

intensamente con el urobilinógeno en medio ácido del papel reactivo, formando un
compuesto azoico, rojo. La intensidad de la coloración roja constituyen una
medida de la concentración del urobilinógeno presente.
BILIRRUBINA.
Se basa en la reacción de la bilirrubina con una sal de diazonio en el medio

ácido del papel, formando un compuesto azoico rojo violeta.
C) CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS.
En condiciones normales la orina tiene un número pequeño de células y

elementos acarreados en todo el trayecto del conducto genitourinario, cilindros,
células epiteliales de la neurona, uréteres, vejiga y uretra, filamentos mucosos,
espermatozoides, etc. Unos cuantos eritrocitos o leucocitos llegan a la orina por
diapédesis, desde cualquier parte del aparato urinario.
Este examen permite de manera cualitativa ver el sedimento urinario, que resulta
al centrifugar la orina, de esta manera se puede confirmar alguna patología.
Dentro de los elementos que pueden observarse en el sedimento se encuentran:
a) SUSTANCIAS QUÍMICAS CRISTALINAS.
Estas sustancias se encuentran en estados fisiológicos y patológicos. Para su

identificación se requiere conocer el pH.
169
CRISTALES DE LA ORINA ACIDA NORMAL.
Uratos amorfos (Uratos de calcio, magnesio, sodio y potasio). El material amorfo

precipita en la orina concentrada a un pH ligeramente ácido en forma de pequeños
gránulos amarillo-pardos. La precipitación global de la muestra de orina puede
adoptar un color rosa naranja o pardo rojizo, que a veces se llama “polvo de
ladrillo”.
Uratos cristalinos (de sodio, potasio y amonio). Los biuratos y uratos ácidos
forman pequeñas esferas pardas o agujas incoloras en la orina ligeramente ácida.
Ácido úrico cristalino. Los cristales se forman a un pH de 5.0 a 5.5. Tienen
distintas formas, en general con colores. Típicamente presentan cuatro lados y
son planos, amarillos de color pardo rojizo, Otras formas: placas romboides o
prismas, ovales con extremos afilados (en forma de limón), en cuña, rosetas o
placas irregulares.
Oxalatos de calcio. Los dihidratados aparecen a pH 6.0 o en orinas neutras. De
forma típica son pequeños, incoloros y octaédricos, recordando sobres de carta.
También pueden ser grandes, a veces en grupos.
CRISTALES DE LA ORINA ALCALINA NORMAL.
Son los fosfatos, que forman sales solubles de sodio y potasio y menos solubles
de calcio y magnesio. Estas últimas son las menos solubles de la orina alcalina.
Fosfatos amorfos (calcio y magnesio). Gránulos incoloros amorfos que aparecen
en la orina de pH alcalino o ligeramente ácido. Se observan en forma de
acumulaciones o masas.
Fosfatos cristalinos. Fosfato triple (fosfato amónico magnésico). Se presentan a
pH alcalino, a menudo con infección presente. Muestran un tamaño variable.
Prismas incoloros con tres a seis lados y extremos oblicuos denominados en “tapa
de ataúd”, menos a menudo en forma de helecho plano.
Carbonato de calcio. Rara vez se presentan. Pequeños gránulos o esferas
incoloras.
170
Biurato de amonio. Urato cristalino que se forma en orinas alcalinas; también se
observa en las neutras y a veces en las ligeramente ácidas.
CRISTALES DE ORINA PATOLOGICA.
Siempre se debe comprobar la medicación que esta recibiendo el paciente

cuando se encuentran cristales anormales. Entre los cuales se pueden presentar
los siguientes tipos de cristales.
CISTINA. Aparecen a pH ácido son placas incoloras hexagonales, a veces en

parejas. Pueden confundirse con los de ácido úrico. Para confirmar su presencia
se debe realizar la reacción de cianuro-nitroprusiato que se describe para la
cistinuria.
TIROSINA. Son muy raros. Son finas agujas sedosas que pueden disponerse en
acumulaciones o haces. Son de color amarillos o incoloros. Parecen negros al
enfocar al microscopio. Son menos solubles que los de leucina por lo que
precipitan más a menudo.
LEUCINA. Son muy raros. Se presentan en forma de esferas amarillentas de
aspecto aceitoso con estriaciones radiales y concéntricas.
CRISTALES DE SULFONAMIDAS. Se observan en orinas de pH ácido, en
general inferior a 6.0, aparecen en varias formas, como en roseta, puntas de
flecha o en agujas, en ocasiones son incoloros, pero en general son pardos
amarillentos.
AMPICILINA. (a altas dosis). Aparecen en pH ácidos. Cristales largos, finos e
incoloros.
MEDIOS DE CONTRASTE RADIOLOGICO. (diatrizoato de meglumina). Se
observan a pH ácido. Se encuentran durante un breve intervalo tras los estudios
radiológicos con contraste intravenoso. Forman placas romboidales, incoloras,
claras y planas, o rectángulos más finos y largos.
171
b) CELULAS.
GLOBULOS ROJOS.
La cifra normal es de 0-2 eritrocitos por campo con objetivo seco fuerte. Se
pueden presentar un incremento en la orina debido a trastornos renales, como en
la glomerulonefritis, cálculos, tumores, infecciones agudas, tuberculosis,
trombosis, etc.
LEUCOCITOS.
La cifra normal es de 0-10 por campo con objetivo seco fuerte. En trastornos
renales del tracto urinario se produce un aumento en el número de leucocitos,
principalmente de neutrófilos. También se puede presentar un aumento en el
ejercicio intenso y durante la fiebre. Otras causas del aumento en el número de
leucocitos se encuentran en infecciones medianas y severas, así también en
procesos litiásicos y tumores.
CELULAS EPITELIALES.
Las células epiteliales del túbulo renal aumentan en caso de necrósis, isquemia
del riñón, glomerulonefritis aguda, etc.
CELULAS EPITELIALES DE TRANSICION.

Se pueden encontrar en la orina debido al proceso normal de descamación, la
presencia de grandes cantidades de estas células en forma de masas celulares
exige la realización de una tinción de papanicolau, para descartar la presencia de
un carcinoma.
c) CILINDROS.
Microscópicamente los cilindros se caracterizan por:
1. Su apariencia de la matriz: hialinos y granulosos.
172
2. Su procedencia celular: Eritrocitos, leucocitos, células epiteliales de los túbulos
renales.
Para el estudio microscópico del sedimento urinario, los cilindros se clasifican en
fisiológicos y patológicos. Los cilindros de tipo fisiológico se encuentran los
hialinos, lo cuales pueden aparecen en la orina por ejercicio, deshidratación o
fiebre y los cilindros granulosos con gránulos finos refringentes, pueden parecer
por ejercicio, deshidratación, fiebre, acumulación de proteínas.
Los cilindros patológicos pueden aparecer con o sin células. Los cilindros con
células como los eritrocitarios son granulares y de color rojo obscuro con
eritrocitos intactos, aparecen debido a sangrado del parénquima renal asociado a
inflamación tubulointersticial.
Los cilindros de leucocitos son granulares, transparentes o céreos, contienen
neutrófilos segmentados. Causas: inflamación renal asociado a inflamación
tubulointersticial (pielonefritis en enfermedad glomerular).
Los cilindros de epitelios tubulares son transparentes, granulosos o céreos,
contienen células tubulares intactas o células necróticas. Son producidos por daño
renal y tubular asociado a necrósis tubular aguda y la enfermedad tubulointersticial
Dentro de los cilindros patológicos sin células se encuentran los cilindros
granulosos los cuales son semitransparentes con gránulos gruesos refringentes,
estos se presentan por degeneración celular y a la acumulación de proteínas.
Los cilindros céreos son altamente refringentes, con bordes irregulares. Estos se
presentan en degeneración celular. Otros cilindros como los de fibrina se
presentan como fibrillas muy finas transparentes y granulosos, estos se observan
en pacientes con problemas de coagulación asociados a enfermedades
glomerulares y trombosis.
Los cilindros biliares céreos se presentan como cilindros transparentes de color
amarillo intenso. Su causa es debido a la liberación de sales biliares asociado a
disfunción hepática y a enfermedad tubulointersticial.
MATERIAL Y EQUIPO.
Microscopios.
173
Gradillas.
Pipetas pasteur.
Cubreobjetos.
Portaobjetos.
Tubos de ensaye de 13 x 100 mm.
Propipeta o bulbo.
Centrífuga clínica.
Densitómetro o refractómetro.
A) EXAMEN FISICO Y QUIMICO

1. Colocar en un tubo de ensaye la muestra de orina de recién emisión. Anotar el
color y el aspecto.
2. Introducir una tira reactiva dentro del tubo hasta cubrir completamente los
cojinetes de ésta.
3. Sacar la tira de la orina y secar el exceso.
4. Con ayuda de la tira de colores anotar los datos de pH, densidad, o peso
específico.
5. Para el ensayo químico anotar presencia o ausencia de proteínas, sangre,
leucocitos, nitritos, glucosa, cetona, urobilinógeno, bilirrubina.
NOTA: El tiempo que debe pasar entre la introducción de la tira y lectura no es
más de 1 minuto.
B) EXAMEN DEL SEDIMENTO.
6. Posteriormente el tubo de ensaye con orina, se centrifuga, a 1800 rpm por 5

minutos.
7. Decantar el exceso de sobrenadante.
8. Colocar una gota del sedimento entre porta y cubreobjetos y observar a seco
fuerte.
9. Contar el número de leucocitos, eritrocitos, cilindros por campo, reportar la
presencia de cristales, levaduras o bacterias por número de cruces.
174
BIBLIOGRAFIA
1. Tietz, N. Fundamentals of Clincial Chemistry . W. B. Saunders Co. Philadelphia.

1998
Estados Unidos.
175
4. DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES Y ALBUMINA
INTRODUCCION.
Las proteínas con macromoléculas constituidas por cadenas de aminoácidos
unidos por enlaces peptídicos. Estas moléculas cumplen funciones esenciales en
todos los organismos vivos entre las cuales se incluyen, transformaciones
químicas, transporte, control metabólico, función estructural o de sostén, de
defensa, etc.
La ingesta diaria de estas proteínas en el organismo es de 70-100 g de
proteínas diarias. La digestión y absorción de las proteínas es un proceso muy
eficiente, lo que permite sólo una excreción de 6-12 g de proteínas en forma de
compuestos nitrogenados no proteicos (como la urea, ácido úrico y creatinina).
Las proteínas en el suero permiten una adecuada presión oncótica lo que
establece un equilibrio en el transporte de diferentes sustancias en la sangre.
Cuando se fraccionan las proteínas del suero se encuentran dos fracciones
importantes en basa a su solubilidad y estas son: la albúmina y las globulinas,
estas últimas a su vez presentan 4 entidades diferentes como son las globulinas,
alfa 1, alfa 2, beta y la gamma.
Desde el punto de vista clínico la determinación de los niveles de estas
proteínas séricas totales, albúmina y globulinas resulta importante pues sus
niveles nos pueden reflejar el estado general de un paciente.
Existen diferentes metodologías para medir los niveles de proteínas presentes en
el suero, las más utilizadas son el método de Biuret para proteínas totales y de la
albúmina por medio de indicadores de pH que se conjugan a la albúmina.
OBJETIVO.
El alumno determinará los niveles de proteínas totales y albumina en el suero

mediante la metodología de Biuret y de Henry respectivamente, por el método
descrito para ambas determinaciones según Diagnostic Chemical Limited.
176
Una deficiencia exagerada de proteínas en la dieta y ciertas condiciones

patológicas que involucran la absorción intestinal, dan como resultado una baja
concentración de proteínas séricas (hipoproteinemia), lo que puede ser indicativo
de desnutrición, alguna enfermedad hepática o un síndrome nefrótico y los niveles
altos de proteínas principalmente de globulinas nos indican alguna
hipersensibilidad a diferentes antígenos.
4.1 METODOLOGIA PARA LA DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES

POR EL METODO DE BIURET
Solución patrón de proteínas. Con concentración de 6 – 8 g /dL en solución salina

fisiológica.
Solución de hidróxido de sodio al 3%.
Reactivo de Biuret.
Solución A. Disolver 17.3 g de sulfato de cobre pentahidratado en

aproximadamente 100 mL de agua caliente.
Solución B. Disolver 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio

anhidro, en aproximadamente 800 mL de agua, se recomienda calentar para
efectuar la disolución.
Cuando se han enfriado ambas soluciones, en un matraz aforado de 1000 mL,
colocar la solución B agitando a la solución A y aforar con agua destilada a la
marca de 1000 mL. Este reactivo se conserva de manera indefinida a temperatura
ambiente.
177
RECOLECCION DE LA MUESTRA
Las muestras se obtienen por punción venosa. Se recomienda inmediatamente
la separación del suero del paquete celular para evitar hemólisis. Las proteínas
presentes en el suero son estables durante 4 horas a temperatura ambiente y
durante 24 horas en refrigeración. Las muestras pueden almacenarse por varias
semanas si se congelan a -10 ºC.
PROCEDIMIENTO.
La metodología aquí empleada sigue la linealidad de la ley de Bouger-Beer
hasta 15 g/dL
1. Colocar en tres tubos de ensayo de 13 x 100 mm lo siguiente:

Agua destilada 0.1 mL --- ---
Solución patrón de 0.1 mL ---
proteínas
Suero Problema 0.1 mL
Solución de 3.0 mL 3.0 mL 3.0 mL
hidróxido de sodio
3%
Reactivo de Biuret 0.5mL 0.5mL 0.5mL
2. Agitar perfectamente cada uno de los tubos y dejar reposar durante 15 minutos.
3. Leer la absorbencia en un espectrofotómetro a 545 nm, ajustando a 0 con el

blanco de reactivos.
CALCULOS
Proteínas totales g/dL= Absorbencia del problema X concentración del patrón g/dL
178
BIBLIOGRAFIA

1998
Estados Unidos.
4.2 DETERMINACION DE ALBUMINA.
INTRODUCCION.
Las técnicas para la determinación de albúmina por conjugación de colorantes,

aprovechan el llamado error de proteína de los indicadores. La adición de
proteínas a una solución de ciertos colorantes da lugar a la formación de un
complejo colorante-proteína que muestra propiedades ópticas diferentes a las que
posee solo la mezcla de colorante.
Existen pocos colorantes que se unen específicamente a la albúmina como el
anaranjado de metilo, el cual es poco sensible. Otro colorante utilizado es el verde
de bromocresol, el cual es más sensible que el anaranjado de metilo y la
metodología es lineal hasta 5 g/dL y ni otras proteínas interfieren con la
determinación como la hemoglobina ni la bilirrubina.
FUNDAMENTO.
El verde de bromocresol es un indicador de pH que cambia de amarillo a azul en
el intervalo de 3.8 a 5.4. A pH 4.0, la albúmina se une a él formando un complejo
que absorbe a 630 nm.
179
3.8 – 5.0 g/dL
SUSTANCIAS.
Hidróxido de sodio
Ácido láctico
Verde de bromocresol
Tween 20
Albúmina sérica recristalizada.
REACTIVOS.
Solución de hidróxido de sodio al 10%.

Solución concentrada de verde de bromocresol. En un matraz aforado a 1000 mL.
Colocar aproximadamente 800 mL de agua destilada, añadir 26 mL de hidróxido
de sodio al 10%, 30 mL de ácido láctico al 85%, 500 mg de verde de bromocresol
y 10 mL de tween 20. Mezclar, ajustar el pH a 4.0 con hidróxido de sodio 2 N y
aforar hasta la marca de 1000 mL con agua destilada.
Solución de trabajo de verde de bromocresol. (Se prepara al momento de

usarse) En un matraz aforado de 100 mL colocar 20 mL de la solución
concentrada de verde de bromocresol y aforar con agua destilada hasta la marca
de 100 mL.
Solución patrón de proteínas. (2.5 g/dL) en solución salina fisiológica.
RECOLECCION DE LA MUESTRA
Las muestras se obtienen por punción venosa. Se recomienda inmediatamente
la separación del suero del paquete celular para evitar hemólisis. Las proteínas
presentes en el suero son estables durante 4 horas a temperatura ambiente y
durante 24 horas en refrigeración. Las muestras pueden almacenarse por varias
semanas si se congelan a -10 ºC.
180
PROCEDIMIENTO.
1. Colocar en tres tubos de ensayo de 13 x 100 mm lo siguiente:

Solución de 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
trabajo de verde
de bromocresol
Agua destilada 10 µL ----- -----
Solución patrón de ----- 10 µL ----
proteínas 2.5 g/dL
Suero o plasma 10 µL
2. Agitar perfectamente cada uno de los tubos dejar reposar 1 min.
3. Leer la absorbencia en un espectrofotómetro a 630 nm, ajustando a 0 con el

blanco de reactivos.
CALCULOS
Albúmina g/dL= Absorbencia del problema X concentración del patrón g/dL

BIBLIOGRAFIA

1998
Estados Unidos.
181
5. ENZIMOLOGIA CLINICA
INTRODUCCION.
Las enzimas generalmente son proteínas altamente especializadas cuya función
en los sistemas biológicos es la de actuar como catalizadores de las reacciones
que se llevan a cabo en el organismo.
Su poder catalítico es superior al de los catalizadores sintéticos. Presentan un
elevado grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran reacciones
químicas específicas y funcionan en soluciones acuosas en condiciones muy
suaves de temperatura y pH. Existen pocos catalizadores no biológicos que
tengan todas estas propiedades.
Las enzimas constituyen una de las claves para conocer de qué modo
sobreviven y proliferan las células. Actuando en secuencias organizadas catalizan
cientos de reacciones consecutivas en las rutas metabólicas mediante las que
degradan nutrientes, se conserva y transforma la energía química y se fabrican las
macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos. (1)
Por ejemplo el CO2 reacciona con el agua para formar H2CO3, parte del cual se
ioniza inmediatamente en condiciones fisiológicas de pH para formar iones HCO3-.
La disociación, por supuesto, no depende de la catálisis enzimática ya que es una
propiedad de la estructura del ácido. La reacción se presenta a continuación.
H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-
La descomposición no catalizada del H2CO3 en H2O y CO2 no ocurre

instantáneamente, la velocidad de reacción es de hecho lenta, el verdadero
equilibrio no puede ser alcanzado hasta por una hora o más. Si uno toma una
muestra de agua carbonatada y adiciona la enzima anhidrasa carbónica el
equilibrio se alcanza en cuestión de minutos o menos. Los glóbulos rojos de
nuestra sangre son especialmente ricos en esta enzima y su presencia en estos
elementos formes de la sangre promueve rápidamente su interconversión CO2 y
HCO3- a través de la forma del intermediario no disociado el ácido carbónico. (2)
182
Muchas enzimas requieren constituyentes no proteicos para su función catalítica
como son los cofactores (generalmente iones inorgánicos), coenzimas (moléculas
orgánicas pequeñas) y grupos prostéticos (moléculas orgánicas que se unen
covalentemente a la molécula proteica). El complejo completo de proteína más
factor accesorio de cualquier tipo requerido para la catálisis se le conoce como
holoenzima y la porción proteica sin factor accesorio se le conoce como
apoenzima. (1)
El interés creciente de la enzimas de tipo clínico empezó hace más de medio
siglo, con la demostración de la utilidad de los niveles de fosfatasa alcalina en el
diagnóstico de las enfermedades óseas y hepatobiliares, de los niveles de
fosfatasa ácida en el diagnóstico del carcinoma de próstata y de los niveles de
amilasa y lipasa en el diagnóstico de pancreopatías. Pese a la utilidad clínica de
estos parámetros en la enfermedad y a la demostración de un número
determinado de otras enzimas séricas durante los siguientes 25 años, el interés
clínico de la enzimología sérica se mantuvo en relativo letargo hasta 1953.
La demostración de ese año de la alanina-aminotransferasa (ALT) y de la
aspartato-aminotransferasa (AST) en el suero de individuos normales y las
observaciones subsiguientes de que el aumento de los niveles de esta enzima
eran útiles en el diagnóstico de las enfermedades cardiacas y hepáticas
condujeron a una acentuada intensificación del interés de la enzimología. (3)
En la actualidad, se han identificado en el suero más de 50 enzimas. Los niveles
de muchas enzimas se han estudiado intensamente en una gran variedad de
procesos. Se han aplicado algunas pruebas de enzimas séricas ampliamente en
algunos problemas clínicos que ya se consideran determinaciones habituales en el
laboratorio. Otras aunque muestran ser claramente un reflejo de diversas
enfermedades, se llevan a cabo en pocos laboratorios clínicos, debido a que la
prueba en sí es técnicamente difícil. Otras pruebas tienen interés solo de
investigación más que de interés clínico o bien sólo tienen interés en situaciones
clínicas especiales. (4)
Para que una determinación enzimática sea considerada de utilidad clínica, debe
satisfacer los siguientes requisitos:
183
1. Tener la suficiente especificidad como para permitir un diagnóstico de daño
tisular.
2. Ser altamente sensible como para detectar un daño tisular intermedio.
3. Ser liberado rápidamente del tejido dañado.
4. Aparecer en cantidades proporcionales a la intensidad del daño tisular.
5. Permanecer en el plasma durante horas, para dejar una ventana diagnóstica.
6. Ser fácil de medir técnicamente. (5)
Las enzimas son únicas en cuanto a que su presencia en el suero puede

detectarse de manera cuantitativa simplemente añadiendo sustratos específicos a
éste y detectando sus índices de conversión al producto, o bien alternativamente
cuando es posible puede cuantificarse la presencia de la coenzima si ésta
participa directa o indirectamente en la reacción. A menudo la presencia de las
enzimas séricas se expresan en unidades de sus actividades más que en sus
concentraciones.
De forma general, se pueden considerar dos diferentes tipos de procedimientos
a) métodos de monitoreo continuo y b) métodos de monitoreo discreto.
En los métodos de monitoreo continuo involucra el seguimiento de la reacción
hasta que se llega a termino la reacción.
En los métodos de monitoreo discreto puede llevarse a cabo en un tiempo fijo o
de un punto o bien de varios puntos. En el primer método involucra la
determinación del producto formado o el sustrato consumido en un tiempo dado.
Todas las sustancias que participan en la reacción se incuban durante un tiempo
fijo, posteriormente se le adiciona la enzima sérica cuya actividad requiere
medirse, transcurrido el tiempo se cuantifica la cantidad de sustrato no
consumidoo la cantidad de producto formado; en muchos casos, esto sólo es
184
posible cuando se acopla una reacción química que transforma al producto o al
sustrato en un compuesto colorido.
El método de monitoreo discreto de varios puntos, involucra el seguimiento
ininterrumpido de la reacción durante cierto tiempo. (5)
OBJETIVO:
Entender la importancia que tiene la cinética enzimática en el laboratorio clínico

teniendo en cuenta los diferentes parámetros que son requisito indispensable
para llevar a cabo las determinaciones de las actividades enzimáticas de forma
correcta.
5.1 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y VELOCIDAD INICIAL

EN EL ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE UNA REACCIÓN. (6, 7)
MATERIALES Y METODOS.
Tubos de ensaye de 13 x 100 mm

Equipo de reactivos para la determinación de fosfatasa alcalina (Stanbio de Licon).
Pipetas de 5 y 10 mL
Micropipetas de volumen variable de 1-10 µL, 20-200 µL y de 200-1000 µL.
Baño de incubación a 37 ºC
Celdas de cuarzo
PROCEDIMIENTO.
1. Se estudiará la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP).
2. Se utilizarán reactivos de la marca en uso por el laboratorio.
185
3. Se utilizará un espectro con termorregulador y con celda de flujo, para incubar
la reacción a temperatura controlada.
4. Hacer diluciones seriadas 1:2 del sustrato con la solución reguladora (primero
sin diluir, después una dilución 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 y 1:256)
5. Mezclar la cantidad de suero adecuada con el sustrato sin diluir, leer cada
minuto a la longitud de onda adecuada, hasta que se agote el sustrato (cuando la
absorbencia se mantenga constante) para determinar el tiempo en que se
mantiene la velocidad inicial (Vi).
6. Repetir el paso 5 con cada dilución, pero tomando sólo las lecturas de los 5
primeros minutos (estar seguros que se tiene Vi o incrementos iguales, sino son
iguales tomar más lecturas).
7. Obtener los incrementos de absorbencias por minuto, calcular la concentración

de la actividad enzimática por volumen (U/L).
9. Construir la gráfica de actividad contra concentración del sustrato, y de los

dobles recíprocos.
10. Determinar la Km de la enzima y hacer notar que el reactivo contiene

aproximadamente 10 veces la Km.
186
5.2 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y
FASE DE RETARDO. (7, 8)
MATERIALES.

Equipo de reactivos para la determinación de aspartato-amino-transferasa (AST,
ASAT, GOT) de la marca que esté en uso en el laboratorio.
Pipetas de 5 y 10 mL
Baños de incubación de 15 ºC, 20 ºC, 25 ºC, 30 ºC, 37 ºC, 40 ºC y 45ºC.
Celdas de cuarzo
PROCEDIMIENTO
1. Se estudiará la actividad de la enzima Aspartato Amino Transferasa (AST,

ASAT, GOT).
2. Se utilizarán reactivos de la marca que este en uso en el laboratorio.
3. Se utilizará un espectro con termorregulador y con celda de flujo, para incubar

la reacción a diferentes temperaturas.
4. Los sustratos y el regulador se preparan de acuerdo a las instrucciones del

equipo comercial.
5. Preparar dos tubos uno con suero y otro con el sustrato e incubar ambos a
temperatura ambiente por 5 minutos.
6. Calentar el espectrofotómetro por 15 minutos y ajustar a cero con agua

bidestilada a la longitud de onda adecuado.
187
7. Adicionar la cantidad de suero adecuada y mezclar con el sustrato suavemente,
vaciar a la celda.
8. Tomar lecturas cada 20 segundos, durante 3 minutos para observar la fase de

retardo (fase lag). Si se mezcla rápidamente se observa en el primer minuto;
después tomar lecturas cada minuto hasta que no haya incrementos.
9. Ajustar la temperatura del baño maría a 37ºC, repetir desde el paso 7 con el
segundo tubo. Esperar 5 minutos más para que el portaceldas alcance la misma
temperatura.
10. Calcular los incrementos para cada intervalo de tiempo y el incremento

calculado. Con éste último, construir la gráfica de cambios de absorbencia contra
tiempo (segundos).
11. Determinar Vi y calcular la actividad enzimática (U/L) para cada temperatura y

el Q10.
12. Determinar la magnitud de los errores que se pueden cometer si no se

mantiene la temperatura controlada en estas mediciones.
188
5.3 ESPECTRO DE ABSORCION DEL NAD+ (NADP+) Y DE SUS FORMAS
REDUCIDAS. (3, 4)
MATERIALES Y METODOS.
NAD(P)+ marca sigma o bien un frasco de reactivo de cualquier equipo comercial
que este en uso en el laboratorio.
NAD(P)H + H+ marca sigma o bien un frasco de reactivo de cualquier equipo
comercial que este en uso en el laboratorio.
Pipetas de 5 mL
Celdas de cuarzo
PROCEDIMIENTO
a) DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DEL NAD(P)+.

1. Se empleará 2 mL de una dilución 1:10 de una solución de NAD(P)+ 1mg/mL en
agua destilada la cual se colocará directamente en una celda de cuarzo y se
tomaran lecturas de absorbencia usando las siguientes longitudes de onda: 220,
240, 260, 280, 300, 310, 320, 340, 350, 360, 370, 380, 400 nm contra blanco de
agua destilada.
2. Registrar las lecturas y construir una gráfica de absorbencia contra longitud de
onda.
NOTA: Para el caso que se utilice un frasco de la marca comercial en uso,
adicionar suero según la cantidad que especifique el reactivo y determinar el
sentido de la reacción y dejar actuar el tiempo indicado para obtener NAD(P)+ y
verter el contenido de la mezcla de reacción a la celda y continuar como se
especifica en la metodología anterior.
189
b) DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DEL NAD(P)H + H+
1. Se empleará 2 mL de una dilución 1:10 de una solución de NAD(P)H + H+
1mg/mL en agua destilada la cual se colocará directamente en una celda de
cuarzo y se tomaran lecturas de absorbencia usando las siguientes longitudes de
onda: 220, 240, 260, 280, 300, 310, 320, 340, 350, 360, 370, 380, 400 nm contra
blanco de agua destilada.
2. Registrar las lecturas y construir una gráfica de absorbencia contra longitud de
onda.
NOTA: Para el caso que se utilice un frasco de la marca comercial en uso,
adicionar suero según la cantidad que especifique el reactivo y determinar el
sentido de la reacción y dejar actuar el tiempo indicado para obtener NAD(P)+ y
verter el contenido de la mezcla de reacción a la celda y continuar como se
especifica en la metodología anterior.
BIBLIOGRAFIA.
1. Lehninger, A. L.; Nelson, D. L.; y Cox, M. M. (1993) Principios de Bioquímica 2ª.

ed. Ed. Omega. Barcelona.
2. Berg, J.M.; Tymoczko, J.L. y Stryer, L. (2002) Biochemistry. 5a ed. Ed. W.H.
Freeman and Company. Nueva York.
4. Voet, D y Voet, J. G. (2004) Biochemistry. 3a.ed. Ed. John Wiley and Sons. Inc.
USA.
5. http://www.fjd.es
190
6. Wenger C. et al. (1984) Alkaline phosphatase, Kaplan A. et al Clin Chem. The
C.V. Mosby Co. St. Louis. Toronto. Princeton; 1094-98.
7. Spinreact. (2005) Catálogo de pruebas de bioquímica clínica. Método Cinético

de p-Nitrofenilfosfato para la determinación cuantitativa de fosfatasa alcalina.
Método recomendado por la IFCC.
8. Murray, R. (1984) Aspartate aminotransferase. Kaplan A. et al Clin. Chem. The


de NADH-UV para la determinación cuantitativa de Aspartato aminotransferasa
191
6. VALORACION DE LA FUNCION HEPATICA
El hígado es el órgano más grande del cuerpo, con un peso aproximadamente

de 1.5 kg en el adulto. Se localiza por debajo del diafragma en el abdomen
superior. Su sistema circulatorio es único ya que tiene un doble aporte de sangre
que lo proporcionan la arteria hepática y la vena porta. Este rico aporte sanguíneo
es el responsable principal del color rojo a café rojizo del órgano. El hígado se
compone de de un gran número de unidades denominadas lóbulos hepáticos.
Pequeños espacios parecidos a canales entre los hepatocitos adyacentes forman
los canalículos biliares. Estos tubos colectan bilis y desembocan en los conductos
hepáticos. (1)
La función principal de este órgano es en el metabolismo celular, en el cual se le
ha dado el nombre de biotransformador, pues la mayoría de las modificaciones
que ocurren en el organismo de la mayoría de las sustancias propias o extrañas
son realizadas en el hígado a través del sistema de citrocromos presentes en las
células hepáticas. (2)
La función de las determinaciones de laboratorio en la valoración del estado del
hígado en la salud y en la enfermedad ha ido evolucionando continuamente de tal
forma que los exámenes de laboratorio están basados en la correcta comprensión
de su fisiopatología. Las mediciones clínicas o exámenes de laboratorio no se
usan solos, sino en unión con técnicas de obtención de imagen y operaciones de
biopsias. (2)
Los hepatocitos producen muchas proteínas diferentes. Algunas de estas son
enzimas y otras, proteínas de transporte. La actividad de varias enzimas, las
concentraciones de varias proteínas y las sustancias sintetizadas o almacenadas
por el hígado se utilizan para estimar el estado de éste, la capacidad del órgano
para sintetizar o convertir metabólicamente diversos compuestos y la capacidad
para segregar bilis. Estas se miden a menudo simultáneamente en diferentes
paneles, algunas veces pueden necesitarse determinaciones suplementarias
dictadas por el problema de que se trate. (3)
192
La medición de la mayoría de las sustancias se basa en la determinación de la
concentración en suero o de la cantidad excretada por la orina o la bilis en un
tiempo dado. Las enzimas sin embargo, se miden por su actividad, esto es por la
rapidez con la que se llevan a cabo sus funciones catalíticas. (2)
Las enzimas que rutinariamente se utilizan para la valoración bioquímica del
estado general del hígado son las aminotransferasas, alanina y aspartato
aminotransferasa y la fosfatasa alcalina. Así también se determinan los productos
del catabolismo de la hemoglobina, las bilirrubinas. Dependiendo de los niveles y
actividades que se encuentren de estas enzimas y metabolitos, puede estimarse la
posible patología de éste órgano, como puede ser, la enfermedad hemolítica del
recién nacido o incompatibilidad de grupo sanguíneo, en la cual los niveles de
aminotransferasas son normales y la bilirrubina indirecta es la única elevada. (2, 3)
6.1. AMINOTRANSFERASAS (TRANSAMINASAS)
Estas enzimas catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a

un alfa-cetoácido para formar un aminoácido diferente. Las actividades aspartato-
aminotranferasa (ASAT, AST, GOT) y alanino-aminotransferasa (ALAT, ALT, GPT)
han sido utilizadas como indicadores de lesión hepatocelular desde 1955. (2, 3, 4)
La primera transfiere el grupo amino del ácido aspártico del ácido
alfacetoglutárico para formar ácido oxalacético y glutámico. La última transfiere el
grupo amino de la alanina con el resto del ácido pirúvico. Las enzimas tienen vidas
medias en sangre de 17 y 47 horas, respectivamente. La ASAT está presente en
muchos órganos, aparte del hígado incluyendo el corazón y el músculo, mientras
que la ALAT se encuentra principalmente en el hígado. (2, 4)
6.1.1. ASPARTATO AMINOTRANSFERASA. (AST, ASAT. GOT)
INTRODUCCION.
La aspartato aminotransfera (L-aspartato:2-cetoglutarato aminotransferasa,
EC:2.6.1.2), es una enzima que cataliza reversiblemente la transferencia del grupo
193
amino del aspartato al grupo ceto del α-cetoglutarato, como productos se forman
glutamato y oxalacetato. (2, 4, 5)
AST
ASPARTATO+ α-CETOGLUTARATO GLUTAMATO + OXALACETATO
PLP
Los métodos aplicados para la determinación de rutina de la AST en el
laboratorio clínico cuantifican de forma directa o indirecta la concentración de
oxalacetato. El método de medición por espectrofotometría al ultravioleta fue
introducido por Karmen y es generalmente considerado el método de referencia.
El oxalacetato se determina por la adición en exceso de NADH y la
deshidrogenasa málica (DHM), la cual produce malato y NAD, la disminución de la
absorbencia a 340 nm es el resultado de la oxidación del NADH por unidad de
tiempo, siendo así una medida del porcentaje de aminotransferencia. (6)
En el método de Reitman y Frankel, el oxalacetato se determina directamente
con la dinitrofenilhidrazina; tanto el ácido α-cetoglutaratco como el oxalacetato
forman hidrazonas, pero la absortividad de la hidrazona del oxalacétato es mayor
que la del α-cetoglutárico, el incremento de la absorbencia, es proporcional al
oxalacetato producido. (7)
Por lo tanto, el método recomendado para medir la actividad de la AST en suero
se basa, en el principio descrito por Karmen, con algunas modificaciones, como la
optimización de la concentración de sustrato, la adición de la malato
deshidrogenasa, el cambio del regulador de fosfatos por el de Tris (hidroximetil-
aminometano) y la adición de fosfato de piridoxal. (6, 7)
La AST es una enzima intracelular, se encuentra en niveles altos en el músculo
del corazón, las células del hígado, las células del músculo esquelético y en menor
cantidad en otros tejidos. (2)
Aunque un nivel elevado de AST en suero no es específico de enfermedad
hepática se emplea principalmente para su diagnóstico y seguimiento, junto con
194
otras enzimas como la ALP y ALT. También se utiliza como control post-infarto, en
pacientes con desordenes del músculo esquelético, y en otras afecciones.
El diagnóstico final debe obtenerse tomando en cuenta todos los datos clínicos y
de laboratorio. (2, 8)
OBJETIVO
El alumno determinará la actividad de la AST en la muestra problema por un
método de monitoreo discreto de la marca SPINREACT o por el método de
STANBIO. (5)
FUNDAMENTO.
Karmen es el primero en reportar un método cinético para la determinación de la
actividad de AST en suero. Posteriormente, el método has sido modificado y
optimizado por Bergmeyer et al. (4-8)
Este procedimiento de SPINREACT para la determinación de AST es similar al
método recomendado por la IFCC (Federación Internacional de Química Clínica).
La secuencia de reacción en el ensayo es como sigue: (5)
O- O- O- O- O- O-
O- AST O O
O-
O + O O
+ +
O
+ NH 3
NH 3 O O O O
PLP
L-Aspartato a-Cetoglutarato L-Glutamato Oxalacetato
O-
O-
O-
+
MDH O-
O
+ NADH + H O + NAD+ + H2O
O O
OH O
Oxalacetato L-Malato
La AST sérica cataliza la transferencia del grupo amino del L-aspartato al α-

cetoglutarato en presencia de la coenzima fosfato de piridoxal que requiere para
esta catálisis para producir L-glutamato y oxalacetato. El oxalacetato formado por
la AST se acopla a la reacción catalizada por la malato deshidrogenasa (MDH) en
195
la que este compuesto y en presencia de la coenzima NADH + H+ forma L-malato
y NAD+. La actividad de la AST se determina midiendo indirectamente la oxidación
del NADH + H+ a 340 nm. (5)
MUESTRAS.
Suero o plasma (EDTA o heparina) no hemolizados. Siempre que sea posible
estas muestras deben de ser separados y analizados el mismo día que se
recolectan. Guarde el plasma o el suero en tubos bien sellados. La actividad de a
AST se conserva bien en el suero por 7 días a 4ºC y un tiempo mayor en el suero
congelado.
Un suero o plasma hemolizados dan resultados falsamente elevados por la
liberación de AST contenida en los eritrocitos. (9, 10)
La hemólisis debe evitarse ya que la concentración de AST en los eritrocitos
excede 10 veces de la del suero. Si tenemos niveles de bilirrubina de hasta 40
mg/dL y de triacilgliceroles de 2000 mg/dL no habrá interferencia en ésta prueba.
Se conoce que existen fármacos que interfieren con ésta determinación.
(Consultar el catálogo de efectos de las drogas en las pruebas de laboratorio
clínico de la AACC.)
Muestras con ictericia y turbidez marcada requieren un blanco de muestra. (9,
10)
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Tubos de ensayo de 13 X 150 mm
Pipetas de 1 mL de capacidad graduadas en centésimas de mL
Pipetas de 2 mL de capacidad graduadas en décimas de mL
Baño maría a 25, 30 o 37ºC (± 0.1ºC)
Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm
Celdas de cuarzo de 1 cm de paso de luz.
196
Cronómetro
REACTIVOS. (5)
COMPOSICION.
R1 REGULADOR TRIS pH 7.8 80 mmol/L

L-Aspartato 200 mmol/L
R2 SUSTRATO NADH 0.18 mmol/L
LDH(músculo de conejo) 800 U/L
MDH(músculo de porcino) 600 U/L
α-cetoglutarato 12 mmol/L
PRECAUCIONES.
Para uso diagnóstico in Vitro.
Tome las precauciones normales para el manejo de los reactivos de laboratorio.
Los reactivos contienen azida de sodio que pueden reaccionar con plomo y cobre
de tuberías pudiendo formar metales de azidas explosivas.
REACTIVO DE TRABAJO (RT):

Disolver una tableta de R2 sustrato en un vial de R1.
Estabilidad: 21 días a 2-8ºC o 72 horas a temperatura ambiente.
PRESENTACION.
20 frascos de 2 mL (R1) y 1 frasco con 20 tabletas de sustrato (R2).
197
Los reactivos son estables hasta su fecha de caducidad marcada en la etiqueta
cuando se almacena de 2-8 ºC y protegidos de la luz. Los reactivos deben verse
claros y sin color. Descartar si se observa turbio o si contiene partículas. El
reactivo reconstituido es estable por 21 días de 2-8 ºC o 72 h a temperatura
ambiente (15-25 ºC). El reactivo de trabajo debe desecharse si la absorbancia
inicial leída contra agua a 340 nm es menor de 1,000.
PROCEDIMIENTO.
1. CONDICIONES DEL ENSAYO:

Temperatura constante 25 ºC /30 ºC /37ºC
2. TECNICA.
1. Prepare el reactivo de trabajo de acuerdo al instructivo.

2. Calibre a cero el espectrofotómetro a 340 nm con agua destilada o aire.
3. Pipetear en una celda:
RT (mL) 1.0
Muestra (µL) 100
4. Mezclar e incubar 1 minuto.

5. Leer la absorbencia inicial (A) de la muestra, poner en marcha el cronómetro
hasta obtener la primera lectura al primer minuto. Continúe incubando a 37 ºC y
anotar el cambio de absorbencia a los 2 y 3 minutos. El cambio debe ser
constante.
198
6. Determine el promedio de absorbencia por minuto (ΔA/min) y multiplicar por el
factor 1750 para obtener los resultados en U/L.
NOTA: Si la cubeta no está a temperatura controlada, incube las muestras a 37ºC

entre lectura y lectura.
UNIDADES: La unidad internacional (U) es la cantidad de enzima que convierte
1µMol de sustrato por minuto, en condiciones estándar. La concentración se
expresa en unidades por litro (U/L).
FACTORES DE CONVERSION DE TEMPERATURAS.

Los resultados pueden transformarse a otras temperaturas multiplicando por:
Temperatura de Factor para convertir a:
medición 25ºC 30ºC 37ºC
25ºC 1.00 1.37 2.08
30ºC 0.73 1.00 1.54
37ºC 0.48 0.65 1.00
CONTROL DE CALIDAD.
Es conveniente analizar junto con las muestras control valorados: SPINTROL H
normal y patológico (Ref. 1002120, 1002210). Si los valores hallados se
encuentran fuera del intervalo de tolerancia, se debe revisar el instrumento, los
reactivos y la técnica.
La actividad de AST determinada para estos materiales y por este método
deberá caer dentro de los intervalos establecidos para los controles. Se deben
utilizar dos niveles de controles para cada ensayo.
Cada laboratorio deberá de disponer de su propio control de calidad y establecer
CALIBRACION.
La actividad de AST, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del
NADH + H+ a 340nm. La guía de calibración del fabricante, deberá ser seguida
199
para calibrar su analizador. Probando el contenido de AST de un suero control,
con valores de AST conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que la
calibración del instrumento ha sido realizada correctamente.
RESULTADOS.
Los valores se derivan en base al coeficiente de extinción micromolar del NADH
+ H+ a 340 nm (0.0063). Una unidad por litro (U/L) de actividad de AST es la
cantidad de enzima que oxida un µmol/L de NADH + H+ por minuto.
U/L= ΔA/min X Volumen total

Absortividad volumen de muestra
U/L= ΔA/min X 1.10
0.0063 0.10
U/L= ΔA/min X 1746
LIMITACIONES.
INTERVALO DE MEDIDA:
De 5.44 U/L hasta el límite de linealidad 260 U/L
Si el cambio de ΔA/min es mayor de 0.342, diluya una parte de muestra con 9
partes de solución salina isotónica y repetir el ensayo. Multiplicar el resultado por
10. Los valores de AST para recién nacidos no han sido establecidos por éste
método.
PRECISION.
Media(U/L) 17.4 128 17.1 128
SD 0.68 1.35 0.72 1.28
CV(%) 3.91 1.05 4.20 0.99
200
SENSIBILIDA ANALITICA:
1U/L = 0.0017 DA/min.
EXACTITUD ANALITICA:
Los reactivos SPINREACT (y) no muestran diferencias sistemáticas
Los resultados obtenidos de 50 muestras fueron los siguientes:
Coeficiente de regresión (r): 0.99
Ecuación de la recta de regresión: y=0.96x + 1.33
TEMPERATURA 25ºC 30ºC 37ºC

HOMBRES Hasta 19 U/L Hasta 26U/L Hasta 40 U/L
MUJERES Hasta 16 U/L Hasta 22U/L Hasta 35U/L
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio

establezca sus propios valores de referencia.
BIBLIOGRAFIA.

3. Devlin, T.M. (2002) Texbook of biochemistry with clinical correlations. 5a.ed. Ed.
Wiley-Lyss. USA.
201
4. Murray, R. (1984) Aspartate aminotransferase. Kaplan A. et al Clin. Chem. The

6. Cabaud, P. Beeper, R. Wroblewski, F.(1956) Am. J. Clin. Path. 26:1101.
7. La due, J. S.; Wroblewski, F.; Karmen, A. (1954) Science 120:497.
8. Mohun, A.F. y cook, I.J.Y.(1957) Am. J. Clin. Path. 10:394
9. Young, D. S. (1995) Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4a. ed. AACC
Press..
10. Young, D. S. (2001) Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4a. ed. AACC
Press.
DETERMINACION CUANTITATIVA DE ASPARTATO AMINO TRANSFERASA

AST (GOT) POR EL METODO DE STANBIO.
OBJETIVO: El alumno determinará la actividad de la AST en la muestra problema por un

método de monitoreo discreto.
FUNDAMENTO.

optimizado por Bergmeyer et al.
202
Este procedimiento de Stanbio para la determinación de AST es similar al
La secuencia de reacción en el ensayo es como sigue:
O- O- O- O- O- O-
O- AST O O
O-
O + O O
+ +
O
+ NH 3
NH 3 O O O O
PLP
O-
O-
O- MDH O-
O
+ NADH + H+ O + NAD+ + H2O
O O
OH O

cetoglutarato en presencia del a coenzima fosfato de piridoxal que requiere para
del NADH + H+ a 340 nm. En éste reactivo se incluye a la LDH para convertir el
piruvato endógeno de la muestra a lactato durante la fase lag anterior a la
medición.
MUESTRAS.
Suero o plasma (EDTA o heparina) no hemolizados. Siempre que sea posible estas
muestras deben de ser separados y analizados el mismo día que se recolectan. Guarde el
plasma o el suero en tubos bien sellados. La actividad de a AST se conserva bien en el
suero por 7 días a 4ºC y un tiempo mayor en el suero congelado.
Un suero o plasma hemolizados dan resultados falsamente elevados por la liberación de
AST contenida en los eritrocitos.
203
La hemólisis debe ser evitada ya que la concentración de AST en los eritrocitos
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Baño maría a 37ºC
Espectrofotómetro
Cronómetro
REACTIVOS.
1. Regulador de AST (R1) Cat. No. 2921.

COMPOSICION.
Regulador de Tris pH 7.5 80 mmol/L
LDH 600 U/L
2. Reactivo (R2) Cat. 2922.

COMPOSICION.
NADH (sal sódica) 0.18 mmol/L
204
PRECAUCIONES.
El regulador y los reactivos enzimáticos líquidos están listos para su uso.

Prepare el reactivo de trabajo en una proporción de 5 partes del regulador (R1) y 1
parte de reactivo (R2). (Por ejemplo 50 mL de regulador (R1) y 10 mL de reactivo
R2)

reactivo es estable por 4 semanas de 2-8 ºC o 5 días a temperatura ambiente (15-
25 ºC). El reactivo de trabajo debe desecharse si la absorbancia inicial leída contra
agua s 340 nm es menor de 1.100.
TECNICA.
2. Calibre a cero el espectrofotómetro a 340 nm con agua destilada.
3. Por cada muestra y control, agregar 1.0 mL de reactivo de trabajo a la cubeta o

tubo de prueba y llevar a 37ºC por 3 minutos.
205
4. Adicionar 100 µL (0.10 mL) de suero a cada tubo respectivamente y agitar
levemente.
5. Leer la absorbencia al primer minuto. Continúe incubando a 37 ºC y anotar el
cambio de absorbencia a los 2 y 3 minutos. El cambio debe ser constante.

CONTROL DE CALIDAD.
Se recomienda los sueros controles Normal Ser-T-Fy I Cat. No. G427-86 y suero
control Anormal Ser-T-Fy II Cat. No. G428-86 para éste ensayo. La actividad de
AST determinada para estos materiales y por este método deberá caer dentro de
los intervalos establecidos para los controles. Se deben utilizar dos niveles de
controles para cada ensayo.
CALIBRACION.
NADH + H+ a 340 nm. La guía de calibración del fabricante, deberá ser seguida
RESULTADOS.

206
U/L= ΔA/min X 1.10

0.0063 0.10
U/L= ΔA/min X 1746
LIMITACIONES.
método.
Muestras con ictericia y turbidez marcada requieren un blanco de muestra.
HOMBRES hasta 40 U/L

MUJERES hasta 35 U/L
BIBLIOGRAFIA

207
6.1.2. ALANINO-AMINOTRANSFERASA. (ALT, ALAT, GPT)
INTRODUCCION.
La alanino-aminotransferasa (L-alanina:2 cetoglutarato
aminotransferasa,E.C.2.6.1.2), es una enzima que cataliza reversiblemente la
transferencia del grupo amino de la alanina al grupo ceto del α-cetoglutarato, como
productos se forman el glutamato y el piruvato. (1, 2, 3)
ALT
ALANINA + α-CETOGLUTATO GLUTAMATO + PIRUVATO
PLP
Los métodos propuestos para la determinación de la actividad de ALT se basa

en la cuantificación de piruvato, al sistema de reacción se le adiciona un exceso
de lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH. Por lo tanto, el piruvato que se forma
es reducido y el NADH + H+ es oxidado a NAD+, el intervalo de disminución en las
absorbencias a 340 nm sirve para medir la actividad de la ALT. (4-7)
Wróbleswski y Cabaud introdujeron un método en el cual el piruvato se convierte a
una hidrazona, la cual se extrae con tolueno o xileno y se determina
fotométricamente en medio alcalino. Reitman y Frankel realizaron modificaciones
a ese método, eliminaron la precipitación de las proteínas del suero y la extracción
con tolueno o xileno. ( 4, 6, 7)
La reacción enzimática de la ALT, también se ha acoplado a la glutamato
deshidrogenasa que utiliza al glutamato formado, y produce NADH + H+, el cual
reduce una sal de diazonio que en presencia de un acarreador de electrones
(metasulfato de fenacina) absorbe a 520 nm. (6, 7)
Actualmente, la IFCC, propone un método bien definido para la medición de la
ALT basado en el principio de Wróbleswski. Las modificaciones realizadas
incluyen la optimización de las concentraciones de sustratos, el uso de Tris como
regulador y la adición de fosfato de piridoxal. (5-7)
208
La ALT es una enzima intracelular, se encuentra principalmente en las células

del hígado y el riñón. (1-4, 8)
Su mejor aplicación es en el diagnóstico de las enfermedades del hígado. Se
observan niveles elevados en enfermedades hepáticas como la hepatitis,
enfermedades de los músculos y traumatismos. (1-3)
Cuando se emplean en conjunto con la AST ayuda en el diagnóstico de infartos
de miocardio, ya que el valor de la ALT se mantiene dentro de los límites normales
y aumenta en los niveles de AST. (4)
de laboratorio. (2)
OBJETIVO
El alumno determinará la actividad de la alanina aminotransferasa en una

muestra clínica por medio de un método de monitoreo discreto de la marca de
SPINREACT o STANBIO. (5)
FUNDAMENTO

(5)
La alanina amino transferasa (ALT) sérica, cataliza la transferencia del grupo
amino del L-alanina al α-cetoglutarato en presencia de la coenzima fosfato de
piridoxal que requiere para esta catálisis para producir L-glutamato y piruvato. El
piruvato formado por la ALT se acopla a la reacción catalizada por la lactato
deshidrogenasa (LDH) en la que este compuesto y en presencia de la coenzima
NADH + H+ forma L-lactato y NAD+. La actividad de la ALT se determina midiendo
indirectamente la oxidación del NADH + H+ a 340 nm dado como la disminución de
209
la absorbencia. La proporción de la disminución de la absorbencia a 340 nm es
directamente proporcional a la actividad de ALT. (5-7)
O- O- O- O- O-
O-
CH3
+ ALT O O CH3
O O O
+ NH 3
+ + O
NH3 O
PLP O
L-Alanina a-Cetoglutarato L-Glutamato Piruvato
O- O-
CH3 +
LDH CH3
O + NADH + H O + NAD+ + H2O
O OH
Piruvato L-Lactato
MUESTRAS. (5-7)
Suero o plasma (EDTA o heparina) no bemolizados. Un suero o plasma con

hemólisis da resultados falsamente elevados por la liberación de ALT contenida en
los eritrocitos.
Siempre que sea posible estas muestras deben de ser separados y analizados
el mismo día que se recolectan. Guarde el plasma o el suero en tubos bien
sellados. La actividad de la ALT aproximadamente se disminuye en un 10% a los
tres días en refrigeración a 4 ºC y en un día a 25 ºC.
. La actividad de la ALT se conserva bien en el suero por 7 días a 4ºC y un
tiempo mayor en el suero congelado.
SUSTANCIAS INTERFERENTES. (7)
La hemólisis debe evitarse ya que la concentración de ALT en los eritrocitos

excede 5 veces de la del suero. No habrá interferencia en ésta prueba si tenemos
210
niveles de bilirrubina de hasta 40 mg/dL y de triacilgliceroles de 2000 mg/dL. Se
conoce que existen fármacos que interfieren con ésta determinación. (Consultar el
catálogo de efectos de las drogas en las pruebas de laboratorio clínico de la
AACC.) (9,10)
Muestras con ictericia y turbidez marcada requieren un blanco de muestra. (7-
10)
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Cronómetro
REACTIVOS. (5)
COMPOSICION.
L-Alanina 500 mmol/L
PRECAUCIONES.
211

PRESENTACION.

PROCEDIMIENTO.

212
2. TECNICA.
3. Pipetear en un tubo:
RT (mL) 1.0
Muestra (µL) 100
4. Mezclar e incubar 1 minuto. Pasar a una celda de cuarzo.
constante.


25ºC 1.00 1.32 1.82
30ºC 0.76 1.00 1.39
37ºC 0.55 0.72 1.00
CONTROL DE CALIDAD.
213
La actividad de ALT determinada para estos materiales y por este método
CALIBRACION.
La actividad de ALT, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del

para calibrar su analizador. Probando el contenido de ALT de un suero control,
con valores de ALT conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que la
RESULTADOS.
+ H+ a 340 nm (0.0063). Una unidad por litro (U/L) de actividad de ALT es la

U/L= ΔA/min X 1.10
0.0063 0.10
U/L= ΔA/min X 1750

214
LIMITACIONES.
10. Los valores de ALT para recién nacidos han sido establecidos por éste
método.
PRECISION.
Media(U/L) 34.9 118.4 34.1 118.3
SD 0.64 1.17 1.03 1.53
CV(%) 1.84 0.99 3.04 1.29
1U/L = 0.000557 DA/min.
215
Temperatura de Factor para convertir a
25ºC 1.00 1.32 1.82
30ºC 0.76 1.00 0.39
37ºC 0.55 0.72 1.00
ADULTO 25ºC 30ºC 37ºC

HOMBRES Hasta 22 U/L Hasta 29 U/L Hasta 45 U/L
MUJERES Hasta 18 U/L Hasta 22 U/L Hasta 35 U/L
En recién nacidos normales se han descrito valores de referencia hasta el doble

del de los adultos, debido a su inmadurez hepática, estos valores se normalizan
aproximadamente a los 3 meses. Se recomienda que cada laboratorio establezca
BIBLIOGRAFIA

Wiley-Lyss. USA.
4. Murray, R. Alanine aminotransferase. Kaplan A. et al Clin. Chem. The C.V.

Mosby Co. St. Louis. Toronto. Princeton 1984; 1088-1090.
216
de NADH-UV para la determinación cuantitativa de Alanina aminotransferasa
9. Young, D. S. (1995) Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4a. ed. AACC Press.
Press.
OBJETIVO
El alumno determinará la actividad de la alanina aminotransferasa en una

muestra clínica, por el método de STANBIO.
METODO DE MONITOREO DISCRETO STANBIO.
FUNDAMENTO
La alanina amino transferasa (ALT) sérica, cataliza la transferencia del grupo amino
del L-alanina al α-cetoglutarato en presencia de la coenzima fosfato de piridoxal
que requiere para esta catálisis para producir L-glutamato y piruvato. El piruvato
formado por la ALT se acopla a la reacción catalizada por la lactato
deshidrogenasa (LDH) en la que este compuesto y en presencia de la coenzima
NADH + H+ forma L-lactato y NAD+. La actividad de la ALT se determina midiendo
indirectamente la oxidación del NADH + H+ a 340 nm dado como la disminución de
217
la absorbencia. La proporción de la disminución de la absorbencia a 340 nm es
directamente proporcional a la actividad de ALT.
O- O- O- O- O-
O-
CH3
+ ALT O O CH3
O O O
+ NH 3
+ + O
NH3 O
PLP O
L-Alanina a-Cetoglutarato L-Glutamato Piruvato
O- O-
CH3
LDH CH3
O + NADH + H+ O + NAD+ + H2O
O OH
Piruvato L-Lactato
MUESTRAS
Suero o plasma (EDTA o heparina) no hemolizados. Siempre que sea posible

recolectan. Guarde el plasma o el suero en tubos bien sellados. La actividad de la
ALT aproximadamente se disminuye en un 10% a los tres días en refrigeración a 4
ºC y en un día a 25 ºC.
La hemólisis debe evitarse ya que la concentración de ALT en los eritrocitos
excede 5 veces de la del suero. No habrá interferencia en ésta prueba si tenemos
niveles de bilirrubina de hasta 40 mg/dL y de triacilgliceroles de 2000 mg/dL. Se
conoce que existen fármacos que interfieren con ésta determinación. (Consultar el
catálogo de efectos de las drogas en las pruebas de laboratorio clínico de la
AACC.)
218
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Espectrofotómetro
Cronómetro
REACTIVOS.
1. Regulador de ALT (R1) Cat. No. 2931.
COMPOSICION.
L-Alanina 500 mmol/L

Regulador de Tris pH 7.5 100 mmol/L
2. Reactivo (R2) Cat. 2932.
COMPOSICION.
NADH (sal sódica) 0.18 mmol/L
PRECAUCIONES.
219
de tuberías pudiendo formar azidas metalicas explosivas.

parte de reactivo (R2). [Por ejemplo 50 mL de regulador (R1) y 10 mL de reactivo
R2]

reactivo es estable por 4 semanas de 2-8 ºC o 5 días a temperatura ambiente (15-
25 ºC). El reactivo de trabajo debe desecharse si la absorbencia inicial contra
agua A 340 nm es menor de 1.100.
TECNICA.
1. Prepare el reactivo de trabajo (RT) de ALT de acuerdo al instructivo.

4. Adicional 100 µL (0.10 mL) de suero a cada tubo respectivamente y agitar
levemente.
220

CONTROL DE CALIDAD.
ALT determinada para estos materiales y por este método deberá caer dentro de
CALIBRACION.
La actividad de ALT, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del
para calibrar su analizador. Probando el contenido de ALT de un suero control,
con valores de ALT conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que la
RESULTADOS.

U/L= ΔA/min X 1.10

0.0063 0.10
U/L= ΔA/min X 1746
221
Unidades: La unidad internacional es la cantidad de enzima que convierte 1 µmol
de sustrato por minuto, en condiciones estándar. La concentración se expresa en
unidades por litro (U/L)
LIMITACIONES.

método.
HOMBRES hasta 40 U/L

MUJERES hasta 35 U/L
FACTORES DE CONVERSION DE TEMPERATURAS

Temperatura de Factor para convertir a

25ºC 1.00 1.32 1.82
30ºC 0.76 1.00 0.39
37ºC 0.55 0.72 1.00
ADULTO 25ºC 30ºC 37ºC

HOMBRES HASTA 25 U/L 33 U/L 45 U/L
MUJERES HASTA 20 U/L 27 U/L 36 U/L
222
En recién nacidos normales se han descrito valores de referencia hasta el doble
del de los adultos, debido a su inmadurez hepática, estos valores se normalizan
aproximadamente a los 3 meses. Se recomienda que cada laboratorio establezca
INTERVALO DE MEDIDA. Hasta el límite de linealidad de 600 U/L.

Si la concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir 1:10
con solución salina fisiológica y multiplicar el resultado final por 10.
SENSIBILIDAD. En base a la resolución del instrumento de A=0.001, éste método

muestra una sensibilidad de 2.0 U/L
BIBLIOGRAFIA
1. Murria R. Alanine aminotransferase. Clin. Chem 1984:1088-1090.
2. Young D.S. Effects of Drugs on Clinical Lab. Tests. 4a ed. ACCC Press, 1995.
3. Young D.S. Effects of Disease on Clinical Lab. Tests. 4a ed. ACCC Press, 2001.
4. Burtis, A. & Tietz, R. Textbook of Clinical Chemistry. 3a ed. ACCC 1999.
223
6.2. FOSFATASA ALCALINA. (ALP)
INTRODUCCION.
Las fosfatasas constituyen un grupo de enzimas de baja especificidad que
catalizan la hidrólisis de ésteres del ácido fosfórico. En función de los valores de
pH al que logran su actividad óptima, se distinguen dos tipos de fosfatasas: ácida
y alcalina. (1, 2)
Las fosfatasas alcalinas (Ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa, E.C. 3.1.2.1.),
poseen su máxima actividad alrededor de pH 9.8 pero el pH óptimo varía según el
sustrato sobre el cual actúan y la naturaleza del regulador utilizado. En su
conjunto, en el laboratorio clínico se le denomina fosfatasa alcalina (ALP). Esta
enzima se encuentra prácticamente en todos los tejidos del cuerpo pero
principalmente en el epitelio intestinal, túbulos renales, huesos (osteoblastos),
leucocitos, hígado y placenta. (3, 4) Se han propuesto varios métodos para la
cuantificación de la fosfatasa alcalina presente en el suero, todos ellos se
fundamentan en la medición del grado de hidrólisis de diferentes ésteres de
fosfato bajo condiciones específicas de temperatura y pH, se han utilizado como
sustrato una gran variedad de compuestos: b-glicerofosfato, fenilfosfato disódico,
fenolftaelína, fluoresceína, fosfoenol piruvato. (5, 6, 7)
Unos de los sustratos más utilizados es el p-nitrofenol-fosfato, el cual es un
compuesto incoloro, por acción de la ALP se libera el grupo fosfato y el ión p-
nitrofenilo de color amarillo que absorbe característicamente a 400 nm. La
Federación Internacional de química Clínica propone el método basado en la
técnica de Beessey y de Lowry-Brock. (6, 7)
Otra metodología que se sigue realizando de forma manual en los laboratorios
clínicos es el método de Roy modificado. (8-11)
Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos
los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en huesos, hígado, placenta,
intestinos y riñón. (4-6)
224
Tanto el aumento como la disminución de los niveles en plasma, tienen
significado clínico. (5-/)
Las causas más probables de aumento de la actividad de la ALP son: la
enfermedad ósea de Pager, obstrucciones hepáticas, hepatitis, hepatoxicidad por
medicamentos y osteomalacia.
Las causas más probables de disminución de la actividad de la ALP son:
cretinismo y déficit de vitamina C. (5-10)
El diagnóstico final para un daño de éste tipo debe ser complementario junto con
las aminotransferasas ALT y AST como indicativos de daño hepático y para el
intestino junto con otros parámetros también complementarios que debe obtenerse
tomando en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio realizados. (5-/)
OBJETIVO:
El alumno realizará la determinación de la actividad enzimática de la ALP en

muestras problema de la marca SPINREACT. (11, 12, 13)
FUNDAMENTO.
Este procedimiento de SPINREACT para la determinación de ALP es similar al

Para la determinación de la fosfatasa alcalina, se utiliza como sustrato el p-
nitrofenilfosfato que por acción de la enzima se libera el fosfato inorgánica y p-
nitrofenol que pH alcalino (10.4) se ioniza a p-nitrofenilato de color amarillo que se
lee a 405 nm. La variación de absorbencia por unidad de tiempo, es directamente
proporcional a la velocidad de transformación del sustrato y por lo tanto a la
actividad enzimática. (12)
HO
O
P O
O OH
OH
O-
ALP ALP
+ HO P O
O-
pH=9 pH=9
NO 2 N
NO 2 -O O
p-NITROFENILFOSFATO p-NITROFENOL p-NITROFENILATO

225
MUESTRAS. (11, 12)
Suero o plasma heparinizado libre de hemólisis. Siempre que sea posible estas
muestras deben de ser separados y analizados el mismo día que se recolectan.
No dejarla a temperatura ambiente. Guarde el plasma o el suero en tubos bien
sellados. La actividad de la ALP se conserva bien en el suero por 3 días a 2-8ºC y
un tiempo mayor en el suero congelado.
Los niveles de bilirrubinas por arriba de 40 mg/dL y de triglicéridos hasta 2000
mg/dL no muestran interferencia en ésta prueba. (13)
EDTA, citrato, fluoruros y oxalatos inhiben la actividad de la ALP, por lo que no
deben ser utilizadas como anticoagulantes ciertas drogas y otras sustancias
también se conoce que afectan los valores de ALP.(11-13) Un suero o plasma
hemolizado dan resultados falsamente elevados por la liberación de ALP que se
encuentra presente en cantidad importante en los eritrocitos. Se conoce que
existen fármacos que interfieren con ésta determinación. (Consultar el catálogo de
efectos de las drogas en las pruebas de laboratorio clínico de la AACC.
Muestras con ictericia y turbidez marcada requieren un blanco de muestra (14-
15).
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Baño maría a 25, 30 y 37ºC (± 0.1ºC)
Espectrofotómetro de luz visible.
Celdas de 1 cm de paso de luz.
Cronómetro
226
REACTIVOS. (13)
COMPOSICION.
R1 REGULADOR Dietanol amina pH 10.4.8 1 mmol/L
Cloruro de Magnesio 0.5 mmol/L
R2 SUSTRATO pNitrofenilfosfato 10 mmol/L
PRECAUCIONES.


Estabilidad: 21 días a 2-8ºC o 5 días a temperatura ambiente.
PRESENTACION.

cuando se almacena de 2-8 ºC y protegidos de la luz. El reactivo R1 debe verse
claro y sin color y el reactivo R2 es de color amarillo. Descartar ambos si se
observa turbio o si contiene partículas. El reactivo de trabajo es estable 21 días a
2-8ºC o 5 días a temperatura ambiente.
227
PROCEDIMIENTO. (12)

2. TECNICA.
2. Calibre a cero el espectrofotómetro a 405 nm con agua destilada o al aire.
3. Pipetee en un tubo:
RT (mL) 1.2
Muestra (µL) 20
4. Mezcle suavemente e incube a 37ºC por 1 minuto.

constante.


228

25ºC 1.00 1.22 2.64
30ºC 0.82 1.00 1.33
37ºC 0.61 0.75 1.00
CONTROL DE CALIDAD.

La actividad de ALP determinada para estos materiales y por este método
CALIBRACION.
La actividad de ALP, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del 4-

nitrofenilfosfato a 405 nm. La guía de calibración del fabricante, deberá ser
seguida para calibrar su analizador. Probando el contenido de ALP de un suero
control, con valores de ALP conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que
la calibración del instrumento ha sido realizada correctamente.
229
RESULTADOS.
Los valores se derivan en base al coeficiente de extinción micromolar del 4-
nitrofenilfosfato a 405 nm (0.01845). Una unidad por litro (U/L) de actividad de ALP
es la cantidad de enzima que produce un mmol/L de 4-nitrofenol por minuto.

U/L= ΔA/min X 1.020

0.01845 0.020
U/L= ΔA/min X 3300
LIMITACIONES.
De 4.26 U/L hasta el límite de linealidad 825 U/L a 37 ºC de acuerdo a la NCCLS
guide line EP-6-P
10.
Los valores de ALP para recién nacidos y niños se han sido establecidos por
éste método.
PRECISION.

Media(U/L) 175 393 176 410
SD 2.28 5.48 4.60 10.4
CV(%) 1.30 1.40 2.61 2.53
230
1U/L = 0.0003 DA/min.
Ecuación de la recta de regresión: y=0.9916x – 0.4634
NIÑOS (1-14AÑOS) < 400 U/L < 480 U/L 150-950 U/L
ADULTOS 20-75 U/L 35-105 U/L 50-125U/L
Factores que pueden afectar los valores de referencia son: el ejercicio, periodos
de crecimiento en niños y en el embarazo.
BIBLIOGRAFIA

USA.
Wiley-Lyss. USA.
231
5. Henry, J.B. (1997) Diagnóstico y tratamiento clínico por el laboratorio. 9ª. ed.
6. Amador, E. Zimmerman, A, Wacher, X. (1970) JAMA 185, 431
7. Coleman, C. M. (1966) Clin. Chem. Acta 13, 401.
8. Kay, H.D. (1930) J. Biol. Chem. (1930) 79, 235
9. Lowry, O. Roberts, N.(1954) J. Biol. Chem. 207, 20
10. Roy, A. Clin. Chem.(1970) 15, 431
11. Wenger C. et al.( 1984) Alkaline phosphatase, Kaplan A. et al Clin Chem. The

de p-Nitrofenilfosfato para la determinación cuantitativa de fosfatasa alcalina.
13. Rosalki, S. et al. Clin. Chem. (1993), 39(4):648-652.
Press.
Press.
232
OBJETIVO:
El alumno realizará la determinación de la actividad enzimática de la ALP es
muestras problema por medio de la marca de STANBIO.
FUNDAMENTO.
Para la determinación de la fosfatasa alcalina, se utiliza como sustrato el p-
nitrofenilfosfato que por acción de la enzima se libera el fosfato inorgánica y p-
nitrofenol que a pH alcalino se ioniza a p-nitrofenilato de color amarillo que se lee
a 405 nm. La variación de absorbencia por unidad de tiempo, es directamente
proporcional a la velocidad de transformación del sustrato y por lo tanto a la
actividad enzimática.
HO
O
P O
O OH
OH
O-
ALP ALP
+ HO P O
O-
pH=9 pH=9
NO 2 N
NO 2 -O O
p-NITROFENILFOSFATO p-NITROFENOL p-NITROFENILATO
MUESTRAS.
Suero o plasma heparinizado libre de hemólisis. La muestra es estable por 7
días a 4ºC. No dejarla a temperatura ambiente. Los niveles de bilirrubinas por
arriba de 40 mg/dL y de triglicéridos hasta 2000 mg/dL no muestran interferencia
en ésta prueba.
EDTA, citrato y oxalatos inhiben la actividad de la ALP, ciertas drogas y otras
sustancias también se conoce que afectan los valores de ALP.
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
233
Espectrofotómetro
Cronómetro
REACTIVOS.
Regulador de fosfatasa alcalina (R1)

COMPOSICION.
2-amino-2-metil-1-propanol pH 10.4 0.35 mmol/L
Cloruro de magnesio 1.0 mmol/L
Sulfato de zinc 2.0 mmol/L
HEDTA 2.0 mmol/L
Sustrato Fosfatasa alcalina (R2)

COMPOSICION.
4- nitrofenil-fosfato 16.0 mmol/L
PRECAUCIONES.
de tuberías pudiendo formar azidas metalicas explosivas.

234
parte de reactivo (R2). (Por ejemplo 50 mL de regulador (R1) y 10 mL de reactivo
R2)

cuando se almacena de 2-8 ºC y protegidos de la luz. El reactivo R1 debe verse
claro y sin color y el reactivo R2 es de color amarillo. Descartar ambos si se
observa turbio o si contiene partículas. El reactivo de trabajo es estable por 4
semanas de 2-8 ºC o 5 días a temperatura ambiente (15-25 ºC).
TECNICA.

4. Adicional 20 µL (0.020 mL) de suero a cada tubo respectivamente y agitar

levemente.



235
CONTROL DE CALIDAD.
AST determinada para estos materiales y por este método deberá caer dentro de
CALIBRACION.
La actividad de ALP, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del 4-
nitrofenilfosfato a 405 nm. La guía de calibración del fabricante, deberá ser
seguida para calibrar su analizador. Probando el contenido de ALP de un suero
control, con valores de ALP conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que
la calibración del instrumento ha sido realizada correctamente.
RESULTADOS.
Los valores se derivan en base al coeficiente de extinción micromolar del 4-
nitrofenilfosfato a 405 nm (0.01845). Una unidad por litro (U/L) de actividad de ALP
es la cantidad de enzima que produce un mmol/L de 4-nitrofenol por minuto.

U/L= ΔA/min X 1.020

0.01845 0.020
U/L= ΔA/min X 2764
LIMITACIONES.
10.
236
LINEALIDAD.
La curva es lineal hasta 800 U/L a 37ºC de acuerdo a la NCCLS guide line EP-6-
P.
Adultos 50-125 U/L
Niños 150-950 U/L
BIBLIOGRAFIA
1. Amador, E. Zimmerman, A, Wacher, X. (1970) JAMA 185, 431
2. Coleman, C. M. (1966) Clin. Chem. Acta 13, 401.
3. Kay, H.D. (1930) J. Biol. Chem. (1930) 79, 235
4. Lowry, O. Roberts, N.(1954) J.Biol. Chem. 207, 20
5. Roy, A. Clin. Chem.(1970) 15, 431
237
6.3. BILIRRUBINAS.
La bilirrubina es un producto del catabolismo del grupo hem, y alrededor del 70%
de la misma deriva de los eritrocitos envejecidos. Alrededor del 5% proviene de los
citocromos citoplásmicos y mitocondriales hepáticos, algo de los citocromos
renales y otros, y algo también, de los eritrocitos defectuosos destruidos de la
médula ósea antes de ser liberados. La producción de bilirrubina en los adultos
alcanza un promedio de 250-350 mg/día. Circula en el plasma unida a la albúmina.
Es extraída por el hígado, donde se conjuga por esterificación de una o las dos
cadenas laterales de ácido propiónico a mono o diconjugado. El conjugado
principal en el hombre es el diglucurónido, que constituye del 70 al 90% del
pigmento biliar total. También se produce la conjugación con glucosa, más a
menudo con una cadena lateral que con dos. (1-4)
La determinación de los niveles de bilirrubina es de gran importancia para el
diagnóstico de diferentes enfermedades hepáticas, algunos desórdenes
hematológicos y en obstrucciones de vías biliares. (1-3)
El desarrollo de los métodos para la determinación de bilirrubinas se inició en
1883, cuando Ehrlich descubrió que la bilirrubina reacciona con el ácido sulfanílico
diazoado y forma un compuesto colorido al que llamo azobilirrubina.(5) En 1913,
Van der Berg utilizó este método para cuantificar la bilirrubina sérica. En 1937,
Malloy y Evelyn diseñaron un método colorimétrico, en la cual ajustaron al 50% la
concentración de metanol para acelerar la reacción sin precipitación de las
proteínas. Este método tiene las desventajas de que otros pigmentos presentes en
el suero y en la orina como los carotenoides y la hemoglobina pueden interferir en
las determinaciones. (5-7) Además la bilirrubina conjugada (directa) y no
conjugada (indirecta) difieren en sus propiedades de diazotización en presencia y
ausencia de un acelerador como el alcohol o la cafeína. Sin embargo
internacionalmente estos métodos para la determinación de estos pigmentos no se
han estandarizado, por lo que aún no existe método de referencia por la dificultad
que presenta la bilirrubina de ser un compuesto insoluble en agua y sensible a la
luz. (6,7)
238
La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina. Es transportada
del bazo al hígado y se excreta en la bilis. (4)
La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en el
plasma. Las causas más probables de la hiperbilirrubinemia son:
Bilirrubina Total (T):Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia
neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas.
Bilirrubina Directa (D): Coléstasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones
hepáticas.
El diagnóstico clínico debe de realizarse teniendo en cuenta todos los datos
clínicos y de laboratorio. (1-3)
OBJETIVO:
Determinar la cantidad de bilirrubina sérica directa (conjugada) y la bilirrubina
total y por cálculos determinará la cantidad de bilirrubina indirecta (no conjugada),
por el método SPINREACT. (7.8)
FUNDAMENTO.
El método se basa en la reacción de Malloy y Evelyn, en el cual la bilirrubina

reacciona con el ácido sulfanílico diazoado (reactivo de Ehrlich) para formar un
complejo de color azul (azo-bilirrubina), cuya intensidad es proporcional a la
concentración de bilirrubina.
La serie de reacciones que se establece para este método son las siguientes:
SO 3H SO 3H
NaNO2
+
NH2 NITRITO DE SODIO +

N=N Cl-
ACIDO DIAZOSULFANILICO
ACIDO SULFANILICO
(REACTIVO DE EHRLICH)
239
+
BILIRRUBINA SO 3H
AZOBILIRRUBINA B (ISOMERO I)
P P P
+ N SO 3H
N N N O
N + N N N
H H H H H H N=N Cl- H
H H
ACIDO DIAZOSULFANILICO
(REACTIVO DE EHRLICH)
AZOBILIRRUBINA B (ISOMERO II)

P
P
N N O
HO
HO 3S N H H
N N N
H H H HIDROXIPIRROMETINO CARBINOL
P=
H
H O
O
-H2C
OH
De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre

ligada a la albúmina, solo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina
directa) precisando la segunda la solubilización con dimetilsulfóxido (DMSO) para
que reaccione (bilirrubina indirecta). En la determinación de la bilirrubina indirecta
se determina también la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total.
(7, 8)
MUESTRAS. (7, 8)
Para la determinación por éste método se utiliza suero o plasma libre de

hemólisis (separado lo antes posible de los eritrocitos) y de preferencia en ayunas.
Esta muestra separada de los eritrocitos debe procesarse inmediatamente y si
se almacena debe protegerse de la luz y refrigerarse (el contacto con la luz puede
disminuir un 50% el contenido de bilirrubina no conjugada en menos de dos horas
a temperatura ambiente) de ésta forma la bilirrubina se mantiene estable por una
semana, y si se congela hasta por tres meses.
240
La hemólisis disminuye de forma importante el valor de la bilirrubina.

Los niveles de triacilgliceroles de menor a 450 mg/dL no interfieren en ésta
prueba. Se conoce que existen fármacos que interfieren con ésta determinación.
Muestras con turbidez marcada requieren un blanco de muestra. (9-12)
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Cronómetro.
REACTIVOS. (8)
COMPOSICION.
R1 (D) Ácido sulfanílico 30 mmol/L
Ácido clorhídrico 150 mmol/L
R2 (T) Ácido sulfanílico 30 mmol/L
Ácido clorhídrico 50 mmol/L
DMSO 7 mmol/L
R3 Nitrito de Sodio 29 mmol/L
OPCIONAL BILIRRUBINA CAL
Calibrador de bilirrubina 20 mg/dL.
241
PRECAUCIONES.
Debido a que el reactivo contiene ácidos debe evitarse el contacto con los ojos,
la piel y mucosas ya que son altamente irritantes. En caso de contacto con los ojos
lávense inmediata y abundantemente con agua y acudir al médico.

Todos los reactivos están listos para su uso.
PRESENTACION.
Reactivo R1(D) 1 x 150 mL.
Reactivo R2(T) 1 x 150 mL.
Reactivo R3 1 x 10 mL.

de los viales cuando se almacena de 2-8 ºC y protegidos de la luz y se evita su
contaminación durante su uso. Los reactivos deben verse claros y sin color.
Descartar si se observan turbios o si contienen partículas. El reactivo 2 debe
desecharse si desarrollo cualquier color. No usar reactivos fuera de la fecha
indicada.
PROCEDIMIENTO.
Longitud de onda 555 nm (530-580).

Cubeta 1 cm de paso de luz.
Temperatura constante 15-25 ºC.
242
2. TECNICA.
2. Pipetear en una cubeta o en un tubo de ensaye de acuerdo al siguiente

esquema:
Blanco B. Total Blanco B. Directa

R1(D) (mL) ---- ---- 1.5 1.5
R2(T) (mL) 1.5 1.5 ---- ----
R3 (µL) ---- 50 ---- 50
Muestra/Calibrador 100 100 100 100
o Control (µL)
3. Mezclar e incubar exactamente 5 minutos a 15-25 ºC.

4. Leer la absorbencia (A).
CALCULOS.
CON CALIBRADOR.
(A) MUESTRA - (A) BLANCO MUESTRA x CONC. CALIBRADOR= mg/dL de
Bilirrubina
(A) CALIBRADOR - (A) BLANCO CALIBRADOR
CON FACTOR.
[(A) MUESTRA - (A) BLANCO MUESTRA] X FACTOR*= mg/dL de Bilirrubina

en la muestra
*FACTOR: CONCENTRACION DEL CALIBRADOR

(A) CALIBRADOR - (A) BLANCO CALIBRADOR
243
FACTOR TEORICO. BILIRRUBINA (T)= 19.1; BILIRRUBINA (D)= 14
FACTOR DE CONVERSION: mg/dL x 17.1 µmol/L
CONTROL DE CALIDAD.
La actividad de bilirrubina (D) y (T) determinada para estos materiales y por este
método deberá caer dentro de los intervalos establecidos para los controles. Se
deben utilizar dos niveles de controles para cada ensayo.
LIMITACIONES.
Desde el límite de detección de (T) 0.5 mg/dL (D) 0.04 mg/dL hasta el límite de
Si la concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir 1/2 con
solución salina isotónica y repetir el ensayo. Multiplicar el resultado por 2.
PRECISION.
Bilirrubina (T) Intraserie (n=20) Interserie (n=20)
Media(U/L) 1.12 5.36 1.01 5.28
SD 0.02 0.12 0.04 0.12
CV(%) 2.16 2.27 4.77 2.38
244
PRECISION.
Bilirrubina (D) Intraserie (n=20) Interserie (n=20)
Media(U/L) 0.641.12 2.28 0.68 2.53
SD 0.01 0.02 0.02 0.05
CV(%) 1.91 1.10 2.51 1.95
SENSIBILIDAD ANALÍTICA:
1 mg/dL=0.015 A (T)
1mg/dL=0.073 A (D)
EXACTITUD.
Los reactivos SPINREACT no muestran diferencias sistemáticas significativas
BILIRRUBINA TOTAL 0.50 a 1.5 mg/dL
BILIRRUBINA DIRECTA 0.00 a 0.25 mg/dL
BILIRRUBINA INDIRECTA 0.05 a 1.00 mg/dL

BIBLIOGRAFIA

245
Wiley-Lyss. USA.
USA.
5. Henry, R.J. (1994) Clinical chemistry: Principles and Technics. Hoeber Division,
Harper and Row, NY.
6. Kaplan, A. et al (1984) Bilirrubin. Clin. Chem. The C.V. Mosby Co. St. Louis.
Toronto. Princeton. 436-650, 1238-1241.
7. Malloy, H. T. et al. (1937) The determination of bilirrubin with photoelectric

colorimeter. J. Biol. Chem. 112(2): 481-491.
8. Spinreact. (2004) Catálogo de pruebas de bioquímica clínica. Método

Colorimétrico DMSO para la determinación cuantitativa de bilirrubina total y
directa. Método recomendado por la IFCC.
9. Sunderman, F.W. (1970) Drug interference in clinical biochemistry. Crit. Rev.

Clin. Lab. Sci, 1:427.
10. Hartshorn, E.A. (1968) Drug interactions. Drug intel. 2:174
Press.
Press.
246
OBJETIVO.
Determinar la cantidad de bilirrubina sérica directa (conjugada) y la bilirrubina
total y por cálculos determinará la cantidad de bilirrubina indirecta (no conjugada),
por el método de Stanbio-Licon. (7.8)
FUNDAMENTO.
La mayoría de los procedimientos clínicos de rutina para la determinación de
bilirrubina sérica, están basados en la clásica reacción Diazo de Ehrlich (1), la cual
se aplicó primero a la estimación de estos pigmentos biliares en suero en 1913 por
Van der Berg y Snapper (2). Winkelman y colaboradores (3) proporcionaron una
revisión excelente de muchas metodologías de bilirrubina.
Cuando una solución de ácido sulfanílico en ácido clorhídrico diluído se combina
con nitrito de sodio, se forma ácido nitroso. Este ácido inestable, el cual debe
prepararse al momento del ensayo, reacciona para formar ácido sulfanílico
diazotizado. Este último (también llamado p-Bencendiazonio sulfonato) se acopla
con la bilirrubina para producir la azobilirrubina, la intensidad el color de este es
proporcional a la concentración de bilirrubina.
Ya que los estándares de bilirrubina sufren una gran degradación por su
inestabilidad, el método presentado utiliza una solución acuosa de N-
naftilendiamina dihidroclorhídrico como calibrador, de acuerdo con Bilissis y Speer
(4). Esta amina aromática estable pura se acopla con el ácido sulfanílico
diazotizado bajo las condiciones de prueba para dar un colorante azo con
cualidades espectrales similares a la azobilirrubina. El calibrador proporcionado ha
sido preparado para obtener, por la técnica descrita, un color equivalente al nivel
de bilirrubina a 540 nm.
REACTIVOS.
REACTIVO DE BILIRRUBINA TOTAL.

El ácido sulfanílico 32 mmol/L en ácido clorhídrico diluido. Adicionado de un
acelerados y estabilizador.
247
REACTIVO DE BILIRRUBINA DIRECTA.
Ácido sulfanílico, 32 mmol/L en ácido clorhídrico diluido. Adicionado de un
acelerados y estabilizador.
OXIDANTE DE BILIRRUBINA.
Nitrito de sodio 20 mmol/L, acuoso. Adicionado de un estabilizador.
ESTANDAR DE BILIRRUBINA (10 mg/dL).

N-1-naftilendiamina dihidroclorhídrico, 0.346 mmol/L. Adicionado de
estabilizadores. Equivalente a 10 mg/dL de bilirrubina en el método descrito.
PRECAUCIONES.
Para uso diagnóstico In Vitro. Los reactivos son cáusticos. No pipetee con la boca.
PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO.

Añada una gota (50 µL) de oxidante de bilirrubina a cada mL de reactivo de
bilirrubina total y directa. Invierta suavemente de 3-4 veces. El calibrador está listo
para su uso.
El reactivo de bilirrubina total y directa, el reactivo oxidante y el estándar son

estables cuando se almacenan a temperatura ambiente, hasta la fecha de
caducidad indicada en su respectiva etiqueta. Descartar el oxidante si presenta
una coloración amarillo oscuro. El reactivo de trabajo es estable por 7 días de 2-
8°C o por 24 h a temperatura ambiente.
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS.

Espectrofotómetro capaz de leer absorbencias a 540 nm, pipetas automáticas,
cubetas, agitador y cronómetro.
248
RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA (3,5).
1. Suero o plasma colectado con cualquier anticoagulante común, libre de

hemólisis y tomado en ayunas para evitar muestras lipémicas.
2. Las muestras deben protegerse de la luz del sol así como de la luz blanca
artificial, ya que la bilirrubina es altamente fotosensible. Se ha reportado que
aproximadamente el 50% de la bilirrubina puede perderse cuando se expone a la
luz solar por una hora.
La bilirrubina es estable en suero o plasma de 4-7 días entre 2-8 °C y por tres
meses cuando se congela a -20°C.
SUSTANCIAS INTERFERENTES
La hemólisis puede causar resultados elevados falsos de bilirrubina, debido a la
inhibición de la reacción diazo por efecto de la oxihemoglobina (3,6). Yung et al
(7), ha reportado una extensa lista de drogas y otros agentes que interfieren con la
metodología diazo bilirrubina proporcionada. Muestras turbias o lipémicas pueden
causar también elevaciones falsas de la bilirrubina, si esto ocurre deberá
manejarse un blanco de suero con cada prueba de paciente.
PARAMETROS DE PRUEBA.
B.TOTAL B. DIRECTA
Longitud de onda 540 nm 540 nm
Tipo de reacción Punto final Punto final
Dirección de la reacción Incremento Incremento
Temperatura de la reacción 37°C 37°C
Relación muestra reactivo 1:20 1:10
Tiempo de equilibrio 3 seg 3 seg
Tiempo de lectura 4 seg 4 seg
249
Tiempo lag 210 seg 180 seg.
Absorbencia límite del blanco 0.100 A 0.100 A
Máxima absorbencia 2.000 A 2.000 A
Calibrador 10 mg/dL 10 mg/dL
Valor normal alto 1.2 mg/dL 0.5 mg/dL
Valor normal bajo 0.0 mg/dL 0.0 mg/dL
Linealidad 20 mg/dL 10 mg/dL
pH 1.9 ±1.0 1.8 ±1.0
Absorbencia inicial < 0.100 < 0.100
pH del reactivo de trabajo de B. Total 1.9 ±1.0

pH del reactivo de trabajo de B. Directa 1.8 ±1.0
pH del reactivo oxidante de bilirrubina 6.3 ±1.0
pH del reactivo calibrador de bilirrubina 7.0 ±1.0
Absorbencia inical del reactivo de trabajo de B. Total < 0.030
Absorbencia inical del reactivo de trabajo de B. Directa < 0.030
PROCEDIMIENTO MANUAL (B. TOTAL).

1. Pipetee en tubos de ensaye marcados como RB (Blanco de reactivo), C
(calibrador), MB (blanco de muestra) los volúmenes (mL), excepto del reactivo
oxidante, el cual es una gota (equivalente a 50 µL), mezclando bien después de
cada adición.
TOTAL
RB C MB M
REACTIVO DE B. TOTAL 1.0 1.0 1.0 1.0
OXIDANTE (GOTAS) 1 1 --- 1
AGUA 0.05 --- --- ---
CALIBRADOR --- 0.05 --- ---
MUESTRA --- --- 0.05 0.05
250
2. Permitir que los tubos se incuben a temperatura ambiente por lo menos 3
minutos.
3. Ajuste a cero el espectrofotómetro a 540 nm con el blanco de reactivo.
4. Lea C y M y BM contra RB a 540 nm en el transcurso de 30 minutos.
PROCEDIMIENTO MANUAL (B. DIRECTA).

1. Pipetee en tubos de ensaye marcados como RB (Blanco de reactivo), C
(calibrador), MB (blanco de muestra) los volúmenes (mL), excepto del reactivo
oxidante, el cual es una gota (equivalente a 50 µL), mezclando bien después de
cada adición.
DIRECTA
RB C MB M
REACTIVO DE B. DIRECTA 1.0 1.0 1.0 1.0
OXIDANTE (GOTAS) 1 1 --- 1
AGUA 0.1 --- --- ---
CALIBRADOR --- 0.1 --- ---
MUESTRA --- --- 0.1 0.1
2. Permitir que los tubos se incuben a temperatura ambiente por lo menos 3

minutos.
3. Ajuste a cero el espectrofotómetro a 540 nm con el blanco de reactivo.
4. Lea C y M y BM contra RB a 540 nm en el transcurso de 30 minutos.
NOTAS.
1. El tiempo de 3 minutos para las muestras de B. Directa después de la adición
del suero es crítico, ya que las lecturas de absorbencia se incrementan lentamente
debido a la presencia de la fracción “Indirecta”. El tiempo del calibrador no es
crítico, ya que la reacción se completa en 3 minutos.
251
CONTROL DE CALIDAD.
Se deben incluir sueros control en cada corrida de muestras de pacientes
analizados por éste método.
RESULTADOS.
Los valores se derivan de los siguientes cálculos:
Bilirrubina Directa o Total mg/dL= AM-AMB X 10
AC
Donde: AM, AMB y AC son los valores de absorbencia de la muestra, blanco de
muestra y calibrador respectivamente y 10 es la concentración del calibrador.
VALORES ESPERADOS.
Bilirrubina Total 0.50-1.50 mg/dL
Bilirrubina Directa 0.00-0.25 mg/dL
Bilirrubina Indirecta 0.05-1.00 mg/dL
CARACTERISTICAS DE FUNCIONAMIENTO (3,5).

PRECISION.
En el estudio intraensayo, se analizaron muestras en 20 ocasiones y en el estudio
interensayo se analizaron las mismas muestras durante 10 días consecutivos. Los
CV intraensayo fueron 3.3% (con un promedio de 0.40 mg/dL) y de 2.3% (con un
promedio de 10.2 mg/dL) y los de interensayo fueron 3.5% (con un promedio de
0.51 mg/dL) y de 2.4% (con un promedio de 10.2 mg/dL) para bilirrubina total.
Para la bilirrubina directa los CV del intraensayo fueron los siguientes: 1.82%
(media=3.70 mg/dL) 2.76% (media=3.62 mg/dL).
CORRELACION.
La determinación de bilirrubina por el procedimiento descrito (y) y por la técnica
modificada de Jendrasski-Groff (x) en 25 muestras de suero mostraron un
coeficiente de correlación (r) de 0.9995, para la bilirrubina total y 0.9970 para la
bilirrubina directa. La ecuación de regresión para la bilirrubina total es y=1.06x-
0.100.
252
SENSIBILIDAD.
Tanto el procedimiento de bilirrubina total como directa demostraron una
sensibilidad de 0.018 mg/dL por 0.001 unidades de absorbencia.
LINEARIDAD.
Los procedimientos de la bilirrubina total y directa han sido establecidos para 20
mg/dL y 10 mg/dL, respectivamente.
BIBLIOGRAFIA.
1. Ehrlich P. Charite Ann 8:140, 1883.
2. Van der Bergh, A.y Snaper J. Deut. Arch. Klin. Med. 110:540, 1913.
3. Wilkelman, J.W. et al. In Clinical Chemistry. Chemistry-Principles and

Techniques. Henry, R. J. et al. Ed. Harper and Row. Hagerstown. M.D. 1974. pp.
1042-1061.
4. Bilissis, P.K.y Speer, R. J. Clin. Chem. 9:552, 1963.
5. Routh, J.I. In fundamentals of clinical chemistry. Nw Tietz. Ed. Saunders.

Philadelphia, 1976. pp. 1035-1043.
6. Shull, D.C. Clin. Chem. 26:22, 1980.
7. Young, D.S. et al. Clin Chem. 21:22, 1980.
8. Jendrassik, L y Groff. P. Bochem. Z. 297-81, 1938.
9. Stanbio Laboratory data.
253
7. VALORACION DEL ESTADO DEL CORAZON
El corazón es un órgano que pesa alrededor de 275 g y suele tener el tamaño de

un puño. El músculo cardiaco (miocardio), esta resguardado por una membrana
muscular denominada pericardio y está dotado de una tremenda potencia; en cada
minuto puede hacer pasar por su interior de 6 a 8 litros de sangre repartidos entre
60 a 80 latidos. (1)
El malfuncionamiento más común de este órgano es el infarto al miocardio y los
síntomas más comunes de éste padecimiento son disnea, dolor torácico,
palpitaciones y fatiga. Ninguno es específico y la interpretación depende del
cuadro clínico total y, en muchos casos, de las pruebas diagnósticas. (2)
Las pruebas diagnósticas que se utilizan son el análisis serológico, la
ultrasonografía y el electrocardiograma. Dentro de las pruebas clínicas se realiza
la determinación de enzimas específicas que se producen en las células
cardiacas, como son la creatin cinasa (CK), la fracción MB esta enzima (CK-MB),
la lactato deshidrogenasa (LDH) y la aspartato aminotransferasa (AST). (3)
7.1. ASPARTATO AMINOTRANSFERASA. (AST, ASAT. GOT)
INTRODUCCION.
La aspartato aminotransfera (L-aspartato:2-cetoglutarato aminotransferasa,
EC:2.6.1.2), es una enzima que cataliza reversiblemente la transferencia del grupo
amino del aspartato al grupo ceto del α-cetoglutarato, como productos se forman
glutamato y oxalacetato. (4)
AST
ASPARTATO +α-CETOGLUTARATO GLUTAMATO + OXALACETATO
PLP
Los métodos aplicados para la determinación de rutina de la AST en el
laboratorio clínico cuantifican de forma directa o indirecta la concentración de
oxalacetato. El método de medición por espectrofotometría al ultravioleta fue
introducido por Karmen y es generalmente considerado el método de referencia.
254
El oxalacetato se determina por la adición en exceso de NADH y la
deshidrogenasa málica (DHM), la cual produce malato y NAD, la disminución de la
absorbencia a 340 nm es el resultado de la oxidación del NADH por unidad de
tiempo, siendo así una medida del porcentaje de aminotransferencia (5-7)
En el método de Reitman y Frankel, el oxalacetato se determina directamente
con la dinitrofenilhidrazina; tanto el ácido α-cetoglutaratco como el oxalacetato
forman hidrazonas, pero la absortividad de la hidrazona del oxalacétato es mayor
que la del α-cetoglutárico, el incremento de la absorbencia, es proporcional al
oxalacetato producido. (5, 6)
Por lo tanto, el método recomendado para medir la actividad de la AST en suero
se basa, en el principio descrito por Karmen, con algunas modificaciones, como la
optimización de la concentración de sustrato, la adición de la malato
deshidrogenasa, el cambio del regulador de fosfatos por el de Tris (hidroximetil-
aminometano) y la adición de fosfato de piridoxal. (5-8)
La AST es una enzima intracelular, se encuentra en niveles altos en el músculo

del corazón, las células del hígado, las células del músculo esquelético y en menor
cantidad en otros tejidos. (6, 7)
Aunque un nivel elevado de AST en suero no es específico de enfermedad
cardiaca se emplea principalmente para su diagnóstico y seguimiento, junto con
otras enzimas como la LDH, CK y su fracción MB. También se utiliza como control
post-infarto, en pacientes con desordenes del músculo esquelético, y en otras
afecciones. (2-4)
de laboratorio. (2)
OBJETIVO
El alumno determinará la actividad de la AST en la muestra problema por un
método de monitoreo discreto de SPINREACT. (7, 8)
255
FUNDAMENTO.

optimizado por Bergmeyer et al. (4, 5, 7,8)
La secuencia de reacción en el ensayo es como sigue: (7,8)
O- O- O- O- O- O-
O- AST O O
O-
O + O O
+ +
O
+ NH 3
NH 3 O O O O
PLP
O-
O-
O- MDH O-
O
+ NADH + H+ O + NAD+ + H2O
O O
OH O

cetoglutarato en presencia de la coenzima fosfato de piridoxal que requiere para
del NADH + H+ a 340 nm. (8)
MUESTRAS.
Suero o plasma (EDTA o heparina) no hemolizado. Siempre que sea posible
recolectan. Guarde el plasma o el suero en tubos bien sellados. La actividad de a
256
AST se conserva bien en el suero por 7 días a 4ºC y un tiempo mayor en el suero
congelado. (7, 8)
Un suero o plasma hemolizado da resultados falsamente elevados por la
liberación de AST contenida en los eritrocitos. (7,8)
La hemólisis debe evitarse ya que la concentración de AST en los eritrocitos

(9,10)
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Cronometro.
REACTIVOS. (8)
257
COMPOSICION.
PRECAUCIONES.

PRESENTACION.

258
PROCEDIMIENTO.

2. TECNICA.

4. Adicionar 20 µL (0.020 mL) de suero a cada tubo respectivamente y agitar

suavemente, incubar nuevamente 1 minuto más.

constante.

259


25ºC 1.00 1.37 2.08
30ºC 0.73 1.00 1.54
37ºC 0.48 0.65 1.00
CONTROL DE CALIDAD.

La actividad de AST determinada para estos materiales y por este método
CALIBRACION.
260
RESULTADOS.


U/L= ΔA/min X 1.10

0.0063 0.10
U/L= ΔA/min X 1746
LIMITACIONES.
método.
261
PRECISION.
Media(U/L) 17.4 128 17.1 128
SD 0.68 1.35 0.72 1.28
CV(%) 3.91 1.05 4.20 0.99
1U/L = 0.0017 DA/min.

HOMBRES Hasta 19 U/L Hasta 26U/L Hasta 40 U/L
MUJERES Hasta 16 U/L Hasta 22U/L Hasta 35U/L

BIBLIOGRAFIA.

Tratamiento. 41a. ed. Ed. El Manual Moderno. México.
262
Wiley-Lyss. USA.
7. Murray, R., Kaplan A. et al.(1984) Aspartate aminotransferase. Clin. Chem. The

C.V. Mosby Co. St. Louis. Toronto. Princeton. 1112-16.

Press.
Press.
263
7.2. LACTATO DESHIDROGENASA. (LDH)
INTRODUCCION.
La lactato deshidrogenasa (Lactato: NADH oxidorreductasa EC. 1.1.1.27) es una

enzima de origen citoplásmico que cataliza reversiblemente la siguiente reacción:
LDH
+
Lactato + NAD Piruvato + NADH + H+
Es un tetrámero con un peso molecular total de alrededor de 135 000 daltons. El

tetrámero está constituido por monómeros H (abundante en corazón) y M
(abundante en hígado) los cuales constituyen cinco enzimas: LDH1 (HHHH), LDH2
(HHHM), LDH3 (HHMM), LDH4 (HMMM) y LDH5 (MMMM). (1, 2)
Existen procedimientos para medir la actividad de LDH sérica, algunos se
fundamentan en la medida de la fluorescencia de NADH + H+ o del NAD+ cuando
se le adiciona metiletilcetona o en la cuantificación del piruvato formado
haciéndolo reaccionar con la 2, 4-dinitrofenil hidracina para producir la hidrazona
correspondiente, la cual en medio alcalino absorbe a 505 nm. Sin embargo, los
métodos más utilizados son los de monitoreo discreto en los que se mide el
aumento o disminución de la absorbencia a 334, 340 o 365 nm; debido a que sólo
el NADH + H+ absorbe la luz. (3)
IMPORTANCIA CLINICA
La LDH es una enzima, distribuida por todo el organismo humano. Las mayores
concentraciones se encuentran en el hígado, corazón, riñón, músculo esquelético
y eritrocitos. (3)
La elevación de la LDH en el suero, ocurre desde infarto al miocardio,
enfermedades del hígado, anemia perniciosa y megalobástica, embolia pulmonar,
enfermedades malignas y distrofia muscular. El análisis combinado de LDH y
264
creatin cinasa, particularmente las isoenzimas de cada una, confirma el
diagnóstico definitivo del infarto agudo al miocardio.
de laboratorio. (3)
OBJETIVO
El alumno determinará la actividad de la LDH en la muestra problema por un

método de monitoreo discreto por el método de SPINREACT o por el método de
STANBIO. (4)
MÉTODO DE MONITOREO DISCRETO POR EL MÉTODO DE SPINREACT.

FUNDAMENTO.
Este método es el original de Buhl y Jackson modificado por Wacker, quienes

optimizaron las condiciones de reacción. (4-6)
La LDH específicamente cataliza la reducción de piruvato a lactato con la
subsecuente oxidación de NADH + H+ a NAD+ según la siguiente reacción:
NADH + H+ NAD+
O- O-
CH3 CH3
O O
O O-
Piruvato Lactato
La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio

determinado fotométricamente, es proporcional a la actividad de la LDH en la
muestra ensayada. El método descrito determina la disminución de absorbencia
por minuto a 340 nm. (4, 7)
265
REACTIVOS. (4)
COMPOSICION.
R1 REGULADOR Fosfato pH7.8 50 mmol/L
Piruvato 0.6 mmol/L

Disolver (®)una tableta de R2 sustrato en un vial de R1.
Estabilidad: 2 días a 2-8ºC o 12 horas a temperatura ambiente (15-25°C).
PRESENTACION.

cuando se almacena de 2-8 ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación.
Los reactivos deben verse claros y sin color. Descartar si se observa turbio o si
contiene partículas. El reactivo reconstituido es estable por 2 días de 2-8 ºC o 12 h
a temperatura ambiente (15-25 ºC). El reactivo de trabajo debe desecharse si la
absorbencia inicial leída contra agua a 340 nm es menor de 1,000.
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
266
Cronómetro.
MUESTRAS.
Suero o plasma (EDTA) no hemolizado ni lipémico. Siempre que sea posible
recolectan. Guarde el plasma o el suero en tubos bien sellados. (4-7)
La actividad de la LDH sérica es estable por 3 días a 2 y 8ºC. Las muestras
congeladas muestran una disminución en las isoenzimas LDH4 y LDH5, dando por
lo tanto valores bajos de LDH. (4)
PRECAUCIONES.
Para uso diagnóstico In Vitro.
de tuberías pudiendo formar azidas metálicas explosivas.
PROCEDIMIENTO.

2. TECNICA.
267
25-30 °C 37°C
RT (mL) 3.0 3.0
Muestra (µL) 100 50

constante.

factor de acuerdo a la temperatura realizada en el análisis para obtener los
resultados en U/L.
CALCULOS
25-35°C= DA/min x 4925= U/L LDH
37°C= DA/min x 9690= U/L LDH


RESULTADOS
Los valores se obtienen en base al coeficiente de extinción de absortividad

micromolar del NADH a 340 nm (0.00622). Una unidad por litro (U/L) de actividad
de LDH es la cantidad de enzima que produce un µmol/L de NADH por minuto.
268
U/L = DA/min x Volumen total
Absortividad Volumen de la muestra
U/L= DA/min x 3050

0.00622 0.050
U/L= DA/min x 9690

25ºC 1.00 1.33 1.92
30ºC 0.75 1.00 1.43
37ºC 0.52 0.70 1.00
CONTROL DE CALIDAD.

La actividad de LDH determinada para estos materiales y por este método
CALIBRACION.
La actividad de LDH, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del
269
para calibrar su analizador. Probando el contenido de LDHT de un suero control,
con valores de LDH conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que la
LIMITACIONES.
Si los valores hallados son mayores al límite de linealidad, diluya una parte de
muestra con 9 partes de solución salina isotónica y repetir el ensayo. Multiplicar el
resultado por 10. Los valores de AST para recién nacidos no han sido establecidos
por éste método.
PRECISION.
Media(U/L) 336 541 343 551
SD 3.81 5.52 4.68 6.66
CV(%) 1.13 1.02 1.36 1.21
1U/L = 0.00030 DA/min.
270

ADULTOS Hasta 100 U/L Hasta 150U/L Hasta 240 U/L

La hemólisis debe evitarse ya que la concentración de LDH en los eritrocitos

La heparina, los citratos y los oxalatos inhiben el ensayo.
Muestras con ictericia y turbidez marcada requieren un blanco de muestra. (8-
10)
BIBLIOGRAFIA.

Wiley-Lyss. USA.
271

NADH-UV para la determinación cuantitativa de Lactato deshidrogenada. Método
recomendado por la IFCC.
5. Roe, et al.J. (1972). Lab. Clin. Med. 80: 557.
6. Bulh, S.N. y Jackson, K.Y. (1978) Clin. Chem. 24:828,
7. Wacker, W.E.C. et al. (1956) New Engl. J. Med. 255: 449.
8. Young, D.S. et al. (2004) Clin.Chem. 21: 323D, 195 (Special Issue)
Press.
272
7.2. LACTATO DESHIDROGENASA. (LDH)
STANBIO LDH LIQUID-UV
Para la determinación cuantitativa de LDH en suero o plasma con EDTA.
RESUMEN Y PRINCIPIO
La elevación de la LDH en el suero, ocurre desde infarto al miocardio,

enfermedades del hígado, anemia perniciosa y megalobástica, embolia pulmonar,
enfermedades malignas y distrofia muscular. El análisis combinado de LDH y
creatin cinasa, particularmente las isoenzimas de cada una, confirma el
diagnóstico definitivo del infarto agudo al miocardio.
Este método es el original de Buhl y Jackson modificado por Wacker, quienes
optimizaron las condiciones de reacción.
La LDH específicamente cataliza la oxidación de lactato a piruvato con la
subsecuente reducción de NAD+ a NADH + H+. La velocidad a la cual se forma el
NADH es proporcional a la actividad de la LDH. El método descrito determina el
aumento de absorbancia por minuto a 340 nm.
REACTIVOS
REGULADOR DE LDH (REACTIVO 1) CAT. No. 2941
LACTATO L-LITIO 100 mmol/L

2-METIL-2-AMINO-1-PROPANOL pH 8.8 600 nmol/L
ENZIMA DE LDH (REACTIVO 2) CAT. No. 2942.
NAD+ 6 mmol/L
PRECAUCIONES DEL REACTIVO: Para uso de diagnóstico in vitro.

No se pipetee con la boca.
273
PREPARACION DEL REACTIVO: El regulador y los reactivos enzimáticos líquidos
están listos para su uso. Prepare el reactivo de trabajo en una proporción de cinco
partes de regulador (R1) y una parte de enzima (R2). Por ejemplo 25 mL de
regulador y 5 mL de enzima.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO: Los reactivos son

estables hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta si se almacena de 2
a 8ºC y protegidos de la luz. Los reactivos deben verse claros y sin color.
Descartar si se ve turbio o si contienen partículas. El reactivo de trabajo es estable
por dos meses entre 2 a 8 ºC o por día a temperatura ambiente.
MATERIALES
Espectrofotómetro capaz de realizar lecturas de absorbencia a 340 nm y con 1

celdas de 1 cm de dm.
Baño de temperatura constante s 37ºC o portacubetas con temperatura
controlada.
Pipetas serológicas o automáticas.
Tubos de ensaye
Cronómetro.
RECOLECCION Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS.

Se utiliza sueros claros no hemolizados ni lipémicos. El plasma puede utilizarse
si se colecta con EDTA.
ESTABILIDAD DE LA MUESTRA
La actividad de la LDH sérica es estable por 3 días a 2 y 8ºC. Las muestras

congeladas muestran una disminución en las isoenzimas LDH4 y LDH5, dando por
lo tanto valores bajos de LDH.
274
INTERFERENCIAS
La heparina, los citratos y los oxalatos inhiben el ensayo. Los sueros ictéricos y
lipémicos requieren de un blanco del suero.
PROCEDIMIENTO MANUAL
1. Por cada muestra coloque 1.0 mL del reactivo de trabajo dentro de una celda de
1 cm de paso de luz e incube a 37ºC por tres minutos.
2. Adicione 0.050 mL de la muestra a su respectivo tubo, mezcle bien e incube por

un minuto a 37ºC.
3. Ajustar a 0 con agua destilada el espectrofotómetro a 340 nm.
4. anote el incremento en la absorbencia a intervalos de 60 seg. (DA/min). Durante

3 minutos. La relación de cambio deberá de ser constante.
CONTROL DE CALIDAD.
Sueros normales y anormales con niveles de LDH determinador por éste método
deben incluirse en cada serie de pruebas.
RESULTADOS
Los valores se obtienen en base al coeficiente de extinción de absortividad

micromolar del NADH a 340 nm (0.00622). Una unidad por litro (U/L) de actividad
de LDH es la cantidad de enzima que produce un µmol/L de NADH por minuto.
U/L = DA/min x Volumen total

Absortividad Volumen de la muestra
U/L= DA/min x 1050

0.00622 0.050
275
U/L= DA/min x 3376
Hasta 240 U/L a 37°C
COMPARACION. Un grupo de 70 muestras dentro de un intervalo de actividad de

LDH de 64-504 U/L se analizó por el método e LDH descrito y también por un
método comercial similar disponible. La comparación de resultados tiene un
coeficiente de correlación de 0.999 y con una ecuación de regresión y=1.108x +
1.582.
LINEALIDAD
El reactivo es lineal hasta 800U/L. Las muestras que exceden este valor deberán
diluirse con un volumen igual de solución salina, repetir el ensayo y multiplicar el
resultado por el factor de dilución.
BIBLIOGRAFIA
1. Roe, et al.J. Lab. Clin. Med. 80:557,1972.

2. Bulh. S.N., Jackson K.Y. Clin. Chem. 24:828,1978
3. Wacker, W.E.C. et al. New Engl. J. Med. 255:449, 1956.
4. Young, D.S. et al. Clin.Chem. 21: 323D,195 (Special Issue)
276
7.3. CREATINA CINASA
A) CREATINA CINASA (CK TOTAL)

INTRODUCCION.
La creatina cinasa (CK, CPK; ATP: creatina-N-fosfotransferasa, E.C. 2.7.3.2),
tiene un peso molecular de 81 Kda, cataliza reversiblemente la fosforilación de la
creatina por el ATP. (1-3)
CK
Creatina + ATP Creatina fosfato + ADP
Mg+2
Existen diferentes métodos para la determinación de CK en suero; pero debido a

que esta enzima es inestable, se recomienda almacenar el suero en la obscuridad
y a 4ºC o utilizar algún activador antes de realizar la determinación. Se ha
encontrado que el glutatión, el ditiotreitol (reactivo de Cleland), la cisteína y la N-
acetilcisteína (NAC), son activadores útiles para cuantificar la CK en suero. (4-8)
La creatina cinasa es una enzima intracelular, distribuida por todo el organismo
humano. Su función fisiológica está asociada con la adenosina trifosfato (ATP)
producida cuando el músculo se contrae. (6-8)
La actividad de CK en el suero se encuentra elevada en pacientes con
alteraciones del músculo esquelético y en infartos al miocardio.
de laboratorio y el uso de otras enzimas como la isoenzima MB de la CK, la LDH,
y la AST. (1-3,6)
OBJETIVO
El alumno determinará la actividad de la CK en la muestra problema por un
método de monitoreo discreto de SPINREACT. (8)
277
OH OP
O Hexocinasa O
+
ATP + ADP
OH HOH
FUNDAMENTO. Mg+2 OH HOH
HO HO
OH Los niveles de creatina cinasa (CK) O H proporcionado una valiosa contribución
han
β-DGlc en las enfermedades del músculo Glc-6-P
esquelético y cardiaco, incluyendo infarto al
miocardio y distrofia muscular. La determinación de las isoenzimas de la creatina
cinasa y lactato deshidrogenasa proporcionan un diagnóstico definitivo del infarto
al miocardio agudo. (1-3, 7,8)
El procedimiento cinético presentado es una modificación de Szasz de la técnica
de Rosalki, la cual optimiza la reacción mediante la reactivación de la actividad de
la CK con N-acetil-L-cisteína (NAC). (8)
La CK cataliza específicamente la transfosforilación de la fosfocreatina al ADP
produciendo creatina y ATP respectivamente. A través de una serie de reacciones
enzimáticas acopladas se puede determinar la actividad de ésta enzima. Las
enzimas que se acoplan en éste método son las enzimas hexocinasa (HK) y la
glucosa-6-fosfato deshidrogenada (G6PDH) mediante la siguiente serie de
reacciones: (8)
H
CH3 O- N
O H CK HN O
N N
P O+ ADP N + ATP
-O
O- NH Mg+2 H3C
FOSFOCREATINA CREATINA
278
OP OP
O O
+
OH HOH + NADP OH O + NADPH + H+
HO HO
OH OH
Glc-6-P 6-Fosfogluconolactona
El NADH es producido en un intervalo proporcional a la actividad de la CK. El

método determina los incrementos de absorbencias del NADH por minuto a 340
nm. (8)
MUESTRAS. (8)
Se requiere suero no hemolizado o plasma heparinizado. Siempre que sea

posible estas muestras deben de ser separadas y analizadas el mismo día que se
recolectan. Almacene el suero o el plasma en tubos bien tapados. La actividad de
la CK sérica es estable por tres días si se almacena de 2 a 8ºC, pero su actividad
disminuye aproximadamente un 10% o tras una hora a temperatura ambiente. No
congelar ya que la actividad de la CK a -20ºC disminuye al 20% en 24 horas. (6-8)
Si tenemos niveles de bilirrubina de hasta 40 mg/dL y de triacilgliceroles de 2000

mg/dL no habrá interferencia en ésta prueba. Muestras con ictericia y turbidez
marcada requieren un blanco de muestra.
Inyecciones intramusculares o ejercicio intenso pueden elevar la CK sérica.
Los cloruros y los sulfatos inhiben la actividad de la CK.
279
clínico de la AACC.) (9, 10)
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Cronómetro
REACTIVOS. (8)
COMPOSICION.
R1 REGULADOR Imidazol pH 7.0 100 mmol/L
D-Glucosa 20 mmol/L
Acetato de magnesio 10 mmol/L
EDTA 2 mmol/L
R2 SUSTRATO ADP 2 mmol/L
AMP 5 mmol/L
Diadenosinpentafosfato 10 mmol/L
+
NADP 2 mmol/L
Hexokinasa (HK) 2500 U/L
Glucosa-6-fosfato deshidrogenada (G6PDH) 1500 U/L
N-acetil-cisteína (NAC) 20 mmol/L
Creatina fosfato 30 mmol/L
280
PRECAUCIONES.

PRESENTACION.
20 frascos de 2.5 mL (R1) y 1 frasco con 20 tabletas de sustrato (R2).

reactivo reconstituido es estable por 5 días de 2-8 ºC o 24h a temperatura
ambiente (15-25 ºC). El reactivo de trabajo debe desecharse si la absorbencia
inicial leída contra agua a 340 nm es mayor o igual a 1.60.
PROCEDIMIENTO.

281
2. TECNICA.
3. Pipetee en un tubo de acuerdo a la siguiente tabla:
25-30°C 37°C
RT (mL) 1.0 1.0
Muestra (µL) 40 20
4. Mezclar e incubar por 2 minutos.

constante.

factor de 4127 si la temperatura de la reacción fue entre 25-30°C o bien por 8095
se la temperatura de trabajo fue de 37°C para obtener los resultados en U/L.


282

25ºC 1.00 1.56 2.44
30ºC 0.64 1.00 1.56
37ºC 0.41 0.63 1.00
CONTROL DE CALIDAD.

La actividad de CK determinada para estos materiales y por este método deberá
caer dentro de los intervalos establecidos para los controles. Se deben utilizar dos
niveles de controles para cada ensayo.
CALIBRACION.
La actividad de CK, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del

NADPH + H+ a 340nm. La guía de calibración del fabricante, deberá ser seguida
para calibrar su analizador. Probando el contenido de CK de un suero control, con
valores de CK conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que la calibración
del instrumento ha sido realizada correctamente.
283
RESULTADOS.
Los resultados derivan en base al coeficiente de extinción de absortividad
micromolar de NADPH a 340 nm (0.00622). Una unidad por litro (U/L) de actividad
de CK es la cantidad de enzima que oxida un µmol/L de NADPH por minuto.
U/L = DA/min X volumen total

Absortividad volumen de la muestra
U/L = DA/min X 1.020

Absortividad 0.020
U/L = DA/min X 8095
LIMITACIONES.
10. Los valores de CK para recién nacidos no han sido establecidos por éste
método.
PRECISION.
Media(U/L) 166 450 165 446
SD 2.36 3.72 2.26 5.17
CV(%) 1.42 0.82 1.37 1.16
284
1U/L = 0.0001 DA/min.

Adultos Hasta 100 U/L Hasta 176U/L Hasta 240 U/L

BIBLIOGRAFIA.
Wiley-Lyss. USA.

4. Abbot, B, et al. (1984) Creatine kinase. Kaplan, a. et al. Clin. Chem. The C. V.
Mosby Co. St. Louis. Toronto. Princeton; 1112-16.
5. Roe, et al. (1972) J. Lab. Clin. Med. 80:557.
284
6. Bulh. S.N., Jackson K.Y.(1978) Clin. Chem. 24:828.
7. Wacker, W.E.C. et al. (1956) New Engl. J. Med. 255:449.

NADH-UV para la determinación cuantitativa de creatina cinasa. Método
recomendado por la IFCC.
Press.
285
DETERMINACION CUANTITATIVA DE CREATINA CINASA EN SUERO O
PLASMA (STANBIO)
RESUMEN Y PRINCIPIO
Los niveles de creatina cinasa (CK) han proporcionado una valiosa contribución
en las enfermedades del músculo esquelético y cardiaco, incluyendo infarto al
miocardio y distrofia muscular. La determinación de las isoenzimas de la creatina
cinasa y la lactato deshidrogenasa proporcionan un diagnóstico definitivo del
infarto al miocardio agudo.
El procedimiento cinético presentado es una modificación de Szasz de la técnica
de Rosalki, la cual optimiza la reacción mediante la reactivación de la actividad de
la CK con N-acetil-L-cisteína (NAC).
La CK cataliza específicamente la transfosforilación del ADP a ATP, a través de
una serie de reacciones enzimáticas acopladas. El NADH es producido en un
intervalo proporcional a la actividad de la CK. El método determina los
incrementos de absorbencias del NADH por minuto a 340 nm.
REACTIVOS:
CK REGULADOR (R1)
Contiene:
D-Glucosa 20 mmol/L
EDTA 2 mmol/L
Regulador de imidazol (pH 6.7) 100 mmol/L
286
CK ENZIMA (R2)
Contiene:
ADP 2.0 mmol/L
AMP 5.0 mmol/L
Diadenosinpentafosfato 10 µmol/L
NADP 2.0 mmol/L
HK (levadura de pan) 2500 U/mL
G6PDH (levadura de pan) 1500 U/L
N-acetil-cisteína 20 mmol/L
Regulador de imidazol (pH 6.7) 100 mmol/L
Estabilizantes y preservadores.
PRECAUCIONES DEL REACTIVO: Para uso de diagnóstico in vitro

No se pipetee con la boca, ya que los reactivos contienen azida de sodio que
puede ser tóxica si se ingiere. La azida de sodio puede reaccionar con las tuberías
de plomo y cobre formando azidas metálicas altamente explosivas.
PREPARACION DEL REACTIVO: Los reactivos líquidos de enzima y regulador

están listos para su uso. Prepare el reactivo de trabajo en una relación de 1 parte
de reactivo enzima con 4 partes de reactivo regulador (v.g. 6 mL con 24 mL de
regulador). Agite suavemente por inversión para disolver el contenido.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO:
El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta si se
almacena de 2 a 8 ºC. El reactivo reconstituido es estable por 5 días de 2 a 8 ºC.
El reactivo seco debe tener una apariencia blanca o cremosa. Si la absorbencia
del blanco del reactivo excede de 0.7 a 340 nm y 1 cm de paso de luz, no deberá
ser utilizado ya que esto indica deterioro del reactivo.
MATERIALES:
287
Espectrofotómetro de LUV.
Baño de temperatura a 37ºC o portacubetas con temperatura controlada
Pipetas automáticas.
Tubos de ensaye.
Cronómetro.
Agitador vórtex.
OBTENCION DE LAS MUESTRAS.
Se requiere suero no hemolizado o plasma heparinizado. Inyecciones

intramusculares o ejercicio intenso pueden elevar la CK sérica.
Almacene el suero en tubos tapados. La actividad de la CK sérica es estable por

tres días si se almacena de 2 a 8ºC.
INTERFERENCIAS
PARAMETROS DE LA PRUEBA

Tipo de reacción Cinética
Temperatura de reacción 37ºC
Relación de la muestra/reactivo 1:40
Tiempo de equilibrio 2 minutos
Absorbencia límite del blanco 0.700 A
Cambio de absorbencia alta/minuto 0.250 DA/min
288
Factor 3376
Valor normal bajo 25 U/L
Valor normal 192 U/L
Linearidad 0 a 1200 U/L
Paso de luz de la celda 1 cm
pH 6.5 ± 1.0
Absorbancia lineal <0.700
PROCEDIMIENTO MANUAL
1. Fije la longitud de onda a 340 nm. Ajuste a cero con agua destilada.
2. Para cada muestra adicione 1.0 mL de reactivo reconstituido de CK dentro de

un tubo e incube a 37ºC aproximadamente 3 min.
3. Adicione 0.05 mL (50 µL) de la muestra, mezcle suavemente e incube 2 minutos

a 37ºC, vierta el contenido a una cubeta.
4. Lea y registre la absorbencia a los 2 minutos. Continúe la incubación a 37°C y

registre nuevamente la absorbencia a los 3 y 4 minutos. La relación de cambio
deberá de ser constante.
5. Determine el promedio de absorbencias por minuto (DA/min), multiplicando por

el factor de 3376 para obtener los resultados en U/L.
NOTA: Si la cubeta no está a temperatura controlada, incube las muestras a 37°C

CONTROL DE CALIDAD.
Se recomienda el uso de los controles de Stanbio Ser-TFy I y II en cada corrida.
Existen otros controles comerciales disponibles con valores de CK para éste
289
método. La actividad de CK determinada por éste tipo de materiales, utilizando
este procedimiento, debe caer entre el intervalo establecido para los controles. Se
debe analizar cada día de prueba, 2 niveles de material de control.
CALIBRACION.
La actividad de la CK está basada en el “Coeficiente de Extinción Micromolar” del
NADP a 340 nm (Obsérvese en la sección de resultados). Se deben realizar
pruebas con sueros controles que incluyan valores conocidos de CK, se puede
asegurar la correcta calibración con el instrumento.
RESULTADOS.
Los resultados derivan en base al coeficiente de extinción de absortividad
micromolar de NADH a 340 nm (0.00622). Una unidad por litro (U/L) de actividad
de CK es la cantidad de enzima que oxida un µmol/L de NADH por minuto.

U/L = DA/min X 1.05

Absortividad 0.05
U/L = DA/min X 3376
LIMITACIONES.
Si el DA/min es mayor de 0.345, realice una dilución apropiada y multiplique por el

factor de dilución correspondiente una vez que vuelva a repetir el ensayo bajo
estas condiciones.
290
VALORES ESPERADOS
Hasta 150 U/L (30 ºC)

Hasta 243 U/L (37ºC)
CORRELACION.
Un grupo de 77 sueros que presentaron una actividad de CK de 3-700 U/L se
analizó por el método descrito para y un método similar comercialmente disponible
de CK. La comparación de los resultados dio un Coeficiente de Correlación de
0.999 y una ecuación de regresión y=1.027x-0.65.
PRECISION.
La precisión intraensayo se estableció mediante 20 ensayos de tres niveles
diferentes de controles comerciales. Los valores de precisión total fueron
obtenidos ensayando tres controles comerciales durante 5 días consecutivos.
INTRAENSAYO
MEDIA CK (U/L) 159 220 508
SD (U/L) 3.2 1.5 3.7
CV (%) 2.0 0.7 0.7
PRECISION TOTAL
MEDIA CK (U/L) 50 157 228
SD (U/L) 1.1 1.6 2.3
CV (%) 2.1 1.0 1.0
291
LINEARIDAD.
El reactivo es lineal desde 1 hasta 1200 U/L, las muestras que excedan este
valor deberán diluirse con un factor de dilución apropiado con agua destilada,
repetir el ensayo y el resultado multiplicarlo por el factor de dilución.
SENSIBILIDAD.
Basado en la resolución del instrumento de A=0.001, el método presentado mostró

una sensibilidad de 1.0 U/L.
REFERENCIAS.
1. Roe, et al.J. Lab. Clin. Med. 80:557,1972.

2. Bulh. S.N., Jackson K.Y. Clin. Chem. 24:828,1978
3. Wacker, W.E.C. et al. New Engl. J. Med. 255:449, 1956.
292
B. CREATINA CINASA FRACCION MB (CK-MB)
La creatina cinasa es una enzima que se encuentra en alta concentración en

músculo esquelético y en el miocardio, y en cantidades apreciables en cerebro,
mientras que en otros órganos sólo existen pequeñas cantidades y en el hígado
no está presente. (1)
Se ha detectado en estos tejidos que la creatina cinasa es un conjunto de
isoenzimas, ya que poseen propiedades fisicoquímicas diferentes. (2, 3)
La isoenzima de cerebro (BB, CK1 o CPK1) se desplaza más rápidamente hacia
el ánodo, mientras que la del músculo esquelético (MM, CK3 o CPK3) se mueve
muy lentamente. La actividad de ésta enzima detectada en el micocardio tiene dos
componentes: uno se desplaza lentamente como la isoenzima de músculo y la
otra más rápidamente como la de cerebro. A partir de estos hallazgos se ha
determinado que estas isoenzimas son un dímero, la detectada en cerebro está
compuesta por dos subunidades idénticas denominadas BB. La detectada en
músculo esquelético a su vez está formada por dos subunidades idénticas
denominadas MM. Los extractos de miocardio contienen principalmente la
isoenzima MM o CPK3 y un híbrido constituido por una subunidad M y otra B, por
lo que se le ha denominado fracción MB, CK2 o CPK2, la cual es exclusiva de éste
tejido. (4, 5)
La presencia de la fracción MB en suero indica una lesión al miocardio y se
observa en los pacientes en un periodo de 48 h después del daño. (1-4)
Debido a que la fracción MB o CPK2 es una enzima exclusiva del tejido

miocárdico y cuyos niveles son bajos (hasta 40 U/L), puede detectarse daño a
éste tejido debido a que se eleva de forma considerable por alrededor de 500 U/L
o más dependiendo de la severidad del daño. De tal forma que la presencia de
ésta isoenzima junto con la presencia de AST, las isoenzimas de la LDH y la CK
total son importantes para el diagnóstico con un infarto agudo al miocardio. (5-8)
293
OH OP
O Hexocinasa O
+ ATP + ADP
OH HOH +2 OH HOH
Mg
HO OBJETIVO HO
OH OH
β-DGlc Glc-6-P
El alumno determinará la actividad de la fracción MB de la isoenzima CPK en
una muestra problema por un método de monitoreo discreto de SPINREACT.
FUNDAMENTO.
La CK-MB está formada por las subunidades CK-B y CK-M. La fracción CK-M es
inhibida por un anticuerpo específico que no influye en la fracción CK-B. La
actividad restante de la fracción no inhibida (CK-B) corresponde a la mitad de la
actividad de la CK-MB se determina mediante la técnica cinética de UV al igual
que CK-NAC. (9-10)
H
CH3 O- N
O H CK HN O
N N
P O+ ADP N + ATP
-O +2
O- NH Mg H3C
FOSFOCREATINA CREATINA
294
OP OP
O O
+
OH HOH + NADP OH O + NADPH + H+
HO HO
OH OH
Glc-6-P 6-Fosfogluconolactona
La velocidad de formación de NADPH, determinado fotométricamente es

proporcional a la concentración catalítica de CK-B de la muestra ensayada.
MUESTRAS. (8-10)
Se requiere suero no hemolizado o plasma con heparina. Siempre que sea

posible estas muestras deben de ser separadas y analizadas el mismo día que se
recolectan. Almacene el suero o el plasma en tubos bien tapados. La actividad de
la CK sérica es estable por tres días si se almacena de 2 a 8ºC, pero su actividad
disminuye aproximadamente un 10% o tras una hora a temperatura ambiente. No
congelar ya que la actividad de la CK a -20ºC disminuye al 20% en 24 horas.
Si tenemos niveles de bilirrubina de hasta 40 mg/dL y de triacilgliceroles de 2000

mg/dL no habrá interferencia en ésta prueba. Muestras con ictericia y turbidez
marcada requieren un blanco de muestra.
Inyecciones intramusculares o ejercicio intenso pueden elevar la CK sérica.
clínico de la AACC.) (11-12)
295
MATERIAL Y APARATOS
Gradilla
Cronometro.
REACTIVOS. (10)
COMPOSICION.
R1 REGULADOR Imidazol pH 6.7 100 mmol/L
D-Glucosa 20 mmol/L
EDTA 2 mmol/L
R2 SUSTRATO *Anti CK-M 2000 U/L
ADP 2 mmol/L
Anti CK-M AMP 5 mmol/L
Diadenosinpentafosfato 10 mmol/L
NADP+ 2 mmol/L
Hexokinasa (HK) 2500 U/L
Glucosa-6-fosfato deshidrogenada (G6PDH) 1500 U/L
N-acetil-cisteína (NAC) 20 mmol/L
* Anti CK-M suficiente para inhibir hasta 2000 U/L de CK-MM
OPCIONAL.
CK-NAC/CK-MB CONTROL Suero humano liofilizado ref. 1002260
296
PRECAUCIONES.
CK-NAC/CK-MB CONTROL.
Todos los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el
antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con
precaución como potencialmente infecciosos.

CONTROL. Disolver con 3 mL de agua destilada suavemente, evitando la

formación de espuma.
PRESENTACION.
6 frascos de 2.5 mL (R1) y 1 frasco con 6 tabletas de sustrato (R2).
CONTROL. Un frasco de liofilizado y un frasco de regulador conteniendo 3 mL.

297
reactivo reconstituido es estable por 5 días de 2-8 ºC o 24h a temperatura
ambiente (15-25 ºC). El reactivo de trabajo debe desecharse si la absorbencia
inicial leída contra agua a 340 nm es mayor o igual a 1.60.
PROCEDIMIENTO. (10)

2. TECNICA.

4. Adicionar 40 µL (0.040 mL) de suero a cada tubo respectivamente y mezclar por

inversión suavemente e incube por 10 minutos.
5. Leer la absorbencia inicial (A1) de la muestra, poner en marcha el cronómetro y

leer la absorbencia después de 5 minutos. (A2).
6. Calcule las diferencias de absorbencias: ΔA= A2-A1.

298


25ºC 1.00 1.53 2.38
30ºC 0.65 1.00 1.56
37ºC 0.42 0.64 1.00
CONTROL DE CALIDAD.

La actividad de CK-MB determinada para estos materiales y por este método
CALIBRACION.
La actividad de CK, se basa en el coeficiente de extinción micromolar del

NADPH + H+ a 340nm. La guía de calibración del fabricante, deberá ser seguida
para calibrar su analizador. Probando el contenido de CK-MB de un suero control,
299
con valores de CK-MB conocidos, éste puede ser utilizado para asegurar que la
RESULTADOS.
Los resultados derivan en base al coeficiente de extinción de la absortividad

micromolar de NADPH a 340 nm (0.00622). Una unidad por litro (U/L) de actividad
de CK-MB es la cantidad de enzima que oxida un µmol/L de NADPH por minuto.

U/L = DA/min X 1.040

Absortividad 0.040
U/L de CK-B= DA X 825 U/L de CK-MB= DA X 1651
PORCENTAJE DE ACTIVIDAD DE LA CK-MB:
ACTIVIDAD DE LA CK-MB X 100= % de actividad de la CK-MB

ACTIVIDAD DE LA CK total
LIMITACIONES.
LÍMITE DE DETECCIÓN: de 2.85 U/L
LINEALIDAD
Antes de efectuar la determinación de CK-MB, se determina la actividad de CK
total mediante le método de CK-NAC activado. Si la actividad de CK es superior a
1000 U/L, las muestras para la determinación de la CK-MB deberán diluirse 1:2
con NaCl a 0.9% y multiplicar el resultado calculado por 2.
300
PRECISION
Media(U/L) 138 9.6 141 8.85
SD 1.33 0.88 1.39 0.67
CV(%) 0.96 9.19 0.98 7.57
1U/L = 0.00013 DA/min.
La probabilidad de un infarto de miocardio es elevada si se rebasan los

siguientes resultados bajo las siguientes condiciones de temperatura:

Adultos £ 10 U/L £ 15 U/L £ 24 U/L
La actividad de la CK-MB se encuentra entre un 5 y 25% de la actividad total de

la CK.
Estos valores son orientadores. Es recomendable que cada laboratorio
En caso de sospecha de un infarto al miocardio y los valores encontrados son
inferiores a los límites indicados, podría tratarse de un infarto reciente. En dicho
caso se repetirá la determinación al cabo de 4 horas.
301
BIBLIOGRAFIA
Wiley-Lyss. USA.

4. Abbot, B, et al. (1984) Creatine kinase. Kaplan, a. et al. Clin. Chem. The C. V.
Mosby Co. St. Louis. Toronto. Princeton; 1112-16.
5. Roe, et al. (1972) J. Lab. Clin. Med. 80:557.
6. Szasz, et al. (1973) J. Lab. Clin. Med. 80:557
7 .Gruber, W. (1977) Clin. Chem. 24:828.
8. Wacker, W.E.C. et al. (1993) New Engl. J. Med. 300: 828-832.
9. Bulh. S.N., Jackson K.Y. (1978) Clin. Chem. 24:828.

de inmunoinhibicióin NADH-UV para la determinación cuantitativa de la fracción
MB de la creatina cinasa Método recomendado por la IFCC.
Press.
12. Young, D. S. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4a. ed. AACC Press.
2001.
302
8. VALORACION DEL ESTADO DEL PANCREAS
INTRODUCCION
Se piensa que la pancreatitis aguda es el resultado de la liberación de enzimas

pancreáticas activadas de las células acinosas a los tejidos circundantes. Casi
todos los casos se relacionan con enfermedades de las vías biliares o ingesta
excesiva de alcohol. Entre las otras múltiples causas o asociaciones están la
hipercalcemia, las hiperlipidemias (tipos I, IV y V), los traumatismos abdominales
(incluyendo cirugía), los fármacos (incluyendo sulfonamidas y tiacidas), vasculitis,
e infecciones virales. La patogenia exacta se desconoce, pero puede incluir
edema con el reflujo resultante de bilis a los conductos pancreaticos o lesión
directa a las células acinosas. La pancreatitis aguda aparentemente idiomática
frecuentemente es causada por microlitiasis biliar oculta. (1)
Las alteraciones anatomopatológicas varían del edema y la infiltración celular a
la necrósis de las células acinares, hemorragia por vasos sanguíneos necróticos y
necrosis grasa intrapancreática y extrapancreática: Puede afectarse todo el
páncreas o parte de él. (2, 3)
En el laboratorio estas alteraciones pueden manifestar la presencia de la
elevación específica de las enzimas amilasa y lipasa en el 90% de los casos en el
transcurso de 24 horas y su normalización es variable según la gravedad de la
enfermedad, pero junto con esta elevación de los niveles de estas enzimas
también se presenta leucocitosis (10 000 a 30 000/µL), proteinuria, cilindros (25%
de los casos), glucosuria (10 a 20%), hiperglicemia y aumento de la bilirrubina
sérica. Es posible que también se encuentre elevado el nitrógeno ureico y la
fosfatasa alcalina y que las pruebas de coagulación sean anormales. (3, 4)
8.1 a-AMILASA.
La a-amilasa (1,4-a-D-glucán-glucano-hidrolasa; E.C. 3.2.1.1), fue descubierta

por Payen y Persoz en 1883, quienes observaron que la diastasa (amilasa)
convertía el almidón de la malta en azúcar. Esta enzima cataliza la hidrólisis de los
303
enlaces glicosídicos a-1,4 del almidón, con lo cual produce diferentes compuestos
de degradación y como productos finales a la maltosa y la maltotriosa. La a-
amilasa tiene un peso molecular de 48 KDa; por lo cual se puede filtrar en el
glomérulo renal y aparecer en la orina. En el humano, las principales fuentes de a-
amilasa son las secreciones del páncreas y de las glándulas salivales, aunque es
probable que se encuentre en el hígado y el músculo esquelético. (1,3,4)
La actividad enzimática de la a-amilasa sérica y de otros líquidos biológicos, se
pueden cuantificar por diferentes métodos: 1) métodos que miden la disminución
de la viscosidad o de la turbiedad; 2) métodos colorimétricos como el iodométrico
o el amiloclástico y 3) métodos enzimáticos en los cuales se acopla una segunda
enzima, como la a-glicosidasa, para producir un compuesto colorido. (5)
OBJETIVO: El alumno determinará la actividad de la enzima a-amilasa en una

muestra problema por un método colorimétrico de Caraway modificado de la
marca Hycel.
FUNDAMENTO.
Esta metodología aquí propuesta por Hycel es un método colorimétrico para la

determinación de suero, orina y otros líquidos como fluidos corporales tales como
bilis, secreciones pancreáticas, líquido duodenal y fluido peritoneal.
Este método se basa en la modificación de Caraway en el cual se mide la
hidrólisis de un sustrato de almidón por la a-amilasa presente en la muestra de
prueba en condiciones estandarizadas, formando un complejo colorido (azul-
verde), cuya intensidad es proporcional a la concentración de amilasa presente en
la muestra.
REACTIVOS
-Sustrato de almidón pH 7.0 cat 64288 2 x 250 mL
-Solución de yodo N/100 cat 64289 2 x 250 mL
304
Los reactivos se usan directamente.
El sustrato de almidón pH 7.0 es estable por 1 año, conservándose a temperatura
ambiente y bien cerrado.
La solución de yodo N/100 es estable por 1 año, conservándose a temperatura
ambiente y bien cerrada.
EQUIPO.
Espectrofotómetro capaz de medir la absorbencia a 660 nm, un cronometro y un
baño de 37°C.
TOMA Y CONSERVACION DE LA MUESTRA.
El suero debe ser fresco o conservarlo en refrigeración. Si se utiliza plasma, la

sangre debe colectarse en un tubo que contenga heparina como anticoagulante.
Recolectar la orina durante 2 h y medir el volumen.
PROCEDIMIENTO.
SUERO.
1. Marcar dos tubos uno para el problema y otro para el blanco.
2. Pipetear exactamente 0.5 mL del sustrato de almidón en cada tubo.
3. Incubar el matraz marcado como problema en un baño a 37°C por 5 minutos.
No es necesario incubar el blanco.
4. Transcurridos los 5 minutos pipetear exactamente 0.010 mL del suero al tubo
marcado como problema, mezclarlo y continuar la incubación a 37°C durante 7
min y medio.
305
5. Transcurridos los 7 min y medio añadir 0.5 mL de la solución de yodo N/100 a
los tubos problema y blanco, inmediatamente después llevar ambos tubos a un
volumen final de 5 mL con agua destilada. Mezclar por inversión.
6. Leer de inmediato las absorbencias del problema y del blanco a 660 nm
estableciendo el cero con agua destilada.
CALCULOS.
SUERO
Unidades de amilasa/100 mL= Ablanco-Aproblema x 800
Ablanco
ORINA. Seguir las indicaciones exactamente igual que para las muestras séricas.
Unidades de amilasa por hora = Ablanco-Aproblema x 4V

Ablanco
V=volumen de la orina que se recoge en 2 h.
UNIDADES DE AMILASA. Una unidad e amilasa se define como la cantidad e

enzima que hidroliza 10 mg de almidón en 30 minutos, a un punto en el cual el
yodo no de ningún color.
En caso de exceder las muestras las 400 U diluir la muestra hasta 5 veces y
multiplicar el valor por 5.
VALORES DE REFRENCIA.
SUERO 60-160 UA/100 mL

ORINA Menos de 300 UA/h
306
BIBLIOGRAFIA:
Wiley-Lyss. USA.

4. Henry, R.J. (1990) Clinical Chemistry. Principles and Technics. Harper and
Row Pub.
5. Caraway, W.T. (1959) Am J C Path 32, 97.
6. Bioxón. (2006) Catálogo de pruebas de bioquímica clínica. Método Cinético de

Caraway para la determinación cuantitativa de a-amilasa pancreática.
Press.
307
-
OH
8.2. LIPASA.
Lipasa
Las lipasas es un conjunto de enzimas que catalizan la hidrólisis de los

triacilgliceroles. Las lipasas del intestino contribuyen en la digestión y a la
absorción de las grasas de la dieta. Los adipositos y las semillas en germinación
contienen lipasas que rompen los triacilgliceroles almacenados, liberando ácidos
grasos que son exportados a otros tejidos en los que se necesitan como
combustible. (1, 2)
La medida de lipasa se usa en el diagnóstico del tratamiento de enfermedades
del páncreas, tal como pancreatitis aguda y obstrucción de los conductos
pancreáticos. El método de lipasa es la adaptación del método colorimétrico
descrito por Neumann y colaboradores. Este método utiliza un derivado del
colesterol esterificado en la posición 1 de un ácido dicarbónico del éster de
resorufina como sustrato. La actividad de la lipasa es aumentada por la presencia
de colipasa, de cloruro de calcio y de sales biliares. (3, 4)
OBJETIVO:
El alumno determinará los niveles de lipasa en una muestra sanguínea por el

método cinético colorimétrico de Spinreact. (5-7)
FUNDAMENTO.
La lipasa pancreática en presencia de la colipasa, iones calcio y desoxicolato,

hidroliza el sustrato 1-2-O-dilauril-rac-glicerol-3-glutárico-(6´-metilresorufina)-ester.
Las secuencias de reacciones para la determinación directa de la lipasa son las
siguientes:
1-2-O-dilauril-rac-glicerol 1-2-O-dilauril-rac-glicerol + ácido glutárico -(6´-metilresorufina)-ester

-3-glutárico-(6´-metilreso (no estable)
rufina)-ester
Ácido glutárico + Metilresorufina
308
La velocidad de formación de la metilresorufina determinado fotométricamente, es
proporcional a la concentración catalítica de lipasa en la muestra ensayada.
REACTIVOS.
Colipasa ³ 1 mg/L
Desoxicolato 1.8 mmol/L
Taurodesoxicolato 7.2 mmol/L
R2 SUSTRATO (MICRO-EMULSION) Tartrato pH 4.0 15 mmol/L

Lipasa ³ 0.7 mmol/L
Cloruro cálcico (CaCl2) 0.1 mmol/L
Patrón. Suero humano liofilizado. La
LIPASA CAL actividad de LPS (U/L de
metilresorufina a 37°C)
PRECAUCIONES.
LIPASA CAL. Todos los componentes de origen humano han resultado ser
negativos a antígeno HBs, HCV y para anti-HIV (1/2) sin embargo, deben tratarse
con precaución como potencialmente infecciosos.
PREPARACION.
R1-R2. Están listos para su uso. Estabilidad una vez abierto 90 días a 2-8°C. R2
mezclar antes de usar (nota1).
LIPASA CAL.: Reconstituir (®) con 1 mL de agua destilada. Tapar y mezclar

suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad por 7 días a 2-8°C o 3 meses
a -20°C, congelado en alícuotas.
309
en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8°C,
protegidos de la luz y si se evita su contaminación.
No usar reactivos fuera de la fecha indicada.
INDICADORES DEL DETERIORO DE LOS REACTIVOS.

-Absorbencias del Blanco a 580 nm ³1.00
-R2 microemulsión de color naranja, descartar si se torna roja.
MATERIAL ADICIONAL.
Espectrofotómetro con lecturas a 580 nm.
Baño termoestable a 37°C (±0.1°C)
Cubetas de 1.0 cm de paso de luz.
Equipamiento habitual de laboratorio (nota2).
MUESTRAS.
Suero o plasma con citrato sódico, EDTA o heparina (1). No congelar o
descongelar las muestras repetidas veces. La estabilidad es de 2 días de 2-8°C.
PROCEDIMIENTO.
1. Condiciones del ensayo.
Longitud de onda 580 nm.
Temperatura constante 37°C.
310
BLANCO PATRON/MUESTRA
R1(mL) 1.0 1.0
R2(µL) 200 200
AGUA DESTILADA(µL) 10 ---
PATRON/MUESTRA --- 10
4. Mezclar e incubar a 37°C por un minuto.
5. Leer la absorbencia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y

leer la absorbencia cada minuto durante 2 minutos.
6. Calcular el promedio del incremento de absorbencia por minuto (DA/min).
CALCULOS.
(DA/min)Muestra- (DA/min)Blanco= (DA/min)Muestra
(DA/min)Patrón - (DA/min)Blanco= (DA/min)Patrón.
(DA/min)Muestra X actividad del calibrador= U/L de lipasa en la muestra.

(DA/min)Patrón
UNIDADES. La unidad internacional (U) es la cantidad de enzima que convierte 1

µmol de sustrato por minuto, en condiciones estándar. La concentración se
CONTROL DE CALIDAD.

SPINTROL H normal y patológico (ref. 1002120 y 1002210)
311
Si los valores hallados se encuentran fuera del intervalo de tolerancia, se debe
revisar la técnica y los reactivos.
Cada laboratorio debe disponer de su propio control de calidad y establecer
£ 38 U/L (U/L de metilresorufina a 37°C)

INTERVALO DE MEDIDA. Desde el límite de detección de 5U/L hasta el límite de
linealidad 250 U/L.
Si la concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir 1:10 con
agua destilada y multiplicar el resultado por el factor de 10.
PRECISION.
INTRASERIE (n=20) INTERSERIE (N=20)

MEDIA (U/L) 119 215 119 215
SD 4.13 5.97 5.43 10.79
CV (%) 3.34 2.78 4.54 5.02
EXACTITUD. Los reactivos de spinreact (y) no muestran diferencias sistemáticas

Los resultados obtenidos con 100 muestras fueron los siguientes:
Coeficiente de regresión (r) =0.997.
La ecuación de la recta y=0.50054x + 3.9443.
INTERFERENCIAS.
Los triglicéridos a 300 mg/dL interfieren en la determinación de la lipasa
reduciendo su actividad un 6%. Hemoglobina hasta 150 mg/dL y bilirrubina hasta
312
150 mg/dL no interfieren. Se han descrito varias drogas y otras sustancias que
interfieren en la determinación de lipasa.
NOTAS.
1. En algunas condiciones de almacenamiento (v.g. almacenaje a temperatura

inferior a la recomendada) puede aparecer precipitación, que no influye en su
funcionalidad; es recomendable resuspender mediante rotación suave del vial.
2. A fin de evitar contaminaciones se recomienda utilizar material plástico de un
solo uso.
BIBLIOGRAFIA.
Wiley-Lyss. USA.

4. Henry, R.J. (1990) Clinical Chemistry. Principles and Technics. Harper and
Row Pub.
5. Tietz, N.W. and D.F. Shuey. Lipase in serum. An overview. Clin. Chem. (1993);
39(5):746-756.
6. Lott, J.A., et al. Assays of serum lipase: Analytical and clinical considerations.
Clin. Chem. (1986); 32(7):1290-1302.
302
7. Bioxón. (2006) Catálogo de pruebas de bioquímica clínica. Método Cinético de
Caraway para la determinación cuantitativa de a-amilasa pancreática.
Press.
303

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ANALISIS CLINICOS

AUTOR: QBP. C. ESMERALDA LOPEZ FERRER

México, D. F. ENERO 2009

LABORATORIO DE ANALISIS CLINICOS

1. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO

2. QUIMICA SANGUINEA DE 6 ELEMENTOS. 9

2.2. METABOLISMO DE COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTEICOS

2.3. METABOLISMO DE LIPIDOS

3. EVALUACION DE LA FUNCION RENAL

4. METABOLISMO DE PROTEÍNAS 176

5. ENZIMOLOGIA CLINICA 182

6. VALORACION DE LA FUNCION HEPATICA. 192

7. VALORACION DE LA FUNCION CARDIACA 254

8. VALORACION DE LA FUNCION DEL PANCREAS. 303

I. SOBRE LA ENTRADA AL ALBORATORIO.

II: SOBRE EL COMPORTAMIENTO DENTRO DEL LABORATORIO.

2.1 Al iniciar cada semestre la coordinación de laboratorios asignará a los

III. SOBRE SANCIONES.

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3. Se discutirán las fuentes de variación y como disminuirlas y controlarlas.

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PREPARACION DEL REACTIVO.

Antes de ser reconstituido se conserva entre 2 y 8 ºC y protegido de la luz, el

Las muestras se obtienen por punción venosa. Se prefiere la obtención de

EQUIPO PARA LA DETERMINACION.

El equipo necesario para la determinación consta de un espectrofotómetro

4. Transcurridos 10 minutos, leer la absorbencia de cada tubo o cubeta contra el

mg de Glucosa= Absorbencia del problema X concentración del estándar (mg/dL)

La glucosa oxidasa es una enzima que reacciona específicamente con la b-D-

70- 110 mg/dL

COMPOSICION DEL REACTIVO.

Indicadores del deterioro de los reactivos

2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

4. Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C o 30 min a temperatura ambiente (15-

5. Leer la absorbencia (A) del patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El

mg/dL de Glucosa= Absorbencia de la muestra X concentración del estándar

CARACTERISTICAS DEL METODO.